CN117448444A - 一组用于检测蚕豆病遗传家系g6pd基因障碍的生物标志物、引物组合以及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一组用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物、引物组合以及其应用，本发明通过X号染色体携带的77个SNP位点，作为用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物。该生物标志物应用于制备用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的诊断试剂或试剂盒。另外，用于检测该生物标志物的引物组合物和特异性引物组合应用于制备用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品，能更好地检测蚕豆病(G6PD缺乏综合征)。本发明的诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品具有通用性、高通量、成本低、高灵敏度、特异性强的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一组用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物、引物组合以及其应用。
背景技术
蚕豆病是一种X连锁不完全显性遗传性溶血性疾病，其发病机制主要涉及G6PD基因的突变。G6PD即葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)，缺乏该酶的功能导致全球约五亿人罹患此病。G6PD突变的分布具有典型的种族和地域差异。在中国，蚕豆病是一种高发疾病，呈现南部高发、北部低发的地域分布特点，患病率在0.2％至44.8％之间。该疾病主要分布于长江以南的各个省份，尤其在海南、广东、广西、云南、贵州和四川等省份发病率较高。某些人群的基因携带率甚至可高达16％，而在北方地区则较为罕见。
G6PD是磷酸戊糖途径的关键酶，其主要作用是产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，以维持细胞内适当的还原环境，尤其在红细胞中具有重要作用。因此，G6PD功能障碍会导致红细胞处理氧化应激的能力下降。该功能障碍的发生与多种基因突变相关，其中最常见的是单核苷酸替换突变，其次是多个突变、缺失和内含子突变。G6PD缺乏症主要由这些基因突变引起。G6PD基因位于X染色体长臂2区8带(Xq28)，总长20114bp，由13个外显子和12个内含子组成，编码了515个氨基酸。目前已经描述了400多个基因突变位点与G6PD缺乏症相关。在中国，也报道了多个基因突变位点，其中c.1388G>A、c.1376G>T和c.95A>G是最常见的三种基因突变类型，占据了70％以上的比例，并且仅在华人及华裔后代中有报道。
由于G6PD缺乏症通常是一种X连锁隐性遗传病，男性的发病率显著高于女性。男性可能是正常的半合子或缺陷的半合子，而女性则可能是正常纯合子、缺陷的纯合子或杂合子。女性杂合子是表达野生型细胞和表达缺失突变细胞的嵌合体。然而，由于X染色体失活机制，杂合子女性也有可能出现轻微的症状。
多年来，针对G6PD缺乏症的检测方法不断更新，目前主要包括四氨蓝纸片定性法、变性珠蛋白小体生成试验、高铁血红蛋白还原试验(MHb-RT)、光斑点法(FST)和G6PD活性测定等。这些方法操作简便、价格低廉，但准确性有所限制，容易产生假阳性或假阴性的结果，特别是在对女性杂合子进行检测时容易出现漏诊情况。常规的基因诊断方法在解决G6PD缺乏症女性杂合子检出方面取得了一定进展。然而，这些方法存在操作繁琐、通量低、易产生假阴性或假阳性结果的缺点，因此无法成为临床基因诊断的最佳选择。例如，等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法需要进行繁琐的聚合酶链式反应(PCR)和后续的杂交盒洗脱等步骤，杂交及洗脱条件的控制可能导致误诊和漏诊。多重等位基因特异性PCR法经济简便，但对引物设计要求较高，并且在PCR反应体系中，多对引物可能相互干扰，影响结果的准确性。高分辨率熔解曲线法操作简便，但对于不同突变位点的检测往往需要多次操作，通量较低，而单管多位点检测结果难以解读，因此在临床应用方面受到限制。现有技术中，中国发明专利申请CN103695554A开发了用于G6PD缺乏症诊断的基因检测膜条及相关引物，针对已报道的几个常见突变位点进行了检测。然而，该技术中的位点覆盖不够全面可能导致漏诊，不利于该疾病的遗传筛查和早期干预。另外，中国发明专利申请CN104450925A利用荧光定量PCR设计了覆盖多数G6PD突变人群的常见位点引物和探针，以进行单独分型。但该方法仍存在标准化程序、仪器规格和试剂选择的多样性，导致部分结果重复性较差，给广泛应用带来了阻碍。因此，在该领域仍需要探索一种新的G6PD缺乏症遗传检测技术，以克服现有方法的局限性。
植入前遗传学诊断(PGD)是一种通过对胚胎进行遗传学检测的技术，旨在筛查可能携带遗传病或染色体异常的胚胎，并选择正常胚胎进行移植。PGD技术在遗传病家族史、染色体结构异常、高龄产妇等情况下特别有用。它可以帮助减少某些遗传病的发生率，并提高辅助生殖技术的成功率。目前尚无公开技术能很好地阻断蚕豆病家族遗传的发生。
二代测序技术，也被称为下一代测序(Next-Generation Sequencing，NGS)，是一种高通量的基因组分析方法。它能够快速、准确地测定DNA或RNA样本中的序列信息，从而实现了大规模基因检测和分析的能力。二代测序技术可以用于检测胚胎携带的基因突变，包括点突变、缺失、插入等各种类型的突变。这有助于筛选出携带遗传疾病的胚胎。与传统PGD方法相比，二代测序通常需要的样本量更少，从而更为非侵入性，减少了对患者的生理影响。二代测序技术具有高灵敏度和高特异性，可以检测到低频突变，减少了假阳性和假阴性的风险。
传统的胚胎植入前遗传学诊断(PGD)检测通常采用毛细管电泳技术来检测核酸中的短串联重复(Short Tandem Repeats，STR)构建单体型，以评估胚胎是否携带致病突变，并进而判断其是否符合合格胚胎的标准。STR的应用需要从胚胎中提取多个细胞进行分析，然而这一过程可能对胚胎的发育和存活率产生不利影响。此外，STR分析存在一系列问题，包括杂合性缺失、基因扩增失败、非特异性扩增等，这可能导致假阳性或假阴性结果的出现，进而需要进行多次验证和确认，增加了诊断的不确定性。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一组用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物，该组用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物能够应用于制备用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的试剂。
本发明的第二个目的在于提供上述生物标志物在制备用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的诊断试剂或试剂盒的应用。
本发明的第三个目的在于提供针对所述用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物检测用的引物组合物。
本发明的第四个目的在于提供用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物的试剂盒。
本发明的第五个目的在于提供用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物检测用的特异性引物组合。
本发明的第六个目的在于提供包含上述特异性引物组合的试剂盒。
本发明的第七个目的在于提供上述试剂盒在制备用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的诊断产品中的应用。
为实现上述发明的第一个目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一组用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物，包括X号染色体携带的77个SNP位点，其中包含位于G6PD突变缺失区域中的2个特异性SNP位点、处于2个特异性SNP位点上游区域的42个SNP位点、处于2个特异性SNP位点下游区域的33个SNP位点；
所述77个SNP位点如下：
其中，所述2个特异性SNP位点在G6PD基因中的位置分别为NM_000402.4(G6PD):c.871G>A和NM_000402.4(G6PD):c.1311>A。
其中，生物标注物采用上述77个SNP有效位点，通过对已知个体或群体的多态性信息与已有数据相结合，能够快速准确地确定出具有高突变率的候选序列。另外，采用上述77个SNP位点信息进行分析，能实现对不同配偶的胚胎前诊断、胎儿诊断和流产组织诊断，从而更加精准地建立单体型。因此，能够对候选基因序列进行快速准确地鉴定，并能将其定位到特定位置。
为实现上述发明的第二个目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供上述生物标志物在制备用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的诊断试剂或试剂盒的应用。
为实现上述发明的第三个目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一组用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物检测用的引物组合物，所述引物组合物中各引物的信息如下：
为实现上述发明的第四个目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物的试剂盒，所述试剂盒含有上述所述的引物组合物。
为实现上述发明的第五个目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一组用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物检测用的特异性引物组合，其特征在于，所述特异性引物组合包含42对上游引物，2对含致病突变位点的特异性引物，33对下游引物；
所述特异性引物组合的序列信息如下：
其中，这些特异性引物的特点是：(1)各特异性引物与其它扩增片段不能存在较大的互补性，扩增片段之间也不能有较大同源性；2)一般18-24碱基，各特异性引物之间不能互补，尤其避免3’端互补，避免出现二聚体或发夹结构；3)上下游靶向扩增区间至少包含一个所筛选的SNP位点。
为实现上述发明的第六个目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物的试剂盒，含有上述所述的特异性引物组合。
为实现上述发明的第七个目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供上述试剂盒在制备用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的诊断产品中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明通过X号染色体携带的77个SNP位点，作为用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物。该生物标志物应用于制备用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的诊断试剂或试剂盒。另外，用于检测该生物标志物的引物组合物和特异性引物组合应用于制备用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品，能更好地检测蚕豆病(G6PD缺乏综合征)。
(2)本发明的生物标志物含有77个SNP位点，采用上述多个SNP有效位点进行分析，能用于用于蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍检测，进而能够更好构建单体型，一旦发生突变则能更好的检测蚕豆病(G6PD缺乏综合征)。
(3)用于检测该生物标志物的引物组合物和特异性引物组合应用于制备用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品，由于引物组合物针对77个SNP位点进行分析，可用于不同配偶的胚胎移植前诊断，通用性好；由于引物组合物和特异性引物组合是基于第二代测序技术，因此，本发明的诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品可以对G6PD基因附近的多个SNP进行分析，不需依赖已知的探针和设计探针；本发明的诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品可以高通量地进行G6PD突变的单倍体，通过在每个样品上加上不同的标签序列，可以一次地对大量样品进行分析；由于本发明的诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品能一次对大量样品进行分析，因此本发明对G6PD突变的单倍体分析的成本低；本发明的诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品可用于3～5个细胞的分析，因此适合于试管婴儿技术中胚胎移植前的检测，灵敏度高；因此，本发明的诊断试剂盒、诊断试剂或诊断产品具有通用性、高通量、成本低、高灵敏度、特异性强的优点，通过对多位点SNP测序、防止扩增等位基因脱扣(ADO)造成的检测误诊，能够对胚胎移植前蚕豆病致病位点精准地检测。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明中，实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
为帮助更好理解本发明，对以下概念进行了解释：
读段(reads)是指高通量测序平台产生的短序列，也就是测序仪单次测序所得到的碱基序列；单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多样性。SNP是最常见的遗传变异。
短串联重复序列(STR)是一段包含1-6个碱基单元组成的DNA重复序列12。STR在不同的个体间具有高度的变异性，可以作为细胞的DNA指纹。
单体型(Haplotype)是一条染色体上一组紧密相连的等位基因的基因型，通常作为一个单位遗传。单体型可以反映出染色体上的单核苷酸多态(SNP)的组合和分布。
测序深度是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值，可以理解为基因组中每个碱基被测序到的平均次数。测序深度越高，表示测序数据的质量和可靠性越高，但也会增加测序的成本和数据量。例如在一个实施方案中，测序深度为1000x，则代表该条特异PCR扩增产物被测序1000次；
有效位点是指夫妻男女双方的某个SNP位点，或STR位点，其中一方为纯合，另一方为杂合，则该位点称为有效位点。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一组用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物，包括X号染色体携带的77个SNP位点，其中包含位于G6PD突变缺失区域中的2个特异性SNP位点、处于2个特异性SNP位点上游区域的42个SNP位点、处于2个特异性SNP位点下游区域的33个SNP位点；
所述77个SNP位点如下：
/>
/>
其中，2个特异性SNP位点在G6PD基因中的位置分别为NM_000402.4(G6PD):c.871G>A和NM_000402.4(G6PD):c.1311>A。
通过采用上述多个SNP有效位点进行分析，能用于用于蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍检测，进而能够更好构建单体型，一旦发生突变则能更好的检测蚕豆病(G6PD缺乏综合征)。
实施例2
实施例1的一组用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物在制备用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的诊断试剂或试剂盒的应用。
针对上述一组用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物设计检测用的引物组合物，所设计的引物组合物中各引物的信息如下：
/>
/>
其中，设计用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物的试剂盒，该试剂盒含有上述引物组合物。
另外，针对上述一组用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物检测用的特异性引物组合，该特异性引物组合包含42对上游引物，2对含致病突变位点的特异性引物，33对下游引物；
该特异性引物组合的序列信息如下：
/>
/>
其中，设计用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物的试剂盒，该试剂盒含有上述的特异性引物组合。
另外，上述的试剂盒应用于制备用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的诊断产品。
实验：
一、通过上下游SNP位点确定单体型(一)包括以下步骤：
(1)样本获取：采集亲代双方4份全血样本；提取采用QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取基因组DNA，使用Qubit4.0测定DNA浓度，取一定量作为待测DNA样本；选取胚胎待测样4例，胚胎发育至囊胚期，采用常规胚胎活检技术取出3-5个外滋养层细胞，自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组DNA进行富集，全基因组扩增采用Fapon Single Cell genome-Ampli Kit(NK023)；
(2)使用Qubit 4.0测定胚胎样本DNA浓度；
(3)目的片段扩增：将DNA与多重PCR引物和PCR扩增试剂混合，经多重PCR反应，得到目的基因DNA片段；
多重PCR反应体系：
| 试剂 | 体积(μL) |
| 5×Ion AmpliSeqTMHiFi Master Mix | 4 |
| 2×Ion AmpliSeqTMPrimer Pool | 10 |
| WGA/gDNA/(>10ng) | X |
| Nuclease-Free Water | 6-X |
| 总体积 | 20 |
反应条件：99℃预变性2min，1个循环；99℃变性15sec，60℃退火和延伸4min，22个循环；10℃终止；
(4)引物消除：将步骤(3)得到的目的基因DNA片段加入2μL Life Technologines公司的FuPa Reagent引物消除试剂，混合反应，降解去除PCR扩增片段中的引物序列，得到去引物的DNA片段；
(5)文库构建：将步骤(4)得到的去引物的DNA片段与P1接头、特异性接头、连接反应试剂混合进行连接反应，得到加接头的DNA片段；
连接反应体系：
| 试剂 | 体积(μL) |
| 步骤(4)产物 | 22 |
| 连接缓冲液 | 4 |
| P1接头 | 4 |
| 特异性接头 | 4 |
| DNA连接酶 | 2 |
| 总体积 | 30 |
震荡混匀，离心后放入PCR仪，反应条件：22℃30min，68℃5min，72℃5min，10℃终止；
(6)磁珠纯化：将加接头的DNA片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头，得到纯化的DNA片段；
(7)文库检测：采用荧光定量PCR的方法检测步骤(6)得到的文库浓度；
(8)高通量测序：采用在Ion Torrent PGM测序平台对步骤(7)得到的文库进行高通量测序；
(9)生物信息学分析：对胚胎活检细胞全基因组扩增WGA产物(DNA)及家系样本进行捕获测序后进行生物信息学SNP分析，获得夫妇及致病基因连锁单倍型信息，再根据胚胎样本的测序信息判断是否存在与蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍相关的致病基因，并进行分类和诊断。利用fastp-0.21.0软件对原始数据进行过滤、利用BWA软件比对到人类GRCh38参考基因组，去除低质量序列，统计目标位点的测序深度，并去除深度小于100的位点、确定目标区域SNP位点的基因型。(利用父母和胚胎目标区域SNP位点的基因型，筛选有效位点构建单体型。利用已经建立好的单体型对胚胎是否携带突变进行判断。
(二)结果
选取目标区域的64个有效位点构建单体型，结果如表1所示。
表1上下游SNP位点判断单体型结果数据
/>
上下游SNP位点判断单体型结果数据(接上表)
/>
/>
表1中，胚胎2中chrA列和胚胎4中chrA列为携带致病缺失基因的染色单体。其中，chrA为携带母源风险染色单体，chrB、chrC、chrY为正常染色体单体。
结果表明：
女方染色单体分为chrA为携带致病突变染色单体，chrB为正常染色体单体；男方染色单体分为chrC、chrY，均为正常染色体单体。胚胎1、胚胎3均不携带母源风险染色体单体无突变。胚胎2为半合子突变。胚胎4为杂突变。具体结果请参见表2。
表2：
该确定单体型方法通过对已知个体或群体的多态性信息与已有数据相结合，能够快速准确地确定出具有高突变率的候选序列。采用多SNP进行分析，能实现对不同配偶的胚胎前诊断、胎儿诊断和流产组织诊断，从而更加精准地建立单体型。通过本研究可以对候选基因序列进行快速准确地鉴定，并能将其定位到特定位置。
本发明基于所设计的77对引物对应的扩增区间，进一步筛选了靶向扩增区间内的其它SNP有效位点一共77个，与上述有效位点组合，共同构建单体型，本发明囊括这77个位点不仅能够增加单体型分型的有效位点数目，一旦发生突变则能更好的检测蚕豆病(G6PD缺乏综合征)。
综上所述，本发明样本采用了单细胞全基因组扩增技术(Single-Cell WholeGenome Amplification，SCWGA)、多重PCR捕获测序、高通量测序方法、生物信息分析方法进行筛选有效位点构建单体型。
二、panel捕获性能指标检测
本实验使用与上述“通过上下游SNP位点确定单体型”实验相同的4例胚胎囊胚期滋养层细胞全基因组扩增产物、父母外周血细胞DNA样本，使用本发明设计的引物组(共77对SNP引物)，按照Fapon Single Cell genome-Ampli Kit(NK023)标准建库流程进行建库，并在Ion Torrent PGM上测序，得到片段长度分布在100-150bp的目标区域DNA片段序列。对获得的测序下机数据进行常规参数的质控和分析。
检测结果：
对本实验中的样本进行测试，能够获得靶向区间全覆盖，目标全覆盖，最低测序深度为100x，mapping rate≥99％，ontargetrate≥95％，100x均一度≥95％。具体信息如下表3所示：
表3：
表3中，“Mapping rate”代表重测序时比对率；“Ontargetrate”代表中靶率，表示测序数据比对到靶向扩增子的比例；“>0.2xAverage Depth Rate”代表大于0.2x平均测序深度位点的比例，该值越高，扩增均一性越好；“>30x Depth Rate”代表目标位点的覆盖率，该值越高，说明目标位点覆盖度越高。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (8)
1.一组用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物，其特征在于，包括X号染色体携带的77个SNP位点，其中包含位于G6PD突变缺失区域中的2个特异性SNP位点、处于2个特异性SNP位点上游区域的42个SNP位点、处于2个特异性SNP位点下游区域的33个SNP位点；
所述77个SNP位点如下：
2.根据权利要求1所述的一组用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物，其特征在于，所述2个特异性SNP位点在G6PD基因中的位置分别为NM_000402.4(G6PD):c.871G>A和NM_000402.4(G6PD):c.1311>A。
3.权利要求1或2所述的生物标志物在制备用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的诊断试剂或试剂盒的应用。
4.权利要求1或2所述的一组用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物检测用的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物中各引物的信息如下：
5.用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物的试剂盒，其特征在于，含有权利要求4所述的引物组合物。
6.权利要求1或2所述的一组用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物检测用的特异性引物组合，其特征在于，所述特异性引物组合包含42对上游引物，2对含致病突变位点的特异性引物，33对下游引物；
所述特异性引物组合的序列信息如下：
7.用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的生物标志物的试剂盒，其特征在于，含有权利要求6所述的特异性引物组合。
8.权利要求5或7任一项所述的试剂盒在制备用于检测蚕豆病遗传家系G6PD基因障碍的诊断产品中的应用。
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