CN117414525A - 作为疫苗递送载体的多孔微针贴片及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种作为疫苗递送载体的多孔微针贴片及其制备方法，包括涂层多孔微针贴片和分层多孔微针贴片，所述涂层多孔微针贴片由含有疫苗药物的多孔微针针体部分和含有佐剂药物的涂层部分组成；所述分层多孔微针贴片由可与微针针体快速分离的背衬部分和含有疫苗药物的多孔微针针体组成。本发明的涂层多孔微针贴片，孔隙率高，提取速度快，针体机械强度高，能够满足载药量和皮肤刺入的需求，实现佐剂和疫苗的分批递送，保证了多孔微针递送疫苗的免疫效果；在此基础上所制备的分层多孔微针贴片，大大缩短了微针给药时间；本发明不仅保证了递送药物的有效性，而且减少注射痛苦，提高了患者依从性。

Description

作为疫苗递送载体的多孔微针贴片及其制备方法
技术领域
本发明属于疫苗递送技术领域，具体地说是涉及一种作为疫苗递送载体的多孔微针贴片及其制备方法。
背景技术
微针(microneedle)是一种新型皮内给药系统，通常由微米级的针阵列组成，可以刺破皮肤的表皮层到达真皮层而不触及到神经末梢，因此可以通过皮肤达到近乎无痛和无创的给药。除了将药物准确递送至皮肤真皮层外，微针的制备和运输成本低，与其他注射途径相比，避免了针头恐惧和危险，提高了患者的依从性，因此在疫苗递送方面拥有广阔的前景。目前微针已被用于递送多种疫苗,如减毒活疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗等，并表现出了良好经皮免疫效果，在流感、结核病等传染性疾病及癌症疾病的预防和治疗方面发挥重要作用。
微针按结构可分为：溶解微针、空心微针、多孔微针和涂层微针。溶解微针由疫苗和佐剂与水溶性材料共混制备，疫苗均匀分散于微针针体中，微针刺入皮肤后溶解并将疫苗等释放，疫苗被皮肤中大量的抗原呈递细胞所捕获，从而迅速刺激机体产生相应的免疫反应。然而，目前溶解微针的制备工艺过程中灌装、离心、干燥等操作步骤，可能对疫苗的稳定性和活性产生不利影响，而且由于制备材料本身的问题，溶解微针可能存在机械强度不足的缺点；空心微针实际上是微米级的注射器，通过连接外部的注射设备可以精确控制给药的剂量和速度，但空心微针脆性较强，容易发生断裂，且在给药时容易被皮肤组织堵塞；涂层微针是指将疫苗等药物包裹在微针表面的一类微针，微针插入皮肤后，涂层溶解在皮肤内，实现药物递送。由于这种微针针体的内部空间无法利用，再加上微针的表面积有限，这大大限制了疫苗等药物的给药量。
为了避免上述几种微针递送疫苗的缺陷，我们选择多孔微针用于递送疫苗。多孔微针通常由无机材料、生物相容性金属或聚合物制成，由于针体存在相互连接的孔隙，使得多孔微针通过孔隙所产生的毛细管作用主动吸附药物溶液或皮肤间质液，实现治疗、监测或诊断的作用。多孔微针的载药方式可以将微针制备与药物加载过程分离，减少疫苗等大分子药物在制备过程中的损耗和失活，也可大大缩短制备周期。多孔微针的针体内部和表面都含有丰富的孔洞，足够吸附满足载药量的疫苗药物，而且采用生物相容性聚合物制备多孔微针，可以避免微针断裂留在皮内引起的安全问题。
由于疫苗溶液基本都是水溶液，因此多孔微针应当由水不溶性材料制备，以避免在加载疫苗时微针就被溶解破坏。而且为了可以负载疫苗等大分子药物，制备的多孔微针的孔径应当大于疫苗的粒径，因此需要对制备多孔微针的材料及方法进行筛选。由金属材料(如不锈钢、钛)制备多孔微针通常采用金属注射成型法和湿法刻蚀法，以此制备的多孔微针制造成本高，而且微针的安全性难以保证。采用无机材料如硅通过刻蚀法制备的多孔微针，孔洞的孔径小，材料不稳定易氧化(参见例如Kim H等人，Bioresorbable,Miniaturized Porous Silicon Needles on aFlexible Water-Soluble Backing forUnobtrusive,Sustained Delivery of Chemotherapy[J].Acs Nano,2020,14(6):7227-36.)；而采用自固化陶瓷通过自固化的方法制备的多孔微针则存在脆性大，机械强度差的问题(参见例如Vallhov H等人，Bioceramic microneedle arrays are able to deliverOVA to dendritic cells in human skin[J].J Mater Chem B,2018,6(42):6808-16.)。采用生物相容性聚合物材料制备多孔微针安全性高，制备方法简单，制备成本低。此类多孔微针多采用致孔剂浸出法和非溶剂诱导相分离法制备。由于致孔剂的去除难度大于非溶剂诱导相分离法的溶剂去除难度，而且非溶剂诱导相分离法对设备要求低且无需高温高压，是制备多孔微针的简便方法。但该方法影响因素众多，在实际应用中要综合考虑各种因素对多孔结构的影响，制备合适孔径的同时避免大空腔的形成，保证多孔微针兼有符合要求的载药性能和机械性能。
此外，表面疏水的材料很难通过毛细管作用对亲水性疫苗等药物进行吸附，这对于多孔微针主动加载水溶性药物产生局限性。目前主要通过等离子处理的方式提高材料的亲水性，即在材料表面引入亲水基团，使材料表面具有亲水性。实验表明，在经过10分钟的等离子处理后，聚醚醚酮的接触角从初始的81.86°降低为35.16°。在另外一项研究中也发现，通过等离子处理后，利用多孔微针提取液体的速度得到了改善。但在一些实验中，等离子处理可能并没有达到很好的效果，并且当研究者通过用氧等离子体进行过度处理，则观察到微针发生变形(参见例如Abe H等人，Biodegradable Porous Microneedles for anElectric Skin Patch[J].Macromol Mater Eng,2021,306(9):2100171.)。因此，本发明将在制备多孔微针的基质材料中添加亲水性添加剂来增强多孔微针对疫苗溶液的吸附，然而，添加剂的选择可能会对多孔微针制备工艺和制备完成的多孔微针的机械强度产生影响。
最后，由于多孔微针针体含有大量孔洞，这可能会造成微针机械强度的降低。目前主要通过选取高机械性能的材料、降低微针整体孔隙率或仅在针体的特定部分引入孔隙的方式改善多孔微针的机械性能。对于材料而言，金属材料与其他材料相比，具有更高的机械性能，因此利用金属作为微针制备材料能够改善多孔微针的刺入效果。但其也存在一些问题，如：利用金属钛制备的多孔微针的生物相容性需要进一步研究(参见例如Li J Y等人，Fabrication of a Ti porous microneedle array by metal injection molding fortransdermal drug delivery[J].Plos One,2017,12(2):e0172043.)。降低微针整体孔隙率或仅在针体的特定部分引入孔隙的方式，其本质是通过调整微针中的孔隙率来达到提高多孔微针机械性能的目的，但是这两种方式会导致载药量的降低，对于需要高剂量才能发挥作用的药物或药物颗粒比较大(使多孔微针吸附摄取它们存在困难)来说，这是不利的。
综上所述，为了制备得到可以负载疫苗的多孔微针，本发明选择使用非溶剂诱导相分离法制备水不溶性多孔微针，该方法简单快速，便于微针批量生产；成本低廉，无需昂贵的材料和仪器；并且安全性高，工艺条件要求低。同时为了保证多孔微针对于疫苗等水溶性药物的吸附效率，本发明在多孔微针的制备处方中增加了亲水性添加剂，可以提高多孔微针的吸附速度。此外，为了在保证载药量的同时提高多孔微针的机械强度，本发明对多孔微针进行涂层的方式来改善。首先制备具有良好针型、高孔隙率、高吸附速度和合适孔径的多孔微针。在得到符合条件的多孔微针基础上采用涂层的方式提高多孔微针自身的机械强度。最后，微针涂层本身同样可以作为药物的载体，增加微针的总体载药能力。对于疫苗免疫而言，在涂层多孔微针的孔道和涂层部分分别加载疫苗和佐剂可以实现两种药物的分批递送，以充分发挥佐剂作用、提高疫苗的免疫效果。
尽管涂层多孔微针针体含有大量合适孔径的孔洞，足以负载足够剂量的疫苗，并且通过涂层操作增强了多孔微针的机械性能，涂层中含有的佐剂材料也可以进一步增强涂层多孔微针的免疫效果。但是涂层多孔微针由水不溶性的生物相容性材料制备，在微针刺入皮肤后完成疫苗从针体的完全释放需要漫长的等待时间，这会增加患者使用微针贴片的时间，降低患者的依从性。因此，为了解决上述问题，我们进一步对涂层多孔微针进行了改进，改变多孔微针的部分制备工艺，使用水不溶性材料制备针体，使用水溶性材料制备背衬，并将两者结合形成了分层多孔微针。分层多孔微针刺入皮肤后，针体与水溶性背衬快速分离，将生物相容性的多孔微针针体留在皮肤中，疫苗制剂从针体中缓慢释放，从而在保证多孔微针免疫效果的同时，可以快速去除微针背衬贴片，增加了患者的依从性。而且新的制备工艺也可以实现分层多孔微针的涂层，保证分层多孔微针的机械强度。
涂层多孔微针和分层多孔微针自身的性能受到许多因素的影响，包括制备材料、制备方法以及工艺条件。如何通过已有材料和方法制备高孔隙率和大孔径的多孔微针，并实现多孔微针对药物的快速吸附存在着不确定性。并且由于涂层多孔微针包括多孔微针的制备以及多孔微针的涂层两部分，如何实现两部分良好的结合也具有不确定性。而分层多孔微针则存在针体制备和背衬制备相结合的问题，以及制备工艺改变导致的药物装载方式的改变。综上所述，如何将涂层与多孔微针结合开发出一种具有良好机械性能和载药量的涂层多孔微针，以及如何将多孔微针针体与水溶性背衬结合开发一种具有良好机械性能和载药量的分层多孔微针是本领域技术人员急需解决的技术难题。
发明内容
解决上述技术中存在的问题，本发明提供了一种作为疫苗递送载体的多孔微针贴片及其制备方法，具体的多孔微针贴片为基于非溶剂诱导相分离法制备可负载疫苗制剂等大分子药物的涂层多孔微针贴片和分层多孔微针贴片，本发明的涂层多孔微针贴片是由含有疫苗药物的涂层多孔微针针体部分和含有佐剂药物的涂层部分组成，疫苗和佐剂分别均匀的分布在涂层多孔微针的孔道和涂层部分，实现疫苗和佐剂经皮给药中的有效递送，并且涂层和孔道药物的分批释放，能进一步提高疫苗的免疫应答效果。分层多孔微针贴片则是由可与微针快速分离的背衬部分和含有疫苗的多孔微针针体组成，目的在于有效递送疫苗的基础上，可以快速去除微针背衬贴片，缩短微针贴片的给药时间，以进一步提高患者的依从性。
本发明采用的技术方案为：
一种作为疫苗递送载体的多孔微针贴片，所述多孔微针贴片包括涂层多孔微针贴片和分层多孔微针贴片，所述涂层多孔微针贴片由含有疫苗药物的多孔微针针体部分和含有佐剂药物的涂层部分组成；所述分层多孔微针贴片由可与微针针体快速分离的背衬部分和含有疫苗药物和佐剂的多孔微针针体组成。
本发明提供的涂层多孔微针贴片和分层多孔微针贴片可用于递送(负载)药物和疫苗，递送的疫苗类型包括但不限于裂解疫苗、亚单位疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗、减毒活疫苗、重组疫苗、类毒素和多肽疫苗。
作为优选，涂层多孔微针贴片或分层多孔微针贴片中，疫苗药物包括但不限于流感疫苗、乙肝病毒疫苗、水痘疫苗、破伤风疫苗、带状疱疹疫苗和HPV疫苗；涂层多孔微针贴片中，涂层部分含有的佐剂药物包括但不限于聚肌胞(poly I:C)、胞壁酰二肽(MDP)、咪喹莫特、含甘露糖基或海藻糖基的衍生物中的一种或二种以上的任意组合。涂层多孔微针贴片中，疫苗药物和佐剂药物分别分布在涂层多孔微针的微孔道内和涂层部分。
作为优选，涂层多孔微针或分层多孔微针的针体的微孔道直径为0.8～1.8μm，微针高度为500～1200μm，微针间距为400～2000μm。
本发明还提供了上述作为疫苗递送载体的多孔微针贴片的制备方法，涂层多孔微针贴片通过下述步骤制备得到：
(1)制备多孔微针针体：将制备微针的聚合物溶解于良溶剂中，形成均匀的聚合物溶液，将聚合物溶液加入到微针阴模中，通过包括离心在内的方式使聚合物固化形成微针，再向阴模中加入非溶剂，非溶剂将微针中的良溶剂萃取出来，再将微针中的两种溶剂反复去除，最后脱模后便得到了多孔微针针体；其中，良溶剂与聚合物有良好溶解性，非溶剂与聚合物互不相溶，并且良溶剂与非溶剂是互溶的；
(2)多孔微针负载疫苗：将多孔微针浸入疫苗溶液中，在溶液静置后拉起，将多孔微针取下后干燥；
(3)将涂层部分涂敷在上述负载了疫苗的多孔微针针体的表面，得到涂层多孔微针贴片；
在本发明中，制作得到的多孔微针贴片可以快速吸附足量的疫苗，多孔微针贴片的涂层中含有佐剂材料，多孔微针贴片刺入皮肤后，涂层部分与组织液接触后快速溶解释放佐剂，储存于多孔微针的疫苗随之持续释放；经过涂层后的多孔微针贴片不仅具备足够的机械性能，而且所载疫苗可以刺激机体产生足够的免疫反应，同时可以实现佐剂和疫苗的分批递送属性；
此外，为了解决多孔微针流感疫苗贴片需要长时间贴敷于皮肤的问题，在本发明中，提供了一种分层多孔微针疫苗贴片，除了具备上述涂层多孔微针疫苗贴片的功能外，同时实现微针刺入后可以快速去除背衬贴片的功能；
分层多孔微针贴片通过下述步骤制备得到：
(1)制备多孔微针针体：将制备微针的聚合物溶解于良溶剂中，形成均匀的聚合物溶液，将聚合物溶液加入到微针阴模中，通过包括离心在内的方式使聚合物入模固化形成微针，刮去阴模表面多余聚合物溶液后，再向阴模中加入非溶剂，非溶剂将微针中的良溶剂萃取出来，再将微针中的两种溶剂反复去除，最后脱模得到多孔微针针体；
(2)多孔微针负载疫苗：取疫苗溶液加入到阴模中，并通过包括离心在内的方式使疫苗进入到多孔微针的孔隙中；
(3)制备水溶性背衬，向阴模中加入水溶性聚合物溶液，通过包括离心在内的方式使之入模形成微针背衬，干燥脱模后便得到了分层多孔微针贴片。
本发明分层多孔微针贴片采用三步灌注法进行制备，针体为多孔微针材料，通过非溶剂诱导相分离法进行制备，背衬则为水溶性良好的聚合物材料。第一步为制备多孔微针针体，通过离心的方式使少量的多孔微针基质溶液入模成针，刮去模具表面多余的溶液，然后经过反复加非溶剂离心并去除的操作后，得到的微针阴模中只有多孔针体。第二步为多孔微针负载疫苗，取适量的疫苗溶液加入到阴模中，并通过离心的方式使疫苗进入到多孔微针的孔隙中。第三步为制备水溶性背衬，向阴模中加入适量的水溶性聚合物溶液，通过离心的方式使之形成微针背衬，干燥脱模后便得到了分层多孔微针(疫苗)贴片。
在本发明中，分层多孔微针贴片的制备方法，目的在于使多孔微针针体与水溶性背衬结合形成分层微针，以实现微针刺入皮肤后，微针针体与背衬的连接处快速溶解，从而与多孔微针针体分离，微针背衬可以快速去除，同时多孔微针留在皮肤内缓慢释放药物并发挥药效。此外，所述分层多孔微针贴片的疫苗不再于微针整体制备完成后通过吸附的方式加载，而是在微针制备的第二步进行离心加载，目的是防止吸附疫苗溶液时影响微针水溶性背衬的完整性。
本发明提供的负载疫苗的涂层多孔微针贴片和分层多孔微针贴片均采用非溶剂诱导相分离法制备，具体原理为：根据使用的聚合物选取一种与其有良好溶解性的良溶剂和一种与其互不相溶的非溶剂，并且两种溶剂却是互溶的。将聚合物溶解于良溶剂中配制成溶液后，再向聚合物溶液中加入非溶剂，由于聚合物不溶于非溶剂，而非溶剂与良溶剂是互溶的，随着良溶剂和非溶剂的不断交换溶解，在去除非溶剂后，聚合物中的良溶剂也会被去除，聚合物相就形成多孔结构。
通过上述制备方法制备的多孔微针针体存在大量大于疫苗粒径的孔洞，并且整体的孔隙率符合载药量的要求，具体为：将聚合物溶解于良溶剂中并形成均匀溶液，通过调整聚合物与良溶剂的比例，使最后使用非溶剂交换后，形成的多孔微针含有足量和大小适宜的孔洞。
多孔微针贴片的制备材料应选用生物相容性较好的聚合物材料，多孔微针贴片刺入皮肤后，应不引起过敏反应、局部组织反应、全身毒性反应，不引起致癌、致畸、致突变反应。作为优选，聚合物包括但不限于醋酸纤维素(CA)、聚乳酸(PLA)和聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)，此外，为了增强上述多孔微针对疫苗等水溶液的吸附性能，上述聚合物中添加亲水性添加剂组成聚合混合物，以提高多孔微针的亲水性，所述亲水性添加剂包括但不限于丙三醇、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，以此制备的上述多孔微针可以快速吸附疫苗；所述良溶剂应对所述聚合物材料有良好溶解性，而且所述非溶剂应不溶于所述聚合物材料且于所述良溶剂有良好溶解性；所述良溶剂包括但不限于N,N二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)，所述非溶剂包括但不限于去离子水、缓冲溶液。
对于负载疫苗的多孔微针贴片，需要进行涂层来增强多孔微针的机械性能，并最终制备得到涂层负载佐剂、多孔微针负载疫苗的涂层多孔微针疫苗贴片，并实现涂层多孔微针疫苗贴片中的疫苗和佐剂的分批递送属性。
作为优选，涂层部分包括去离子水、涂层材料、表面活性剂和佐剂药物，涂层材料包括但不限于羧甲基纤维素(CMC)、海藻酸钠(SA)透明质酸(HA)、明胶、阿拉伯胶、西黄蓍胶、普鲁兰糖、淀粉中的一种或二种以上的任意组合；此外，为了使涂层溶液更均匀、更容易的包覆到所述多孔微针表面，涂层材料中添加有表面活性剂，所述表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、脂肪酸山梨坦和聚山梨酯80中的一种或二种以上的任意组合；所述佐剂药物包括但不限于poly I:C、MDP、咪喹莫特、含甘露糖基或海藻糖基的衍生物中的一种或二种以上的任意组合。
作为优选，将涂层部分涂敷在多孔微针针体表面的方法包括但不限于喷涂法、浸润法、模具法。
作为优选，聚合物为CA，亲水性添加剂为丙三醇，聚合物混合物在其良溶剂中应有适宜的浓度范围，涂层多孔微针贴片制备过程中，醋酸纤维素浓度为15～20wt％，丙三醇浓度为1～4wt％；分层多孔微针贴片的制备材料及良溶剂和非溶剂与上述涂层多孔微针贴片所用的相同，然而为了适应新的制备工艺，对分层多孔微针贴片的聚合物浓度进行了调整，具体为：分层多孔微针贴片制备过程中，CA浓度为10～15wt％，丙三醇浓度为1～4wt％。
作为优选，所述涂层材料为HA，其浓度为3～5wt％，表面活性剂为聚山梨酯80，其浓度为0.1～0.5wt％。
作为优选，涂层部分中，佐剂药物占比为0.1～30wt％，当选用的佐剂材料本身还可以作为涂层材料时，可以适当增加其使用量。
作为优选，构成分层微针阵列背衬的水溶性聚合物溶液为PVP K90水溶液，其浓度为20～40wt％。
本发明提供的涂层多孔微针贴片和分层多孔微针贴片及其制备方法，与现有技术相比，具有如下有益效果：
①本发明通过选取合适的基质材料、制备方法和制备工艺，制备了具有高孔隙率和合适孔径的多孔微针，保证了多孔微针对于疫苗制剂的载药能力；
②本发明通过在多孔微针基质材料中添加亲水性添加剂，制备了可以快速吸附水溶性制剂的水不溶性多孔微针，减少了多孔微针药物吸附时间；
③本发明通过涂层的方式在不降低孔隙率的情况下，增加了多孔微针本身的机械性能；
④本发明的涂层多孔微针的涂层部分本身同样可以作为药物载体，通过在涂层多孔微针的孔道和涂层部分负载不同的药物可以实现药物的分批递送；
⑤本发明通过分层的方式实现了多孔微针与背衬的快速分离，大大缩短微针背衬贴片的皮肤滞留时间。
附图说明
图1a是本发明的实施例2的多孔微针阴模的结构示意图；
图1b是本发明的实施例2的多孔微针阴模的剖视图；
图2a、图2b和图2c分别是本发明的实施例5的多孔微针针尖、针体和横切面的扫描电子显微镜图；
图2d是本发明的实施例5的涂层多孔微针流感疫苗贴片的光学显微镜图；
图2e是本发明的实施例5的分层多孔微针流感疫苗贴片的光学显微镜图；
图3a是本发明的实施例5的涂层多孔微针流感疫苗贴片的机械性能测定结果图；
图3b是本发明的实施例5的分层多孔微针流感疫苗贴片的机械性能测定结果图；
图4a和图4b分别是本发明的实施例5的涂层多孔微针流感疫苗贴片吸附BSA-FITC后的微针针体和横切面的荧光倒置显微镜图；
图5a是本发明的实施例5的罗丹明B涂层多孔微针的涂层中罗丹明B的体外渗透曲线图；
图5b是本发明的实施例5的吸附BSA涂层多孔微针的针体中BSA的体外渗透曲线图；
图6是本发明的实施例5的分层多孔微针流感疫苗贴片的体外溶解情况图；
图7是本发明的实施例5的涂层多孔微针流感疫苗贴片和分层多孔微针流感疫苗贴片的血凝素滴定结果图；
图8是本发明的实施例5的涂层多孔微针流感疫苗贴片和分层多孔微针流感疫苗贴片的血凝抑制实验抗体滴度结果图；
图示说明：1、阴模本体，2、凹槽，3、孔洞。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，这些实施例是对本发明的说明而作，不是对本发明的限制。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；涉及的百分比，如无特殊说明，均为质量百分比；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
本发明的涂层多孔微针(流感疫苗)贴片由微针基质材料、涂层基质材料、佐剂、流感疫苗组成。
涂层多孔微针(流感疫苗)贴片的微针基质材料：CA(MW＝40,60kDa)与丙三醇的共混物，更优选的，CA(MW＝60kDa)与丙三醇的共混物；前期处方筛选得到上述分子量的CA微针成形性更优。
其中，CA浓度为15～20wt％，丙三醇浓度为1～4wt％，更优选的，CA浓度为16.5wt％，丙三醇浓度为2.5wt％。CA浓度过高会导致针尖缺失，太低会导致缺针现象；丙三醇浓度过高或过低也会导致微针的弯折发生。
涂层多孔微针(流感疫苗)贴片的涂层基质材料：CMC、SA、HA与聚山梨酯80的混合物，更优选的，涂层基质材料为HA与聚山梨酯80的混合物。
其中，HA浓度为3～5wt％，聚山梨酯80浓度为0.1～～0.5wt％，更优选的，HA浓度为4wt％，聚山梨酯80浓度为0.2wt％。通过涂层溶液的处方筛选得到此浓度为最佳，该浓度涂层多孔微针的机械性能最强，浓度高或低的涂层溶液得到的涂层多孔微针不是最优的。
微针基质材料的良溶剂为DMF，非溶剂为去离子水。涂层基质材料的溶剂为去离子水。
涂层多孔微针佐剂为poly I:C或MDP。更优选的，涂层多孔微针佐剂为poly I:C。
涂层多孔微针负载的流感疫苗制剂为流感病毒裂解疫苗。
根据以下优选处方，可以成功制备出涂层多孔微针(流感疫苗)贴片：
(1)多孔微针制备处方：16.5wt％的CA，2.5wt％的丙三醇，81wt％的DMF。
(2)多孔微针涂层处方：4wt％的HA，0.2wt％的聚山梨酯80，94.8wt％的去离子水，1wt％的poly I:C。
实施例2
一种涂层多孔微针流感疫苗贴片的制备方法，采用实施例1的最优处方，包括如下步骤：
(1)微针阳模与阴模制备：采用光刻和蚀刻工艺制备微针阳模，将PDMS与固化剂甲基三乙氧基硅烷按质量比10：1混合后，浇注到放有微针阳模的长方形容器中；将容器放置在真空干燥箱，抽真空除去混合液中的气泡；再放入烘箱，干燥3h后去除，获得PDMS阴模；多孔微针阴模如图1a和图1b所示，包含大小为14mm的正方形PDMS阴模本体1，所述的阴模本体1内设有凹槽2，多孔微针孔洞3设置在凹槽2的底部，具体为：凹槽2深度为1.6mm，这是为了使多孔微针基质溶液能够充分填充于凹槽2和孔洞3的内部。孔洞3含有10×10的微针贴片，单个孔洞3的形状为铅笔形，底面直径为0.2mm，深度为0.8mm。
(2)多孔微针基质溶液配置：称取CA与丙三醇于烧杯中，加入良溶剂DMF，60℃下加热并持续搅拌直至完全溶解，即得多孔微针基质溶液。
(3)涂层基质溶液配置：称取HA、聚山梨酯80和poly I:C于烧杯中，加入去离子水，搅拌均匀后，转移至离心管内，10000rpm离心30min，除去搅拌过程中产生的气泡，即得涂层基质溶液。
(4)多孔微针制备：将上述多孔微针基质溶液在60℃下加热备用，取0.2mL基质溶液于阴模凹槽2中，随后将阴模1放入离心机中，在25℃、4000rpm的条件下离心3min使基质溶液入模；离心结束后，将阴模1在室温下干燥10min，接着向阴模1中注满去离子水以实现相分离，相分离过程进行10min后，用滤纸小心吸去阴模1中的去离子水，随后用压敏胶带将微针从阴模1中脱出，即得多孔微针；由于基质溶液以有机试剂为溶剂配制，为充分去除多孔微针中的有机试剂，将脱出的上述多孔微针浸入去离子水中，反复更换去离子水，以保证完全除去微针的有机试剂。
(5)多孔微针吸附疫苗：首先将上述多孔微针针体向下用胶带固定在万能试验机上压板上，使微针以0.5mm/s的速度浸入流感疫苗溶液中，在溶液静置15min后以0.5mm/s的速度拉起；将多孔微针取下后放置于4℃下低温干燥。
(6)多孔微针涂层：将上述多孔微针用双面胶带固定在万能试验机上压板上，使微针以0.1mm/s的速度浸入涂层溶液中，涂层溶液深度800μm；当压力达到0.01N时，微针停止下降并返回初始原点，取下微针，将其针尖向上放入真空干燥箱，在4℃、-20Kpa真空度下放置10min以促进涂层溶液快速蒸发；再次进行浸润和干燥的操作4次后，完成微针涂层，即得到涂层中含有poly I:C的涂层多孔微针(流感疫苗)贴片。
实施例3
本发明的分层多孔微针流感疫苗贴片由微针基质材料、微针背衬材料、流感疫苗组成。
分层多孔微针(流感疫苗)贴片的基质材料：CA(MW＝40,60kDa)与丙三醇的共混物，更优选的，CA(MW＝60kDa)与丙三醇的共混物；前期处方筛选得到上述分子量的CA微针成形性更优。
其中，CA浓度为10～15wt％，丙三醇浓度为1～4wt％，更优选的，为了适应新的制备工艺，对分层多孔微针贴片的聚合物浓度进行了调整，CA浓度为12.4wt％，丙三醇浓度为2.1wt％。CA浓度过高会导致针尖缺失，太低会导致缺针现象；丙三醇浓度过高或过低也会导致微针的弯折发生。
微针基质材料的良溶剂为DMF，非溶剂为去离子水。背衬基质材料的溶剂为去离子水。
分层多孔微针流感疫苗贴片的背衬材料：PVP K90水溶液的浓度为20～40wt％，更优选的，PVP K90水溶液的浓度为29.4wt％。PVP K90水溶液的浓度过高离心入模困难，浓度过低会导致微针背衬不平、微针针体过软等问题。
分层多孔微针负载的流感疫苗制剂为流感病毒裂解疫苗。
根据以下处方：12.4wt％的CA，2.1wt％的丙三醇，85.5wt％的DMF；背衬材料为29.4wt％PVP K90，我们可以成功制备得到分层多孔微针(流感疫苗)贴片。
实施例4
一种分层多孔微针流感疫苗贴片的制备方法，采用实施例3的最优处方，包括如下步骤：
(1)本实施例中多孔微针使用实施例2中所使用的微针阳模和阴模进行微针制备。
(2)分层多孔微针基质溶液配置：称取CA与丙三醇于烧杯中，加入DMF，60℃下加热并持续搅拌直至完全溶解，即得到分层多孔微针基质溶液。
(3)分层多孔微针背衬溶液配置：称取PVP K90于烧杯中，加入去离子水，搅拌均匀后，转移至离心管内，10000rpm离心30min，除去搅拌过程中产生的气泡，即得背衬溶液。
(4)分层多孔微针流感疫苗贴片制备：向阴模凹槽中加入上述分层多孔微针基质溶液并铺满，立即将阴模转移到离心机中于40℃，4000rpm下离心5min，随后取出阴模，使用刀片将凹槽表面的多余溶液刮除；然后向阴模中加入去离子水，并将阴模放入离心机于室温、4000rpm下离心10min，随后去除阴模中的去离子水；重复加去离子水，离心并去除去离子水的操作共3次，以完全去除微针中的有机试剂并形成多孔结构；接下来，在微针中去离子水干燥后，向阴模凹槽中加入流感疫苗溶液，并于4℃、4000rpm下离心5min；离心结束后，将阴模于4℃下干燥30min；最后，向阴模中加入0.15mL的PVP K90溶液，并于并于4℃、4000rpm下离心5min；离心结束后，将阴模放入4℃条件下干燥3d，最后脱模即得分层多孔微针(流感疫苗)贴片。
实施例5
对实施例2制备得到的涂层多孔微针(流感疫苗)贴片和实施例4制备得到的分层多孔微针(流感疫苗)贴片进行一系列微针表征，包括：微针形态表征、机械性能测定、微针吸附性能评价、体外渗透效率评价、体外溶解性能评价和药效学评价。
(1)微针形态表征
在扫描电子显微镜下观察上述未进行涂层的多孔微针针尖和针体如图2a和图2b所示，再将微针进行横向切割后，得到微针的横切面的扫描电镜图如图2c所示，证明了微针的针尖、针体的表面和内部都充满了微孔道。经image.J软件来量化所制备微针的微孔道大小，孔径为1.13μm±0.45，大于流感疫苗的粒径(～447.45nm)。
如图2d所示，制备得到的涂层多孔微针流感疫苗贴片为边长10mm的正方形，共有10×10根微针，微针高800μm，微针间的间距为600μm。
如图2e所示，制备得到的分层多孔微针流感疫苗贴片为边长10mm的正方形，共有10×10根微针，微针高800μm，微针间的间距为600μm。此外，分层多孔微针流感疫苗贴片可以清晰的看到分层结构，针体为乳白色的CA多孔微针，背衬为透明色的PVP K90材料。
(3)孔隙率测定
为计算多孔微针的孔隙率。首先将制备好的多孔微针称重记录当前微针的干重(Wdry)。接着将微针浸入到罗丹明B(1mg/mL)溶液中1h，以保证孔隙完全被罗丹明B溶液填充。用滤纸吸取多孔微针表面多余的罗丹明B溶液，随后将微针放入装有5mL去离子水的离心管中振荡1h以提取多孔微针中吸附的罗丹明B，将提取后的溶液转移至烧杯中，再向装有多孔微针的容器中加入5mL去离子水继续提取孔隙中的罗丹明B，整个提取过程重复8次。提取过程完成后，用紫外分光光度计测量提取液的吸光度，通过标准曲线得到多孔微针吸附罗丹明B的质量，对比吸附液中罗丹明B的浓度可以计算出多孔微针的孔体积(Vpore)。
多孔微针的孔隙率按下列公式计算。
式中，Wdry为多孔微针的重量；ρp为微针基质材料的密度，1.3g/cm3；Vpore为微针的孔体积。
根据罗丹明B标准曲线y＝0.0662x+0.03(R2＝0.9997)和上述公式计算得到多孔微针孔隙率为74.8％±2.8。对比现有技术中多孔氧化铝微针的孔隙率范围为22至60％和PLGA多孔微针的50％左右的孔隙率，上述多孔微针具有比较高的孔隙率，微孔道内空间用以负载足量的药物。
(3)机械性能测定
使用万能试验机对上述涂层多孔微针流感疫苗贴片和分层多孔微针流感疫苗贴片进行轴向的压变性能考察。万能试验机的试验参数如下：采用压缩模式，下压速度为0.02mm/s，触发力为0.01N，当位移达到500μm时结束试验。将上述两种微针贴片分别针尖向上放置于下压盘上，使其垂直于上压头的平面，进行轴向应力测定。
对上述涂层多孔微针流感疫苗贴片机械性能测试的结果如图3a所示，在500μm应变时产生的最大应力平均值为32.89N；此外，上述分层多孔微针流感疫苗贴片机械性能测试的结果如图3b所示，在500μm应变时产生的最大应力平均值为19.79N。实验表明，刺破猪皮肤所需要的最小的穿刺力为0.065N/针，上述两种多孔微针能承受的最大机械应力远远大于刺入皮肤的力的要求(6.5N/100针)，并且相较于其他多孔微针，如多孔硅微针(6.9N)和PLGA多孔微针(3.168N)，上述两种多孔微针都表现出了优异的机械性能。
(4)药物吸附评价
为了验证在上述两种多孔微针中添加亲水性添加剂以增强其吸附药物的速度的效果，以涂层多孔微针进行验证，选择具有荧光标记的BSA-FITC作为模型药物进行吸附，吸附15min后，取出多孔微针后，在4℃下进行干燥。将干燥好的多孔微针用手术刀横向切割，将切割好的微针放在荧光倒置显微镜下观察微针横切面。结果如图4a所示，吸附BSA-FITC的多孔微针针体在荧光倒置显微镜下呈现绿色的荧光，将吸附了BSA-FITC的多孔微针横向切开，如图4b可以清晰地看到绿色荧光，这说明通过在多孔微针中添加亲水性添加剂可以使大分子药物通过微孔道结构所产生的毛细管效应快速的进入到微针内部，这也证明了多孔微针递送大分子药物的可行性。
(5)涂层多孔微针透皮释放效率
为测定上述涂层多孔微针涂层部分以及孔道内药物的释放速率，使用Franz扩散池进行微针的体外药物释放实验，分别制备了两种涂层多孔微针：一种是吸附浓度为8mg/mL BSA的涂层多孔微针，另一种是采用含有0.1wt％罗丹明B的涂层溶液涂层后的涂层多孔微针。
具体为：将吸附BSA的涂层多孔微针安装于Franz扩散池受体池，受体池中装有6.35mL生理盐水，将扩散池放入透皮吸收仪中，以400r/min的速度搅拌。于0min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h移取1mL的受体池溶液并补充等量生理盐水进行替换。通过测定取出的受体池溶液在595nm处的吸光度，对比标准曲线得到BSA含量。最终数据为6次平行实验平均值。按照上述方法对罗丹明B涂层多孔微针进行实验，并测定受体池溶液在554nm处的吸光度，对比标准曲线得到罗丹明B含量。
根据药物含量分别绘制涂层中罗丹明B和针体中BSA的体外渗透曲线，罗丹明B的渗透曲线如图5a所示，罗丹明B在前40min迅速渗透，在60min时趋于平稳，渗透百分比为62.2％±2.2。BSA的渗透曲线如图5b所示，BSA在前8h迅速渗透，在8h后趋于平稳，12h的渗透百分比稳定在60.4％±2.4。从释放曲线上可以看出，涂层部分的罗丹明B释放速率优于BSA，这也说明涂层多孔微针可以实现两种药物的分批递送。
(6)体外溶解性能评价：由于涂层多孔微针流感疫苗贴片由生物相容性材料制备，微针刺入后疫苗溶液通过扩散给药，不存在微针溶解的情况，故该微针不做此类评价。为了验证上述分层多孔微针流感疫苗贴片可以实现微针刺入后快速除去贴片的功能，将上述分层多孔微针流感疫苗贴片刺入2mm厚的琼脂糖凝胶中，于刺入5min后去除微针背衬，在3D显微镜下观察到的结果如图6所示，微针的针体部分留在琼脂糖凝胶中，证明上述分层多孔微针流感疫苗贴片可以实现微针给药后快速去除背衬的功能。
以体外实验的微针背衬在5min内可以去除验证，微针在人体给药时可以在很短的时间实现针体于背衬的分离，从而说明可以大大缩短微针给药时间。
(7)载药量评价：使用单项免疫扩散法对上述两种微针进行吸附的流感疫苗含量的测定，具体为：制备含有30μg/mL抗流感病毒免疫血清的琼脂糖凝胶板，并在板上打12个直径3mm的孔洞。取2片载有流感疫苗的涂层多孔微针剪碎分别放入1.5mL离心管中并加入250μL的0.9％无菌氯化钠溶液，离心1h，取出提取液。取2片分层多孔微针流感疫苗贴片进行上述操作，共得到4份样品溶液。在凝胶板的4个孔中每孔加入10μL流感抗原标准品用于做标准曲线，每份样品溶液平行加入到2个孔中，每孔加入10μL。将凝胶板放入25℃环境中静置反应18～24h。反应结束后取出凝胶板并进行压板1h。将压好的凝胶板放入培养皿中，倒入2％考马斯亮蓝染色液浸没并进行染色3～5min，再向培养皿中倒入考马斯亮蓝脱色液浸没，脱色30min以上，直至凝胶沉淀环清晰。最后使用image.J软件对凝胶片照片进行处理，测量出沉淀环横向直径和纵向直径。以标准抗原的浓度和其在凝胶板上形成的沉淀环直径做直线回归，求得直线回归方程，代入检测样品的沉淀环直径，即可得到检测样品中血凝素的浓度。
单向免疫扩散实验检测的结果如图7所示，其标准曲线为y＝0.0228x+4.6025(R2＝0.9924)，得到涂层多孔微针中负载的流感疫苗含量为5.3575μg，分层多孔微针中负载的流感疫苗含量为6.0475μg。
载药量是多孔微针的重要表征内容之一，以此说明该多孔微针可以负载疫苗药物，并通过后续的药效学评价证明多孔微针递送疫苗的可能性和有效性。
(8)药效学评价：使用上述两种微针贴片进行大鼠给药，将7-8周龄的雄性Wistar大鼠随机分为6组，每组含有6只大鼠，即空白涂层多孔微针组(不含流感疫苗和佐剂)、载有流感疫苗的涂层多孔微针实验组(针体含6μg流感疫苗，涂层不含佐剂)、载有流感疫苗和佐剂的涂层多孔微针实验组(针体含6μg流感疫苗，涂层含有poly I:C 13μg)、空白分层多孔微针组(不含流感疫苗和佐剂)、载有流感疫苗的分层多孔微针实验组(针体含6μg流感疫苗)、肌肉注射组(含6μg流感疫苗)。给药周期设定为第0天和第14天进行微针免疫，于第28天眼眶取血。并对大鼠血清进行血凝抑制实验测定抗体水平。血凝抑制试验结果如图8所示，负载疫苗和佐剂后的涂层多孔微针引起的血抑效价高于空白涂层多孔微针及只载有流感疫苗的涂层多孔微针实验组引起的血抑效价，并且涂层部分载有poly I:C的流感疫苗涂层多孔微针与肌肉注射引起的免疫应答水平相当，负载疫苗的分层多孔微针也能引起与肌肉注射相近的血抑效价，证明了两种微针贴片均能有效的递送流感疫苗并刺激机体产生较高水平的免疫反应。
综上所述，本发明所制备的涂层多孔微针(流感疫苗)贴片，孔隙率高，提取速度快，针体机械强度高，能够满足载药量和皮肤刺入的需求，实现佐剂和疫苗的分批递送，保证了多孔微针递送疫苗的免疫效果。在此基础上所制备的分层多孔微针(流感疫苗)贴片，大大缩短了微针给药时间。两种微针贴片与传统注射剂相比，不仅保证了递送药物的有效性，而且减少注射痛苦，提高了患者依从性。
以上结合实施例对本发明进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (10)

1.一种作为疫苗递送载体的多孔微针贴片，其特征在于：所述多孔微针贴片包括涂层多孔微针贴片和分层多孔微针贴片，所述涂层多孔微针贴片由含有疫苗药物的多孔微针针体部分和含有佐剂药物的涂层部分组成；所述分层多孔微针贴片由可与微针针体快速分离的背衬部分和含有疫苗药物的多孔微针针体组成。
2.根据权利要求1所述作为疫苗递送载体的多孔微针贴片，其特征在于：涂层多孔微针贴片或分层多孔微针贴片中，疫苗药物包括流感疫苗、乙肝疫苗、水痘疫苗、破伤风疫苗、带状疱疹疫苗和HPV疫苗；涂层多孔微针贴片中，涂层部分含有的佐剂药物包括聚肌胞、胞壁酰二肽、咪喹莫特、含甘露糖基或海藻糖基的衍生物中的一种或二种以上的任意组合。
3.根据权利要求1或2所述作为疫苗递送载体的多孔微针贴片，其特征在于：多孔微针贴片递送的疫苗制剂类型包括裂解疫苗、亚单位疫苗、灭活疫苗、DNA疫苗、减毒活疫苗、类毒素和多肽疫苗。
4.根据权利要求1所述作为疫苗递送载体的多孔微针贴片，其特征在于：涂层多孔微针或分层多孔微针的微孔孔径为0.8～1.8μm，微针高度为500～1200μm，微针间距为400～2000μm。
5.一种权利要求1所述作为疫苗递送载体的多孔微针贴片的制备方法，其特征在于，涂层多孔微针贴片通过下述步骤制备得到：
(1)制备多孔微针针体：将制备微针的聚合物溶解于良溶剂中，形成均匀的聚合物溶液，将聚合物溶液加入到微针阴模中，通过包括离心在内的方式使聚合物固化形成微针，再向阴模中加入非溶剂，非溶剂将微针中的良溶剂萃取出来，再将微针中的两种溶剂反复去除，最后脱模后便得到了多孔微针针体；其中，良溶剂与聚合物有良好溶解性，非溶剂与聚合物互不相溶，并且良溶剂与非溶剂是互溶的；
(2)多孔微针负载疫苗：将多孔微针浸入疫苗溶液中，在溶液静置后拉起，将多孔微针取下后干燥；
(3)将涂层部分涂敷在上述负载了疫苗的多孔微针针体的表面，得到涂层多孔微针贴片；
分层多孔微针贴片通过下述步骤制备得到：
(1)制备多孔微针针体：将制备微针的聚合物溶解于良溶剂中，形成均匀的聚合物溶液，将聚合物溶液加入到微针阴模中，通过包括离心在内的方式使聚合物固化形成微针，刮去阴模表面多余聚合物溶液后，再向阴模中加入非溶剂，非溶剂将微针中的良溶剂萃取出来，再将微针中的两种溶剂反复去除，最后脱模后便得到了多孔微针针体；
(2)多孔微针负载疫苗：取疫苗溶液加入到阴模中，并通过包括离心在内的方式使疫苗进入到多孔微针的孔隙中；
(3)制备水溶性背衬，向阴模中加入水溶性聚合物溶液，通过包括离心在内的方式使之形成微针背衬，干燥脱模后便得到了分层多孔微针贴片。
6.根据权利要求5所述作为疫苗递送载体的多孔微针贴片的制备方法，其特征在于：聚合物包括醋酸纤维素、聚乳酸和聚乳酸-羟基乙酸共聚物，上述聚合物中添加亲水性添加剂组成聚合混合物，所述亲水性添加剂包括丙三醇、聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮；所述良溶剂包括N,N二甲基甲酰胺、四氢呋喃，所述非溶剂包括去离子水、缓冲溶液。
7.根据权利要求5或6所述作为疫苗递送载体的多孔微针贴片的制备方法，其特征在于：涂层部分包括涂层材料、表面活性剂和佐剂药物，涂层材料包括羧甲基纤维素、海藻酸钠、明胶、阿拉伯胶、西黄蓍胶、透明质酸中的一种或二种以上的任意组合，表面活性剂包括聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯80中的一种或二种以上的任意组合。
8.根据权利要求7所述作为疫苗递送载体的多孔微针贴片的制备方法，其特征在于：将涂层部分涂敷在多孔微针针体表面的方法包括喷涂法、浸润法、模具法。
9.根据权利要求6所述作为疫苗递送载体的多孔微针贴片的制备方法，其特征在于：聚合物为醋酸纤维素，亲水性添加剂为丙三醇，聚合物混合物在其良溶剂中应有适宜的浓度范围，涂层多孔微针贴片制备过程中，醋酸纤维素浓度为15～20wt％，丙三醇浓度为1～4wt％；分层多孔微针贴片制备过程中，醋酸纤维素浓度为10～15wt％，丙三醇浓度为1～4wt％，背衬水溶性聚合物溶液为浓度为20～40wt％的聚乙烯吡咯烷酮K90水溶液。
10.根据权利要求7所述作为疫苗递送载体的多孔微针贴片的制备方法，其特征在于：所述涂层材料为透明质酸，其浓度为3～5wt％，表面活性剂为聚山梨酯80，其浓度为0.1～0.5wt％；涂层部分中，佐剂药物占比为0.1～30wt％。
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