CN117440968A - 靶向表皮调节素的化合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及表皮调节素抗体，包含其的组合物和制备和/或使用抗体和/或其组合物的方法，用于治疗慢性疼痛病症，如慢性骨关节炎疼痛，或慢性糖尿病性周围神经病变疼痛和慢性腰背疼痛。

Description

靶向表皮调节素的化合物和方法
本发明涉及包括针对人表皮调节素的抗体的化合物、药物组合物和方法，及其在治疗慢性疼痛中的用途，所述慢性疼痛包括伤害感受性(nociceptive)疼痛、神经性疼痛和混合性疼痛，特别是在治疗骨关节炎(OA)疼痛，或糖尿病性周围神经病疼痛(DPNP)，或慢性腰背痛(chronic low back pain,CLBP)中的用途。
慢性疼痛基于机制分成以下不同的类别：伤害感受性的、神经性的和混合性的。伤害感受性疼痛是由潜在地或实际上引起非神经元组织损伤的刺激引起的。这激活了外周感觉系统中的伤害感受受体。由骨关节炎引起的疼痛是躯体伤害感受性疼痛的典型实例。神经性疼痛是由中枢或外周神经系统的损伤或疾病引起的，导致感觉神经系统的适应不良超敏反应。糖尿病性周围神经病变引起的疼痛是外周神经性疼痛的典型实例。表现出伤害感受性疼痛和神经性疼痛的特征的病症，例慢性腰背痛，被归类为混合性疼痛。
慢性疼痛是一种具有巨大社会影响的高度普遍的病症。在2016年，基于来自国家健康访谈调查的数据，估计20.4％的美国成人群体经历慢性疼痛，其被定义为在过去6个月中的大多数天或每天的疼痛。估计8％的人群患有慢性疼痛，在过去6个月的大多数日子或每天限制他们的生活或工作活动。因此，慢性疼痛是医疗保健支出的主要原因，2010年美国管理慢性疼痛的年度成本估计为约6350亿美元。尽管疾病负担和社会影响很高，但慢性疼痛的管理目前仍不令人满意。单独的非药物疗法很少足以缓解疼痛或改善功能，并且可用的药物疗法变化并提供适度的益处，并且一些具有显著的安全风险。目前，用于缓解最常见类型的慢性疼痛的最常用药物是对乙酰氨基酚、非甾体抗炎药和阿片样物质。加巴喷丁、其他抗惊厥剂(如二丙戊酸钠、卡马西平或拉莫三嗪)和一些抗抑郁剂(如三环类或度洛西汀)可用于一些特定的疼痛障碍。目前的药物配备通常提供低水平的功效，并且具有耐受性问题和/或有害的副作用。阿片类药物对急性疼痛有效，但由于高滥用风险和潜在的严重不良反应，它们是慢性疼痛的有限治疗选择。慢性疼痛对患者和社会的身体、情绪和经济影响，加上缺乏有效和可耐受的治疗选择，使其成为显著未满足的医疗需求。
表皮调节素是配体的表皮生长因子受体(EGFR)家族的成员，其包括7种配体：TGF-α(TGFA)、表皮调节素(EREG)、EGF、肝素结合EGF(HB-EGF)、上皮细胞有丝分裂蛋白(Epigen,EPGN)、双调蛋白(AREG)和β细胞调节素(BTC)(Schneider MR，Wolf E.The epidermalgrowth factor receptor ligands at a glance.J Cell Physiol.2009；218(3)：460-466)。除了EGFR(ErbB1)外，在该受体家族中还有3种另外的受体(ErbB2、ErbB3和ErbB4)，其中ErbB3和ErbB4可以结合神经调节蛋白家族配体以及选择配体的EGFR家族的成员(表皮调节素、β细胞调节素和HB-EGF)。这些配体被合成为跨膜蛋白，其被蛋白水解切割以产生可溶性配体，所述可溶性配体可以以旁分泌或自分泌方式起作用以调节各种生物过程。表皮调节素可以结合EGFR和ErbB4两者，以通过与ErbB2或ErbB3的同源二聚化或配体诱导的异源二聚化来诱导信号传导。
表皮调节素信号传导有助于各种生理状况，如炎症、伤口愈合和血管生成(Riese等，Epiregulin：Roles in Normal Physiology and Cancer，Semin Cell Dev Biol.2014，0:49-56)。通过EGFR受体同二聚体或异二聚体对的表皮调节素信号传导允许许多下游信号传导途径(如ERK、MAPK、AP1、PI3K、JAK/STAT和NFκB)的激活。诸如JAK/STAT和NFκB的途径的激活在驱动炎症中被充分证明，而API信号传导的激活驱动c-FOS和c-JUN激活，这是神经激活的标志物。最近发表的临床前模型的数据表明表皮调节素在调节以神经元炎症和神经元激活为特征的慢性疼痛中的作用，表明表皮调节素信号传导途径调节炎症和神经元激活作为慢性疼痛病症的潜在机制的作用。报道表明EGFR途径参与神经性疼痛的发病机理(Kersten等，Epidermal growth factor receptor-inhibition(EGFR-I)in thetreatment of neuropathic pain.Br JAnaesth.2015；115(5)：761-767)。然而，已经发现用EGFR抗体或EGFR酪氨酸激酶抑制剂靶向受体与胃肠道(GI)和皮肤不良反应的高发生率有关，这限制了它们在慢性疼痛障碍中的潜在用途。
结合TGFα和表皮调节素两者的抗体连同治疗糖尿病性肾病的方法公开于WO2012/138510中。LY3016859是结合表皮调节素和转化生长因子α(TGF-α)的单克隆抗体，其在1期临床研究中进行了测试，并在健康受试者和糖尿病性肾病患者中评估安全性、药代动力学、药效学和功效(参见Sloan-Lancaster等，Evaluation of the safety，pharmacokinetics，Pharmacodynamics，and Efficacy After Single and MultipleDosings of LY3016859in Healthy Subjects and Patients With DiabeticNephropathy，Clinical Pharmacology in Drug Development2018，7(7)759-772)。Sloan-Lancaster等记载了LY3016859对TGFα比表皮调节素具有更大的亲和力，并且进一步地，LY3016859施用不会对肾病疾病相关生物标志物产生任何明显的影响(也参见Beidler等，J.Pharmacology and Experimental Therapeutics，2014，349(2)：330-343)。观察到非线性动力学，表明靶标介导的药物处置，并且高水平的可溶性靶标接合需要高剂量。值得注意的是，在两项报道的研究中观察到高频率的抗LY3016859抗体，但对药代动力学或靶标接合没有明显影响，如在药物耐受测定中测量的循环表皮调节素的剂量和时间依赖性增加所示。对于慢性疼痛适应症的治疗，对表皮调节素更具选择性、具有更高亲和力并且不太可能诱导抗药物抗体应答的抗体代表了重要的未满足的治疗需求。对于慢性疼痛障碍(包括伤害感受性疼痛、神经性疼痛和混合性疼痛)的替代和/或改善的治疗，特别是骨关节炎或糖尿病性周围神经病变或慢性腰背痛的治疗，和/或治疗抗性疼痛的治疗，仍然存在未满足的需求。
发明概述：
本公开内容的实施方案提供了新的抗人表皮调节素抗体、其药物组合物以及使用这些抗体和组合物治疗疼痛和慢性疼痛疾病的方法。根据一些实施方案，本发明提供了包含轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)的抗体，其中所述LCVR包含互补决定区(CDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且所述HCVR包含CDR HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且选自表1中提供的CDR组合的分组。本文使用的序列标识符列于表1中，并且序列在本文提供的氨基酸和核苷酸序列表中提供。抗体1是高亲和力的完全人免疫球蛋白G4(IgG4)单克隆抗体，其结合人表皮调节素的C-末端区域中的残基并防止人表皮调节素与EGFR的结合和EGFR的激活。抗体1代表改进的用于人类治疗的抗表皮调节素抗体，其具有有利性质的组合：包括增强的亲和力、选择性、降低的脱靶风险和不期望的活性、降低的免疫原性风险、高效力和长的作用持续时间，以及其他期望的性质，并且提供了改进的阻断表皮调节素并治疗疼痛和慢性疼痛病症的手段。
表1：抗体1的氨基酸和核苷酸序列
抗体1
SEQ ID HC 1
SEQ ID LC 2
SEQID HCVR 3
SEQID LCVR 4
SEQID HCDR1 5
SEQID HCDR2 6
SEQID HCDR3 7
SEQID LCDR1 8
SEQID LCDR2 9
SEQID LCDR3 10
SEQ ID:DNA HC 11
SEQ ID DNA LC 12
因此，本公开的实施方案还提供了包含LCVR和HCVR的抗体，其中LCVR具有SEQ IDNO:4的氨基酸序列，并且HCVR具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
根据其他实施方案，本公开还提供了包含LCVR和HCVR的抗体，其中LCVR具有SEQID NO:4的氨基酸序列，并且HCVR具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，具有选自SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52的铰链区和Fc区。
在一些实施方案中，本公开还提供了包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的LC和具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC的抗体。根据其他实施方案，本公开还提供了包含LC和HC的抗体，所述LC和HC具有与具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的LC和具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HC的氨基酸序列具有至少95％同源性的氨基酸序列。
如本文所用，“抗体1”是指具有SEQ ID NO:5的HCDR1氨基酸序列，SEQ ID NO:6的HCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:7的HCDR3氨基酸序列，SEQ ID NO:8的LCDR1氨基酸序列，SEQID NO:9的LCDR2氨基酸序列，SEQ ID NO:10的LCDR3氨基酸序列，SEQ ID NO:3的HCVR氨基酸序列，SEQ ID NO:4的LCVR氨基酸序列，SEQ ID NO:1的HC氨基酸序列，SEQ ID NO:2的LC氨基酸序列，或由SEQ ID NO:11的HC DNA序列编码的，或由SEQ ID NO:12的LC DNA序列编码的抗体。使用与North等，J.Mol.Biol.2011:406:228-256的方法一致的注释规则注释本文所述序列的每种抗体中的框架和CDR序列，除非另有说明。
每个HC的羧基末端部分定义主要负责效应子功能的恒定区，并且在本发明的一些实施方案中，抗体在每个HC的恒定区中具有一个或多个降低效应子功能的修饰。优选地，本发明的实施方案是IgG4抗体，且因此含有IgG4 Fc区或衍生自人IgG4的Fc区，例如修饰的IgG4 Fc区。
根据一些实施方案，将降低效应子功能的两个HC的恒定区中的修饰和氨基酸取代引入IgG4铰链区和Fc区中。因此，一些实施方案在两个HC的恒定区中具有修饰，其包括在残基229和230(EU索引位置234-235)两者处的氨基酸丙氨酸(在抗体1的HC中例示，并且在SEQID NO:52中说明)，并且在两个HC的恒定区中具有促进稳定性的进一步修饰，包括在残基223(EU索引位置228)处的氨基酸脯氨酸(在抗体1的HC中例示，并且在SEQ ID NO:51中说明)。以及残基442(EU索引位置447)处氨基酸赖氨酸的缺失(SEQ ID NO:1的示例性HC)。
认为本发明的抗体具有优于现有技术的抗表皮调节素抗体的特别有利的性质的组合，包括但不限于以下性质中的一种或多种：1)高结合亲和力和期望的缔合和解离速率，2)中和人表皮调节素以实现疼痛减轻反应的效力和体内功效，3)作为治疗和/或预防疼痛病症的单一疗法的足够效力；4)持续的作用持续时间；5)充分限制的注射部位反应；6)可接受的低免疫原性(即，在人中充分无免疫原性)；7)减少不期望的皮疹反应，和/或8)期望的体内稳定性、物理和化学稳定性，包括但不限于热稳定性、溶解度、低的自缔合和药代动力学特征，其可用为开发和/或治疗疼痛障碍，例如慢性疼痛，包括伤害感受性疼痛、神经性疼痛和混合性疼痛，特别是用于治疗慢性骨关节炎疼痛或慢性糖尿病性周围神经病变疼痛或慢性腰背痛的用途所接受，。
本发明的实施方案通过提供抗人表皮调节素的抗体、其组合物和使用本文所述实施方案中提供的药理学上有利的抗人表皮调节素抗体通过表皮调节素中和用于治疗、下调或改善疼痛病症的方法，提供了相对于现有技术的显著进步。本发明的抗人表皮调节素抗体能够减轻疼痛症状，改善疼痛病理生理学，优选通过抑制疼痛反应，特别是在慢性疼痛病症和疼痛状态中。临床上使用此类抗体可导致所治疗的疼痛相关病症的延长缓解。
此外，还需要诊断性抗人表皮调节素抗体，其对人表皮调节素具有特异性，并且具有改善的结合亲和力，并且在人表皮调节素测定中表现出增强的灵敏度，以及改善的酶联免疫吸附测定(ELISA)测定条件，其导致最小的干扰和宽的稀释线性。根据本公开的一些方面，提供了结合由SEQ ID NO:21给出的人表皮调节素的抗人表皮调节素抗体，包括人表皮调节素中和抗体。“表皮调节素”或“人表皮调节素”是指人表皮调节素。如本文所用，表皮调节素是指成熟的表皮调节素肽。表皮调节素(也称为EREG，EPR)是属于肽激素的表皮生长因子(EGF)家族的46个氨基酸的蛋白质。表皮调节素作为162个氨基酸的跨膜表皮调节素前体产生，其被切割以释放具有以下序列的46个氨基酸的成熟肽：“VSITKCSSDMNGYCLHGQCIYLVDMSQNYCRCEVGYTGVRCEHFFL”(SEQ ID NO:21)(参见例如Toyoda等，Molecular cloning ofmouse epiregulin，a novel epidermal growth factor-related protein，expressed inthe early stage of development.FEBS Lett.1995；377：403-7)。如实施例2中所述和制备的人表皮调节素(SEQ ID NO:22)可以例如用于如本文所述的体外实验中。提及如本文所述的抗体结合和/或中和人表皮调节素的能力也涉及它们在体外实验中结合和中和人表皮调节素的能力。
如本文所用，“人抗表皮调节素抗体”或“抗人表皮调节素抗体”是指结合人表皮调节素的抗体，并且在体外或体内施用时，导致表皮调节素活性中和和/或阻断反应，如至少一种显著降低的活性。例如，如通过表皮调节素响应分子或细胞终点的变化所证明的表皮调节素信号传导的期望减少。如本文所用，术语“信号传导”和“信号转导”和“表皮调节素介导的”，当它们涉及表皮调节素时，是指由表皮调节素的活性引起的细胞的和/或细胞间应答。
本文所用的术语“抗体”是指结合抗原的免疫球蛋白分子。抗体的实施方案包括单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或缀合抗体。抗体可以是任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA)和任何亚类(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)。示例性抗体是由四条多肽链组成的免疫球蛋白G(IgG)型抗体：通过链间二硫键交联的两条重链(HC)和两条轻链(LC)。LC被分类为κ或λ，其各自的特征在于特定的恒定区。本发明的实施方案可以包含IgGl或IgG4抗体，并且还包含κ轻链或λ轻链。优选地，本发明的抗体包含为κ恒定区的轻链恒定区。
HC被分类为γ、μ、α、δ或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。四条多肽链中的每一条的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100-125个或更多个氨基酸的可变区。四条多肽链中的每一条的羧基末端部分含有主要负责效应子功能的恒定区。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区组成。重链的恒定区含有CH1、CH2和CH3结构域。CH1位于HCVR之后；CH1和HCVR形成抗原结合(Fab)片段的重链部分，其是结合抗原的抗体的部分。CH2位于铰链区之后且在CH3之前。CH3位于CH2之后并且在重链的羧基末端。轻链的恒定区含有一个结构域CL。CL位于LCVR之后；CL和LCVR形成Fab的轻链部分。
本发明的抗体包括IgG HC，其可以进一步分成例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4的亚类，并且本公开的实施方案可以在每个HC的恒定区中包括一个或多个修饰，例如增强或降低效应子功能。如本文所用的术语“Fc区”是指抗体的区域，其包含抗体重链的CH2和CH3结构域。任选地，Fc区可以包括抗体重链的铰链区的一部分或整个铰链区。已知IgGl诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，并且本文所述的Fc突变可减少聚集，降低或增强ADCC或CDC活性(或其他功能)，和/或改变抗体的药代动力学。本文所述的抗人EREG抗体的实施方案具有降低的与FcγR和Clq受体的结合，从而降低或消除可由具有野生型IgG Fc区的抗体诱导的细胞毒性。因此，根据一些实施方案，在Fc区中在如本文所述的位置处引入突变。通过充分降低或消除此类包含经修饰的Fc区的抗人EREG抗体的效应子功能，可以提高患者安全性，并且与本文所述的其他性质组合，提供具有改善的有用活性谱的治疗剂，同时避免不期望的活性。
在某些生物系统中表达时，抗体在Fc区中糖基化。通常，糖基化发生在抗体的Fc区中高度保守的N-糖基化位点处。N-聚糖通常与天冬酰胺连接。抗体也可以在其他位置糖基化。本公开的抗体是单克隆抗体。单克隆抗体是衍生自单个拷贝或克隆的抗体，包括例如任何真核、原核或噬菌体克隆，并且不通过生产其的方法来定义。单克隆抗体可以例如通过杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术、合成技术(例如CDR移植)或此类或本领域已知的其他技术的组合来产生。本公开考虑本发明的抗体是人或人源化抗体。在单克隆抗体的上下文中，术语“人”和“人源化的”是本领域普通技术人员熟知的(Weiner LJ，J.Immunother.2006；29：1-9；Mallbris L等，J.Clin.Aesthet.Dermatol.2016；9:13-15)。本公开的抗体的示例性实施方案还包括抗体片段或抗原结合片段，其包含保留与抗原特异性相互作用的能力的抗体的至少一部分，如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fd片段和线性抗体。
每个LC和HC的氨基末端部分包括约100-120个氨基酸的可变区，其主要负责通过其中包含的CDR进行抗原识别。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，与称为框架区(FR)的更保守的区域散布。CDR暴露在蛋白质的表面上，并且是抗体对抗原结合特异性的重要区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本文中，重链的三个CDR被称为“HCDR1、HCDR2和HCDR3”，并且轻链的三个CDR被称为“LCDR1、LCDR2和LCDR3”。CDR含有与抗原形成特异性相互作用的大多数残基。抗体结合特定抗原的功能能力在很大程度上受六个CDR的影响。氨基酸残基到CDR的分配可以根据众所周知的方案进行，包括Kabat(Kabat等，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1991)、Chothia(Chothia等，“Canonical structures for thehypervariable regions of immunoglobulins”，Journal of Molecular Biology，196，901-917(1987)；Al-Lazikani等，“Standard conformations for the canonicalstructures of immunoglobulins”，Journal of Molecular Biology，273，927-948(1997))、North(North等，“A new clustering of antibody CDR Loop Conformations”，Journal of Molecular Biology，406，228-256(2011))或IMGT(可在www.imgt.org上获得的国际免疫遗传学数据库；参见Lefranc等，Nucleic Acids Res.1999；27：209-212)。
为了本公开的目的，除非另有说明，否则North CDR定义用于本文所述的抗表皮调节素抗体，和将氨基酸分配给LCVR和HCVR区内的CDR结构域。下表2提供了使用SAbPred/ANARCI文库(Dunbar和Deane，“ANARCI:Antigen Receptor Numbering and ReceptorClassification”，Bioinformatics，32，298-300(2016))生成的分别基于North、Kabat、Chothia和/或IMGT惯例的抗体1和/或本公开的抗体的CDR序列。
表2：
本公开的抗体实施方案具有多种药理学上有用的和重要的活性的组合，并且在一个方面能够以高亲和力与人表皮调节素结合，并且对人表皮调节素具有高特异性，以及其他有用的性质。除非另有说明，否则本文所用的术语“结合(bind)”和“结合(binds)”旨在表示蛋白质或分子与另一种蛋白质或分子形成吸引相互作用的能力，其导致两种蛋白质或分子的接近，如通过本领域已知的常用方法所确定的。如本文所用，短语“特异性结合”是指抗表皮调节素抗体对人表皮调节素的亲和力，并且除非另有说明，否则旨在意指KD小于约2×10-9M，且优选小于约2×10-11M，且甚至更优选在约2×10-11M和约2×10-12M之间，如通过本领域已知的常规方法在约pH 7.4下测定的，包括使用如本文所述的MSD-SET(溶液平衡滴定)。短语“特异性结合”还表示与其他抗原，特别是EGFR配体TGFα相比，抗表皮调节素抗体对人表皮调节素的相对亲和力，其中对人表皮调节素的亲和力导致对人表皮调节素的特异性识别并且缺乏与所测试的其他EGFR配体的结合。
本公开的抗体实施方案可以从包含本公开的序列的构建体通过本领域已知的多种技术来表达和产生。如本文可互换使用的术语“核酸”或“多核苷酸”是指核苷酸的聚合物，包括单链和/或双链含核苷酸的分子，如DNA、cDNA和RNA分子，其掺入天然的、修饰的核苷酸和/或核苷酸的类似物。本公开的多核苷酸还可以包括例如通过DNA或RNA聚合酶或合成反应掺入其中的底物。本公开的DNA分子是包含编码多肽的非天然存在的多核苷酸序列的DNA分子，所述多肽具有本发明的抗体中的多肽中的至少一种的氨基酸序列(例如，重链、轻链、可变重链和可变轻链)。
编码HCVR或LCVR区的分离的DNA可通过将各自的编码HCVR或LCVR的DNA可操作地连接至编码重链或轻链恒定区的另一DNA分子以分别形成重链或轻链而转化为全长重链基因。人以及其他哺乳动物重链恒定区基因的序列是本领域已知的。可以例如通过标准PCR扩增获得涵盖这些区域的DNA片段。
本公开的多核苷酸可以在序列与表达控制序列可操作地连接后在宿主细胞中表达。表达载体通常可作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分在宿主生物体中复制。通常，表达载体将含有选择标记，例如四环素、新霉素和二氢叶酸还原酶，以允许检测用所需DNA序列转化的那些细胞。含有目标多核苷酸序列(例如，编码抗体的多肽和表达控制序列的多核苷酸)的载体可以通过熟知的方法转移到宿主细胞中，所述方法根据细胞宿主的类型而变化。
本公开的抗体可以容易地在哺乳动物细胞中产生，所述哺乳动物细胞的非限制性实例包括CHO、NS0、HEK293或COS细胞。使用本领域熟知的技术培养宿主细胞。抗体的哺乳动物表达通常导致糖基化。抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的糖基化是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。O-连接的糖基化是指糖(例如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖)与羟基氨基酸的连接。通常，糖基化发生在抗体的Fc区中高度保守的N-糖基化位点处(例如，IgGl中的位置297，根据IMGT或EU索引编号)。可以修饰糖基化位点以改变糖基化(例如，阻断或减少糖基化或改变氨基酸序列以产生另外的或不同的糖基化)。
来自IgG亚类的抗体的哺乳动物表达可导致来自一条或两条重链的C-末端氨基酸的剪切；例如，对于IgGl抗体，可以除去一个或两个C-末端氨基酸。对于IgGl抗体，如果存在C-末端赖氨酸，则其可以在表达期间从重链截短或剪切。另外，倒数第二个甘氨酸也可以从重链截短或剪切。
抗体的哺乳动物表达也可导致N-末端氨基酸的修饰。例如，当重链或轻链的N-末端大部分氨基酸是谷氨酰胺时，可以将其修饰成焦谷氨酸。
本公开的抗体或包含其的药物组合物可以通过肠胃外途径施用，其非限制性实例是皮下施用和静脉内施用。本公开的抗体可以单剂量或多剂量与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起施用于患者。本公开的药物组合物可以通过本领域熟知的方法制备(例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第22版(2012)，A.Loyd等，Pharmaceutical Press)，并且包含如本文所公开的抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本公开的抗体实施方案的用途：
根据一些实施方案，本公开的抗表皮调节素抗体可用于治疗疼痛疾病。如本文所用，术语“一种疼痛疾病”或“多种疼痛疾病”是指由过度和/或慢性疼痛病症引起的不期望的病症，其中表皮调节素抑制导致更稳态和更少病理性疼痛状态。示例性预期通过本文所述的本公开的抗体治疗的疼痛病症包括慢性疼痛，包括伤害感受性疼痛、神经性疼痛和混合性疼痛，并且特别是骨关节炎疼痛，或糖尿病性周围神经病变疼痛，或腰背痛和化疗诱发的周围神经病变的治疗，特别是在慢性疼痛状态下。
根据本发明的其它实施方案，抗表皮调节素抗体可用于表皮调节素介导的疼痛疾病的诊断应用中。在一些实施方案中，疼痛病症是骨关节炎(OA)疼痛或糖尿病性周围神经病变疼痛(DPNP)或慢性腰背痛(CLBP)中的至少一种。在一些更具体的实施方案中，疼痛病症是骨关节炎(OA)。
本公开还提供了包含本公开的抗表皮调节素抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。此外，本公开提供了一种治疗疼痛病症的方法，所述疼痛病症如骨关节炎疼痛或糖尿病性周围神经病变疼痛或慢性腰背痛，所述方法包括向有需要的患者施用本公开的药物组合物。
另外，本公开提供了一种治疗表皮调节素介导的疾病的方法。更具体地，本发明提供了一种治疗慢性疼痛病症的方法，所述慢性疼痛病症如骨关节炎疼痛，或糖尿病性周围神经病变疼痛，或慢性腰背痛，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的本公开的抗表皮调节素抗体。
本公开还提供了本公开的抗表皮调节素抗体用于治疗。更具体地，本公开提供了本公开的抗表皮调节素抗体用于慢性疼痛疾病，如骨关节炎疼痛，或糖尿病性周围神经病变疼痛，或慢性腰背痛的治疗。
在某些实施方案中，本公开提供了本公开的抗表皮调节素抗体或其组合物在制备用于治疗一种或多种慢性疼痛疾病的药物中的用途，所述慢性疼痛疾病如骨关节炎疼痛，或糖尿病性周围神经病变疼痛，或慢性腰背痛。
本公开的抗体可用于鉴定其中表皮调节素可能促进了疾病的病因发生的慢性疼痛疾病。在进一步的实施方案中，本公开提供了治疗患者的慢性疼痛疾病的方法。这些方法包括以下步骤：使患者样品与抗表皮调节素抗体接触，并检测患者样品中的人表皮调节素与抗体之间的结合；并在检测到患者样品中表皮调节素的存在高于未患病个体中观察到的参考值时，将患者诊断为患有表皮调节素介导的疾病；处于表皮调节素介导的疾病风险；需要治疗表皮调节素介导的疾病；和/或处于与表皮调节素介导的疾病相关的症状的风险。根据本文提供的治疗方法的一些更具体的实施方案，这样的方法还包括确定参考值的步骤，包括以下进一步的步骤：使对照标准品与第一抗体接触，所述第一抗体结合与用于接触患者样品的相同的表皮调节素的第一表位区；将对照标准品与具有可检测标记的第二抗体接触，所述第二抗体结合与用于接触患者样品的表调节蛋白的第二表位区相同的表调节蛋白的第二表位区；以及检测由可检测信号提供的信号。在一些具体实施方案中，所述抗表皮调节素抗体包含表1中提供的LC和HC CDR的组合。在另外的实施方案中，第二抗体包含表1中提供的LCVR和HCVR的组合。在某些实施方案中，慢性疼痛疾病是骨关节炎疼痛或糖尿病性周围神经病变疼痛或慢性腰背痛中的一种。在一些实施方案中，患者样品是CSF、血液、血清、组织裂解物或血浆之一。根据一些实施方案，该方法还包括以下步骤：使患者样品与结合表皮调节素的第二表位区并具有可检测标记的第二抗表皮调节素抗体接触，并检测由可检测信号提供的信号。在另外的实施方案中，第二抗体包含表1中提供的LC和HC CDR的组合。在另外的实施方案中，第二抗体包含表1中提供的LCVR和HCVR的组合。根据某些实施方案，第一和第二抗表皮调节素抗体不分到同一箱。
根据一些实施方案，本公开提供了一种检测患者样品中的表皮调节素的方法，其包括以下步骤：使患者样品与结合表皮调节素的第一表位区的第一抗体接触；使患者样品与结合表皮调节素的第二表位区并具有可检测标记的第二抗体接触；以及检测由可检测标记提供的信号。在一些实施方案中，患者样品是血液、血清、组织裂解物或血浆之一。根据一些更具体的实施方式，表皮调节素的第一表位区与表皮调节素的第二表位区部分重叠。此外，在一些实施方案中，与第一和第二抗体接触的所述步骤同时发生。在一些具体实施方案中，第一抗体包含表1中提供的LC和HC CDR的组合。在另外的实施方案中，第一抗体包含表1中提供的LCVR和HCVR的组合。
根据本发明的一些实施方案，提供了一种定量患者样品中表皮调节素的方法。这种方法包括以下步骤：使患者样品与结合表皮调节素的第一表位区的第一抗体接触；使患者样品与第二抗体接触，所述第二抗体结合表皮调节素的第二表位区并且具有可检测标记；以及检测由所述可检测标记提供的信号；将对照标准品与第一抗体接触，所述第一抗体结合表皮调节素(如用于接触患者样品的)的相同的第一表位区；将对照标准品与第二抗体接触，所述第二抗体结合表皮调节素(如用于接触患者样品的)的相同的第二表位区并具有可检测标记；以及检测由所述可检测信号提供的信号。在一些实施方案中，患者样品是血液、血清或血浆或组织裂解物之一。根据一些更具体的实施方案，表皮调节素的第一表位区与表皮调节素的第二表位区部分重叠。此外，在一些实施方案中，与第一和第二抗体接触的所述步骤同时发生。在一些具体实施方案中，第一抗体包含表1中提供的LC和HC CDR的组合。在另外的实施方案中，第一抗体包含表1中提供的LCVR和HCVR的组合。在一些具体实施方案中，第二抗体包含表1中提供的LC和HC CDR的组合。在另外的实施方案中，第二抗体包含表1中提供的LCVR和HCVR的组合。
根据一些实施方案，提供了一种诊断表皮调节素介导的疾病或病症的方法。这种方法包括使患者样品与抗表皮调节素抗体接触并检测患者样品中的表皮调节素与抗体之间的结合的步骤。根据一些具体实施方案，诊断方法包括当检测到患者样品中表皮调节素的存在高于参考值时，将患者诊断为患有表皮调节素介导的疾病；处于表皮调节素介导的疾病风险；需要治疗表皮调节素介导的疾病；和/或处于与表皮调节素介导的疾病相关的症状的风险。根据一些更具体的实施方案，此类方法还包括确定参考值的步骤，包括以下步骤：使对照标准品与第一抗体接触，所述第一抗体结合与用于接触患者样品的表皮调节素的第一表位区相同的表皮调节素的第一表位区；将对照标准品与具有可检测标记的第二抗体接触，所述第二抗体结合与用于接触患者样品的表调节蛋白的第二表位区相同的表调节蛋白的第二表位区；以及检测由可检测信号提供的信号。在一些实施方案中，第一抗体包含表1中提供的LC和HC CDR的组合。在另外的实施方案中，抗体包含表1中提供的LCVR和HCVR的组合。本文提供的诊断表皮调节素介导的疾病的方法的一些实施方案还包括以下步骤：使患者样品与结合表皮调节素的第二表位区并具有可检测标记的第二抗表皮调节素抗体接触；以及检测由可检测标记提供的信号。在一些具体实施方案中，抗表皮调节素抗体包含表1中提供的LC和HC CDR的组合。在另外的实施方案中，抗体包含表1中提供的LCVR和HCVR的组合。根据特定的实施方式，表皮调节素的第一表位区与表皮调节素的第二表位区部分重叠。根据某些实施方案，第一和第二抗体不分在同一箱。根据进一步的实施方案，参考值由健康志愿者血浆、体液或组织裂解物建立，和/或由本领域技术人员针对适当的参考组和样品来源确定。在进一步的实施方案中，疼痛病症是骨关节炎疼痛或糖尿病性周围神经病变疼痛或慢性腰背痛中的一种。
在本公开的一个实施方案中，提供了测定体液样品中人表皮调节素水平的方法，包括：(a)使体液样品与特异性结合人表皮调节素的抗人表皮调节素诊断性单克隆抗体或其抗原结合片段接触，所述人表皮调节素包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10的轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:5、SEQID NO:6和SEQ ID NO:7的重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3；(b)任选地，去除任何非特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段；和(c)检测和/或定量与人表皮调节素特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的量。优选地，其中所述体液样品是血液、血清或血浆样品，或脑脊液样品，并且所述接触离体发生。
在本公开的实施方案中，患者是已被诊断为具有医学风险、病症或障碍(例如本文所述的疾病或障碍之一)而需要用本文所述的抗体治疗的人。在可通过本发明的方法治疗的病症通过已建立和接受的分类已知的那些情况下，如骨关节炎疼痛，或糖尿病性周围神经病变疼痛，或慢性腰背痛，它们的分类可在各种公知的医学教科书中找到。例如，Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders(DSM-5)的第5版或类似文本提供了用于鉴定本文所述的某些障碍的诊断工具(还参见例如Scholz等，The IASPclassification of chronic pain for ICD-11:chronic neuropathic pain.Pain.2019年1月；160(1):53-59和Treede等，Chronic pain as a symptom or a disease:the IASPClassification of Chronic Pain for the International Classification ofDiseases(ICD-11),PAIN:2019年1月，160:19-27)。此外，International Classificationof Diseases，第十修订版(ICD-10)提供了本文所述的某些病症的分类。本领域技术人员将认识到，对于本文所述的疾病和病症存在替代的命名法、疾病分类学和分类系统，包括如DSM-5和ICD-10或ICD-11中所述的那些，并且术语和分类系统随着医学科学进步而演变。
术语“治疗(treating)”或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”意指其中可以减缓、中断、阻止、控制、减轻、停止、减少或逆转本文所述的现有症状、障碍、病症或疾病的进展或严重程度的所有过程，但不一定表示所有障碍或疾病症状的完全消除。治疗包括施用蛋白质或核酸或载体或组合物以治疗患者，特别是人的疾病、病症或病况。治疗包括施用本公开的抗体用于治疗将受益于表皮调节素活性降低的人的疾病或病症，并且包括其中所述治疗提供：(a)抑制疾病的进一步进展，即阻止其发展；(b)缓解疾病，即引起疾病或病症消退或减轻其症状或并发症；和/或(c)预防疾病或症状的发作。如本文所定义的，治疗明确地包括降低疼痛的发生率、改善疼痛或疼痛的一种或多种症状、减轻疼痛或疼痛的一种或多种症状、延迟疼痛的发展。在一些情况下，治疗还包括治疗疼痛，但不一定改变引起疼痛的潜在疾病或病症。如本文所用，“治疗抗性疼痛”定义为对两种或更多种先前单一疗法和/或双重疗法治疗方案难治的疼痛。
本文所用的疼痛的“降低发生率”意指减少疼痛的持续时间和/或频率中的任一种(包括例如延迟或增加个体中疼痛症状的时间)。如本领域技术人员所理解的，个体可以根据其对治疗的反应而变化。疼痛的治疗还包括降低疼痛的严重程度以及减少对通常用于该病症的其他药物和/或疗法(包括例如阿片制剂)的需要和/或量(例如，暴露于其他药物和/或疗法)。“改善”疼痛或疼痛的一种或多种症状(例如骨关节炎疼痛)意指与不施用本公开的抗体或组合物相比，减轻或改善疼痛的一种或多种症状。“改善”还包括缩短或减少症状的持续时间。“缓和”疼痛或疼痛的一种或多种症状(如骨关节炎疼痛)意指减轻用根据本公开的抗体或组合物治疗的个体或个体群体中疼痛的一种或多种不期望的临床表现的程度。如本文所用，“延迟”疼痛的发展意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定和/或推迟疼痛(如骨关节炎疼痛)的进展。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。对于本领域技术人员显而易见的是，足够或显著的延迟实际上可以包括预防，因为个体不发生疼痛。“延迟”症状发展的方法可以是与不使用该方法相比，在给定时间范围内降低发生症状的概率和/或在给定时间范围内降低症状程度的方法。这种比较通常基于使用统计学上显著数量的受试者的临床研究。
“有效量”是指本公开的抗人表皮调节素抗体或包含这种抗体的药物组合物的量，其将引起治疗健康专业人员所寻求的对组织、系统或人的生物学或医学反应或期望的治疗效果。如本文所用，术语患者的“有效反应”或患者对治疗的反应性是指在施用本公开的抗体后赋予患者的临床或治疗益处。抗体的有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。这种期望的反应包括以下任何一种或多种：慢性疼痛水平降低；或改善疼痛障碍的体征或症状。本领域技术人员可以使用已知技术并通过观察在类似情况下获得的结果容易地确定有效量。本公开的抗人表皮调节素抗体的有效量可以以单剂量或多剂量施用。此外，本发明的抗体的有效量可以以多个剂量的量施用，所述多个剂量的量将小于如果不超过一次施用的有效量。在确定患者的有效量时，主治医师要考虑许多因素，包括但不限于：患者的体型(例如体重或质量)、体表面积、年龄和一般健康状况；所涉及的特定疾病或病症；疾病或病症的程度或涉及或严重程度；个体患者的反应；所施用的具体化合物；给药方式；施用的制剂的生物利用度特征；所选择的剂量方案；使用伴随药物；以及医疗从业者已知的其他相关情况。剂量(包括但不限于皮下、肌内和/或静脉内)可以是约0.5mg/kg至约50mg/kg。然而，还设想了低于或高于本文提及的剂量的剂量，特别是考虑到本领域技术人员已知的和/或本文所述的剂量考虑。可以通过定期评估监测正在治疗的患者的进展，并且如果需要，相应地调整剂量。
本文公开的方法的潜在优点是在患有慢性疼痛障碍的患者中产生显著的和/或延长的缓解的可能性，或者具有可接受的安全性特征，包括可接受的耐受性、毒性和/或不良事件，包括抗药物抗体应答，使得患者整体受益于治疗方法。更具体地，本公开的抗体将提供有效的治疗，同时避免临床上不期望的不良事件，例如皮疹(Li T，Perez-Soler R.Skintoxicities associated with epidermal growth factor receptor inhibitors.TargetOncol.2009年4月；4(2)：107-19)和或抗药物抗体反应。本公开的治疗的功效可以通过通常用于评估各种疼痛障碍的治疗的各种终点来测量。可以任选地采用确定本公开的任何特定疗法的功效的其他方法，包括例如本领域技术人员已知的评估。
附图简述
图1.显示了抗体1(图A)和LY 3016859(图B)的配体选择性ELISA结果，并证明了抗体1对人表皮调节素的选择性，但如实施例2中所述的配体特异性ELISA所测定的，与其它EGF家族配体(表观因子、双调蛋白、β细胞调节素、EGF、HB-EGF和TGFα(TGFα))没有明显的结合。相比之下，LY 3016859与表皮调节素和TGFα都结合。
图2.与对照hIgG抗体(实心正方形)相比，施用抗体1(实心圆)3天后体内膜表皮调节素的结合。
图3.与对照hIgG抗体(空心正方形)相比，10mg/kg皮下剂量的抗体1(实心正方形)后体内膜表皮调节素的预处理时间依赖性结合。
图4.与效力低>50倍的结合表皮调节素的比较抗体(空心圆)相比，施用抗体1(实心正方形)3天后体内膜表皮调节素的结合。
图5.抗体1Fab与表皮调节素的指定突变的结合的ELISA评估。
图6.抗体1的人EGFR配体表位(EGF样结构域)比对。配体序列在氨基酸和核苷酸序列列表中提供。
实施例
提供以下实施例以说明而不是限制所要求保护的本发明。以下测定的结果表明，本公开的示例性单克隆抗体和/或其抗原结合片段结合和/或中和人表皮调节素，且因此可用于治疗本文所述的表皮调节素介导的病症。
实施例1：抗体产生、表达和纯化
通过用重组EREG(人和食蟹猴)免疫人源化小鼠以鉴定可有效中和表皮调节素信号传导的抗体，从而获得一组人抗表皮调节素抗体。将突变系统地引入每种抗体的各个互补决定区(CDR)中，并对所得文库进行多轮选择，使用递减浓度的抗原，减少与抗原缔合的时间，和/或增加解离时间段，以分离具有改善亲和力的克隆。确定各个变体的序列并用于构建组合文库，所述组合文库经受具有增加的严格性的另外一轮选择，以鉴定各个CDR区之间的累加或协同突变配对。对单个组合克隆进行测序，并确定结合特征。该筛选可以针对人或小鼠表皮调节素进行，以增加针对一种或多种所选物种的亲和力(例如针对人表皮调节素的抗体1)。可以针对其他EGFR配体进行反筛选以在工程化后维持选择性。也可以诱变选择的抗体以固定翻译后修饰，如甲硫氨酸氧化，同时保留对表皮调节素的结合亲和力。另外，可以对抗体进行框架(FW)和CDR取代以将这些序列恢复到其种系状态，以降低潜在的免疫原性风险。
获得本文称为抗体1的工程化和/或优化的抗表皮调节素抗体，其具有重链和轻链可变区的氨基酸序列，完整的重链和轻链氨基酸序列，以及编码它们的核苷酸序列，如下文标题为“氨基酸和核苷酸序列列表”的部分所列的。对应于这些序列的SEQ ID NO以及轻链和重链CDR氨基酸序列显示于表1中。
表达和纯化：
本公开的示例性抗-表皮调节素抗体可以基本上如下表达和纯化。抗体1在适当的宿主细胞(如HEK293或CHO)中表达，所述宿主细胞使用最佳预定HC:LC载体比率或编码HC和LC两者的单一载体系统用用于分泌抗体1的表达系统瞬时或稳定转染。表达质粒含有抗体1的LC和HC基因的cDNA版本(例如，表1中所示的编码示例性抗体1的HC的SEQ ID NO:11的DNA序列，和编码根据表1的LC氨基酸序列的DNA序列，例如，表1中所示的编码示例性抗体1的LC的SEQ ID NO:12的DNA序列)；并且由用于此目的的常用且合适的构建体表达，如基于人巨细胞病毒主要立即早期启动子的构建体。
可以通过常规技术纯化其中分泌了本发明抗体的培养基，如离子交换和疏水相互作用层析的混合模式方法。例如，可以使用常规方法将培养基施加到蛋白A或G柱并从蛋白A或G柱洗脱；也可以使用离子交换和疏水相互作用层析的混合模式方法。可溶性聚集体和多聚体可以通过常规技术有效地去除，包括尺寸排阻、疏水相互作用、离子交换或羟基磷灰石色谱。产物可以立即冷冻，例如在-70℃，冷藏，或可以冻干。可以采用各种蛋白质纯化方法，并且此类方法是本领域已知的并且描述于例如Deutscher，Methods in Enzymology 182：83-89(1990)和Scopes，Protein Purification:Principles and Practice，第3版，Springer，NY(1994)中。抗体1可立即在-70℃下冷冻或在2-8℃下储存数月，或可冻干，或在4℃下保存以供立即使用。本发明的示例性人抗体的氨基酸SEQ ID NO示于表1中。
实施例2：抗表皮调节素抗体的表征
将表皮调节素试剂制备为融合蛋白，切割并纯化。切割的表皮调节素是成熟的可溶形式，其相对于天然形式包括额外的氨基酸，并且用于体外结合和中和测定(SEQ ID NO:22-25)。人表皮调节素(EREG)融合体(SEQ ID NO:27)也用于结合测定(捕获试剂)，并且全长表皮调节素序列(SEQ ID NO:26)用于基于细胞的结合和效应子功能测定，其具有单个突变以减少脱落。
在瞬时转染的CHO细胞培养物中，成熟的可溶性表皮调节素在单体人IgG4 Fc(F405Q/Y407E)(SEQ ID NO:27)上表达为HRV3C蛋白酶可切割的C末端融合体。用蛋白A亲和柱捕获融合蛋白，并通过尺寸排阻色谱进一步纯化。用HRV3C蛋白酶切割融合体，流过蛋白A亲和柱以除去单体Fc，并通过尺寸排阻色谱进一步纯化以产生成熟的可溶性表皮调节素。
抗原序列：
切割的人表皮调节素(SEQ ID NO:22)
切割的食蟹猴表皮调节素(SEQ ID NO:23)
切割的大鼠表皮调节素(SEQ ID NO:24)
切割的兔表皮调节素(SEQ ID NO:25)
全长人表皮调节素(与T111P突变结合的膜)(SEQ ID NO:26)
单体Fc人表皮调节素(SEQ ID NO:27)
来自各种物种的成熟表皮调节素的序列通常是本领域已知的，并且参考序列例如如下：成熟的可溶性人表皮调节素参考序列(NP_001423.163-108)、成熟的可溶性食蟹猴(在本文中也称为cyno)表皮调节素参考序列(XP_005555120.1 63-108)、成熟的可溶性大鼠表皮调节素参考序列(NP_067721.1 56-101)和成熟的可溶性兔表皮调节素参考序列(XP_008265968.157-102)。其它人EGFR配体参考序列号是：人TGFα(NP_003227.1)、EREG(NP_001423.1)、EPGN(NP_001257918.1)、AREG(NP_001648.1)、BTC(NP_001720.1)、EGF(NP_001954.2)、HB-EGF(NP_001936.1)。
对人表皮调节素的结合亲和力
抗体1对人(SEQ ID NO:22)、食蟹猴(SEQ ID NO:23)、大鼠(SEQ ID NO:24)和兔(SEQ ID NO:25)表皮调节素的溶液相平衡结合亲和力通过MSD溶液平衡滴定(MSD-SET)测定在37℃下测量。(参见例如Darling RJ，Brault P-A(2005)Kinetic Exclusion AssayTechnology：Characterization of Molecular Interactions.Assay and DrugDevelopment Technologies 2.647 657)
使用MSD SI6000仪器(Meso Scale Discovery，Rockville，MD)读取MSD板。MSD测定板如下制备。将多阵列96孔板(Meso Scale Discovery，P/N L15XA-3)在2-8℃下用30μl的1μg/ml单体Fc-人表皮调节素融合体的PBS溶液包被过夜。在包被后将板在PBST中洗涤3次，然后在室温下在3％ Blocker A(用PBS从5％ Blocker A稀释，Meso Scale Discovery，P/N R93AA-1)中振荡封闭1小时。
在pH 6.0和pH 7.4的1％ Blocker A中制备SET样品。将抗体稀释至20和200pM(pH7.4)或200pM和2nM(pH 6.0)。将表皮调节素连续稀释，
将其稀释总共12次，以抗体浓度的2倍为中心。这通过使用10和100nM(pH 7.4)或100nM和1000nM(pH 6.0)的起始浓度来实现，然后将其10x稀释一次，2x连续稀释9次，然后10x稀释用于最终稀释。将表皮调节素滴定液和固定浓度抗体溶液1:1组合以制备SET溶液。将SET溶液在37℃下孵育约96小时以使结合达到平衡。将100μl的SET溶液以一式两份的行转移到制备的MSD板中，并在室温下孵育10分钟以捕获游离抗体。孵育后，将板用PBST洗涤3次，然后向所有孔中加入100μl的1％ Blocker A中的1μg/ml生物素化的山羊抗人κ一抗(Southern Biotech，目录号2060-08)。将其在平板振荡器上在室温下温育60分钟。然后将板用PBST洗涤3次，然后向所有孔中加入100μl的1％Blocker A中的1μg/ml磺基链霉亲和素(Meso Scale Discovery，P/N R32AD-1)。将其在平板振荡器上在室温下温育30分钟。然后将板用PBST洗涤3次，然后加入100μl的1X读取缓冲液T(用水从4X读取缓冲液T稀释，MesoScale Discovery，P/N R93AA-1)，然后读取板。解离常数(KD)和用于解释未知活性抗原分数的最小公倍数(LCM)配体校正因子使用非线性回归从MSD-SET数据全局拟合至平衡结合方程。这是在给定pH下对每对固定抗体浓度进行的。
在pH 7.4下，抗体1以14.9pM的亲和力(KD)与人表皮调节素结合，以26.8pM的KD与食蟹猴表皮调节素结合，以30.2pM的KD与大鼠表皮调节素结合，以24.0pM的KD与兔表皮调节素结合。在pH 6.0下，抗体1以195pM的KD与人表皮调节素结合，以328pM的KD与食蟹猴表皮调节素结合，以286pM的KD与大鼠表皮调节素结合，并且以330pM的KD与兔表皮调节素结合。抗体1的pH选择性(pH 6.0KD/pH 7.4kD)对于人表皮调节素为13.0，对于食蟹猴表皮调节素为12.2，对于大鼠表皮调节素为9.5，并且对于兔表皮调节素为13.7。pH依赖性抗原结合可以提供药代动力学和靶标中和持续时间的改善(参见Vincent，K.J.和M.Zurini(2012).“Current strategies in antibody engineering：Fc engineering and pH-dependentantigen binding，bispecific antibodies and antibody drug conjugates.”Biotechnol J7(12):1444-1450)，并且本公开的抗体1和/或抗体对表皮调节素结合表现出有利的pH选择性，认为其提供有用的药代动力学和表皮调节素中和性质。
表3：在37℃、pH 7.4和6.0下，通过MSD-SET测量的抗体1与表皮调节素的体外结合亲和力。KD值是3次独立重复的平均值±标准偏差。
结果报告为来自3个独立重复的KD的平均值。误差估计值计算为独立重复的标准偏差。在pH 7.4下抗体1对人EREG的亲和力表示相对于LY3016859亲和力提高约70倍，这可能导致在体内实现等同的EREG中和所需的抗体1的剂量显著更低。使用较低剂量的抗体1的能力意味着可以用较少的抗体实现必需的抑制，因此与需要静脉内给药的抗体相比，药物产品可以适合于皮下施用，这对于可及性、耐受性、依从性是临床上重要的。这在诸如本文所述的慢性疼痛适应症所需的慢性给药的背景下是特别有利的。
抗体1的配体特异性：
抗体与EGF家族配体结合的特异性可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和/或本领域技术人员熟知的其它常用方法来检测。
ELISA试剂制备可以如下进行。测试的配体是人上皮细胞有丝分裂蛋白(R&D6629-EP-025/CF)、表皮调节素(如本文实施例2中所述和/或通过本领域已知的方法制备和纯化的(SEQ ID NO:22))、双调蛋白(R&D 262-AR-100/CF)、β细胞调节素(R&D261-CE-010/CF)、EGF(R&D 236-EG-200)、HB-EGF(R&D 259-HE-050/CF)和TGFα(R&D239-A-100)。使用ThermoPierce Sulfo-NHS-LC-生物素(A39257)将配体用10倍过量的生物素在冰上生物素化2小时，然后以小等分试样在-80℃下冷冻以供单独使用。
ELISA测定可以如下进行。将Greiner 96孔高结合板(650061)在4℃下用50μL/孔中性抗生物素蛋白(Thermo-Pierce 31000)在PBS中以1μg/mL包被过夜。第二天除去包被溶液，加入100μl/孔Pierce Blocker酪蛋白(37528)并在室温下孵育30分钟或更长时间以封闭板。封闭后，将板用PBS加0.05％吐温20洗涤3次以除去残留的封闭缓冲液。将生物素化的配体在单独的PCR板(Eppendorf 951020443)中在Pierce酪蛋白阻断剂中以20nM的恒定浓度在12个孔中每种配体稀释，最后一行中有无抗原对照。将配体转移至封闭的测定板并在室温下孵育1小时。将测定板用PBS加0.05％Tween20洗涤3次。将待测试的抗体在Pierce酪蛋白封闭剂中以5μg/mL(LY3016859)或10μg/mL(抗体1)开始以1:3稀释度在板(12个孔)上连续稀释，最终体积为50μL/孔，并在室温下孵育1小时。将测定板用PBS加0.05％Tween20洗涤3次。抗人κ-AP二抗(Southern Biotech 2060-04)在PBS加0.05％Tween20中以1:2000稀释，以50μL/孔添加，并在室温下孵育1小时。将测定板用PBS加0.05％Tween20洗涤3次。最后，加入50μL pNPP底物(Sigma-Aldrich N2765)并使其显色直至存在足够的颜色，并在Molecular Devices的SpectraMax Plus 384板读数器上在405nm处读数。
图1示出了抗体1的配体选择性ELISA结果。如在上述配体特异性ELISA中所测定的，抗体1表现出结合人表皮调节素的选择性，但与其他EGF家族配体上皮细胞有丝分裂蛋白、双调蛋白、β细胞调节素、EGF、HB-EGF和TGFα没有明显结合。与表皮调节素而不是其他EGF家族配体的选择性和特异性结合表明抗体1可以实现期望的阻断表皮调节素信号传导的效果，同时避免临床上不期望的与其他EGF家族配体(例如TGFα等)结合的效果。缺乏与TGFα的结合可以减少为有效抑制表皮调节素所需的剂量。这种选择性可以避免不期望的临床不良事件，如对于泛EGFR抑制剂已经观察到的皮疹。
物理化学属性：
关于治疗性抗体产品属性，包括化学稳定性、溶解性和粘度，抗体1表现出用作人治疗剂的物理化学属性的理想组合。
稳定性：
在5mM组氨酸，pH 6.0加280mM甘露醇加0.05％(w/v)聚山梨醇酯-80中配制的高浓度(大约100mg/mL)下评估抗体1的稳定性。将浓缩的样品在5℃和35℃下孵育4周。孵育后，用尺寸排阻色谱(SEC)分析样品的高分子量百分比(％HMW)，通过毛细管电泳(CE-SDS)分析片段化，并通过LC-MS肽作图分析化学修饰(例如脱酰胺、异构化或氧化)。在35℃下4周后，抗体1表现出0.4％的Δ％HMW(高分子量百分比的变化)，0.6％的Δ％片段(片段百分比的变化)，并且没有大于0.5％的CDR化学修饰。
在相同制剂条件下的光稳定性通过在25℃下40瓦特小时/m2 UV光和240klux小时可见光的组合总暴露来评估。孵育后，通过SEC分析样品的％HMW，并通过LC-MS肽作图分析样品的化学修饰。相对于未暴露的对照，抗体1表现出通过SEC测量的6.1％的Δ％HMW并且没有大于0.7％的CDR化学修饰。
在相同制剂条件下的冷冻/解冻稳定性是使用3次重复的缓慢、受控温度循环来评价的，该循环模拟了置于-70℃下的大量原料药物的冷冻/解冻条件。在3个冻融循环后，抗体1表现出通过SEC测量的1.0％的Δ％HMW。
这些结果表明抗体1具有有利的物理和化学稳定性，足以促进溶液制剂的开发和用作治疗剂。
溶解度：
通过用30kDa分子量截留离心过滤器(例如Amicon U.C.过滤器，Millipore，目录号UFC 903024)将100mg抗体1浓缩至约0.5ml的体积来评估溶解度。使用Solo VPE分光光度计(C Technologies，Inc)通过280nm处的UV吸光度测量样品的最终浓度。
抗体1显示处在5mM组氨酸pH 6缓冲液中大于或等于175mg/mL的溶解度和在PBSpH7.4中大于或等于168mg/mL的溶解度。在5℃或-5℃下储存1周后没有观察到相分离或低温沉淀。这些结果表明抗体1表现出足够的溶解度以实现高浓度给药。
粘度：
使用VROC Initium(Rheosense)，在大约125mg/ml浓度下，在15℃下分析抗体1和LY 3016859的粘度。抗体1在pH 6的5mM组氨酸加280mM甘露糖醇中在133mg/ml下表现出6.4cP的粘度，并且LY3016859在pH 6的5mM组氨酸加280mM甘露糖醇中在132mg/mL下表现出12.2cP的粘度。这些结果表明抗体1表现出相对于LY3016859降低的粘度，以及足够低的粘度以实现高浓度给药。使用较高浓度的抗体1的能力与对较低剂量的需要相结合意味着可以以较小的递送体积实现必要的有效剂量，并且这意味着药物产品可以适合于皮下施用，与必须是需要静脉内给药的抗体的药剂相比，这对于可及性、耐受性、依从性是临床上重要的。
实施例3：抗人表皮调节素抗体的体外功能表征
表皮调节素的体外中和：
本公开的抗体(如抗体1)对表皮调节素活性的中和可以通过如下所述的一种或多种表皮调节素诱导的基于细胞的应答测定来评估。
在两个独立的功能测定中测试本公开的抗体中和表皮调节素活性的能力。本公开的抗体1对表皮调节素活性的中和可以通过利用如下所述的EGFR受体家族的下游信号传导途径的一种或多种基于细胞的活性测定来评估。在SigmaPlot或GraphPad Prism中计算中和测定(C166-AP1-Luc和TGW-pERK)的平均半最大抑制浓度(IC50)的确定。在GraphPadPrism中，通过运行Log10转化的抗体浓度的非线性回归分析来计算IC50。对于在1个板上仅以一式两份或一式三份运行的测定，通过计算每个重复的IC50和来自重复的平均IC50的SD来确定IC50和标准偏差(SD)。为了一式两份或一式三份分析不同板上的化合物，计算每个板的IC50并测定板间的SD。
在C166-AP1-荧光素酶功能测定中抑制表皮调节素诱导的反应：
本公开的抗体中和人表皮调节素诱导的荧光素酶报道基因活性的能力可以在过表达由API激活驱动的荧光素酶报告基因的C166细胞(C166-AP1-Luc)中评估。C166细胞是内皮衍生的细胞系，其表达所有4个EGFR受体家族，EGFR表达水平最高。为了测试抗体1活性，使C166-AP1-Luc细胞在生长培养基[DMEM(Gibco 12430-047)、10％FBS(Gibco10082147)、抗/抗(Gibco 15240062)和2μg/ml Puro(1000x 2mg/ml嘌呤霉素二盐酸盐(Calbiochem，目录号540411)]中生长，并在0.05％胰蛋白酶-PBS中解离，并在无血清培养基(不含FBS的生长培养基)中以50,000个细胞/1ml在组织培养物处理的96孔板中以50μl/孔铺板。用50μl 100ng/ml(16-18.5nM)最终浓度的表皮调节素(人(SEQ ID NO:22)、食蟹猴(SEQ ID NO:23)、大鼠(SEQ ID NO:24)和兔(SEQ ID NO:25)，如上文所述)和抗体1的浓度系列稀释液处理细胞6h。孵育后，将细胞用100μl PromegaTMOne-GloTM荧光素酶溶液(PromegaTM公司，目录号E6120)裂解3分钟。在Perkin Elmer Wallace 1420Victor 2TM酶标仪上读取发光。以下表4中所示的相对荧光单位(RFU)的减少反映了抗体1中和所测试的各种相关物种(包括人(SEQ ID NO:22)、食蟹猴(SEQ ID NO:23)、大鼠(SEQ ID NO:24)和兔(SEQ ID NO:25))的表皮调节素活性的能力。抗体1中和人表皮调节素的IC50值为8.7nM，SD2.3，n＝5个板，2-3个重复/板(表4)。通过针对食蟹猴(IC50 2.1nM，SD 0.08，n＝3个重复)、大鼠(IC50 2.5nM，SD 0.27，n＝3个重复)、兔(IC50 3.6nM，SD 0.14，n＝3个重复)的测试来证明相关物种间的中和。与LY3016859(WO 2012/138510的抗体1)相比的抗体1的测定验证和降低的IC50与在该测定中用LY3016859中和人表皮调节素进行了比较确认(表4)。在这些研究中使用的人、兔、食蟹猴和兔表皮调节素如上文所述产生。证明LY3016895以25.9nM的IC50中和人表皮调节素，SD 11.7，n＝8个板，2-3个重复/板，食蟹猴(IC50 8.6nM，SD 0.27，n＝2个板，2-3个重复/板)，大鼠(IC50 720nM，SD 10，n＝2个板，2-3个重复/板)和兔(IC5011.0nM，SD 1.15，n＝2个板，2-3个重复/板)。表皮调节素诱导的C166-AP1-Luc测定的统计学验证确定了MSR为1.24，MSR的95％CI(MSR＝最小显著比率)为1.15、1.43，并且抗体1的效力分析为8.4+/-1.3。该测定证明了抗体1在体外中和表皮调节素诱导的功能性细胞应答，以及抑制来自各种物种的表皮调节素的活性的能力，以及抗体1在体内针对表皮调节素的中和作用的潜力。
表4：抗体1中和C166-AP1-荧光素酶细胞中表皮调节素诱导的荧光素酶报告基因活性。
对于抗人表皮调节素的中和，通过对抗体1的5个平板和LY 3016859的8个平板的重复测定IC50的平均值来确定平均值和SD。对于针对大鼠、食蟹猴和兔表皮调节素的中和，将来自每个物种的1个板的一式三份的IC50取平均值，并确定抗体1的SD。对于针对大鼠、食蟹猴和兔表皮调节素的中和，通过对LY3016859的2个不同板上的一式两份的IC50进行平均来产生IC50。
表4中的数据表明，在上述基于C166-AP1-Luc细胞的测定中，抗体1可以有效地中和人表皮调节素诱导的荧光素酶报告基因活性(IC50＝8.7nM)，其IC50比LY3016895(IC50＝25.9nM)低约3倍。通过测试针对大鼠(IC50＝2.5nM)、食蟹猴(IC50＝2.1nM)和兔(IC50＝3.6nM)表皮调节素的中和来证实与表皮调节素的相关种类的交叉反应性。这些数据支持抗体1中和人表皮调节素介导的信号传导并治疗表皮调节素介导的信号传导促进病因发生的人类疾病的能力，所述人疾病如疼痛病症，且特别是OA、DPNP和CLBP。
在C166-AP1-Luc测定中抗体1对表皮调节素中和的选择性：
抗体1中和表皮调节素的选择性可以通过在C166-AP1-Luc测定中测试所有7种EGFR配体(上皮细胞有丝分裂蛋白、TGFα、BTC、EGF、HB-EGF、表皮调节素和双调蛋白)的活性来进一步证明(配体可以购自例如R&D Systems：表皮调节素#1195-EP-CF、β细胞调节素#261-CE-CF、EGF#236-EG-CF、TGFα#239-A-CF、HB-EGF#259-HE-CF、上皮细胞有丝分裂蛋白#6629-EP-CF和双调蛋白#262-AR-CF)。这7种EGFR配体表现出AP1激活，其中荧光素酶活性增加2-5倍，这取决于配体。通过运行每种配体在如上所述的C166-AP1-luc细胞系中的剂量反应来确定EGFR配体的EC50。用于刺激的配体浓度通过使用每种配体的EC50-EC80来确定(β细胞调节素0.8nM、EGF 1.3nM、TGFα2.5nM、HB-EGF 0.52nM、表皮调节素16nM、上皮细胞有丝分裂蛋白333nM和双调蛋白181nM，由于曲线上缺乏平台，上皮细胞有丝分裂蛋白和双调蛋白被估计为EC50)。抗体1显示出在C166-AP1-luc细胞中以8.7nM的IC50中和表皮调节素诱导的荧光素酶活性的能力，并且相反，在C166-AP1-luc测定中未能显示出对β细胞素、EGF、TGFα、HB-EGF、上皮细胞有丝分裂蛋白或双调蛋白诱导的荧光素酶活性的抑制(参见下表5)。表5中的数据还支持抗体1特异性中和表皮调节素而不是其他家族成员β细胞调节素、EGF、TGFα、HB-EGF、上皮细胞有丝分裂蛋白和双调蛋白的活性的药理学选择性。这种选择性是重要的，因为预期抗体1选择性地干预表皮调节素应答，并因此避免由可能阻断其他EGFR配体的特异性较低的药剂(如LY3016859)引起的可能的副作用。
表5：在C166-AP1-Luc测定中抗体1中和表皮调节素的特异性。在C166-AP-Luc测定中测试所有7种EGFR配体的EC50计算。NA(无活性)表示缺乏测定IC50的抑制曲线，因此在最高浓度的测试抗体200nM下缺乏中和。对于表皮调节素中和，使用表皮调节素试剂(SEQ IDNO.22)计算IC50。
抗体1中和TGW神经母细胞瘤细胞系中表皮调节素诱导的应答的能力：
通过测量TGW成神经细胞瘤细胞系中表皮调节素诱导的ERK磷酸化，进一步评估对表皮调节素的中和。TGW细胞表达EGFR家族受体中的所有4种，其中EGFR表达水平最高。在该测定中，TGW细胞在胶原蛋白1包被的平板上在生长培养基[具有NAPYR(Gibco#1195-065)、1X NEAA(Gibco#11140-050)、Glutamax(Gibco#35050-061)和1X抗-抗(Gibco#15240-062)的DMEM高葡萄糖]中生长。将细胞在0.05％胰蛋白酶-PBS中解离，在96孔胶原蛋白1包被的96孔板(Corning#354407)中以100,000个细胞/100μl铺板在无血清培养基(用0.1％BSA代替FBS的生长培养基)中。在TGW细胞中，与未刺激的细胞相比，表皮调节素处理(80ng/ml，5分钟)诱导超过5倍的ERK磷酸化增加(Meso Scale Diagnostics，LLC磷酸化-ERK 1/2全细胞裂解试剂盒#K151DWD)。通过化学发光诱导测定磷酸化-ERK激活，并显示为相对荧光单位(RFU)。在刺激细胞之前通过用连续稀释的抗体1与人表皮调节素孵育20分钟来测定抗体1的中和。通过在Meso Scale Diagnostics Sector Imager上读取板来获得数据。表6显示了用抗体1处理的表皮调节素诱导的磷酸化-ERK1/2信号的减少，并且反映了抗体1中和人表皮调节素的能力。观察到抗体1中和人表皮调节素诱导的TGW细胞中的pERK诱导的IC50值为3.4nM，SD 0.7，(n＝2个重复)，其低于LY3016859的IC50为14.6nM，SD 0.7，(n＝2个重复)。表6中的数据提供了抗体1在TGW细胞中阻断人表皮调节素诱导的磷酸化-ERK 1/2激活的能力的证据。该数据利用两种不同细胞系和独立的读出证明了本公开的抗体(特别是抗体1)中和人表皮调节素的能力，并支持这些抗体在表皮调节素介导的病症(如慢性疼痛病症)的治疗中的治疗用途。
表6：抗体1在TGW细胞中中和人表皮调节素诱导的磷酸-ERK诱导的作用。
实施例4：表皮调节素在CD-小鼠中的诱导性触觉异常痛敏(Induced Tactile Allodynia)中的体内功能表征
生物活性分子表皮调节素和TGFα诱导触觉异常痛敏的能力可以在雄性CD-1小鼠足底内注射后进行评估。在实验前，使小鼠在温度和光控制的动物设施中适应至少7天的时间，随意饮水和进食。在测试日，将动物带到测试室，在笼子中适应20分钟，然后置于升高的金属网地板上的透明塑料室中，并使其适应1小时。通过使用校准的von Frey细丝来确定对机械刺激的爪缩回反应，所述校准的von Frey细丝通过金属网底板中的开口从笼下面施加到后爪跖面。在上下测试范例中使用von Frey细丝完成测量。八个渐变长丝的力范围为0.04g至6g。测量并计算缩爪阈值。将动物基于缩爪阈值的基线值随机化至给药组，PBS、表皮调节素30ng、表皮调节素300ng、TGFα30ng或TGFα300ng(鼠表皮调节素(SEQ ID NO:28)和鼠TGFα(SEQ ID NO:29))试剂，如本文所述制备，或对于TGFα，通过标准色谱技术(固定化金属离子亲和色谱或IMAC，然后进行尺寸排阻色谱或SEC)进行His标签化和纯化。然后，动物接受后爪足底内注射20μl PBS溶液或新鲜稀释的表皮调节素或TGFα。在注射后2小时和4小时的时间点评估缩爪阈值。数据显示在下表7中。
表7：
以上表7显示了表皮调节素与TGFα相比较的作用，并且表明在该疼痛模型中，表皮调节素诱导疼痛反应，如缩爪阈值的降低所示，而TGFα不诱导疼痛反应。与识别表皮调节素和TGFα两者的LY3016859相比，认为抗体1是更具选择性和特异性的疼痛治疗剂，并且认为本公开的抗体1缺乏与TGFα的结合在避免脱靶效应、降低免疫原性和改善或降低治疗用途可能需要的剂量方面是有利的。
实施例5：抗体1免疫原性潜力的表征
抗体1代表在几个组合方面改进的治疗性抗体，包括增强的对人表皮调节素的亲和力、相对于其它EGFR配体改进的对表皮调节素的特异性，以及与LY 3016859相比改进的生物物理性质和全人序列，认为后者提供降低的免疫原性潜力，如以下发现所支持的。
树突细胞(DC)内化测定
单核细胞衍生的DC培养(MDDC)
从外周血单个核细胞中分离CD14+单核细胞，并按照以下标准方案培养并分化成DC。简言之，使用Ficoll(#17-1440-02，GE Healthcare)和Sepmate 50(#15450，StemCellTechnologies)的密度梯度离心从LRS-WBC分离PBMC。按照制造商的手册，使用CD14+微珠试剂盒(#130-050-201，Miltenyi Biotec)的阳性选择分离CD14+单核细胞。然后将细胞以1百万/ml与1000单位/ml GM-CSF和600单位/ml IL-4一起培养6天，以在含有L-谷氨酰胺和25mM HEPES并补充有10％FBS、1mM丙酮酸钠、1×青霉素-链霉素、1×非必需氨基酸和55μM2-巯基乙醇的RPMI培养基(下文称为完全RPMI培养基或培养基，购自Life Technologies)中衍化成不成熟的树突细胞(MDDC)。在第2天和第5天更换培养基两次。在第6天，用细胞刮器轻轻地收集细胞并用于实验。通过显微镜目视表征MDDC的树突形态并通过流式细胞术表征CD14、CD11c和HLA-DR的表达。通过使用流式细胞术测量CD80、CD83和CD86的上调来确认它们应答LPS处理的能力。
Fab-TAMRA-QSY7的缀合
将F(ab′)2片段山羊抗人IgG(Jackson ImmunoResearch)用QSY7-NHS和TAMRA-SE(Molecular Probes)双标记，以获得Fab-TAMRA-QSY7，其用作通用探针以跟踪测试物内在化。通过用Amico Ultra-0.5离心过滤装置(#UFC501096，Millipore)在14,000rcf下离心2分钟，将每个小瓶的F(ab')2(大约1mL，1.3mg/mL)浓缩至约2mg/mL。用10％(v/v)1M碳酸氢钠将pH调节至碱性(>pH8)，并加入在DMSO中的10mM的6.8μl QSY-NHS储液并混合。将反应小瓶在黑暗中在室温下保持30min。用Zeba旋转脱盐柱(#89890，Thermo Scientific)通过在1000相对离心力(RCF)下离心2min来纯化中间产物Fab-QSY7。通过在NanoDrop(ThermoFisher)上测量280nm和560nm处的吸光度来计算浓度和标记程度(DOL)。然后通过再次用Amico Ultra-0.5离心过滤装置以14,000ref离心2min将Fab-QSY7浓缩至约2mg/ml。在用10％(v/v)1M碳酸氢钠调节pH后，加入4.3μl DMSO中的15mM TAMRA-SE储液并混合。在黑暗中室温下30min后，使用Zeba旋转脱盐柱通过在1000rcf下离心2min纯化最终产物Fab-TAMRA-QSY7并收集，通过在NanoDrop分光光度计上读取280nm、555nm和560nm处的吸光度再次定量浓度和DOL。使用该方案，获得约300μl约1.5mg/ml的Fab-TAMRA-QSY7，其中每个F(ab')2具有约两个QSY7和两个TAMRA。
通过FACS的标准的内化研究
用PBS将各个测试分子标准化至1mg/ml，然后在完全RPMI培养基中进一步稀释至8μg/ml。将Fab-TAMRA-QSY7在完全RPMI培养基中稀释至5.33μg/ml。将抗体和Fab-TAMRA-QSY7以等体积混合，并在4℃下在黑暗中孵育30min以形成复合物。将MDDC以4百万/ml重悬于完全RPMI培养基中，并以每孔50μl接种在96孔圆底板中，向其中加入50μl抗体/探针复合物。将细胞在37℃下在CO2培养箱中孵育24h。用2％ FBS PBS洗涤细胞，并重悬于含有CytoxGreen活/死染料的100μl 2％FBS PBS中。在BD LSR Fortessa X-20上收集数据并在FlowJo中分析。对活的单细胞进行门控，并将TAMRA荧光阳性细胞的百分比记录为读数。
数据列报和统计分析
一式两份或一式三份在三个或更多个供体上测试分子。考虑每个供体的TAMRA阳性群体的百分比。为了允许将分子与从不同供体产生的数据进行比较，使用归一化的内化指数(NII)。使用下式将内化信号相对于IgGl同种型(NIL＝0)和内部阳性对照PC(NIL＝100)归一化：
其中XTAMRA、IgGl同种型TAMRA和PCTAMRA分别是测试分子X、IgGl同种型和PC的TAMRA阳性群体的百分比。在14.1.0或Graphpad Prism 8.1.2中分析数据。计算并报告TAMRA阳性群体和NII的百分比的平均值。抗原呈递细胞(如DC)中增加的内化与增加的免疫原性风险相关。表9中的结果表明，相对于LY3016859，抗体1的DC内在化降低，且因此免疫原性风险降低。
表9.DC内化结果
测试抗体 ％TAMRA+ NII
LY3016859 10.3 16.9
抗体1 2.3 1.3
(参见例如Wen，Y.，Cahya，S.，Zeng，W.等，Development of a FRET-based assayfor Analysis of mAbs Internalization and Processing by Dendritic Cells inPreclinical Immunogenicity Risk Assessment.AAPSJ 22，68(2020))
MAPPS测定(MHC相关肽蛋白质组学)方法：
如(Knierman等，“The Human Leukocyte Antigen Class II Immunopeptidomeof the SARS-CoV-2Spike Glycoprotein”，Cell Reports，33，108454(2020))所述，通过分离CD-14阳性细胞，从血沉棕黄层制备来自10名正常人供体的原代人树突细胞，并通过与20ng/ml IL-4和40ng/ml GM-CSF在含有5％血清替代物(Thermo Fisher Scientific，Cat#A2596101)的完全RPMI培养基中在37℃和5％CO2下温育3天分化成未成熟树突细胞。在第4天将3微摩尔的测试抗体加入约5×106个细胞中，并在温育5小时后，更换含有5mg/ml LPS的新鲜培养基以将细胞转化为成熟树突细胞。第二天，将成熟的细胞在含有蛋白酶抑制剂和DNA酶的1ml RIPA缓冲液中裂解。将裂解物储存在-80℃直至样品分析。
使用生物素化的抗泛HLAII类抗体(克隆TU 39)，用自动液体处理系统从解冻的裂解物中分离HLA-II分子。用5％乙酸、0.1％TFA洗脱结合的受体-肽复合物。将洗脱的MHC-II肽通过预洗涤的10k MWCO过滤器以除去高分子量蛋白质。使用具有Thermo Lumos质谱仪的Thermo Easy 1200nLC-HPLC系统，通过纳米LC/MS分析分离的MHC-II肽。分离使用了75μm×7cm YMC-ODS C18柱进行65分钟梯度，流速为250nL/分钟，0.1％甲酸水溶液作为A溶剂，含0.1％甲酸的80％乙腈作为B溶剂。质谱法以240,000分辨率的全扫描模式运行，然后是3秒数据依赖性MS/MS循环，其由具有HCD和EThcD片段化的离子阱快速扫描组成。
通过内部蛋白质组学管道(Higgs等，“Label-Free LC-MS Method for theIdentification of Biomarkers”，Methods in Molecular Biology，428，209-230(2008))使用针对含有测试抗体序列的牛/人数据库的不具有酶搜索参数的多重搜索算法来产生肽鉴定(Higgs等，“Label-Free LC-MS Method for the Identification of Biomarkers”，Methods in Molecular Biology，428，209-230(2008))。KNIME工作流程用于处理样品的识别文件。将从测试物鉴定的肽与亲本序列比对。为所有供体创建概述，其注释展示非种系残基的供体的百分比、展示具有非种系残基的肽的不同区域的数目以及在具有非种系残基的每个区域处展示肽的深度。非种系肽的展示程度的增加与免疫原性的风险增加相关。表8中的结果显示，与LY3016859相比，抗体1的非种系肽的展示减少，因此抗体1的免疫原性风险降低。
表8：MAPPS结果
实施例6.在大鼠中给药后体内与膜表皮调节素结合的证明。
表皮调节素以膜结合形式和可溶形式存在，且可溶形式通过ADAM(一种去整合蛋白和金属蛋白酶)蛋白酶切割膜形式而发生。本公开的抗体在外周给药(例如通过皮下注射)后在体内结合表皮调节素的膜形式的能力可以通过离体分离组织，然后采用如本文所述和/或本领域技术人员已知的标准免疫荧光染色方法来评估。可以用抗体1证明大鼠舌上皮层的阳性和特异性免疫荧光标记。
在不同剂量(0.1至100mg/kg，皮下)的待测抗体(包括抗体1或对照或比较抗体)后，以及在给药后的不同时间(给药后3-28天)后，可以从安乐死的雄性Sprague Dawley大鼠(体重140-215克)获得大鼠舌，并在干冰上快速冷冻。将舌组织的冷冻冠状20微米切片解冻，在PBS中洗涤3分钟，并在4％多聚甲醛中固定10分钟。将载玻片在超灵敏洗涤缓冲液(HK583-5K，Biogenex)中洗涤，然后用Power block(HK065-5K，Biogenex)加0.1％Tritonx-100封闭10分钟。然后洗涤载玻片并在室温下与Alexa Fluor 488山羊抗人IgG(A11013，Life Technologies，13.3μg/ml)和标记的人/小鼠IgGl嵌合体(在本文中称为“抗体1VR嵌合体”(SEQ ID 64和65))一起孵育15分钟，所述嵌合体具有抗体1的可变区(SEQ ID 3和4)和鼠恒定区(DyLight 650标记的)。将载玻片洗涤3次，并在盖玻片之前施加Prolong gold抗褪色试剂。使用Keyence BZ800捕获来自每只动物的488和650nm波长的荧光图像，对所有图像使用相同的曝光设置。利用ImageJ-Win64软件通过获取四个随机目的区域来定量阳性染色的上皮层内的绿色或红色信号的平均强度。绿色信号来自结合的抗体1，或对照抗体，或参考比较抗体(体内给药)，红色信号是未结合的表皮调节素，其中检测抗体与结合的药物竞争，并且仅染色游离的表皮调节素而不是结合的。通过利用Alexa Fluor 488山羊抗人IgG信号(绿色)与剩余抗体1VR嵌合体信号(红色)的比率来归一化所得数据。
图2显示在剂量≥1mg/kg的抗体1给药3天后，观察到体内膜表皮调节素结合的显著剂量依赖性增加。图3显示在10mg/kg抗体1的单剂量后，体内膜表皮调节素持续结合至少14天。
图4表明，与>50x更低效力的结合表皮调节素的比较抗体相比，抗体1在体内结合的膜表皮调节素的程度更高。图4显示抗体1亲和力的改善也转化为体内膜结合的表皮调节素配体结合的改善。
实施例7：抗体1的表位作图
抗体1是一种人IgG4抗体，其以相对于其它EGFR配体家族成员的高亲和力和选择性，以及有利的表皮调节素中和活性和药代动力学性质，选择性地结合并中和EGFR配体家族成员表皮调节素(EREG)。这些性质以及本文所述的另外的稳定性和粘度和溶解度性质导致抗体具有改善的属性和中和EREG活性的有利治疗剂的组合。进行表位作图研究以确定抗体1结合和特异性所需的人EREG中的特定氨基酸。从抗体1Fab/EREG复合物的晶体结构鉴定关键氨基酸，并且通过诱变和结合研究进一步表征这些氨基酸的贡献。与其他EGFR配体家族成员相比，这些氨基酸的贡献为抗体1对EREG的特异性提供了结构基础。这些结果还告知了相关临床前物种中的交叉反应性和选择性。
测试材料的序列在氨基酸和核苷酸序列列表中提供并如下交叉引用：人EREG(SEQID NO:21)、抗体1Fab HC(SEQ ID NO:62)、抗体1Fab LC(SEQ ID NO:63)、单Fc人EREG(SEQID NO:27)、单Fc人EREG E95H(SEQ ID NO:57)、单Fc人EREG E95A(SEQ ID NO:56)、单Fc人EREG H78N(SEQ ID NO:55)、单Fc人EREG H78A(SEQ ID NO:54)、单Fc人EREG F106K(SEQ IDNO:61)、单Fc人EREG F106A(SEQ ID NO:60)、单Fc人EREG Y98A(SEQ ID NO:58)、单Fc人EREG L77F(SEQ ID NO:53)、单Fc人EREG R102A(SEQ ID NO:59)。
抗体1Fab片段和人EREG均在瞬时CHO表达中产生，并通过标准技术纯化。通过向抗体1Fab添加30％摩尔过量的EREG来制备复合物，然后通过尺寸排阻色谱法纯化以除去过量的游离EREG。首先通过蛋白质印迹分析探测抗体1Fab与EREG的结合，并显示在该测定中抗体1Fab可以识别变性的非还原的EREG，但不识别变性的还原的EREG。这强烈地表明依赖于EREG二硫键的构象表位。
与人表皮调节素结合的抗体1的Fab片段的晶体结构
解析了与人表皮调节素结合的抗体1的Fab片段的晶体结构。使复合物结晶，并使用Phaser 2.8.3通过分子置换解析结构，随后用REFMAC 5.8.0258精修。在晶体中，抗体1Fab结合在表皮调节素二聚体的相对面上。表皮调节素Leu77和His78侧链位于表位的中心，Leu77包埋在疏水口袋中，His78侧链以氢键网络为中心。抗体1重链Arg50侧链是重链Tyr52侧链羟基的氢键供体，重链Tyr52侧链羟基是去质子化的His78侧链Nδ1氢键受体的氢键供体，质子化的His78侧链Nε2作为水分子的氢键供体，并且该水分子作为重链Leu109和轻链Tyr107骨架羰基的氢供体。抗体1残基通过IMGT惯例编号。另外鉴定的表位接触包括Glu95、Tyr98、Arg102和Phe106侧链以及Leu77、Val96和Glu104骨架。该结构清楚地表明抗体1表位是构象的而不是线性的，证实了上述Western结果。
使用抗体1Fab的突变体表皮调节素ELISA
通过点诱变进一步表征关键表位残基，以了解它们对结合和选择性的相对贡献。将单Fc EREG融合体(参见上文)在PBS中稀释至1μg/mL，并向每个孔中加入100μL以在5℃下包被ELISA板(Greiner目录号655061)过夜。将变体在板上按列分组，其中野生型包被在3个重复列中，点突变体包被在单个重复列中。包被后，将板用PBST以3×200μL/孔洗涤，然后使用酪蛋白封闭缓冲液(Thermo目录号37528)在板振荡器上在室温下封闭1小时。封闭后，如前所述洗涤板。将抗体1Fab片段在酪蛋白封闭缓冲液中稀释至1μg/ml。然后在封闭缓冲液中3倍连续稀释总共7个浓度，和封闭缓冲液空白。将Fab稀释系列加入到制备的ELISA板中，每孔100μL，并在室温下在板振荡器上孵育1小时。如前所述洗涤板，然后向每个孔中加入100μL在封闭缓冲液中1:8,000稀释的山羊抗人κHRP二抗(Southern Biotech目录号2060-05)。将板与二抗在室温下在板振荡器上孵育1小时，然后如前所述洗涤。制备TMB底物(Thermo目录号34021)，并向所有孔中加入100μL。将板在室温下静态孵育3-5分钟，然后向所有孔中加入100μL 1N HCl以终止反应。在读板器上在450nm处读板。在GraphPad Prism 9中绘制减去空白的ELISA数据，其中抗体浓度在X轴上，OD450在Y轴上。通过使用非线性回归将数据拟合到"Sigmoidal,4PL,X is concentration"模型来生成曲线。
通过ELISA评价点突变体，将表皮调节素突变体包被在平板上，加入抗体1Fab系列稀释液，并通过抗κ二抗测量信号(参见图5)。除Y98A外，所有突变体显示结合减少。H78A几乎踢除结合，并且Y98A在测试浓度下未表现出可检测的结合。
抗体1Fab片段与单Fc人EREG突变体结合的SPR分析
使用Biacore 8K仪器和试剂(Cytiva)对与两种单Fc人EREG突变体结合的抗体1Fab片段进行SPR分析。使用胺偶联试剂盒(Cytiva P/N BR100050)和Biacore 8K控制软件中的“Low Level CM5 Coupling”方法，将低水平的单Fc人EREG突变体固定在CM5 S系列传感器芯片(Cytiva P/N BR100530)的样品流动池(FC2)中。运行缓冲液为1X HBS-EP+pH 7.4(由20X HBS-EP+，Teknova P/N H8022制备)或1X MBS-EP+pH 6.0(10mM MES+150mM NaCl+3mM EDTA+0.05％吐温20)，且运行温度为37℃。在三个独立实验中进行Biacore实验，在每个独立实验中每个稀释液进行单次重复。使用‘1:1binding’动力学模型(EREG变体)或具有Biacore Insight Evaluation 3.0版(Cytiva)的‘Steady State Affinity’模型分析参考减去、空白减去的SPR数据以确定KD值。
将抗体1Fab在运行缓冲液中稀释至300nM(pH 7.4)或900nM(pH 6.0)，然后进行3倍连续稀释，共稀释7次。将Fab注射到所有流动池上240秒，然后以50μL/min的流速进行1800秒解离。以100μL/min注射7M胍2×30秒再生芯片表面。在8个通道中的每一个中收集参考减去数据作为样品流动池减去参考流动池(Fc2-Fc1)，然后将参考减去数据减去缓冲液空白。
通过Biacore在37℃下测量突变体亚组的结合亲和力。结果在表9中报告为3次独立重复测量的平均值±标准偏差，“rel”表示相对于野生型(WT)。
表9：抗体1在pH 6.0和pH 7.4下在37℃下对野生型和突变型EREG的结合亲和力。
表9中的结果显示在pH 7.4下，突变体的较弱亲和力范围为R102A的3倍至F106K的>1000倍。
人EGFR配体表位比对
在EGFR配体序列比对的背景下(图6)，数据显示E95和F106是EREG选择性的关键表位位置。100％保守的Y98和R102位置虽然对于结合是重要的，但对选择性没有贡献。L77和H78对于结合和影响选择性也是关键的，但它们在EGFR配体中是高度保守的，因此不是EREG特异性的。这些结果不仅证明了抗体1对EREG的结合和精细选择性的结构基础，而且还从表位作图研究中提供了配体和物种选择性。
氨基酸和核苷酸序列的列表
抗体1的重链(SEQ ID NO:1)
抗体1的轻链(SEQ ID NO:2)
抗体1的HCVR(SEQ ID NO:3)
抗体1的LCVR(SEQ ID NO:4)
抗体1的HCDR1(SEQ ID NO:5)
TVSGGSISSYYWS
抗体1的HCDR2(SEQ ID NO:6)
RIYPSGNTN
抗体1的HCDR3(SEQ ID NO:7)
ARGGLVMDV
抗体1的LCDR1(SEQ ID NO:8)
RASQSVEFSYLA
抗体1的LCDR2(SEQ ID NO:9)
YGASSRAT
抗体1的LCDR3(SEQ ID NO:10)
HQYGTNPFT
编码抗体1的重链的DNA(SEQ ID NO:11)
编码抗体1的轻链的DNA(SEQ ID NO:12)
人表皮调节素(SEQ ID NO:21)
人表皮调节素构建体(SEQ ID NO:22)
食蟹猴表皮调节素(SEQ ID NO:23)
大鼠表皮调节素(SEQ ID NO:24)
兔表皮调节素(SEQ ID NO:25)
全长人表皮调节素(膜结合的，具有T111P突变)(SEQ ID NO:26)
单Fc人表皮调节素(SEQ ID NO:27)
切割的小鼠EREG(SEQ ID NO:28)
小鼠TGFαHis(SEQ ID NO:29)
抗体1的HCDR1(Kabat)(SEQ ID NO:31)
抗体1的HCDR2(Kabat)(SEQ ID NO:32)
/>
抗体1的HCDR3(Kabat)(SEQ ID NO:33)
GGLVMDV
抗体1的LCDR1(Kabat)(SEQ ID NO:34)
抗体1的LCDR2(Kabat)(SEQ ID NO:35)
抗体1的LCDR3(Kabat)(SEQ ID NO:36)
抗体1的HCDR1(Chothia)(SEQ ID NO:37)
抗体1的HCDR2(Chothia)(SEQ ID NO:38)
抗体1的HCDR3(Chothia)(SEQ ID NO:39)
抗体1的LCDR1(Chothia)(SEQ ID NO:40)
抗体1的LCDR2(Chothia)(SEQ ID NO:41)
抗体1的LCDR3(Chothia)(SEQ ID NO:42)
抗体1的HCDR1(IMGT)(SEQ ID NO:43)
抗体1的HCDR2(IMGT)(SEQ ID NO:44)
抗体1的HCDR3(IMGT)(SEQ ID NO:45)
抗体1的LCDR1(IMGT)(SEQ ID NO:46)
抗体1的LCDR2(IMGT)(SEQ ID NO:47)
抗体1的LCDR3(IMGT)(SEQ ID NO:48)
IgG4PAA铰链区(SEQ ID NO:51)
IgG4PAA Fc区(SEQ ID NO:52)
单Fc huEREG L77F(SEQ ID NO:53)
单Fc huEREG H78A(SEQ ID NO:54)
单Fc huEREG H78N(SEQ ID NO:55)
单Fc huEREG E95A(SEQ ID NO:56)
单Fc huEREG E95H(SEQ ID NO:57)
单Fc huEREG Y98A(SEQ ID NO:58)
单Fc huEREG R102A(SEQ ID NO:59)
单Fc huEREG F106A(SEQ ID NO:60)
单Fc huEREG F106K(SEQ ID NO:61)
抗体1Fab HC(SEQ ID NO:62)
抗体1Fab LC(SEQ ID NO:63)
抗体1VR嵌合体h/mIgG1 HC(SEQ ID NO:64)
抗体1VR嵌合体h/mKappa LC(SEQ ID NO:65)
人上皮细胞有丝分裂蛋白/EPGN(SEQ ID NO:66)
人双调蛋白/AREG(SEQ ID NO:67)
人肝素结合表皮生长因子/HBEGF(SEQ ID NO:68)
人β细胞调节素/BTC(SEQ ID NO:69)
人转化生长因子α/TGFa(SEQ ID NO:70)
人表皮生长因子/EGF(SEQ ID NO:71)
/>
序列表
<110> 伊莱利利公司
<120> 靶向表皮调节素的化合物和方法
<130> X30020
<150> 63/191,496
<151> 2021-05-21
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Leu Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
435 440
<210> 2
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Glu Phe Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Thr Asn Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 3
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Leu Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Glu Phe Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Thr Asn Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr Asn
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Ala Arg Gly Gly Leu Val Met Asp Val
1 5
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Arg Ala Ser Gln Ser Val Glu Phe Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
His Gln Tyr Gly Thr Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 11
<211> 1323
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
caggtgcagc tgcaggagtc gggtccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt tcgtactact ggagctggat tcggcagccc 120
gcagggaagg gactggagtg gattgggagg atctatccga gtgggaacac caactacaac 180
ccctccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aggaggactg 300
gtgatggacg tgtggggaca gggaacacta gtgaccgtga gtagcgcctc caccaagggc 360
ccatcggtct tcccgctagc gccctgctcc aggagcacct ccgagagcac agccgccctg 420
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc 480
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta 600
gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagttg agtccaaata tggtccccca 660
tgcccaccct gcccagcacc tgaggccgcc gggggaccat cagtcttcct gttcccccca 720
aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 780
gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat 840
aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 900
ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 960
aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagag 1020
ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccag gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1080
acctgcctgg tcaaaggctt ctaccccagc gacatcgccg tggagtggga aagcaatggg 1140
cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1200
ctctacagca ggctaaccgt ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc 1260
tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacacaga agagcctctc cctgtctctg 1320
ggt 1323
<210> 12
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gtctgtggaa ttcagctact tagcctatgg tgcatccagc 120
agggccactt ggtaccagca gaaacctggc caggctccca ggctcctcat ctatggtgca 180
tccagcaggg ccactggcat cccagacagg ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc 240
actctcacca tcagcagact ggagcctgaa gattttgcag tgtattactg tcaccagtac 300
ggaacaaacc cgttcacatt cgggcaggga accaaggttg aaataaagcg aactgtggct 360
gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 420
gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 480
aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 540
acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc 600
tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 660
ggagagtgc 669
<210> 13
<211> 46
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 13
Val Ser Ile Thr Lys Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys
20 25 30
Glu Val Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu
35 40 45
<210> 14
<211> 50
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 14
Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr
1 5 10 15
Cys Leu His Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr
20 25 30
Cys Arg Cys Glu Val Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe
35 40 45
Leu Gly
50
<210> 15
<211> 46
<212> PRT
<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）
<400> 15
Val Ser Ile Thr Lys Cys Asn Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys
20 25 30
Glu Val Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Tyr Leu
35 40 45
<210> 16
<211> 46
<212> PRT
<213> 大鼠（Rattus norvegicus）
<400> 16
Val Leu Ile Thr Lys Cys Ser Ser Asp Met Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Gly His Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Glu Lys Tyr Cys Arg Cys
20 25 30
Glu Val Gly Tyr Thr Gly Leu Arg Cys Glu His Phe Phe Leu
35 40 45
<210> 17
<211> 46
<212> PRT
<213> 家兔（Oryctolagus cuniculus）
<400> 17
Val Ser Ile Thr Lys Cys Gly Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Glu Asn Tyr Cys Arg Cys
20 25 30
Glu Val Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu
35 40 45
<210> 18
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Met Thr Ala Gly Arg Arg Met Glu Met Leu Cys Ala Gly Arg Val Pro
1 5 10 15
Ala Leu Leu Leu Cys Leu Gly Phe His Leu Leu Gln Ala Val Leu Ser
20 25 30
Thr Thr Val Ile Pro Ser Cys Ile Pro Gly Glu Ser Ser Asp Asn Cys
35 40 45
Thr Ala Leu Val Gln Thr Glu Asp Asn Pro Arg Val Ala Gln Val Ser
50 55 60
Ile Thr Lys Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln
65 70 75 80
Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val
85 90 95
Gly Tyr Thr Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu Thr Val Pro Gln
100 105 110
Pro Leu Ser Lys Glu Tyr Val Ala Leu Thr Val Ile Leu Ile Ile Leu
115 120 125
Phe Leu Ile Thr Val Val Gly Ser Thr Tyr Tyr Phe Cys Arg Trp Tyr
130 135 140
Arg Asn Arg Lys Ser Lys Glu Pro Lys Lys Glu Tyr Glu Arg Val Thr
145 150 155 160
Ser Gly Asp Pro Glu Leu Pro Gln Val
165
<210> 19
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu
165 170 175
Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys
225 230 235 240
Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln Cys Ile Tyr
245 250 255
Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val Gly Tyr Thr
260 265 270
Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu Gly
275 280
<210> 20
<211> 50
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 20
Gly Pro Gly Val Gln Ile Thr Lys Cys Ser Ser Asp Met Asp Gly Tyr
1 5 10 15
Cys Leu His Gly Gln Cys Ile Tyr Leu Val Asp Met Arg Glu Lys Phe
20 25 30
Cys Arg Cys Glu Val Gly Tyr Thr Gly Leu Arg Cys Glu His Phe Phe
35 40 45
Leu Gly
50
<210> 21
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Val Val Ser His Phe Asn Lys Cys Pro Asp Ser His Thr Gln Tyr Cys
1 5 10 15
Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Val Gln Glu Glu Lys Pro Ala Cys
20 25 30
Val Cys His Ser Gly Tyr Val Gly Val Arg Cys Glu His Ala Asp Leu
35 40 45
Leu Ala Gly His His His His His His
50 55
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Ser Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
Gly Gly Leu Val Met Asp Val
1 5
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Arg Ala Ser Gln Ser Val Glu Phe Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
His Gln Tyr Gly Thr Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
1 5
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Tyr Pro Ser Gly Asn
1 5
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
Gly Gly Leu Val Met Asp Val
1 5
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Arg Ala Ser Gln Ser Val Glu Phe Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
His Gln Tyr Gly Thr Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr
1 5
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Ala Arg Gly Gly Leu Val Met Asp Val
1 5
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
Gln Ser Val Glu Phe Ser Tyr
1 5
<210> 38
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Gly Ala Ser
1
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
His Gln Tyr Gly Thr Asn Pro Phe Thr
1 5
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 41
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly
210 215
<210> 42
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu
165 170 175
Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys
225 230 235 240
Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Phe His Gly Gln Cys Ile Tyr
245 250 255
Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val Gly Tyr Thr
260 265 270
Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu Gly
275 280
<210> 43
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu
165 170 175
Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys
225 230 235 240
Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu Ala Gly Gln Cys Ile Tyr
245 250 255
Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val Gly Tyr Thr
260 265 270
Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu Gly
275 280
<210> 44
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu
165 170 175
Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys
225 230 235 240
Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu Asn Gly Gln Cys Ile Tyr
245 250 255
Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val Gly Tyr Thr
260 265 270
Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu Gly
275 280
<210> 45
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu
165 170 175
Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys
225 230 235 240
Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln Cys Ile Tyr
245 250 255
Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Ala Val Gly Tyr Thr
260 265 270
Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu Gly
275 280
<210> 46
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu
165 170 175
Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys
225 230 235 240
Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln Cys Ile Tyr
245 250 255
Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys His Val Gly Tyr Thr
260 265 270
Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu Gly
275 280
<210> 47
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu
165 170 175
Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys
225 230 235 240
Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln Cys Ile Tyr
245 250 255
Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val Gly Ala Thr
260 265 270
Gly Val Arg Cys Glu His Phe Phe Leu Gly
275 280
<210> 48
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu
165 170 175
Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys
225 230 235 240
Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln Cys Ile Tyr
245 250 255
Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val Gly Tyr Thr
260 265 270
Gly Val Ala Cys Glu His Phe Phe Leu Gly
275 280
<210> 49
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu
165 170 175
Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys
225 230 235 240
Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln Cys Ile Tyr
245 250 255
Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val Gly Tyr Thr
260 265 270
Gly Val Arg Cys Glu His Ala Phe Leu Gly
275 280
<210> 50
<211> 282
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Gln Leu
165 170 175
Glu Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro Gly Val Ser Ile Thr Lys
225 230 235 240
Cys Ser Ser Asp Met Asn Gly Tyr Cys Leu His Gly Gln Cys Ile Tyr
245 250 255
Leu Val Asp Met Ser Gln Asn Tyr Cys Arg Cys Glu Val Gly Tyr Thr
260 265 270
Gly Val Arg Cys Glu His Ala Lys Leu Gly
275 280
<210> 51
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Leu Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215
<210> 52
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Glu Phe Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Thr Asn Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 53
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ala Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Gly Leu Val Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu
165 170 175
Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
180 185 190
Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys
210 215 220
Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
260 265 270
Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe
275 280 285
Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp
290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys
325 330 335
Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys
340 345 350
Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp
355 360 365
Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys
370 375 380
Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser
385 390 395 400
Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr
405 410 415
Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser
420 425 430
Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435
<210> 54
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Glu Phe Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Thr Asn Pro
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp
130 135 140
Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val
145 150 155 160
Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser
180 185 190
Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 55
<211> 47
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 55
Lys Phe Ser His Leu Cys Leu Glu Asp His Asn Ser Tyr Cys Ile Asn
1 5 10 15
Gly Ala Cys Ala Phe His His Glu Leu Glu Lys Ala Ile Cys Arg Cys
20 25 30
Phe Thr Gly Tyr Thr Gly Glu Arg Cys Glu His Leu Thr Leu Thr
35 40 45
<210> 56
<211> 47
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 56
Lys Lys Lys Asn Pro Cys Asn Ala Glu Phe Gln Asn Phe Cys Ile His
1 5 10 15
Gly Glu Cys Lys Tyr Ile Glu His Leu Glu Ala Val Thr Cys Lys Cys
20 25 30
Gln Gln Glu Tyr Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys Ser Met Lys
35 40 45
<210> 57
<211> 46
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 57
Lys Lys Arg Asp Pro Cys Leu Arg Lys Tyr Lys Asp Phe Cys Ile His
1 5 10 15
Gly Glu Cys Lys Tyr Val Lys Glu Leu Arg Ala Pro Ser Cys Ile Cys
20 25 30
His Pro Gly Tyr His Gly Glu Arg Cys His Gly Leu Ser Leu
35 40 45
<210> 58
<211> 48
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 58
Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gln Tyr Lys His Tyr Cys Ile Lys
1 5 10 15
Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gln Thr Pro Ser Cys Val Cys
20 25 30
Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr
35 40 45
<210> 59
<211> 50
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 59
Val Val Ser His Phe Asn Asp Cys Pro Asp Ser His Thr Gln Phe Cys
1 5 10 15
Phe His Gly Thr Cys Arg Phe Leu Val Gln Glu Asp Lys Pro Ala Cys
20 25 30
Val Cys His Ser Gly Tyr Val Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Asp Leu
35 40 45
Leu Ala
50
<210> 60
<211> 49
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 60
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp

Claims (29)

1.一种结合人表皮调节素(epiregulin)的抗体，其中所述抗体包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述V H包含重链互补决定区(HCDR)HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且所述VL包含轻链互补决定区(LCDR)LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中
HCDR1包含SEQ ID NO:5，
HCDR2包含SEQ ID NO:6，
HCDR3包含SEQ ID NO:7，
LCDR1包含SEQ ID NO:8，
LCDR2包含SEQ ID NO:9，和
LCDR3包含SEQ ID NO:10。
2.权利要求1的抗体，其中所述VH包含SEQ ID NO:3且所述VL包含SEQ ID NO:4。
3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体包含包含SEQ ID NO:1的重链(HC)和包含SEQID NO:2的轻链(LC)。
4.核酸，其包含SEQ ID NO:11或12的序列。
5.载体，其包含权利要求4的核酸。
6.权利要求5的载体，其中所述载体包含SEQ ID NO:11的第一核酸序列和SEQ ID NO:12的第二核酸序列。
7.组合物，其包含包含SEQ ID NO:11的核酸序列的第一载体和包含SEQ ID NO:12的核酸序列的第二载体。
8.细胞，其包含权利要求5或6的载体。
9.细胞，其包含包含SEQ ID NO:11的核酸序列的第一载体和包含SEQ ID NO:12的核酸序列的第二载体。
10.权利要求8或9的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
11.产生抗体的方法，其包括在表达抗体的条件下培养权利要求8-10任一项的细胞，并从培养基中回收表达的抗体。
12.通过权利要求11的方法产生的抗体。
13.药物组合物，其包含权利要求1-3任一项或12的抗体或其药学上可接受的的赋形剂、稀释剂或载体。
14.治疗在有需要的受试者中的疼痛病症的方法，包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-3任一项或12的抗体或权利要求13的药物组合物。
15.权利要求14的方法，其中疼痛病症选自骨关节炎疼痛、糖尿病性周围神经病变疼痛和慢性腰背痛。
16.权利要求15的方法，其中所述疼痛病症是骨关节炎疼痛。
17.权利要求15的方法，其中所述疼痛病症是糖尿病性周围神经病变疼痛。
18.权利要求15的方法，其中所述疼痛病症是慢性腰背痛。
19.权利要求15的方法，其中所述疼痛病症是治疗抗性的。
20.权利要求1-3任一项或12的抗体用于治疗。
21.权利要求1-3任一项或12的抗体或权利要求13的药物组合物用于治疗疼痛病症。
22.权利要求21的抗体或药物组合物，其中所述疼痛病症选自骨关节炎疼痛、糖尿病性周围神经病变疼痛和慢性腰背痛。
23.权利要求21的抗体或药物组合物，其中所述疼痛病症是骨关节炎疼痛。
24.权利要求21的抗体或药物组合物，其中所述疼痛病症是糖尿病性周围神经病变疼痛。
25.权利要求21的抗体或药物组合物，其中所述疼痛病症是慢性腰背痛。
26.权利要求1-3任一项或12的抗体在制备用于治疗疼痛病症的药物中的用途。
27.权利要求26的用途，其中所述疼痛病症选自骨关节炎疼痛、糖尿病性周围神经病变疼痛和慢性腰背痛。
28.确定体液样品中的人表皮调节素水平的方法，包括：
(a)使体液样品与权利要求1-3任一项的抗人表皮调节素诊断单克隆抗体或其抗原结合片段接触；
(b)任选地，去除任何非特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段；和
(c)检测和/或定量与人表皮调节素特异性结合的单克隆抗体或其抗原结合片段的量。
29.权利要求28的方法，其中所述体液样品是血液、血清或血浆样品，或脑脊液样品，并且所述接触离体发生。
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