CN117431295A - 一种滴瓶式荧光pcr试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体地涉及一种滴瓶式荧光PCR试剂盒及其使用方法。本发明公开了一种滴瓶式荧光PCR试剂盒，其包括采样滴瓶、反应液滴瓶，其特征在于所述采样滴瓶和反应液滴瓶的滴嘴孔径一致，直径为0.5mm～1.5mm；所述采样滴瓶含有采样液，所述反应液滴瓶包含荧光PCR反应液；其中所述采样液含有5‑20mM Tris‑HCl pH 7.0‑8.5；0.5％v/v‑10％v/v。本发明试剂盒使用成本低，操作简单，无需任何其它设备，仅需样本和荧光PCR反应液各一滴即可完成体系配制，无需专业人员及专业实验室；彻底排除了移液器或滴管液体吸取分装及配制过程的气溶胶污染；本发明可实现了发热门诊，海关，家庭，学校，社区等非专业实验室场景及非专业人员操作，实现了荧光PCR技术的民用化。

Description

一种滴瓶式荧光PCR试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地涉及一种滴瓶式荧光PCR试剂盒及其使用方法。

背景技术

荧光定量PCR是一种有用的检测方法，已广泛用于食品、环境、临床样本的快速检测，尤其是传染病快检方面；PCR核酸检测标准操作程序大体为样本采集、运送、核酸提取、PCR检测，此外对于一些传染病病毒，相关规范要求对原始样本在进行核酸提取前进行可靠的灭活，因此流程复杂且试剂成分多，严重依赖标准PCR实验室及专业操作人员，同时也产生了大量仪器耗材成本、人力成本、污染风险成本，给大规模筛查及快速灵活的应用场景造成了巨大障碍。

为了解决核酸检测流程简单，不依赖专业人员问题，国内外主要两种技术路线，美国赛沛、雅培，Cue Health及中国万孚、尤思达、杭州遂真及上海奥染等厂家主要卡盒式一体机路线，但是这种技术路线设备、卡盒成本过高，难于大规模筛查应用。另外卡尤迪及圣湘采用免提取的“一步法”路线，虽然节省了提取成本，但是依然需要多步移液和分液进行，还是依赖于专业人员和存在样本污染风险。

目前，全球急需适合于大规模筛查、无需依赖专业人员的荧光定量PCR 产品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适合于大规模筛查、无需依赖专业人员的荧光定量PCR产品，满足“操作非常简单”和“成本非常低廉”两个核心指标。

本发明公开了一种滴瓶式荧光PCR试剂盒，其包括采样滴瓶、反应液滴瓶，其特征在于所述采样滴瓶和反应液滴瓶的滴嘴孔径一致，直径为 0.5mm～1.5mm；所述采样滴瓶含有采样液，所述反应液滴瓶包含荧光PCR反应液；其中所述采样液含有5-20mM Tris-HCl pH7.0-8.5；0.5％v/v-10％v/v。

本发明技术方案采取滴瓶代替精准的移液加样，使得样本液滴和N×荧光 PCR反应液的液滴体积一致非常重要，能最大降低反应体系的误差。液滴大小控制主要采取如下策略：1：保证滴嘴大小孔径一致可让液滴大小接近，本发明中优先选用的采样滴瓶和反应液滴瓶的规格一致来保证液滴大小一致。在某些多管混合实施例中，采样滴瓶规格虽然不一致时采用同样孔径的滴嘴一致行保证了液滴大小的接近；2：本发明在一些实施案例过程中，经过测量发现反应液滴瓶滴出溶液25uL-30uL/滴，而采用TE缓冲液作为采样液的采样瓶滴出的溶液35-40uL。为了样本液滴的大小，本发明人发现采用0.5％-10％表面活性剂，可以通过加大表面张力，调节液滴大小，保证样本液滴和荧光 PCR反应液的液滴体积大体一致。

在一优选实施例中，所述采样滴瓶和反应液滴瓶均包括瓶体、滴嘴及滴嘴盖，更优选所述瓶体的瓶口上有可撕拆的密封薄膜或铝箔膜，保证运输过程中放置液体溢出。

在一优选实施例中，所述采样滴瓶的滴嘴内含有滤纸或滤芯，以便于过滤掉实际采样带入到颗粒杂质。

在一优选实施例中，DNA病毒检测实施例下，所述采样液含有5-20mM Tris HCL pH7.0-8.5，0.5-3mM EDTA，0.5-10％的表面活性剂。

在一优选实施例中，RNA病毒检测实施例下，所述采样液含有5-20mM Tris HCL pH7.0-8.5，0.5-3mM RNase抑制剂，0.5-10％的表面活性剂；所述RNase 抑制剂包括蛋白类RNase抑制及化学RNase抑制剂，优选低成本的化学RNase 抑制剂如聚乙烯磺酸钠(PVSA)等。

所述表面活性剂，包括Triton X 100，NP-40，吐温20，吐温80或聚乙二醇等。

在一优选实施例中，所述采样液包含如下组分：

Tris HCl pH 7.0-8.5，5-20mM；

TritonX-100，0.5％v/v-5％v/v；

聚乙烯磺酸钠，0.05mg/mL-50mg/mL；

DTT，0.1-0.5mM。

在一些优选实施例中，DNA样本检测和单酶一步法RNA检测中，荧光PCR 反应液含有PCR酶，UNG酶，氯化镁，dNTPs，dUTP，PCR缓冲液，稳定剂及增强剂全预混的PCR预混液及目标基因的引物探针混合液。更优选实施例，将荧光PCR反应液和目标基因引物探针混合液分装在A和B两个滴瓶中，使用前将A滴瓶的荧光PCR反应液直接滴入B滴瓶目标基因引物探针混合液快速制备成反应滴瓶。

在一些优选实施例中，双酶一步法RNA检测的实施例中，所述荧光PCR 反应液含有PCR酶，UNG酶，氯化镁，dNTPs，dUTP，PCR缓冲液，稳定剂及增强剂全预混的PCR预混液。

所述的荧光PCR酶为野生及改造的Tth DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶或 MMLV聚合酶的一种或两种，具有抗抑制特征适用于直接荧光PCR扩增。

在一些优选实施例中，所述荧光PCR反应液为TOROIVDR 5G qPCR Premix withUNG。

在一些优选实施例中，还包含所述PCR反应管，管中含有逆转录酶、RNase 抑制剂及目标基因引物探针混合物，混合物为冻干制剂形式。

另外一方面，本发明还公开上述滴瓶式荧光PCR试剂盒的使用方法，包括下列步骤：

S1：样本采集：环境拭子，口咽拭子，鼻拭子，环境拭子，肛门拭子及阴道拭子等拭子类样本，采集后直接放入及折断到采样滴瓶，挤压释放。血清，全血类及尿液等液体类直接按和采样液比例1％-20％加入到采样滴瓶。粪便，动植物组织等固体类样本，从采样瓶里取600-1mL采样液研磨并离心后，取上清完全转入采样滴瓶里。

S2：将采样滴瓶里的样本上下混合后滴入反应管1滴，然后再将反应液滴瓶中荧光PCR反应液上下混合后滴入一滴到反应管；手指轻弹混合直接放入荧光PCR仪进行实时荧光PCR检测。

本发明滴瓶式荧光PCR试剂盒具有如下有益效果:

操作过程非常简单，只需样本和试剂两个滴加动作，适合非专业人员使用。没有吸液和移液过程，来降低吸取过程的气溶胶污染，适合非专业实验室场景使用。

制造成本低，所有滴瓶均采用非常通用的抗原检测采样用的滴瓶，及反应管采用市场通用的定量PCR单管及八连管，通用性高，价格非常低廉。试剂采用市场大量生产的PCR试剂原料，成本也非常低廉。

使用成本低，所有过程无需移液器及移液吸头，离心机，温浴设备，加热设备等所有仪器设备，无需专业实验室。降低了人工成本和实验室效果。

降低了污染风险，彻底排除了移液器或滴管液体吸取分装及配制过程的气溶胶污染。

灵敏度及准确度高，采用金标准PCR检测技术，因每液滴大小25-30uL，大大提高了加样体积，可实现50-200copies/mL的超灵敏检测。

附图说明

图1.滴瓶荧光PCR试剂盒的结构组成示意图；其中，1-含采样液的采样滴瓶和2-荧光PCR反应液的滴瓶，包含滴嘴盖及透明盖，通过两个盖将滴瓶盖密封，防止运输漏液。下部溶液腔体可以通过挤压方式促使样本释放混合，也可以使得液体滴出。另外一个本发明人发现当荧光PCR反应液和采样液含有表面活性剂时，所产生的气泡使用移液器加样具有很大困扰，本发明中的滴瓶加样的滴嘴产生了过滤气泡的作用，降低了气泡对荧光定量PCR检测影响。

图2.滴瓶荧光PCR试剂盒操作使用流程示意图。

图3.表面活性剂调节液滴大小对扩增曲线重复性和检测效果影响。

图4.灭活型RNA保存液优化和适用范围研究。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

如本文使用的，“荧光PCR反应液”可为除模板以外的组合物，包括但不限于缓冲液、盐、DNA聚合酶、dNTP、PCR用水、引物和或探针，有部分场景，其不含引物和或探针。

如本文使用的，“聚合酶链式反应”或PCR是核酸的扩增，由以下步骤组成：起始预变性步骤，打开封闭的PCR酶的活性，然后通过重复(i)变性步骤，其分离双链核酸样品的链；(ii)退火步骤，允许扩增引物与靶序列的旁侧位置特异性退火；(iii)延伸步骤，其使引物以5’至3’方向延伸因而形成与靶序列互补的扩增子多核苷酸(Mullis等人编辑，ThePolymerase Chain Reaction，BirkHauser，Boston，Mass.(1994)。每个上面的步骤可以在不同的温度下进行，优选使用自动化的热循环仪(Applied Biosystems LLC，LifeTechnologies Corporation，Foster City，CA.的一个部门)。如果需要，可以通过本领域技术人员已知的方法将RNA样品转换成DNA/RNA异型双链或双链cDNA。PCR方法还包括逆转录酶-PCR和遵循PCR原理的其它反应。

在本发明中有用的逆转录酶可以是任何表现出逆转录酶活性的聚合酶。优选的酶包括那些表现出降低的RNA酶H活性的酶。在一些实施方式中，逆转录酶可以是禽成髓细胞增多症病毒逆转录酶(AMV-RT)、莫罗尼鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV-RT)、人类免疫病毒逆转录酶(HIV-RT)、EIAV-RT、RAV2-RT、生氢氧化碳嗜热菌(C.hydrogenoformans)DNA聚合酶、rTth DNA聚合酶、 SUPERSCRIPT I、SUPERSCRIPT II以及其突变体、变体和衍生物。

本发明的DNA聚合酶可以是能够复制DNA分子的任何聚合酶。优选的DNA 聚合酶是热稳定聚合酶，在一些实施方式中，DNA聚合酶可以是Taq、Tbr、 Tfl、Tru、Tth、Tli、Tac、Tne、Tma、Tih、Tfi、Pfu、Pwo、Kod、Bst、Sac、 Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4、VENTTM、DEEPVENTTM及其活性突变体、变体或衍生物。应理解，各种DNA聚合酶可用于本发明，包括上文未具体公开的DNA聚合酶，而不偏离本发明的范围或其优选的实施方式。

逆转录酶可以与DNA聚合酶以任何适当的比率存在。在一些实施方式中，单位活性的逆转录酶比DNA聚合酶的比率大于或等于3。本领域技术人员应理解，其他逆转录酶比DNA聚合酶的比率可用于本发明中。

如本文使用的，“扩增”是指线性地或指数地增加多核苷酸序列的广泛的技术。示例性扩增技术包括但不限于PCR或任何其它应用引物延伸步骤的方法。扩增的其它非限制性例子包括但不限于连接酶检测反应(LDR)和连接酶链式反应(LCR)。扩增方法可以包括热循环或可以等温进行。在各种具体实施方案中，术语“扩增产物”包括来自任何扩增反应循环数目的产物。

在某些具体实施方案中，扩增方法包括至少一个扩增循环，例如但不限于以下的连续过程：将引物杂交至靶序列的引物特异性部分或扩增来自任何扩增反应循环数目的产物；使用聚合酶以依赖模板的方式合成核苷酸的链；和将新形成的核酸双链变性从而分离链。循环可以重复或可以不重复。

有许多已知的扩增核酸序列的方法，包括例如PCR。见例如PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification(编辑 H.A.Erlich，FreemanPress，NY，N.Y.，1992)；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(编辑Innis等人，Academic Press，San Diego， Calif.，1990)；Mattila等人，Nucleic AcidsRes.19，4967(1991)；Eckert 等人，PCR Methods and Applications 1，17(1991)；PCR(编辑McPherson 等人，IRL Press，Oxford)；和美国专利号4,683,202、4,683,195、 4,800,1594,965,188和5,333,675，为了所有的目的其中的每个通过引用以其全部并入本文。

根据扩增方法的温度需要传统地将核酸扩增技术归类。等温扩增在恒定的温度下进行，与需要高和低温度之间循环的扩增相反。等温扩增技术的例子是：链置换扩增(Strand Displacement Amplification)(SDA；Walker等人， 1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：392396；Walker等人，1992， Nuc.Acids.Res.20：1691 1696；和EP 0 497 272，所有的都通过引用并入本文)，自主序列复制(self-sustained sequencereplication)(3SR；Guatelli 等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874 1878)，Q.beta.复制酶系统(Lizardi等人，1988，BioTechnology 6：1197 1202)，和WO 90/10064和WO 91/03573中公开的技术。

需要温度循环的扩增技术的例子是：聚合酶链式反应(PCR；Saiki等人， 1985，Science 230：1350 1354)，连接酶链式反应(LCR；Wu等人，1989，Genomics 4：560 569；Barringer等人，1990，Gene 89：117 122；Barany，1991， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189193)，基于转录的扩增 (transcription-based amplification)(Kwoh等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173 1177)和限制性扩增(restriction amplification)(美国专利号5,102,784)。

其它的示例性技术包括基于核酸序列的扩增(Nucleic Acid Sequence-BasedAmplification)(″NASBA″；见美国专利号5,130,238)， Q.beta.复制酶系统(见Lizardi等人，BioTechnology 6：1197(1988))，和滚环扩增(Rolling Circle Amplification)(见Lizardi等人，Nat Genet 19： 225232(1998))。本发明的扩增引物可以用于进行例如但不限于PCR。任何本文公开的扩增技术和方法可以用于进行所要求的本发明，如本领域普通技术人员所理解的。

单词“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可以提供某些益处的本发明的具体实施方案。但是，在相同的或其它的情况下其它的具体实施方案也可以是优选的。另外，对一个或多个优选的具体实施方案的详述不意味着其它的具体实施方案是没有用途的，不用于从本发明的范围中排除其它的具体实施方案。

术语“含有”和其变体在这些术语出现在说明书和权利要求中的地方不具有限制性意思。。

还在本文，通过端点详述的数值范围包括所有包括在该范围内的数值。术语“和/或”意思是一个或所有列出的元素或任何两个或两个以上列出元素的组合。

本发明实施例中，DNA病毒类的检测使用TE缓冲液(pH 8.0，10mM Tris-HCL；1mMEDTA)作为基础采样液。DNA在TE缓冲液中非常稳定，常用于DNA的保存，并且兼容直接PCR扩增体系。但是在TE缓冲液不能灭活包膜类病毒，本发明人也发现形成的液滴大小和预混液不一致。根据文献报道 (Patterson，et al.2020；Smyrlaki I,et al.2020)，0.5％-5％的表面活性剂(如Triton X 100等)等能有效破坏包膜结构，完全灭活包膜类病毒。同时本发明中发现表面活性剂可以调节液滴大小(图3)提高检测重复性和稳定性。所以在DNA病毒类样本，本发明中采用TE缓冲液加5％表面活性剂，优先选择pH 8.0，10mM Tris-HCL；1mMEDTA，5％Triton X-100作为灭活型DNA 病毒保存液。

本发明滴瓶式荧光PCR试剂盒的制作方法，包括采样滴瓶，反应液滴瓶及反应管的制作方法。具体内容包括如下：

1.采样滴瓶及采样液的制作方法：

采样滴瓶，所述采样滴瓶包括瓶体，滴嘴及滴嘴盖。所述滴嘴和滴嘴盖均可单独拆卸。采样滴瓶中含有缓冲液，病毒等样本裂解及灭活剂，DNA或 RNase抑制剂，液体大小调节剂。单样单管的采样实施例下，采用0.5-3mL 采样滴瓶，采样液体积为0.5-3mL。多样混管实施例下，采用3-20mL采样滴瓶，采样液体积为3mL-15mL。

采样液成分的优化决定了是否能兼容直接扩增PCR，是否能灭活病毒及是否能保持核酸稳定，液滴大小是否合适。在非洲猪瘟病毒，猴痘病毒，HPV病毒等DNA病毒检测实施例下，采用5-20mM Tris HCL(pH 7.0-8.5)，0.5-3mM EDTA，0.5-10％的表面活性剂。在新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，甲流乙流病毒等人类及动物RNA病毒检测实施例下，采用5-20mM Tris HCL(pH 6.5-7.5)，0.5-3mM RNase抑制剂，0.5-10％的表面活性剂。单酶一步法中还含有1-8mM的醋酸锰，氯化锰，醋酸镁或氯化镁等一种或两种混合物。所述表面活性剂，包括Triton X-100，NP-40，吐温 20，吐温80或聚乙二醇等，用于裂解病毒包膜及调节液滴大小。所述RNase 抑制剂包括蛋白类RNase抑制及化学RNase抑制剂，优选低成本的化学RNase 抑制剂如聚乙烯磺酸钠(PVSA)等。

2.反应液滴及反应液的制作方法：

反应液滴瓶，所述反应液滴瓶包括瓶体，滴嘴及滴嘴盖。所述反应液滴瓶中包含荧光定量PCR反应液。在某些实施例中反应液滴瓶通过A液滴瓶或B 液滴瓶两瓶配制而成。反应液滴瓶采用0.5-3mL采样滴瓶，溶液体积 0.1-2.5mL，且滴嘴孔径大小和采样滴瓶一致。反应液成分主要包括PCR酶反应体系和引物探针，酶体系必须使用荧光PCR酶为野生及改造的Tth DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶或MMLV聚合酶的一种或两种，具有抗抑制特征适用于直接荧光PCR扩增。酶体系及引物探针混合液需要进行浓度优化，来提高液体误差的容忍空间。

在进行DNA样本检测和单酶一步法RNA检测的实施例中，荧光PCR反应液含有PCR酶，UNG酶，氯化镁，dNTPs，dUTP，PCR缓冲液，稳定剂及增强剂全预混的PCR预混液及目标基因的引物探针混合液。更稳定的实施例，将 PCR预混液及目标基因引物探针混合液按比例分装在A和B两个滴瓶中，使用前将A滴瓶的PCR预混液直接滴入B滴瓶快速制备成反应滴瓶。在进行双酶一步法RNA检测的实施例中，荧光PCR反应液含有PCR酶，UNG酶，氯化镁， dNTPs，dUTP，PCR缓冲液，稳定剂及增强剂全预混的PCR预混液。

3.反应管的制作方法：

反应管，所述反应管包括PCR反应管及管盖。在进行DNA样本检测和单酶一步法RNA检测的实施例中，PCR管主要0.2mL或0.1mL的PCR单管或八连管，颜色为透明或乳白色。在进行双酶一步法RNA检测的实施例中，反应管 PCR管主要0.2mL或0.1mL的PCR单管或八连管，颜色为透明或乳白色。并且反应管中含有逆转录酶，RNase抑制剂及目标基因引物探针混合物，混合物为冻干制剂形式。

本发明实施例中，RNA病毒类的检测使用pH 7.0，10mM TrisHCL缓冲液作为基础采样液。本发明中为了保持RNA稳定性，添加了RNase抑制剂。RNase 抑制剂包括蛋白类的或化学类的如聚乙烯磺酸钠。蛋白类的RNase抑制剂成本过高，优选化学类的聚乙烯磺酸钠。聚乙烯磺酸钠对RNA的保护作用在文献已经报道(Smyrlaki I,et al.2020)，但是文献中30％浓度聚乙烯磺酸钠添加量仅为0.4uL/mL，本发明中针对30％浓度聚乙烯磺酸钠在保存液中添加量进行进一步优化，如图4a看出，保存液中最大添加量为5.4uL/mL对Ct 值影响在0.52之内。因图4a测试时是使用20％的模板添加量，所以考虑到滴瓶式PCR时模板为体系的50％，所以30％浓度聚乙烯磺酸钠最大添加量为 2uL/mL，即聚乙烯磺酸钠最大添加量为RNA样本保存液的0.06％(v/v)。和 DNA病毒保存液同样使用表面活性剂进行灭活。优先选择pH 7.0，10mM Tris-HCL；0.06％聚乙烯磺酸钠，5％Triton X-100作为灭活型RNA病毒保存液，命名为0.06％PVSA Buffer。

本发明中实施例中为了验证0.06％PVSA Buffer的保存RNA效果，图4-b 表明了在4℃，21℃，37℃分别保存RNA 4小时和12小时，然后经过病毒 DNA/RNA提取试剂提取进行定量PCR对比。发现0.06％PVSA Buffer均比市面上常用的4.5M盐酸胍和生理盐水保存后Ct值更低。进一步，适用未灭菌滴瓶和采样拭子，取两根人鼻腔样本分别放入1mL 0.06％PVSABuffer和4.5M 盐酸胍溶液中对比。图4-c表明了在4小时内，0.06％PVSA Buffer的RNA 保存效果和4.5M盐酸胍溶液完全一样。此外，根据图4-a，b，c结果，4.5M 盐酸胍和生理盐水由于高的盐离子浓度影响提取效果，进一步，图4-c中显示只添加拭子但不采样的的样本4.5M盐酸胍明显影响提取效果，这是由于人鼻样本中的RNA可以降低提取效率影响损失。所以本发明实施例中优化0.06％ PVSA Buffer完全不受提取效率的影响，可同时兼容提取模板RT-qPCR和直扩 RT-qPCR。虽然0.06％PVSA Buffer只4个小时内常温稳定，但对于本发明实施例中快速场景完全满足。另外在环境样本等非靶标RNA少的情况下，比4.5M 盐酸胍和生理盐水配合核酸提取方式具有更好的检测稳定性。

本发明中实施例中为了兼容基于野生或改造的Tth酶的单酶一步法反应体系，锰离子作为该酶体系的辅因子。但是Mn²⁺在PH8.0以上容易被氧化，所以不能和pH8.0的PCR预混液混合，也不能和TE Buffer保存的引物探针混合。本发明中优化的0.06％PVSA Buffer是基于pH 7.0的10mM Tris-HCL，有效地保护了锰离子不被氧化。本发明中将锰离子按固定浓度加入0.06％PVSA Buffer中，所以针对单酶一步法反应体系优先选择pH 7.0，10mMTris-HCL； 0.06％聚乙烯磺酸钠，5％Triton X 100，8mM醋酸锰作为灭活型RNA病毒保存液。

DNA在TE缓冲液中非常稳定，常用于DNA的保存，并且兼容直接PCR扩增体系。但是在TE缓冲液不能灭活包膜类病毒，本发明人也发现形成的液滴大小和预混液不一致。根据文献报道(Patterson，et al.2020；Smyrlaki I,et al.2020)，0.5％-5％的表面活性剂(如Triton X 100等)等能有效破坏包膜结构，完全灭活包膜类病毒。同时本发明中发现表面活性剂可以调节液滴大小(图3)提高检测重复性和稳定性。所以在DNA病毒类样本，采用 TE缓冲液加5％表面活性剂，优先选择pH 8.0，10mM Tris-HCL；1mM EDTA， 5％Triton X 100作为灭活型DNA病毒保存液。

本发明实施例针对单人单管采样优先选择采用0.5-1mL采样液体积，既保证了能完全侵没拭子，也比传统的3mL采样管提高了3-6倍的模板浓度。在多人混和采样场合，本发明使用3mL(5混1)，6mL(10混1)，12mL(20 混1)，但不限于其它采样液体积和更多混采方式。本发明实施例子中滴瓶式采样管比传统采样管更容易进行混检模式。具体实施方式为，取一个3mL的空滴瓶，将带混检的样本滴瓶均按同样滴数(1-5滴)滴入空滴瓶，混合后作为混检采样滴瓶，极大缩短了混检方式，操作非常简便。

在本发明的一个实施例中，对新型冠状病毒N基因检测的三组引物探针组进行了优化。发现中国CDC公布的N基因引物探针集中在0.6-0.8uM高引物浓度区，Ct值和荧光信号最优，且波动最小。而在美国CDC公布的N1引物探针组在0.1uM低探针浓度区，Ct值和荧光信号最优，且波动最小。美国CDC 公布的N2引物探针组在0.2-0.4uM高探针浓度区或0.8uM的高浓度引物区， Ct值和荧光信号最优，且波动最小。充分说明了，同一基因不同扩增子的引物探针最佳扩增效率的分布区不同。在本发明的新冠病毒实施例中，为了更好的突变兼容度及引物探针量容忍度，本发明优选使用三扩增子使用同样探针染料-VIC标记，优选为：N和N1均选择引物终浓度为0.7uM，探针浓度为 0.1uM，同时N2选择引物终浓度为0.8uM，探针浓度为0.2uM。

在本发明一个非洲猪瘟检测实施例中，采用同样原理对OIE公布内部的 VP72引物探针浓度筛选进行了筛选，引物为0.4uM和探针为0.1uM。针对不同仪器的算法及数据处理方式。又对以上VP72引物探针混合液进行不同条件量的进一步优化。对天罗一号荧光定量PCR仪器进行添加量倍比优化。虽然使用移液器精确添加引物为0.4uM和探针为0.1uM在Step one等仪器上使用引物探针浓度为最优。但是在天罗一号荧光定量PCR仪器上使用滴瓶式PCR 时，VP72引物探针浓度提高到3倍扩增曲线的重复性和一致性表现最佳。所以本发明实施例中，在天罗一号荧光定量PCR检测非洲猪瘟的VP72引物探针优选为：引物为0.4uM和探针为0.1uM。

在进行DNA样本检测和单酶一步法RNA检测的实施例中，为了让反应液滴瓶中反应液具有更好的储存稳定性和运输稳定性。本发明将反应液滴瓶分为两个滴瓶，A滴瓶含有qPCR预混液，B滴瓶中含有TE Buffer溶解的引物探针混合液。使用前将A滴瓶中的qPCR预混液完全滴入B滴瓶中，即可简单制备含荧光定量PCR反应液滴瓶。在实施例中选择容忍度高的荧光PCR预混液，优选以Tth聚合酶改造的抗抑制性预混液。本发明一个实验例中使用TOROIVD 5G qPCR Premix with UNG(天罗诊断)，含有PCR酶，UNG酶，氯化镁，dNTPs，dUTP，PCR缓冲液，稳定剂及增强剂全预混的PCR预混液。该预混液可在37℃热加速一个月保持性能无变化，以此作为A液。另外TE Buffer 溶解的引物探针混合液经过测试也可在37℃热加速一个月保持性能无变化。两种试剂可以室温运输和2-8℃保存。在非洲猪瘟试剂盒制作实施例中，我们将A液加入B液后的试剂可室温稳定1个周，2-8℃稳定1年。优选将反应液滴瓶分为A液滴瓶和B液滴瓶两部分。在本发明的新型冠状病毒单酶一步法 RT-qPCR检测的实施例中，反应液的滴瓶实行同样的模式，B液滴瓶仍然是引物探针混合液，但A液滴瓶是采用单酶一步法反应体系，含有TOROIVD 5G RT-qPCR Premix(天罗诊断)，含有PCR酶，UNG酶，氯化镁，dNTPs，dUTP， PCR缓冲液，稳定剂及增强剂全预混的PCR预混液。其氯化镁仅0.5-1mM，主要发挥5G聚合酶(Tth聚合酶突变体)逆转录功能是靠反应滴瓶中的锰离子。

在进行双酶一步法RNA检测的实施例中，反应液滴瓶仅含有TOROIVD 5G qPCRPremix with UNG(天罗诊断)，含有PCR酶，UNG酶，氯化镁，dNTPs， dUTP，PCR缓冲液，稳定剂及增强剂全预混的PCR预混液。将改造的MMLV和 RNase抑制剂和引物探针冻干到反应管中；这样设计避免了MMLV和RNase抑制剂容易失活，而制剂形式和滴管加样方式仍然保持一致。

本发明实施的使用的反应管主要是市场上兼容性高的0.2mL和0.1mL PCR 单管或八连管，透明或白色的。在进行DNA样本检测和单酶一步法RNA检测的实施例中无需冻干处理，仅为通用的PCR管耗材即可，可对应不同荧光PCR 仪器进行选择。在进行双酶一步法RNA检测的实施例中，定量PCR管中包含逆转录酶和RNase抑制剂及引物探针混合物。本发明发现逆转录酶和RNase 抑制剂的容忍空间非常大，从保持性能的最低添加量到最高添加量之间有10 倍空间，一般选择最高添加量的40-60之间，保证反应的足够容忍度。

本发明一些实施例子发现，滴瓶PCR的加样方式对检测的稳定性和灵敏度影响非常大。本发明中针对低拷贝模板量进行了加样方式设计验证。本发明实施例中发现PCR反应管对模板吸附及混合对检测灵敏度影响很大，并且发现PCR预混液因含甘油等物质密度很大，而样本溶液小。当采用加样方式5时低拷贝模板 (200copies/mL，5-6copies/反应)检出率最高，且检出最稳定，SD值最小。本发明实施例中均采用加样方式5进行操作，即先滴加样本1滴，后滴加预混液1 滴。在进行双酶一步法RNA检测的实施例中，需要用手轻弹管底加速混合。在使用进行DNA样本检测和单酶一步法RNA检测的实施例中直接上机检测即可，因可在反应程序中设置95℃，3-10min实现热混合。本发明发现通过此加样方式，可以让高密度的预混液在上面，而低密度的样本在下面，重力作用及加热对流混合可以完全混合完全。反之，低密度的样本在上面很难和下层混合完全，若采用颠倒混合方式，极低拷贝模板容易吸附到壁上造成检出率下降。

本发明技术实施例中，为了实现直接PCR效果且简单操作的技术效果，对反应程序具有优化要求。在使用进行DNA样本检测和单酶一步法RNA检测的实施例中，因起作用的酶为耐热PCR聚合酶，可以在反应程序中首先设置 95℃，3-10min。该步骤不仅实现了样本的热裂解，使得核酸热释放，抗体封闭的PCR酶的热启动，同时实现了反应体系的热混合。在进行双酶一步法RNA 检测的实施例中，因逆转录酶耐热性不够高，所以采用PCR循环前预设5个循环，(58℃，20-40sec，95℃，3sec-10sec)，该循环同时实现了，热启动-热混合-热裂解-逆转录-延伸，该免单独反转录步骤的程序具有更高灵敏度和更短的检测时间。

实施例1.液滴大小对扩增曲线重复性和检测效果影响

1.1实验材料

以编码非洲猪瘟VP72蛋白的质粒为模板，TE buffer为稀释液，QPT-200U(G2108271BB)为试剂，以及准备对应的引物探针(ASF-VP72-F/R/P-VIC， P-ACT-F/R/P-ROX，EC-23S-F/R/P-ROX)。

1.2实验部分

直接将配好的引物探针mix与试剂QPT-200U于滴管中混合作反应液，模板采用TEbuffer在滴管内稀释至一定梯度，直接先滴加模板，再滴加反应液，瞬时离心于天罗1号PCR仪上检测。

1.3实验结果

见图3a,多次实验，测试多个重复，结果都不佳，推测将引物探针mix与试剂预混后，再采用滴加的方式与模板混匀上机后，可能是引物探针的量不足，尝试提高引物探针的量来提升复孔间的稳定性。

2.1实验材料

以编码非洲猪瘟VP72蛋白的质粒为模板，TE buffer为稀释液，QPT-200U(G2108271BB)为试剂，以及准备对应的引物探针(ASF-VP72-F/R/P-VIC， P-ACT-F/R/P-ROX，EC-23S-F/R/P-ROX)。

2.2实验部分

直接将配好的引物探针mix按不同梯度与试剂QPT-200U于滴管中混合作反应液，模板采用TE buffer在滴管内稀释至一定梯度，直接先滴加模板，再滴加反应液，瞬时离心于天罗1号PCR仪上检测。

2.3实验结果

见图3b,多次实验，测试不同梯度下引物探针mix与试剂预混后，再采用滴加的方式与模板混匀上机后的结果，挑选最佳的引物探针添加量，其曲线的一致性都较好。但曲线的CT值相比于实际CT值都有靠后，表明在用滴管操作下曲线的CT值靠后。推测可能是将buffer体积稀释后，使得试剂组分无法达到平衡，因此尝试在引物探针mix与试剂预混后，额外添加反应buffer，使得与模板混匀后能够保持平衡。

3.1实验材料

以编码非洲猪瘟VP72蛋白的质粒为模板，TE buffer为稀释液，QPT-200U(G2108271BB)为反应液，以及准备对应的引物探针(ASF-VP72-F/R/P-VIC， P-ACT-F/R/P-ROX，EC-23S-F/R/P-ROX)，额外测试添加10×ASF-100反应 buffer。

3.2实验部分

直接将配好的引物探针mix与试剂QPT-200U于滴管中混合作反应液，额外添加不同梯度反应buffer，模板采用TE buffer在滴管内稀释至一定梯度，直接先滴加模板，再滴加反应液，瞬时离心于天罗1号PCR仪上检测。

3.3实验结果

图3c,多次实验，测试引物探针mix与试剂预混后，额外添加不同梯度反应buffer，曲线的结果与CT值并未得到明显改善。尝试改换思路，固定引物探针mix与试剂的预混液，减少每个反应中滴加的模板量，使体系从另一个方式达到平衡。

4.1实验材料

以编码非洲猪瘟VP72蛋白的质粒为模板，TE buffer为稀释液，QPT-200U(G2108271BB)为反应液，以及准备对应的引物探针(ASF-VP72-F/R/P-VIC， P-ACT-F/R/P-ROX，EC-23S-F/R/P-ROX)，额外测试添加5％曲拉通。

4.2实验部分

直接将配好的引物探针mix与试剂QPT-200U于滴管中混合作反应液，模板采用TEbuffer+5％曲拉通在滴管内稀释至一定梯度，直接先滴加模板，再滴加反应液，瞬时离心于天罗1号PCR仪上检测。

4.3实验结果

图3d,多次实验，测试引物探针mix与试剂预混后，模板采用TE buffer+5％曲拉通在滴管内稀释，结果得到明显改善，曲线的一致性提升明显， CT值明显前移达到理论CT值。

本发明发现滴瓶代替精准的移液加样，荧光PCR反应液的各组份对反应体系的容忍度非常重要。液滴大小控制在25-30uL之间时，需要控制各组份成分在15％以上的容忍度，目前也是仅能靠移液器进行荧光PCR反应的主要原因。根据本发明人已经知晓，这种容忍度，主要对荧光定量PCR反应体系组份量进行调整，尤其是qPCR预混液及引物探针浓度的优化。

实施例2.滴瓶式荧光PCR试剂盒制备

一种滴瓶式荧光PCR试剂盒，其包括采样滴瓶、反应液滴瓶和PCR反应管以及说明书，所述采样滴瓶和反应液滴瓶的滴嘴孔径一致，直径为 0.5mm～1.5mm；

采样滴瓶，所述采样滴瓶包括瓶体，滴嘴及滴嘴盖。所述滴嘴和滴嘴盖均可单独拆卸。采样滴瓶中含有缓冲液，病毒等样本裂解及灭活剂，DNA或 RNase抑制剂，液体大小调节剂。单样单管的采样实施例下，采用0.5-3mL 采样滴瓶，采样液体积为0.5-3mL。多样混管实施例下，采用3-20mL采样滴瓶，采样液体积为3mL-15mL。

采样液包含如下组分：

Tris HCL pH 7.0-8.5，5-20mM；

TritonX-100，0.5％v/v-5％v/v；

PVSA，0.05mg/mL-50mg/mL；

DTT，0.1-0.5mM；

所述荧光PCR反应液为TOROIVD^R 5G qPCR Premix with UNG(天罗诊断)。

实施例3.滴瓶式荧光PCR试剂盒在非洲猪瘟DNA病毒检测中的应用

1.样本滴瓶制作：

采用pH 8.0，10mM Tris-HCL；1mM EDTA，5％Triton X 100作为灭活型 DNA病毒保存液。将已经用提取法验证过Ct值28左右的非洲猪瘟阳性拭子样本，用灭活型DNA病毒保存液稀释10倍作为20的模板，然后用灭活型DNA 病毒保存液倍比稀释6个梯度各1mL，均放入3mL滴瓶内，制作为7个稀释梯度的非洲猪瘟阳性样本滴瓶。

2.反应液滴瓶制作：

A反应液滴瓶含500uL预混液，TOROIVD^R 5G qPCR Premix with UNG(天罗诊断)，B反应液滴瓶含有100uL TE Buffer溶解的引物探针混合液。将 500uL预混液完全滴入反应液中，制作成含非洲猪瘟荧光PCR反应液的反应液滴瓶。引物探针序列如下表，由湖州河马合成。

反应管和反应体系配制：将样本滴瓶滴一滴到0.2mL PCR八连管中，将反应液滴瓶中非洲猪瘟荧光PCR反应液滴一滴到以上管内，直接上机检测。

对照组：以上7种模板各取200uL采用病毒DNA/RNA试剂盒(厦门普康同创)进行提取，用50uL洗脱液洗脱。提取的模板分别用Animal Detection U+Probe qPCR SuperPreMix(南京诺唯赞)和II Probe qPCR SuperMix UDG(北京全式金)，按说明书推荐的引物探针浓度使用表一的VP72引物探针序列进行检测。

仪器及反应条件：

本发明的滴瓶式PCR试剂盒采用天罗一号荧光PCR仪(天罗诊断)反应程序，如下。总反应时间56min。

对照组采用CFX 96荧光PCR仪(美国Biorad)反应程序，如下。

6.检测限结果：

检测限对比如下表：

通过检测倍比稀释可以看出基于TOROIVD 5G qPCR Premix with UNG的反应体系检测灵敏度比全式金和诺唯赞灵敏度高8倍。

实施例4.滴瓶式双酶一步法荧光PCR试剂盒在新冠病毒检测中的应用

1.样本滴瓶制作：

采用pH 7.0，10mM Tris-HCL；0.06％聚乙烯磺酸钠，5％Triton X 100 作为灭活型RNA病毒保存液。采用新型冠状病毒(SASRS-CoV-2)假病毒标准物质(编号：GBW(E)091132，批号：2021031)，其中N基因浓度为2.0×105 拷贝/mL。用灭活型RNA病毒保存液将标准物质倍比稀释，选择29(390.6拷贝/mL)，210(195.3拷贝/mL)，211(97.7拷贝/mL)和212(48.8拷贝/mL). 倍比稀释时注意完全融化和完全混合，可37℃温浴稀释。

2.反应液滴瓶制作：

反应液滴瓶含300uL预混液，TOROIVD 5G qPCR Premix with UNG(天罗诊断)，大约8人份/瓶。制作适度数量的滴瓶。

3.新冠检测反应管制作：

本工作采用了中国和美国CDC公布的针对N基因检测的三套引物探针组和作为内标的人RNase P基因引物探针组，三段扩增子的基因组坐标为:N1:28287-28358；N2:29164-29230；N:28881-28979。为了降低仪器要求，将N1/N2/N三个探针序列均采取VIC荧光标记，同时RNase P基因探针以ROX进行标记来检测采样是否成功。使用国家基因组科学数据中心提供的目前新型冠状病毒变异株突变分析数据，以0.01的突变频率对三段N基因扩增子基因坐标突变情况进行了分析如下表。

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按上表引物探针浓度由上海百力合成，配合200U/uL逆转录酶反转录酶 (天罗诊断)及200U/uL RNase抑制剂(天罗诊断)各0.1uL，冻干体系为 25uL，反应体系为50uL。制备冻干PCR八连管，冻干反应管由厦门普康同创提供服务。

4.反应体系配制：

将样本滴瓶滴一滴到新冠检测反应管中，将反应液滴瓶中反应液滴一滴到以上管内，轻轻用手指弹底部或超声混合30sec，直接上机检测。

5.仪器及反应条件：

本发明的滴瓶式PCR试剂盒采用天罗一号荧光PCR仪(天罗诊断)反应程序，如下。总反应时间40min。

6.检测结果及分析：

使用滴瓶PCR试剂盒及天罗一号荧光PCR仪测试新冠病毒的检测限和检出率分析如下表。

通过上表分析，滴瓶PCR试剂盒用于新冠检测，具有200copies/mL的高灵敏度。

实施例5.滴瓶式单酶一步法荧光PCR试剂盒在新冠病毒检测中的应用：

1.样本滴瓶制作：

采用pH 7.0，10mM Tris-HCL；0.06％聚乙烯磺酸钠，5％Triton X 100， 8mM醋酸锰作为灭活型RNA病毒保存液II。采用新型冠状病毒(SASRS-CoV-2) 假病毒标准物质(编号：GBW(E)091132，批号：2021031)，其中N基因浓度为2.0×105拷贝/mL。

用灭活型RNA病毒保存液II将标准物质倍比稀释，选择29(390.6拷贝 /mL)，210(195.3拷贝/mL)，211(97.7拷贝/mL)和212(48.8拷贝/mL). 倍比稀释时注意完全融化和完全混合，可37℃温浴稀释。

2.反应液滴瓶制作：

A反应液滴瓶含500uL预混液，2.5×TOROIVD 5G 1-Step RT-qPCR Premix withUNG(天罗诊断)，B反应液滴瓶含有100uL TE Buffer溶解的按实施例 4中引物探针混合液。将500uL预混液完全滴入反应液中，制作成含反应液滴瓶。

3.反应管和反应体系配制：

将样本滴瓶滴一滴到0.2mL PCR八连管中，将反应液滴瓶中单酶一步法 PCR反应液滴一滴到以上管内，直接上机检测。

4.仪器及反应条件：

本发明的滴瓶式PCR试剂盒采用天隆48E荧光PCR仪(天罗诊断)反应程序，如下。

5.检测结果及分析：

使用滴瓶PCR试剂盒及天罗一号荧光PCR仪测试新冠病毒的检测率分析如下表。

通过上表分析，使用单酶一步法滴瓶PCR试剂盒用于新性冠状病毒检测，400copies/mL的高灵敏度。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。

Claims (10)

1.一种滴瓶式荧光PCR试剂盒，其包括采样滴瓶、反应液滴瓶，其特征在于，所述采样滴瓶和反应液滴瓶的滴嘴孔径一致，直径为0.5mm～1.5mm；所述采样滴瓶含有采样液，所述反应液滴瓶包含荧光PCR反应液；其中所述采样液含有5-20mM Tris-HCl pH 7.0-8.5；0.5％v/v-10％v/v。

2.如权利要求1所述的滴瓶式荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述采样滴瓶和反应液滴瓶均包括瓶体、滴嘴及滴嘴盖，所述瓶体的瓶口上有可撕拆的密封薄膜或铝箔膜。

3.如权利要求2所述的滴瓶式荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述采样滴瓶的滴嘴内含有滤纸或滤芯。

4.如权利要求1所述的滴瓶式荧光PCR试剂盒，其特征在于，DNA病毒检测实施例下，所述采样液含有5-20mM Tris-HCL pH 7.0-8.5，0.5-3mM EDTA，0.5-10％的表面活性剂。

5.如权利要求1所述的滴瓶式荧光PCR试剂盒，其特征在于，RNA病毒检测实施例下，所述采样液含有5-20mM Tris-HCL pH 7.0-8.5，0.5-3mM RNase抑制剂，0.5-10％的表面活性剂。

6.如权利要求5所述的滴瓶式荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为TritonX 100，NP-40，吐温20，吐温80或聚乙二醇中之一。

7.如权利要求1所述的滴瓶式荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述采样液包含如下组分：

Tris HCl pH 7.0-8.5，5-20mM；

TritonX-100，0.5％v/v-5％v/v；

聚乙烯磺酸钠，0.05mg/mL-50mg/mL；

DTT，0.1-0.5mM。

8.如权利要求1所述的滴瓶式荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR反应液为TOROIVD^R 5G qPCR Premix with UNG。

9.如权利要求1所述的滴瓶式荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述滴瓶式荧光PCR试剂盒还含管PCR反应管。

10.权利要求1-9中任一项所述滴瓶式荧光PCR试剂盒的使用方法，其特征在于，包括下列步骤：

S1：样本采集：拭子类样本，采集后直接放入及折断到采样滴瓶，挤压释放；

S2：将采样滴瓶里的样本上下混合后滴入反应管1滴，然后再将反应液滴瓶中荧光PCR反应液上下混合后滴入一滴到反应管；手指轻弹混合直接放入荧光PCR仪进行实时荧光PCR检测。