CN117414346A - 一种金属多酚纳米粒子、制备方法及制备tmem16a和/或egfr抑制剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种金属多酚纳米粒子、制备方法及制备TMEM16A和/或EGFR抑制剂中的应用。所述金属多酚纳米粒子包括原花青素和PEG多酚化合物反应形成的有机骨架主体,以及通过金属配位修饰在所述有机骨架主体的金属纳米粒子。本发明还提供一种含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子包括:所述的金属多酚纳米粒子,以及包覆于所述的金属多酚纳米粒子网络中的EGFR抑制剂类药物。此外,这两种金属多酚纳米粒子均还包括透明质酸外壳。本发明所述金属多酚纳米粒子建立了TMEM16A和EGFR双靶点纳米网络,可以双靶点协同抑制乳腺癌增殖、迁移和复,从而高效,特异性的实现对于乳腺癌的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,尤其涉及一种金属多酚纳米粒子、制备方法及制备TMEM16A和或EGFR抑制剂中的应用。
背景技术
乳腺癌是女性非常常见的癌症,全球每年大约有200多万新发病例。且发病率和死亡率均呈上升趋势。疾病负担也日益增加,已成为全球重点公共卫生问题。三阴性乳腺癌是乳腺癌中最凶险的一种亚型,约占所有乳腺癌的15%。目前,在临床的治疗选择十分有限。且与其他亚型的乳腺癌相比,晚期三阴性乳腺癌具有侵袭性强、早期复发率高、内脏转移率高、预后差等特点。晚期三阴性乳腺癌对靶向治疗和内分泌治疗不敏感,缺乏特异性的治疗方法,传统治疗手段以手术、放疗、化疗为主。
随着医学的发展,对乳腺癌病人的治疗方式也越来越完善,但治疗过程中会伴随出现相应的副作用,由于三阴性乳腺癌缺乏有效的治疗靶点,其主要治疗手段为手术切除和放化疗。
手术治疗能使原发肿瘤及区域淋巴结能得到最大程度的局部控制,但是随着乳腺癌发展到中期,病人体质较为虚弱,很大可能已经发生转移。盲目手术后极有可能大大减弱病人体质,为恢复带来难度,且手术后极易复发,一旦复发则更加难治;而化疗对身体伤害非常大,化疗药物在杀伤癌细胞的同时也会杀死正常细胞。从而导致病人白细胞降低、骨髓抑制、恶心呕吐、体重减轻等多种并发症产生。并且由于产生耐药等因素,导致无论单药或是联合化疗均疗效欠佳,患者中位生存期为9个月-12个月,5年生存率不足30%。化疗耐药已经成为三阴性乳腺癌治疗的瓶颈。因此目前获取针对乳腺癌的有效治疗方案迫在眉睫。
与此同时越来越多的纳米药物也为乳腺癌的治疗提供了新思路,然而常规的纳米药物递送系统多数需要额外载体的合成且合成路径较为复杂,而这些过程难以对空间和时间进行精确控制,可重复性差,降低了药物治疗的效率,并且载体大多生物相容性欠佳,难以代谢排出,从而降低了其在体外、体内实验中的效果。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种金属多酚纳米粒子,所述金属多酚纳米粒子包括原花青素和PEG多酚化合物反应形成的有机骨架主体,以及通过金属配位修饰在所述有机骨架主体的金属纳米粒子。所述金属多酚纳米粒子天然多酚小分子抑制剂原花青素为骨架,金属离子进行配位组成金属多酚纳米网络,可高效包覆抗乳腺癌药物,如EGFR抑制剂吉非替尼,利用金属多酚纳米网络的光热特性从而实现化疗-PTT协同治疗。
本发明的目的之二在于提供一种所述的金属多酚纳米粒子的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:将金属盐溶液和PEG多酚化合物溶液混合,进行第一次搅拌;再与原花青素溶液混合,进行第二次搅拌;反应结束后,收集得到所述金属多酚纳米粒子。本发明所述金属多酚纳米粒子的制备方法简单易操作,且能够制备得到尺寸均一、球形形貌的纳米颗粒。
本发明的目的之三在于提供一种含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子,所述含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子包括上述金属多酚纳米粒子,以及包覆于所述的金属多酚纳米粒子网络中的抗乳腺癌药物。该多酚纳米网络高效包覆抗乳腺癌药物,如EGFR抑制剂吉非替尼后,形成TMEM16A和EGFR双靶点纳米网络,双靶点协同抑制乳腺癌增殖、迁移和复,从而高效,特异性的实现对于乳腺癌的治疗。
本发明的目的之四在于提供一种含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子的制备方法。所述制备方法包括以下步骤:将金属盐溶液和PEG多酚化合物溶液混合,进行第一次搅拌;再与原花青素溶液混合,进行第二次搅拌;再与吉非替尼溶液混合,进行第三次搅拌;反应结束后,收集得到含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子。
本发明的目的之五在于提供一种金属多酚纳米粒子、或含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子在制备TMEM16A和/或EGFR抑制剂中的应用。
为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种金属多酚纳米粒子,所述金属多酚纳米粒子包括原花青素和PEG多酚化合物反应形成的有机骨架主体,以及通过金属配位修饰在所述有机骨架主体的金属纳米粒子。
本发明以天然多酚小分子抑制剂原花青素为骨架,金属离子进行配位组成金属多酚纳米网络,与传统纳米颗粒相比,以原花青素为骨架的金属多酚纳米颗粒无需要额外载体的引入,与金属配位后即可构成纳米网络。同时,本发明所述金属多酚纳米粒子具备良好的光热响应性,能够在细胞内或者细胞外通过近红外光的照射下快速升温,且可高效包覆抗乳腺癌药物,如EGFR抑制剂吉非替尼,利用金属多酚纳米网络的光热特性从而实现化疗-PTT协同治疗。
其中,原花青素(procyanidins)又称前花青素,是一种在热酸处理下能产生花青素的多酚化合物,其分布广泛,种类丰富,主要存在于葡萄籽、银杏叶、莲房、日本罗汉柏、法国海岸松树皮等天然植物中,有着抗氧化和清除自由基能力,同时,原花青素也是一种高效的天然小分子TMEM16A通道抑制剂,具备优异的抗肿瘤活性。
优选地,所述PEG多酚化合物由八臂聚乙二醇类活化酯和多巴胺盐反应得到。
优选地,所述八臂聚乙二醇类活化酯的分子量为8000~12000Da,例如可以是8000Da、8500Da、9000Da、9500Da、10000Da、10500Da、11000Da、11500Da、12000Da等。
优选地,所述八臂聚乙二醇类活化酯为八臂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯。
优选地,所述多巴胺盐为盐酸多巴胺。
优选地,所述金属纳米粒子选自Cu、Zr或Fe中的任意一种或至少两种的组合,优选为Fe。
优选地,所述金属多酚纳米粒子还包括透明质酸外壳。
在本发明中,纳米网络的外层包覆了一层透明质酸(HA)作为外壳,可以靶向肿瘤细胞中的CD44受体,为乳腺癌靶向治疗药物的研究开发提供了新的解决方案。
优选地,所述透明质酸的分子量为8000~12000Da,例如可以是8000Da、8500Da、9000Da、9500Da、10000Da、10500Da、11000Da、11500Da、12000Da等。
第二方面,本发明提供一种如第一方面所述的金属多酚纳米粒子的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
将金属盐溶液和PEG多酚化合物溶液混合,进行第一次搅拌;再与原花青素溶液混合,进行第二次搅拌;反应结束后,收集得到所述金属多酚纳米粒子。
该方法能够简便、高效地制备一种基于多酚类TMEM16A抑制剂的金属多酚纳米颗粒能够通过抑制TMEM16A通道过表达实现乳腺癌的局部治疗,对于乳腺癌靶向治疗药物的研究开发,质量控制乃至临床应用都具有重要的意义。
优选地,所述金属多酚纳米粒子为PF-NPs纳米粒子。
优选地,所述PEG多酚化合物由以下步骤制备得到:
先将八臂聚乙二醇类活化酯、多巴胺盐和溶剂混合,进行反应;再向上述反应体系中加入缚酸剂,进行反应;反应结束后,收集得到所述的PEG多酚化合物。
优选地,所述八臂聚乙二醇类活化酯和多巴胺盐的质量比为10:(3~5),例如可以是10:3、10:3.2、10:3.4、10:3.6、10:3.8、10:4、10:4.2、10:4.4、10:4.6、10:4.8、10:5等。
优选地,所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
优选地,所述缚酸剂为三乙胺(TEA,Et3N)。
优选地,所述缚酸剂的添加量为所述八臂聚乙二醇类活化酯和多巴胺盐总质量的0.1~1%,例如可以是0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%等。
优选地,向上述反应体系中加入缚酸剂前,在20~30℃(例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等)下反应0.5~2h,例如可以是0.5h、0.6h、0.8h、1h、1.2h、1.4h、1.6h、1.8h、2h等。
优选地,向上述反应体系中加入缚酸剂后,在20~30℃(例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等)下反应10~15h,例如可以是10h、11h、12h、13h、14h、15h等。
优选地,所述反应结束后,需将收集得到产物在微酸性条件下透析。
优选地,所述微酸性条件为盐酸的水溶液。
优选地,所述盐酸的水溶液的浓度为0.5~2mol/L,例如可以是0.5mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、1mol/L、1.2mol/L、1.4mol/L、1.6mol/L、1.8mol/L、2mol/L等。
优选地,所述透析的时间为42~54h,例如可以是42h、44h、46h、48h、50h、52h、54h等。
优选地,所述透析后还包括冻干,所述冻干的温度为-80~-40℃,例如可以是-80℃、-75℃、-70℃、-65℃、-60℃、-55℃、-50℃、-45℃、-40℃等,所述冻干的时间为24~48h,例如可以是24h、30h、36h、42h、48h等。
作为本发明优选技术方案,所述PEG多酚化合物由以下步骤制备得到:
先将八臂聚乙二醇类活化酯、多巴胺盐和溶剂混合,在保护性气体的存在下、于20~30℃下反应0.5~2h;随后向上述反应体系中加入缚酸剂,继续在保护性气体的存在、避光的条件下,于20~30℃下反应10~15h;将反应结束的产物依次进行透析、冻干,得到所述PEG多酚化合物。
优选地,所述金属盐、PEG多酚化合物和原花青素的质量比为(4~6):(5~7):(2~3);
其中,“4~6”例如可以是4、4.2、4.4、4.6、4.8、5、5.2、5.4、5.6、5.8、6等;
其中,“5~7”例如可以是5、5.2、5.4、5.6、5.8、5、6.2、6.4、6.6、6.8、7等;
其中,“2~3”例如可以是2、2.2、2.4、2.6、2.8、6等。
优选地,所述金属盐溶液的浓度为50~150mg/mL,例如可以是50mg/mL、60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、120mg/mL、140mg/mL、150mg/mL等。
优选地,所述PEG多酚化合物溶液的浓度为1~5mg/mL,例如可以是1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL、5mg/mL等。
优选地,所述原花青素溶液的浓度为5~15mg/mL,例如可以是5mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、14mg/mL、15mg/mL等。
优选地,所述第一次搅拌的温度为20~30℃,例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等,时间为0.5~2h,例如可以是0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、0.9h、1h、1.2h、1.4h、1.6h、1.8h、2h等。
优选地,所述第二次搅拌的温度为20~30℃,例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等,时间为6~8h,例如可以是6h、6.2h、6.5h、6.8h、7h、7.2h、7.5h、7.8h、8h等。
优选地,所述收集金属多酚纳米粒子的方式为离心,所述离心的转速为8000~12000r/min,例如可以是8000r/min、9000r/min、10000r/min、11000r/min、12000r/min等,离心的时间为5~15min,例如可以是5min、6min、8min、10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
优选地,所述离心后还包括洗涤,所述洗涤为用水洗涤至少1次,例如可以是1次、2次、3次、4次、5次等。
优选地,所述洗涤得到的产物还需重新分散至水中进行储存,所述产物和水的质量比为1:(3~5),例如可以是1:3、1:3.2、1:3.4、1:3.6、1:3.8、1:4、1:4.2、1:4.4、1:4.6、1:4.8、1:5等。
优选地,所述金属多酚纳米粒子的制备方法还包括透明质酸外壳的包覆,具体包括以下步骤:
将金属多酚纳米粒子置于透明质酸溶液中,通过搅拌完成包覆,再进行离心处理,得到透明质酸包覆的金属多酚纳米粒子。
优选地,所述金属多酚纳米粒子的制备方法还包括透明质酸外壳的包覆,具体包括以下步骤:
将PF-NPs纳米粒子置于透明质酸溶液中,通过搅拌完成包覆,再进行离心处理,得到HA-PF-NPs纳米粒子。
优选地,所述PF-NPs纳米粒子和透明质酸溶液的质量比为1:(0.5~1),例如可以是1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1等。
优选地,所述透明质酸溶液的浓度为0.5~1mg/mL,例如可以是0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL等。
优选地,所述搅拌在避光条件下进行。
优选地,所述搅拌的温度为20~30℃,例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等,搅拌的时间为6~8h,例如可以是6h、6.2h、6.4h、6.6h、6.8h、7h、7.2h、7.4h、7.6h、7.8h、8h等。
作为本发明优选技术方案,所述金属多酚纳米粒子由以下步骤制备得到:
S1、PEG多酚化合物的制备
先将八臂聚乙二醇类活化酯、多巴胺盐和溶剂混合,在保护性气体的存在下、于20~30℃下反应0.5~2h;随后向上述反应体系中加入缚酸剂,继续在保护性气体的存在、及避光的条件下,于20~30℃下反应10~15h;将反应结束的产物依次进行透析、冻干,得到所述PEG多酚化合物。
S2、金属多酚纳米粒子的制备
将金属盐溶液和PEG多酚化合物溶液混合,在20~30℃下搅拌0.5~1h;随后向上述体系中加入原花青素溶液,继续在20~30℃下搅拌4~8h;反应结束后,依次进行离心、洗涤,得到所述金属多酚纳米粒子。
S3、透明质外壳的包覆
将金属多酚纳米粒子置于透明质酸溶液中,20~30℃下搅拌6~8h完成包覆,再进行离心处理,得到透明质外壳包覆的金属多酚纳米粒子。
第三方面,本发明提供一种含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子,所述含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子包括:第一方面所述的金属多酚纳米粒子、以及包覆于所述的金属多酚纳米粒子网络中的抗乳腺癌药物。
优选地,所述抗乳腺癌药物为EGFR抑制剂。
优选地,所述EGFR抑制剂为吉非替尼。
吉非替尼(Gefitinib)是第一代EGFR抑制剂(属小分子化合物),对EGFR的抑制可阻碍肿瘤的生长、转移和血管生成,并增加肿瘤细胞的凋亡。本发明通过金属多酚纳米网络将二者联合,包覆吉非替尼,从而实现化疗-PTT协同治疗;既解决了吉非替尼耐药性又克服了花青素易氧化的不足,二者协同作用于双靶点为乳腺癌的治疗提供了高效的解决方案。
优选地,所述EGFR抑制剂的负载量为3~8wt%,例如可以是3wt%、3.5wt%、4wt%、4.5wt%、5wt%、5.5wt%、6wt%、6.5wt%、7wt%、7.5wt%、8wt%等。
优选地,所述含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子还包括透明质酸外壳。
在本发明中,在含抗乳腺癌药物的金属多酚的纳米网络的外层包覆了一层透明质酸(HA)作为外壳,可以靶向肿瘤细胞中的CD44受体,为乳腺癌靶向治疗药物的研究开发提供了新的解决方案。
优选地,所述透明质酸的分子量为8000~12000Da,例如可以是8000Da、8500Da、9000Da、9500Da、10000Da、10500Da、11000Da、11500Da、12000Da等。
第四方面,本发明提供一种如第三方面所述的含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
将金属盐溶液和PEG多酚化合物溶液混合,进行第一次搅拌;再与原花青素溶液混合,进行第二次搅拌;再与吉非替尼溶液混合,进行第三次搅拌;反应结束后,收集得到含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子。
优选地,所述含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子为PFG-NPs纳米粒子。
优选地,所述吉非替尼溶液的浓度为5~15mg/mL,例如可以是5mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、14mg/mL、15mg/mL等。
优选地,所述吉非替尼溶液的添加量占混合后总溶液体积的2~6%,例如可以是2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%等。
优选地,所述第一次搅拌的温度为20~30℃,例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等,时间为0.5~1h,例如可以是0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、0.9h、1h等。
优选地,所述第二次搅拌的温度为20~30℃,例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等,时间为5~10min,例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min等。
优选地,所述第三次搅拌的温度为20~30℃,例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等,时间为4~8h,例如可以是4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h、7.5h、8h等。
优选地,所述收集得到含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子的方式为离心,所述离心的转速为8000~12000r/min,例如可以是8000r/min、9000r/min、10000r/min、11000r/min、12000r/min等,离心的时间为10~15min,例如可以是10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
优选地,所述离心后还包括洗涤,所述洗涤为用水洗涤至少1次,例如可以是1次、2次、3次、4次、5次等。
优选地,所述洗涤得到的产物还需重新分散至水中进行储存,所述产物和水的质量比为1:(0.8~1.2),例如可以是1:0.8、1:0.85、1:0.9、1:0.95、1:1、1:1.05、1:1.1、1:1.15、1:1.2等。
优选地,所述金属多酚纳米粒子的制备方法还包括透明质酸外壳的包覆,具体包括以下步骤:
将含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子置于透明质酸溶液中,通过搅拌完成包覆,再进行离心处理,得到透明质酸包覆的含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子。
优选地,所述含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子的制备方法还包括透明质酸外壳的包覆,具体包括以下步骤:
将PFG-NPs纳米粒子置于透明质酸溶液中,通过搅拌完成包覆,再进行离心处理,得到HA-PFG-NPs纳米粒子。
优选地,所述PFG-NPs纳米粒子和透明质酸溶液的质量比为1:(0.5~1),例如可以是1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1等。
优选地,所述透明质酸溶液的浓度为0.5~1mg/mL,例如可以是0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、1mg/mL等。
优选地,所述搅拌在避光条件下进行。
优选地,所述搅拌的温度为20~30℃,例如可以是20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等,搅拌的时间为6~8h,例如可以是6h、6.2h、6.4h、6.6h、6.8h、7h、7.2h、7.4h、7.6h、7.8h、8h等。
作为本发明优选技术方案,所述含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子由以下步骤制备得到(如图1所示):
S1、PEG多酚化合物的制备
先将八臂聚乙二醇类活化酯、多巴胺盐和溶剂混合,在保护性气体的存在下、于20~30℃下反应0.5~2h;随后向上述反应体系中加入缚酸剂,继续在保护性气体的存在、及避光的条件下,于20~30℃下反应10~15h;将反应结束的产物依次进行透析、冻干,得到所述PEG多酚化合物。
S2、含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子的制备
将金属盐溶液和PEG多酚化合物溶液混合,在20~30℃下搅拌0.5~1h;随后向上述体系中加入原花青素溶液,继续在20~30℃下搅拌5~10min;再向上述体系中加入吉非替尼水溶液,继续在20~30℃下搅拌4~8h;反应结束后,依次进行离心、洗涤,得到所述含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子。
第五方面,本发明提供一种如第一方面所述的金属多酚纳米粒子、或如第三方面所述的含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒在制备TMEM16A和/或EGFR抑制剂中的应用。
TMEM16A(ANO1)具有十个跨膜段的钙激活的氯离子通道,TMEM16A离子通道在乳腺癌组织中高表达,并且TMEM16A离子通道的高表达与癌症的增殖、迁移和侵袭等都有着密切的关系,研究表明,TMEM16A激活促进了乳腺癌细胞的体外迁移和侵袭以及小鼠乳腺癌的转移。并且TMEM16A水平较高的乳腺癌患者淋巴结转移更大,生存期更短。在机制上,TMEM16A通过激活EGFR/STAT3/ROCK1信号促进迁移和侵袭。同时被激活的EGFR也会继续促进TMEM16A的表达。
基于此,本发明使用TMEM16A抑制剂,联合EGFR抑制剂,可以双靶点协同抑制乳腺癌增殖、迁移和复,从而高效,特异性的实现对于乳腺癌的治疗。而目前的广谱化疗药物副作用大且易产生耐药性。
第六方面,本发明提供一种如第一方面或第三方面所述的纳米粒子的使用方法,所述使用方法具体包括以下步骤:
将如第一方面所述的金属多酚纳米粒子、或如第三方面所述的含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒孵育在MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞)的培养基中;
待纳米粒子被细胞胞吞后,使用近红外激光进行照射,使纳米粒子发生光热转换效应以及药物释放;
待药物作用完毕后,评估治疗效果。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明以天然多酚小分子抑制剂原花青素为骨架,金属离子进行配位组成金属多酚纳米网络,与传统纳米颗粒相比,以原花青素为骨架的金属多酚纳米颗粒无需要额外载体的引入,与金属配位后即可构成纳米网络;
(2)本发明所述金属多酚纳米粒子具备良好的光热响应性,能够在细胞内或者细胞外通过近红外光的照射下快速升温,且可高效包覆抗乳腺癌药物,如EGFR抑制剂吉非替尼,利用金属多酚纳米网络的光热特性从而实现化疗-PTT协同治疗;
(3)本发明纳米颗粒的原料均为无毒且具有高度的生物相容性,例如原花青素是从天然植物中找到具有确切药理作用的化合物,原花青素具有抗氧化和清除自由基能力,无毒副作用;PEG可显著增加纳米颗粒的血液循环时间和在肿瘤部位的积累;而铁离子为人体必需金属元素,易于代谢;
(4)本发明制备工艺简单无污染且成本低廉效率高、容易实现批量化生产,有着广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所述含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子的制备过程示意图。
图2实施例1和实施例2提供的纳米粒子的扫描电镜图。
图3实施例1和实施例2提供的纳米粒子的粒径和电位的测量图。
图4为不同浓度下的PFG-NPs纳米粒子的红外热成像图。
图5为不同纳米粒子的红外热成像图。
图6为不同组处理后的MDA-MB-231细胞的存活率图。
图7为不同组处理后的U87mg活死染色实验结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
除非另有说明,本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
为了有助于更清楚的理解本发明的内容,现结合具体的实施例详细介绍如下。如无特别说明,本发明实施例中使用的实验动物、药品及试剂均来源为正规而易购渠道:
实施例1
本实施例提供一种原花青素-Fe纳米粒子(PF-NPs)以及原花青素-Fe-吉非替尼纳米粒子(PFG-NPs),所述纳米粒子由以下步骤制备得到:
S1、PEG多酚化合物的合成
将100mg八臂PEG活性酯(芃硕生物8ARM-PEG-NHS)与38mg盐酸多巴胺加入25mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,在氮气保护下室温反应1h,随后将35μL三乙胺(TEA,Et3N)加入上述反应中,继续在避光以及氮气保护条件下反应12h,将反应结束的产物在微酸性条件下(2mL纯水+20mL、1mol/L的盐酸)透析48h,再在-70℃下冻干48h,得到PEG多酚化合物;
S2、原花青素-Fe纳米粒子纳米粒子(PF-NPs)的合成
将0.5mL(100mg/mL)六水三氯化铁(FeCl3·6H2O)水溶液与22mL(2.6mg/mL)PEG多酚衍生物水溶液在室温下搅拌1h;随后加入2.5mL(10mg/mL)的原花青素水溶液,继续室温下避光搅拌7h;将反应结束后的PF-NPs纳米粒子离心(10000转/分钟)10min,然后用水洗涤3次;最后,将产物重新分散在水中,所述产物和水的质量比为1:1,密封放置于4℃冰箱中避光储存。
S2'、原花青素-Fe-吉非替尼纳米粒子(PFG-NPs)的合成
将0.5mL(100mg/mL)六水三氯化铁(FeCl3·6H2O)水溶液与22mL(2.6mg/mL)PEG多酚衍生物水溶液在室温下搅拌1h;随后加入2.5mL(10mg/mL)的原花青素水溶液,继续室温下避光搅拌7h;再向上述体系中加入1.25mL(10mg/mL)吉非替尼水溶液,继续室温下避光搅拌7h;将反应结束后的PFG-NPs纳米粒子离心(10000转/分钟)10min,然后用水洗涤3次;最后,将产物重新分散在水中,所述产物和水的质量比为1:1,密封放置于4℃冰箱中避光储存。
实施例2
本实施例提供一种透明质酸包覆的原花青素-Fe纳米粒子(HA-PF-NPs)以及透明质酸包覆的原花青素-Fe-吉非替尼纳米粒子(HA-PFG-NPs),所述纳米粒子由以下步骤制备得到:
S1、PEG多酚化合物的合成
将100mg八臂PEG活性酯(芃硕生物8ARM-PEG-NHS)与38mg盐酸多巴胺加入25mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,在氮气保护下室温反应1h,随后将35μL三乙胺(TEA,Et3N)加入上述反应中,继续在避光以及氮气保护条件下反应12h,将反应结束的产物在微酸性条件下(2mL纯水+20mL、1mol/L的盐酸)透析48h,再在-70℃下冻干48h,得到PEG多酚化合物;
S2、原花青素-Fe纳米粒子纳米粒子(PF-NPs)的合成
将0.5mL(100mg/mL)六水三氯化铁(FeCl3·6H2O)水溶液与22mL(2.6mg/mL)PEG多酚衍生物水溶液在室温下搅拌1h;随后加入2.5mL(10mg/mL)的原花青素水溶液,继续室温下避光搅拌7h;将反应结束后的PF-NPs纳米粒子离心(10000转/分钟)10min,然后用水洗涤3次;最后,将产物重新分散在水中,所述产物和水的质量比为1:1,密封放置于4℃冰箱中避光储存。
S3、透明质酸包覆的原花青素-Fe纳米粒子(HA-PF-NPs)的合成
将10mL的PF-NPs纳米粒子置于10mL的透明质酸溶液(1mg/mL,平均分子量为10000Da)中,室温下搅拌7h完成包覆,再进行离心处理除去杂质,得到HA-PF-NPs纳米粒子。
S2'、原花青素-Fe-吉非替尼纳米粒子(PFG-NPs)的合成
将0.5mL(100mg/mL)六水三氯化铁(FeCl3·6H2O)水溶液与22mL(2.6mg/mL)PEG多酚衍生物水溶液在室温下搅拌1h;随后加入2.5mL(10mg/mL)的原花青素水溶液,继续室温下避光搅拌0.1h;再向上述体系中加入1.25mL(10mg/mL)吉非替尼水溶液,继续室温下避光搅拌7h;将反应结束后的PFG-NPs纳米粒子离心(10000转/分钟)10min,然后用水洗涤3次;最后,将产物重新分散在水中,所述产物和水的质量比为1:1,密封放置于4℃冰箱中避光储存。
S3'、透明质酸包覆的原花青素-Fe纳米粒子(HA-PF-NPs)的合成
将10mL的PFG-NPs纳米粒子置于10mL的透明质酸溶液(1mg/mL,分子量为10000Da)中,室温下搅拌7h完成包覆,再进行离心处理除去杂质,得到HA-PFG-NPs纳米粒子。
测试例1
纳米颗粒的表征数据测试
测试样品:实施例1~2提供的纳米粒子;
测试方法:通过SEM扫描电镜、粒径和电位的测量;
如图2所示,PF-NPs的粒径为50~120nm;PFG-NPs的粒径为70~130nm;HA-PF-NPs的粒径为100~180nm;HA-PFG-NPs为100~220nm。
如图3所示,所述金属多酚纳米粒子包括原花青素和PEG多酚化合物反应形成的有机骨架主体,以及通过金属配位修饰在所述有机骨架主体的金属纳米粒子;且当所述PEG多酚化合物由八臂聚乙二醇类活化酯和多巴胺盐反应得到;所述金属纳米粒子Fe时,能够得到尺寸更为均一、分散性好的球形形貌的纳米颗粒。
测试例2
光热响应性测试
测试样品:实施例1~2提供的PF-NPs、PFG-NPs、HA-PF-NPs、HA-PFG-NPs纳米粒子;
测试方法:将不同浓度的纳米粒子置于96孔板内,以1W的功率光照5min(808nm,1W/cm2),每隔60s使用红外相机进行拍摄记录;另外取固定浓度的纯水、原花青素水溶液(PC)、吉非替尼水溶液(Gf)、PF-NPs和PFG-NPs两种纳米粒子以1W的功率光照5min(808nm,1W/cm2),使用红外相机进行拍摄记录。
如图4~5所示,本发明纳米颗粒具备良好的光热响应性,能够在细胞内或者细胞外通过近红外光的照射下快速升温,同时高效递送吉非替尼,从而实现化疗-PTT协同治疗。
测试例3
细胞增殖测试
测试样品:实施例1~2提供的PF-NPs、PFG-NPs、HA-PF-NPs、HA-PFG-NPs纳米粒子;
测试方法:通过细胞增殖实验,采用CCK-8法测定其对MDA-MB-231细胞的细胞增殖影响。MDA-MB-231细胞培养在96孔板24h;
分为普通组和光照组(LASER),然后添加两种样品(PF-NPs和PFG-NPs)浓度分别是6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL。
其中,光照组在纳米药物孵育4h后,对组内每孔细胞使用808nm的近红外激光,以1W的功率光照5min(808nm,1W/cm2);光照结束后继续培养至48h,培养结束后每孔加入10μLCCK-8检测试剂,在37℃孵育2-4h后,在酶标仪上设置测量波长为450nm,将96孔板置于其中进行其吸光度的测定。通过与对照进行比较来测定相对细胞活力。
结果如图6所示,可以看到PF-NPs和PFG-NPs两种材料均以浓度依赖的方式抑制MDA-MB-231细胞的增殖,其中,包载了吉非替尼的PFG-NPs效果要由于仅包含原花青素的PF-NPs;并且两种材料在加入激光光照以后的抑制效果较普通组更为显著。
结果如图7活死细胞染色结果所示,可以看到PF-NPs和PFG-NPs两种材料均比单独小分子原花青素和吉非替尼给药组的杀伤效果好,其中,包载了吉非替尼的PFG-NPs效果要优于仅包含原花青素的PF-NPs;并且两种材料在加入激光光照以后的杀伤效果较普通组更为显著。
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种金属多酚纳米粒子,其特征在于,所述金属多酚纳米粒子包括原花青素和PEG多酚化合物反应形成的有机骨架主体,以及通过金属配位修饰在所述有机骨架主体的金属纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的金属多酚纳米粒子,其特征在于,所述PEG多酚化合物由八臂聚乙二醇类活化酯和多巴胺盐反应得到;
优选地,所述八臂聚乙二醇类活化酯的分子量为8000~12000Da;
优选地,所述八臂聚乙二醇类活化酯为八臂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯;
优选地,所述多巴胺盐为盐酸多巴胺;
优选地,所述金属纳米粒子选自Cu、Zr或Fe中的任意一种或至少两种的组合,优选为Fe。
3.根据权利要求1或2所述的金属多酚纳米粒子,其特征在于,所述金属多酚纳米粒子还包括透明质酸外壳;
优选地,所述透明质酸的分子量为8000~12000Da。
4.一种根据权利要求1~3中任一项所述的金属多酚纳米粒子的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
将金属盐溶液和PEG多酚化合物溶液混合,进行第一次搅拌;再与原花青素溶液混合,进行第二次搅拌;反应结束后,收集得到所述金属多酚纳米粒子。
5.根据权利要求4所述的金属多酚纳米粒子的制备方法,其特征在于,所述PEG多酚化合物由以下步骤制备得到:
先将八臂聚乙二醇类活化酯、多巴胺盐和溶剂混合,进行反应;再向上述反应体系中加入缚酸剂,进行反应;反应结束后,收集得到所述的PEG多酚化合物;
优选地,所述八臂聚乙二醇类活化酯和多巴胺盐的质量比为10:(3~5);
优选地,所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺;
优选地,所述缚酸剂为三乙胺;
优选地,所述缚酸剂的添加量为所述八臂聚乙二醇类活化酯和多巴胺盐总质量的0.1~1%;
优选地,向上述反应体系中加入缚酸剂前,在20~30℃下反应0.5~2h;
优选地,向上述反应体系中加入缚酸剂后,在20~30℃下反应10~15h;
优选地,所述反应结束后,需将收集得到产物在微酸性条件下透析;
优选地,所述微酸性条件为盐酸的水溶液;
优选地,所述盐酸的水溶液的浓度为0.5~2mol/L;
优选地,所述透析的时间为42~54h;
优选地,所述透析后还包括冻干,所述冻干的温度为-80~-40℃,所述冻干的时间为24~48h。
6.根据权利要求4所述的金属多酚纳米粒子的制备方法,其特征在于,所述金属多酚纳米粒子为PF-NPs纳米粒子;
优选地,所述金属盐、PEG多酚化合物和原花青素的质量比为(4~6):(5~7):(2~3);
优选地,所述金属盐溶液的浓度为50~150mg/mL;
优选地,所述PEG多酚化合物溶液的浓度为1~5mg/mL;
优选地,所述原花青素溶液的浓度为5~15mg/mL;
优选地,所述第一次搅拌的温度为20~30℃,时间为0.5~2h;
优选地,所述第二次搅拌的温度为20~30℃,时间为6~8h;
优选地,所述收集金属多酚纳米粒子的方式为离心,所述离心的转速为8000~12000r/min,离心的时间为5~15min;
优选地,所述离心后还包括洗涤,所述洗涤为用水洗涤至少1次;
优选地,所述洗涤得到的产物还需重新分散至水中进行储存,所述产物和水的质量比为1:(3~5);
优选地,所述金属多酚纳米粒子的制备方法还包括透明质酸外壳的包覆,具体包括以下步骤:
将PF-NPs纳米粒子置于透明质酸溶液中,通过搅拌完成包覆,再进行离心处理,得到HA-PF-NPs纳米粒子;
优选地,所述PF-NPs纳米粒子和透明质酸溶液的质量比为1:(0.5~1);
优选地,所述透明质酸溶液的浓度为0.5~1mg/mL;
优选地,所述搅拌在避光条件下进行;
优选地,所述搅拌的温度为20~30℃,搅拌的时间为6~8h。
7.一种含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子,其特征在于,所述含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子包括:如权利要求1~3中任一项所述的金属多酚纳米粒子,以及包覆于所述的金属多酚纳米粒子网络中的抗乳腺癌药物;
优选地,所述抗乳腺癌药物为EGFR抑制剂;
优选地,所述EGFR抑制剂为吉非替尼;
优选地,所述EGFR抑制剂的负载量为3~8wt%;
优选地,所述含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子还包括透明质酸外壳;
优选地,所述透明质酸的分子量为8000~12000Da。
8.一种根据权利要求7所述的含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
将金属盐溶液和PEG多酚化合物溶液混合,进行第一次搅拌;再与原花青素溶液混合,进行第二次搅拌;再与吉非替尼溶液混合,进行第三次搅拌;反应结束后,收集得到含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子。
9.根据权利要求8所述的含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子的制备方法,其特征在于,所述含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子为PFG-NPs纳米粒子;
优选地,所述吉非替尼溶液的浓度为5~15mg/mL;
优选地,所述吉非替尼溶液的添加量占混合后总溶液体积的2~6%;
优选地,所述第一次搅拌的温度为20~30℃,时间为0.5~1h;
优选地,所述第二次搅拌的温度为20~30℃,时间为5~10min;
优选地,所述第三次搅拌的温度为20~30℃,时间为4~8h;
优选地,所述收集得到含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子的方式为离心,所述离心的转速为8000~12000r/min,离心的时间为10~15min;
优选地,所述离心后还包括洗涤,所述洗涤为用水洗涤至少1次;
优选地,所述洗涤得到的产物还需重新分散至水中进行储存,所述产物和水的质量比为1:(0.8~1.2);
优选地,所述含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子的制备方法还包括透明质酸外壳的包覆,具体包括以下步骤:
将PFG-NPs纳米粒子置于透明质酸溶液中,通过搅拌完成包覆,再进行离心处理,得到HA-PFG-NPs纳米粒子;
优选地,所述PFG-NPs纳米粒子和透明质酸溶液的质量比为1:(0.5~1);
优选地,所述透明质酸溶液的浓度为0.5~1mg/mL;
优选地,所述搅拌在避光条件下进行;
优选地,所述搅拌的温度为20~30℃,搅拌的时间为6~8h。
10.一种根据权利要求1~3中任一项所述的金属多酚纳米粒子、或权利要求7所述的含抗乳腺癌药物的金属多酚纳米粒子在制备TMEM16A和/或EGFR抑制剂中的应用。
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