CN117431277A - 一种发酵生产l-氨基酸的方法 - Google Patents

一种发酵生产l-氨基酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117431277A
CN117431277A CN202210828534.8A CN202210828534A CN117431277A CN 117431277 A CN117431277 A CN 117431277A CN 202210828534 A CN202210828534 A CN 202210828534A CN 117431277 A CN117431277 A CN 117431277A
Authority
CN
China
Prior art keywords
corn steep
steep liquor
supernatant
fermentation
hydrolysate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210828534.8A
Other languages
English (en)
Inventor
宫卫波
张苏龙
王晓平
赵津津
李岩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Original Assignee
Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd filed Critical Langfang Meihua Bio Technology Development Co Ltd
Priority to CN202210828534.8A priority Critical patent/CN117431277A/zh
Publication of CN117431277A publication Critical patent/CN117431277A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及微生物发酵培养技术领域，具体公开了一种发酵生产L‑氨基酸的方法。本发明的发酵生产L‑氨基酸的方法，其中，发酵培养基中含有经过前处理后的玉米浆和/或玉米浆水解液，所述前处理包括以黄血盐与所述玉米浆的离心上清液或所述玉米浆水解液进行反应、离心后，获得第一清液的步骤。本发明选用黄血盐对发酵培养基中的玉米浆和/或玉米浆水解液进行前处理，可以保证玉米浆原料批次物质含量的稳定性，提高其在后续发酵使用中的性能。

Description

一种发酵生产L-氨基酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵培养技术领域，具体地说，涉及一种发酵生产L-氨基酸的方法。
背景技术
目前，微生物发酵法生产L-氨基酸，发酵主要是采用以玉米淀粉水解糖或糖蜜为碳源、以玉米浆、水解液、酵母膏、蛋白胨和铵盐、硝酸盐、尿素、氨水和液氨等为氮源发酵法生产。其工艺优化包括溶氧、控制碳源和氮源、甜菜碱用量和其他维生素等。
其中，玉米浆是玉米淀粉生产的副产物，其中含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素等营养物质，是微生物培养常用的有机氮源，常用于氨基酸(例如：L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸等)等微生物代谢产物的发酵生产。然而，玉米浆中微量元素、氨基酸、维生素等营养物质的含量受玉米的品种、产地、玉米浆的存放和运输的时间和条件等因素的影响，会存在较大差异，这使得将不同生产产地、不同生产批次的玉米浆用于作为微生物培养时，不可避免地会引起微生物生长、目标产物产量等发酵性能的波动。因此，有必要对如何减少其批次效应和波动对微生物培养造成的不利影响，更好地控制微生物生长和目标产物的生产及其稳定性进行进一步研究。
发明内容
为了克服现有技术的缺点，本发明提供一种可以保证玉米浆原料批次物质含量稳定性，提高其在后续发酵使用中的性能的方法。
为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
一种发酵生产L-氨基酸的方法，其中发酵培养基中含有经过前处理后的玉米浆和/或玉米浆水解液，所述前处理包括以黄血盐与所述玉米浆的离心上清液或所述玉米浆水解液进行反应、离心后，获得第一清液的步骤。
本发明对玉米浆类原料(玉米浆和/或玉米浆水解液)进行了特定的加工处理，可有效避免因原料批次间离子元素的差异而导致的发酵性能不稳定问题，并提升了玉米浆类原料的发酵性能。
本发明在研发时发现，目前现有技术中并没有特别成熟的避免玉米浆发酵批次效应的方法，而且黄血盐针对不同的处理对象，并没有统一的作用效果(有些研究结论还是互相矛盾的)，本发明是在不断摸索下，才最终获得了本发明的成功方案。
本发明的方法中，所述前处理还包括将所述第一清液与氯化铁反应的步骤。
本发明在研究时发现，以黄血盐处理玉米浆类原料后，再加入特定的铁盐可有效避免黄血盐在原料中的残留，以防对后续发酵环节产生不利影响。
本发明的方法中，所述玉米浆的离心上清液或所述玉米浆水解液与所述黄血盐反应时，所述黄血盐与所述玉米浆的离心上清液或所述玉米浆水解液的质量体积比为(0.6-1):1.2g/L，反应温度为25-30℃，pH为7.0。
优选，所述黄血盐与所述玉米浆的离心上清液或所述玉米浆水解液的质量体积比为1:1.2g/L，反应温度为30℃，pH为7.0。
本发明研究时发现，黄血盐反应时的pH值对反应结果影响较大，过高或过低均会影响反应结果。
本发明的方法中，所述第一清液与氯化铁反应时，所述氯化铁与所述第一清液的质量体积比为(0.2-0.4):1g/L，反应温度为25-30℃，pH为7.0。
优选，所述氯化铁与所述第一清液的质量体积比为0.4:1g/L，反应温度为30℃，pH为7.0。
本发明在研究去除黄血盐的物质时，也进行了大量摸索，发现氯化铁的效果最佳。
作为一个具体实施方式，本发明的方法中，当进行所述玉米浆的前处理时，包括如下步骤：
(1)将所述玉米浆离心，获得所述玉米浆的离心上清液；
(2)将所述玉米浆的离心上清液与黄血盐混合，在温度25-30℃，pH为7.0下搅拌反应，离心后收集上清液作为所述第一清液；
(3)将所述第一清液与氯化铁混合，在25-30℃，pH为7.0下搅拌反应，离心后收集上清液作为精制的玉米浆清液；
当进行所述玉米浆水解液的前处理时，包括如下步骤：
(1)将所述玉米浆水解液与黄血盐混合，在温度25-30℃，pH为7.0下搅拌反应，离心后收集上清液作为所述第一清液；
(2)将所述第一清液与氯化铁混合，在25-30℃，pH为7.0下搅拌反应，离心后收集上清液作为精制的玉米浆水解液。
本发明的方法中，当进行所述玉米浆的前处理时，步骤(1)中的离心的转速为4000rpm，时间为10min；步骤(2)中的离心的转速为10000rpm，时间为10min；步骤(3)中的离心的转速为10000rpm，时间为10-30min；
当进行所述玉米浆水解液的前处理时，步骤(1)中的离心的转速为10000rpm，时间为10-30min；步骤(2)中的离心的转速为10000rpm，时间为10min。
本发明的方法中，所述发酵培养基中包括所述精制的玉米浆清液、所述玉米浆前处理时步骤(1)中离心后获得的玉米浆沉淀和所述精制的玉米浆水解液；
优选，所述玉米浆沉淀和所述精制的玉米浆清液的质量体积比为0.2:1kg/L，可更有利于提升氨基酸转化率和产量。
本发明的发酵培养基在使用时，还针对不同的发酵菌进行培养基中其他物质的选择，以保证培养基中的各营养、离子元素可适宜发酵菌进行氨基酸生产。
本发明的方法中，所述L-氨基酸为L-苏氨酸、L-赖氨酸或L-谷氨酸。
本发明的有益效果至少在于：
本发明提供了一种操作简单，可有效避免因玉米浆原料批次间离子元素的差异而导致的发酵性能不稳定，并有效提升了玉米浆类原料的发酵性能，为提升发酵生产氨基酸的效果，提供了一种新的方案。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或按本领域常规方法制备。
本发明中，各实施例和对比例中使用的原料玉米浆和玉米浆水解液为廊坊玉米浆和廊坊玉米浆水解液。
本发明中，各实施例和对比例中使用的原料玉米浆的主要指标如下：氨基氮1.8％，乳酸3.0％，pH 3.9，波美21，干物36％，黄褐色，玉米浆中除含有丰富的氨基酸，蛋白质外，还含有钙离子，镁离子，钾离子，钠离子等多种金属离子。
各实施例和对比例中使用的原料玉米浆水解液为玉米浆的硫酸水解液，其主要指标如下：氨基氮1.9％，pH 1.5，黑色，其中含有丰富的氨基酸，大量的硫酸根和少量的微量元素。
实施例1
本实施例提供一种玉米浆的处理方法，具体包括：
(1)取2L玉米浆，常温常压4000rpm离心10min，得到上清液(玉米浆清液)和玉米浆沉淀；
(2)取步骤(1)得到的玉米浆清液1.2L加入黄血盐0.6g，氨水调节pH7.0，温度25℃，搅拌10min后，常温常压10000rpm离心10min，收集上清液(第一清液)；
(3)取步骤(2)得到的第一清液1L，加入0.2g氯化铁后，温度25℃，搅拌频率50Hz，加氨水调节pH7.0，维持10min后，将反应物于常温常压10000rpm离心10min，收集上清液，得到精制的玉米浆清液。
本实施例还提供一种玉米浆水解液的处理方法，该方法包括如下步骤：
(1)取玉米浆水解液1.2L加入黄血盐0.6g，氨水调节pH7.0，温度25℃，搅拌10min后，常温常压10000rpm离心10min，收集上清液(第一清液)；
(2)取步骤(1)得到的第一清液1L，加入0.2g氯化铁后，温度25℃，加氨水调节pH7.0，搅拌频率50Hz，维持10min后，将反应物于常温常压条件下10000rpm离心10min，收集上清液，得到精制的玉米浆水解液。
实施例2
本实施例提供一种玉米浆的处理方法，该方法包括如下步骤：
(1)取2L玉米浆，常温常压4000rpm离心10min，得到上清液(玉米浆清液)和玉米浆沉淀；
(2)取步骤(1)得到的玉米浆清液1.2L加入黄血盐1g，温度30℃，氨水调节pH7.0，搅拌10min后，10000rpm离心10min，收集上清液(第一清液)；
(3)取步骤(2)得到的第一清液1L，加入0.4g氯化铁后，温度30℃，搅拌30Hz，维持10min后，加氨水调节pH7.0，将反应物于常温常压条件下10000rpm离心30min，收集上清液，得到精制的玉米浆清液。
本实施例还提供一种玉米浆水解液的处理方法，该方法包括如下步骤：
(1)取玉米浆水解液1.2L加入黄血盐1g，温度30℃，氨水调节pH7.0，搅拌10min后，常温常压10000rpm离心30min，收集上清液(第一清液)；
(2)取步骤(1)得到的第一清液1L，加入0.4g氯化铁后，温度30℃，加氨水调节pH7.0，搅拌频率30Hz，维持10min后，将反应物于常温常压条件下10000rpm离心10min，收集上清液，得到精制的玉米浆水解液。
对比例1
本对比例提供一种玉米浆的处理方法，该方法与实施例2的玉米浆处理方法基本相同，区别仅在于，步骤(2)中氨水调节pH至5.0。
本对比例还提供一种玉米浆水解液的处理方法，该方法与实施例2的玉米浆水解液的处理方法基本相同，区别仅在于，步骤(1)中氨水调节pH至5.0。
对比例2
本对比例提供一种玉米浆的处理方法，该方法与实施例2的玉米浆处理方法基本相同，区别仅在于，步骤(2)中氨水调节pH至6.0。
本对比例还提供一种玉米浆水解液的处理方法，该方法与实施例2的玉米浆水解液的处理方法基本相同，区别仅在于，步骤(1)中氨水调节pH至6.0。
对比例3
本对比例提供一种玉米浆的处理方法，该方法与实施例2的玉米浆处理方法基本相同，区别仅在于，步骤(2)中氨水调节pH至8.0。
本对比例还提供一种玉米浆水解液的处理方法，该方法与实施例2的玉米浆水解液的处理方法基本相同，区别仅在于，步骤(1)中氨水调节pH至8.0。
对比例4
本对比例提供一种玉米浆的处理方法，该方法与实施例2的玉米浆处理方法基本相同，区别仅在于，步骤(3)中氯化铁更改为0.71g七水硫酸锌。
本对比例还提供一种玉米浆水解液的处理方法，该方法与实施例2的玉米浆水解液的处理方法基本相同，区别仅在于，步骤(2)氯化铁更改为0.71g七水硫酸锌。
对比例5
本对比例提供一种玉米浆的处理方法，该方法与实施例2的玉米浆处理方法基本相同，区别仅在于，步骤(3)中氯化铁更改为0.7g七水硫酸铜。
本对比例还提供一种玉米浆水解液的处理方法，该方法与实施例2的玉米浆水解液的处理方法基本相同，区别仅在于，步骤(2)氯化铁更改为0.7g七水硫酸铜。
对比例6
本对比例提供一种玉米浆的处理方法，该方法与实施例2的玉米浆处理方法基本相同，区别仅在于，步骤(3)中氯化铁更改为0.68g七水硫酸亚铁。
本对比例还提供一种玉米浆水解液的处理方法，该方法与实施例2的玉米浆水解液的处理方法基本相同，区别仅在于，步骤(2)氯化铁更改为0.68g七水硫酸亚铁。
实验例1
本实验例对各实施例和对比例的处理方法中黄血盐处理后制得的第一清液中的主要无机盐离子含量进行了检测，结果如表1-表4所示，结果表明，特定黄血盐处理方式可有效去除玉米浆和玉米浆水解液中的铁、锌、钙和锰离子。其中，就目前的检测项目而言，对比例1、2的处理结果与实施例类似，但原料处理时还会改变其他未列举的物质的含量，故各方案最终效果的验证还有赖于下述的发酵实验。
表1
表2
表3
表4
实验例2
将实施例2的玉米浆处理方法中步骤(1)制得的玉米浆沉淀与步骤(3)制得的精制的玉米浆清液按表5所示的比例混合，得到精制的玉米浆。
表5
利用上述制得的精制的玉米浆A-E和实施例2的方法制得的精制玉米浆水解液配制L-苏氨酸的种子培养基和发酵培养基，具体配方如下：
种子培养基：精制的玉米浆A、B、C、D或E15g/L，精制的玉米浆水解液5g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 2g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO4·H2O 20mg/L，ZnSO4·7H2O 0.05mg/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1mg/L，CuSO4·5H2O 0.05mg/L，CoCl2·6H2O 0.05mg/L，VB1 1mg/L，VB3 2mg/L，VB7 0.2mg/L；共配制五种种子培养基；
L-苏氨酸发酵培养基：精制的玉米浆A、B、C、D或E 5g/L，精制的玉米浆水解液5g/L，葡萄糖40g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 2g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO4·H2O 20mg/L，ZnSO4·7H2O0.05mg/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05mg/L，CuSO4·5H2O0.05mg/L，CoCl2·6H2O 0.05mg/L，VB1 1mg/L，VB3 2mg/L，VB7 0.2mg/L；共配制五种发酵培养基。
以添加未处理的玉米浆和玉米浆水解液的培养基作为对照组，对照组的培养基配方如下(其中，未处理的玉米浆和玉米浆水解液所含的元素组成见表1)：
种子培养基：玉米浆15g/L，玉米浆水解液5g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O 0.46g/L，KH2PO4 2g/L，FeSO4·7H2O 9mg/L，MnSO4·H2O19.2mg/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2MoO4·2H2O0.1mg/L，CuSO4·5H2O0.05mg/L，CoCl2·6H2O 0.05mg/L，VB1 1mg/L，VB3 2mg/L，VB70.2mg/L；
发酵培养基：玉米浆5g/L，玉米浆水解液5g/L，葡萄糖40g/L，MgSO4·7H2O 0.46g/L，KH2PO4 2g/L，FeSO4·7H2O 9mg/L，MnSO4·H2O19.2mg/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2MoO4·2H2O0.05mg/L，CuSO4·5H2O0.05mg/L，CoCl2·6H2O 0.05mg/L，VB1 1mg/L，VB3 2mg/L，VB70.2mg/L。
使用上述种子培养基和发酵培养基(添加精制的玉米浆A的种子培养基配套使用添加精制的玉米浆A的发酵培养基，以此类推)进行L-苏氨酸发酵生产菌株的培养，具体方法如下：
种子培养：采用L-苏氨酸发酵生产用大肠杆菌MHZ-0216-5(菌株MHZ-0216-5的构建方法参见中国专利申请CN113846132A)，将甘油管冻存菌种首先涂布于LB培养基活化培养过夜，挑取一定量菌落接种于装有1000mL种子培养基的5L三角瓶中，放入恒温往复式摇床中振荡培养，转速120rpm，温度37℃，培养8-12h至种子液中菌种的浓度为OD600＝10后结束培养。
发酵培养：将培养好的种子液接入装有20L发酵培养基的50L发酵罐中，通气量0.8vvm，转速300rpm，培养pH7.0，温度37℃，溶氧30％。
待发酵液中残糖量为0.1g/L开始流加碳源，氮源氨水作为pH调节剂控制pH 7.0。配制50％的葡萄糖溶液作为流加碳源，利用25％的氨水作为流加氮源。
使用SBA生物传感仪测定葡萄糖含量，HPLC测定L-苏氨酸含量。发酵结果表明(表6)，种子培养基和发酵培养基中添加未处理玉米浆时L-苏氨酸产量为106.5g/L，转化率55.1％，种子培养基和发酵培养基中添加各种精制的玉米浆时，产量最高可达117.1g/L，转化率可达58.3％，明显高于添加未处理玉米浆。
表6
以下实验中所述精制的玉米浆，均指本实验例中的精制的玉米浆C。
实验例3
将各实施例和对比例制得的精制的玉米浆清液与玉米浆沉淀按照1L：0.2kg混合，得到各实施例和对比例对应的精制的玉米浆，利用各实施例和对比例对应的精制的玉米浆及其制得的精制的玉米浆水解液配制L-苏氨酸的种子培养基和发酵培养基，具体配方如下：
L-苏氨酸种子培养基：精制的玉米浆15g/L，精制的玉米浆水解液5g/L，葡萄糖20g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 2g/L，FeSO4·7H2O20mg/L，MnSO4·H2O 20mg/L，ZnSO4·7H2O 0.05mg/L，(NH4)2SO45g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1mg/L，CuSO4·5H2O 0.05mg/L，CoCl2·6H2O0.05mg/L，VB1 1mg/L，VB3 2mg/L，VB7 0.2mg/L；
L-苏氨酸发酵培养基：精制的玉米浆5g/L，精制的玉米浆水解液5g/L，葡萄糖40g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO4 2g/L，FeSO4·7H2O20mg/L，MnSO4·H2O 20mg/L，ZnSO4·7H2O0.05mg/L，(NH4)2SO45g/L，Na2MoO4·2H2O 0.05mg/L，CuSO4·5H2O 0.05mg/L，CoCl2·6H2O0.05mg/L，VB1 1mg/L，VB3 2mg/L，VB7 0.2mg/L。
分别使用上述各实施例、对比例的精制的玉米浆、玉米浆水解液配制的培养基进行L-苏氨酸发酵生产菌株的培养，具体方法如下：
种子培养：采用L-苏氨酸发酵生产用大肠杆菌MHZ-0216-5，将甘油管冻存菌种首先涂布于LB培养基活化培养过夜，挑取一定量菌落接种于装有1000mL种子培养基的5L三角瓶中，放入恒温往复式摇床中振荡培养，转速120rpm，温度37℃，培养8-12h至种子液中菌种的浓度为OD600＝10后结束培养。
发酵培养：将培养好的种子液接入装有20L发酵培养基的50L发酵罐中，通气量0.8vvm，转速300rpm，培养pH7.0，温度37℃，溶氧30％。
待发酵液中残糖量为0.1g/L开始流加碳源，氮源氨水作为pH调节剂控制pH7.0。配制50％的葡萄糖溶液作为流加碳源，利用25％的氨水作为流加氮源。
使用SBA生物传感仪测定葡萄糖含量，HPLC测定L-苏氨酸含量。发酵结果如表7所示。
表7
实验例4
利用实验例2中的精制的玉米浆和实施例2制得的精制的玉米浆水解液配制L-赖氨酸的种子培养基和发酵培养基(实验组)，具体配方如下：
L-赖氨酸种子培养基：葡萄糖60g/L，(NH4)2SO4 25g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，精制的玉米浆20g/L，精制的玉米浆水解液10g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，ZnSO4·7H2O0.05mg/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1mg/L，CuSO4·5H2O0.05mg/L，CoCl2·6H2O 0.05mg/L，VB1 1mg/L，VB3 2mg/L，VB7 0.5mg/L；
L-赖氨酸发酵培养基：葡萄糖40g/L，(NH4)2SO4 25g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，精制的玉米浆10g/L，精制的玉米浆水解液10g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，ZnSO4·7H2O0.05mg/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1mg/L，CuSO4·5H2O0.05mg/L，CoCl2·6H2O 0.05mg/L，VB1 1mg/L，VB3 2mg/L，VB7 0.15mg/L。
以添加未处理的玉米浆和玉米浆水解液的培养基作为对照组，对照组的培养基配方如下(其中，未处理的玉米浆和玉米浆水解液所含的元素组成见表1)：
种子培养基：葡萄糖60g/L，(NH4)2SO4 25g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.94g/L，玉米浆20g/L，玉米浆水解液10g/L，MnSO4·H2O 8.8mg/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2MoO4·2H2O0.1mg/L，CuSO4·5H2O 0.05mg/L，CoCl2·6H2O 0.05mg/L，VB1 1mg/L，VB3 2mg/L，VB70.5mg/L；
发酵培养基：葡萄糖40g/L，(NH4)2SO4 25g/L，KH2PO4 2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.96g/L，玉米浆10g/L，玉米浆水解液10g/L，MnSO4·H2O 8.8mg/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2MoO4·2H2O0.1mg/L，CuSO4·5H2O 0.05mg/L，CoCl2·6H2O 0.05mg/L，VB1 1mg/L，VB3 2mg/L，VB70.15mg/L。
分别使用上述实验组和对照组的培养基进行L-赖氨酸发酵生产菌株的培养，具体方法如下：
种子培养：采用保藏编号CGMCC No.22648的大肠杆菌(大肠埃希氏菌(Escherichia coli)MHZ-0914现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.22648，保藏日期2021年6月1日，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli)，将甘油管冻存菌种首先涂布于LB培养基活化培养过夜，挑取一定量菌落接种于装有1000mL种子培养基的5L三角瓶中，放入恒温往复式摇床中振荡培养，转速120rpm，温度37℃，种子生长至OD600＝20时停止培养。
发酵培养：初始培养温度37℃，调节风量0.5-0.8vvm、转速300-700rpm和罐压0.07MPa，控制过程溶氧20％以上。配制50％的葡萄糖溶液作为碳源，利用25％的氨水作为氮源和pH调节剂，发酵过程控制pH7.0，温度37℃，溶氧30％，发酵周期36h。发酵过程中发酵液中葡萄糖的浓度控制在0.1g/L左右。
使用SBA生物传感仪测定葡萄糖含量，HPLC测定L-赖氨酸含量。实验组放罐发酵液中L-赖氨酸产量为201.5g/L，较对照组的L-赖氨酸产量(197.6g/L)提高3.9g/L，糖酸转化率为70.1％，较对照组发酵L-赖氨酸转化率(68.4％)提高1.7％。
实验例5
利用实验例2中的精制的玉米浆和实施例2制得的精制的玉米浆水解液配制L-谷氨酸的种子培养基和发酵培养基(实验组)，具体配方如下：
L-谷氨酸种子培养基：葡萄糖40g/L，精制的玉米浆30g/L，精制的玉米浆水解液15g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 1.2g/L，VB1 100μg/L，生物素200μg/L，VB3 3mg/L，FeSO4·7H2O 5mg/L，MnSO4·H2O 5mg/L，琥珀酸1.5g/L，ZnSO4·7H2O 0.05mg/L，(NH4)2SO45g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1mg/L，CuSO4·5H2O 0.05mg/L，CoCl2·6H2O0.05mg/L。
L-谷氨酸发酵培养基：葡萄糖50g/L，精制的玉米浆60g/L，精制的玉米浆水解液30g/L，K2HPO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，VB1 200μg/L，生物素300μg/L，VB3 3mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，琥珀酸3g/L，ZnSO4·7H2O 0.05mg/L，(NH4)2SO45g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1mg/L，CuSO4·5H2O 0.05mg/L，CoCl2·6H2O0.05mg/L。
以添加未处理的玉米浆和玉米浆水解液的培养基作为对照组，对照组的培养基配方如下(其中，未处理的玉米浆和玉米浆水解液所含的元素组成见表1)：
种子培养基：葡萄糖40g/L，玉米浆30g/L，玉米浆水解液15g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 1.1g/L，VB1 100μg/L，生物素200μg/L，VB3 3mg/L，MnSO4·H2O 3.2mg/L，琥珀酸1.5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1mg/L，CuSO4·5H2O 0.05mg/L，CoCl2·6H2O0.05mg/L；
发酵培养基：葡萄糖50g/L，玉米浆60g/L，玉米浆水解液30g/L，K2HPO4 3g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，VB1 200μg/L，生物素300μg/L，VB3 3mg/L，MnSO4·H2O 6.4mg/L，琥珀酸3g/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2MoO4·2H2O 0.1mg/L，CuSO4·5H2O 0.05mg/L，CoCl2·6H2O0.05mg/L。
分别使用上述实验组和对照组的培养基进行L-谷氨酸发酵生产菌株的培养，具体方法如下：
种子培养：采用生产用温敏型谷氨酸棒杆菌MHZ-0112-8(谷氨酸棒杆菌MHZ-0112-8已于2015年12月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.11941，分类命名为谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum，该菌株已在专利CN105695383B中公开)。将甘油管冻存菌种首先涂布于LB培养基活化培养过夜，挑取一定量菌落接种于装有1000mL种子培养基的5L三角瓶中，放入恒温往复式摇床中振荡培养，转速120rpm，温度32℃，培养8-12h至种子液OD562达到20以上后结束培养。
发酵培养：将L-谷氨酸发酵培养基接入50L发酵罐中，121℃灭菌20min，降温至37℃，取种子液接入50L发酵罐中，初始培养温度32℃，培养至发酵液OD562达到40以上后升温至37℃，24h后升温至39℃，调节通风量0.5-0.8vvm、转速300-700rpm和罐压0.05MPa，控制过程溶氧20％以上。配制50％的葡萄糖溶液作为碳源，利用25％的氨水作为氮源并作为pH控制手段，调节pH7.0。发酵周期32h。发酵过程中发酵液中葡萄糖的浓度控制在0.1g/L左右。
使用SBA生物传感仪测定葡萄糖含量，HPLC测定L-谷氨酸含量。实验组放罐发酵液中L-谷氨酸产量为201.9g/L，较对照组的L-谷氨酸的产量(197.3g/L)提高了4.6g/L，糖酸转化率为69.1％，转化率较对照组发酵L-谷氨酸(66.8％)提高了2.3％。
实验例6
按照实验例3中的方法(包括菌株、培养基和发酵条件)进行发酵，与实验例3的区别仅在于，将实施例3中L-苏氨酸种子培养基和发酵培养基中的精制的玉米浆和精制的玉米浆水解液，替换为不同产地来源的玉米浆和玉米浆水解液分别按照实施例2的方法进行处理得到的精制的玉米浆和精制的玉米浆水解液，作为实验组。并设对照组，其菌株、发酵条件与上述实验组相同，区别仅在于，本对照组的L-苏氨酸种子培养基和发酵培养基以实验例2中的对照组相应培养基为基础，以未处理的不同产地来源的玉米浆和玉米浆水解液替代实验例2中的对照组相应培养基中的玉米浆和玉米浆水解液，其余组分相同。具体发酵实验结果如表8所示。
表8
从中可知，实验组的发酵结果更稳定，转化率更佳。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种发酵生产L-氨基酸的方法，其特征在于，发酵培养基中含有经过前处理后的玉米浆和/或玉米浆水解液，所述前处理包括以黄血盐与所述玉米浆的离心上清液或所述玉米浆水解液进行反应、离心后，获得第一清液的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述前处理还包括将所述第一清液与氯化铁反应的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述玉米浆的离心上清液或所述玉米浆水解液与所述黄血盐反应时，所述黄血盐与所述玉米浆的离心上清液或所述玉米浆水解液的质量体积比为(0.6-1):1.2g/L，反应温度为25-30℃，pH为7.0。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述黄血盐与所述玉米浆的离心上清液或所述玉米浆水解液的质量体积比为1:1.2g/L，反应温度为30℃，pH为7.0。
5.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，所述第一清液与氯化铁反应时，所述氯化铁与所述第一清液的质量体积比为(0.2-0.4):1g/L，反应温度为25-30℃，pH为7.0。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述氯化铁与所述第一清液的质量体积比为0.4:1g/L，反应温度为30℃，pH为7.0。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，当进行所述玉米浆的前处理时，包括如下步骤：
(1)将所述玉米浆离心，获得所述玉米浆的离心上清液；
(2)将所述玉米浆的离心上清液与黄血盐混合，在温度25-30℃，pH为7.0下搅拌反应，离心后收集上清液作为所述第一清液；
(3)将所述第一清液与氯化铁混合，在25-30℃，pH为7.0下搅拌反应，离心后收集上清液作为精制的玉米浆清液；
当进行所述玉米浆水解液的前处理时，包括如下步骤：
(1)将所述玉米浆水解液与黄血盐混合，在温度25-30℃，pH为7.0下搅拌反应，离心后收集上清液作为所述第一清液；
(2)将所述第一清液与氯化铁混合，在25-30℃，pH为7.0下搅拌反应，离心后收集上清液作为精制的玉米浆水解液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当进行所述玉米浆的前处理时，步骤(1)中的离心的转速为4000rpm，时间为10min；步骤(2)中的离心的转速为10000rpm，时间为10min；步骤(3)中的离心的转速为10000rpm，时间为10-30min；
当进行所述玉米浆水解液的前处理时，步骤(1)中的离心的转速为10000rpm，时间为10-30min；步骤(2)中的离心的转速为10000rpm，时间为10min。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中包括所述精制的玉米浆清液、所述玉米浆前处理时步骤(1)中离心后获得的玉米浆沉淀和所述精制的玉米浆水解液；
优选，所述玉米浆沉淀和所述精制的玉米浆清液的质量体积比为0.2:1kg/L。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述L-氨基酸为L-苏氨酸、L-赖氨酸或L-谷氨酸。
CN202210828534.8A 2022-07-13 2022-07-13 一种发酵生产l-氨基酸的方法 Pending CN117431277A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210828534.8A CN117431277A (zh) 2022-07-13 2022-07-13 一种发酵生产l-氨基酸的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210828534.8A CN117431277A (zh) 2022-07-13 2022-07-13 一种发酵生产l-氨基酸的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117431277A true CN117431277A (zh) 2024-01-23

Family

ID=89548513

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210828534.8A Pending CN117431277A (zh) 2022-07-13 2022-07-13 一种发酵生产l-氨基酸的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117431277A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106011216B (zh) 一种微生物联合培养生产1,5-戊二胺的方法
CN112626143A (zh) 一种l-赖氨酸的发酵方法
JPH044887A (ja) Ｌ―リジンの発酵的製造法
CN117431277A (zh) 一种发酵生产l-氨基酸的方法
CN114921502B (zh) 一种基于微生物生理参数进行反馈调控氮源流加的戊二酸生产方法
JPS58158185A (ja) 生育の改善されたアミノ酸生産菌の育種方法
JP3074781B2 (ja) 発酵法によるｌ−リジンの製造法
CN106086099B (zh) L-缬氨酸发酵培养基及用其生产l-缬氨酸的发酵方法
CN113502308B (zh) 一种基于氧化还原电位调控好氧发酵生产维生素b12的方法
CN114875090B (zh) 一种生产赖氨酸的方法及应用
CN117106607A (zh) 一种玉米浆或玉米浆水解液的处理方法
CN112195117A (zh) 一株大肠杆菌及其在生物催化生产低副产物烟酰胺中的应用
CN112662609B (zh) 一种用于提高β-丙氨酸产量的发酵培养基及应用方法
CN111172212A (zh) 一种高含量聚谷氨酸的发酵方法
CN113817627B (zh) 一种嗜乙酰乙酸棒杆菌及以氨态氮浓度控制进行谷氨酰胺发酵的方法
CN116287046A (zh) 一种氨基酸发酵培养基及半连续发酵生产赖氨酸的方法
CN114606276B (zh) 提高l-苏氨酸发酵产量的方法
CN116042753B (zh) 一种玉米浆菌体蛋白复合水解液的制备方法及l-异亮氨酸的制备方法
CN116606795A (zh) 提高氨基酸发酵产酸的方法
CN117987485A (zh) 一种发酵生产l-苏氨酸的方法、培养基及其应用
CN116656755A (zh) 培养基灭菌方法及其在l-氨基酸发酵生产中的应用
CN117903983A (zh) 一种谷氨酸棒杆菌突变株、其菌剂及其在l-精氨酸发酵中的应用
JPS62289192A (ja) アミノ酸の連続発酵生産方法
CN116218926A (zh) 一种生产酸性氨基酸的方法及应用
US3138540A (en) Manufacture of glutamic acid by fermentation

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination