CN117405473A - 一种动物肌肉组织的病理切片制作方法 - Google Patents

一种动物肌肉组织的病理切片制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种动物肌肉组织病理切片的制作方法，包括以下步骤：取动物肌肉样本，生理盐水冲洗，10wt％中性甲醛溶液固定，在波长为10cm～15cm的微波条件下，使用80％乙醇溶液进行脱脂处理；无水乙醇脱色，二甲苯透明，液体石蜡浸蜡，包埋得到石蜡病理样本，切片处理，最终进行病理染色。本发明提供的制片方法参考微波对组织的渗透作用，增加微波脱脂操作进行组织标本制备，所制备的标本固定完好，肌肉切片平整，染色后切片的形态结构、颜色均匀良好，使得制成的动物肌肉组织切片结构更加完整，平整，干净无褶皱，无脱片现象，品质更高，可观察性更优，符合病理诊断要求。

Description

一种动物肌肉组织的病理切片制作方法
技术领域
本发明属于生命科学技术领域，具体涉及一种动物肌肉组织的病理切片制作方法。
背景技术
在评估注射剂临床前安全性评价中，通常选用实验动物兔的股四头肌，作为评价肌肉损伤的实验系统，进行药物注射剂对肌肉组织刺激性的评估。在注射结束后，剖检动物肌肉组织，对肌肉组织进行组织病理学检查。组织病理学检查作为评价注射液肌肉刺激性反应、药物安全性评价中的关键指标，其作用至关重要。
传统的病理制片方法为酒精梯度脱水，肌肉组织经过70％、80％、90％、95％、100％乙醇逐级梯度脱水，通常是在脱水机中进行，在梯度脱水过程中完成脱脂，但是在此过程中存在一些问题：如传统方式梯度酒精置于脱水机内，脂类组织被脱出，容易堵塞脱水机管路；传统过程的酒精梯度无法确定脱脂的程度，无法确保肌肉中脂质组织完全去除，因此肌肉中会残留脂质成分；由于肌肉组织其特性为质地较韧，肌肉组织中含有脂质成分，两种成分质地不同，给切片制作增加困难，容易出现肌肉组织薄厚不均，容易脱片，容易出现肌肉间空间较大，容易叠片等人工假象，可导致病理诊断造成困难，出现误诊的情况。
传统的病理制片方法并不容易制备出质量较好的肌肉病理切片，因为兔肌肉组织中脂肪成分含量低、筋膜含量较少，肌肉间间质成分占比较少，同时每条肌丝互相贴合，但又相对独立，所以从组织固定到切片制作完成这个过程中存在很多不确定性，如取材、脱水、包埋、切片及染色的不同，均会造成肌肉组织的固定不彻底、切片过厚、切片碎裂、染色质量较低等情况。上述情况对组织病理学诊断造成较严重的影响，可出现误导判断，错误判断的问题。
发明内容
本发明的目的是，提供一种肌肉组织病理切片制作方法。本发明参考微波对组织的渗透作用，通过反复试验和条件的摸索，增加微波脱脂操作进行组织标本制备，所制备的标本固定完好，肌肉切片平整，染色均匀，有利于病理诊断的进行。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
本发明提供一种动物肌肉组织病理切片的制作方法，包括以下步骤：
S1、取材处理：剖取动物肌肉组织样本，沿肌肉肌丝方向剖开肌肉组织，使用生理盐水冲洗除去血污；
S2、固定处理：将步骤S1冲洗后的肌肉组织样本浸泡于浓度为10wt％中性甲醛溶液中固定24～48小时，所述中性甲醛溶液的体积是所述肌肉组织样本体积的5倍以上；
S3、脱脂处理：将步骤S2固定后的肌肉组织样本，在波长为10cm～15cm的微波条件下，使用80％乙醇溶液作为脱脂液，对肌肉组织进行脱脂，每1～3小时更换一次肌肉组织样本中的脱脂液，所述肌肉组织样本中的脱脂液无色清澈即为脱脂结束；
S4、脱色透明：在步骤S3脱脂处理结束后，将肌肉组织样本用无水乙醇脱水5～9次，每0.5～3小时更换一次无水乙醇溶液；然后，将脱色后的肌肉组织样本用二甲苯透明2～4次，每0.5～3小时更换一次二甲苯；
S5、浸蜡包埋：将步骤S4脱水透明后的肌肉组织样本，在62～68℃条件下用液体石蜡浸蜡处理1～3次，每1～2小时更换一次液体石蜡，处理后进行包埋得到石蜡病理样本；
S6、病理切片、染色处理：将步骤S5得到的石蜡病理样本进行切片处理，最终进行病理染色。
作为优选实施方案，所述步骤S2还包括以下步骤：在所述固定处理完成后，沿所述剖开的剖开面40～60°切取剖开面，得到肌肉组织样本块，将所述样本块置于包埋框中进行流水冲洗3～6小时，所述流水冲洗是将含有肌肉组织样本块的包埋框置于容器中，容器口罩上纱布并用线系牢，用橡皮管将自来水引流至容器内，让水自下而上的溢出，实现冲洗作用，容器可以是烧杯或广口瓶。
作为优选实施方案，在所述包埋框内的肌肉组织样本块上下设置有海绵。
作为优选实施方案，所述动物肌肉组织包括兔的股四头肌肉组织。
作为优选实施方案，所述步骤S2中的固定处理过程置于37℃摇床内进行，所述固定时间为24小时。
作为优选实施方案，所述步骤S3，将固定后的肌肉组织样本，在波长为12.25cm的微波条件下，使用80％乙醇溶液作为脱脂液，对肌肉组织进行脱脂，每2小时更换一次肌肉组织样本中的脱脂液，更换脱脂液的次数不少于3次。
作为优选实施方案，所述步骤S4，将脱脂处理后的肌肉组织样本用无水乙醇脱水7次，每1～2小时更换一次无水乙醇；然后，将脱色后的肌肉组织样本用二甲苯透明3次，每1～2小时更换一次二甲苯。
作为优选实施方案，所述步骤S5，将脱水透明后的肌肉组织样本，在65℃条件下用液体石蜡浸蜡处理2次，每1小时更换一次液体石蜡，处理后进行包埋得到石蜡病理样本。
作为优选实施方案，所述步骤S6中的切片处理包括对石蜡病理样本进行切片、摊片和烤片操作，所述切片的厚度为2～5μm，所述摊片的温度为45～50℃，所述烤片的温度为45～50℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供的肌肉组织病理制片方法，相对与传统标本组织标本制作，本发明增加了微波脱脂过程，确保脂类物质的脱离，保证脱水效果，优化了整个病理切片制备的处理方式，确保动物肌肉组织制备切片的厚度均匀，保证染色后切片的形态结构、颜色均匀良好，使得制成的动物肌肉组织切片结构更加完整，平整，干净无褶皱，无脱片现象，品质更高，可观察性更优，符合病理诊断要求。
附图说明
图1是本发明剖取实验动物兔的股四头肌肉组织，其中，方框内是股四头肌注射部位。
图2是本发明将固定、脱水、透明后肌肉组织包埋于石蜡中的蜡块标本。
图3是本发明的实施例1制作的肌肉组织病理切片的显微镜下图，其中，箭头所指的白圈是肌肉组织标本经过脱脂处理后，标本内去除脂肪组织留下的遗迹。
图4是本发明的实施例1制作的肌肉组织病理切片的显微镜下图。
图5是本发明的实施例2制作的肌肉组织病理切片的显微镜下图；其中，箭头所指位置为部分切面不平整，厚度不均一，切片部分脱落不全的位置。
图6是本发明的实施例3制作的肌肉组织病理切片的显微镜下图。
图7是本发明的实施例4制作的肌肉组织病理切片的显微镜下图；其中，箭头所指位置为部分切面不平整，厚度不均一，切片部分脱落不全的位置。
图8是本发明的实施例5制作的肌肉组织病理切片的显微镜下图；其中，箭头所指位置为部分切面不平整，厚度不均一，切片部分脱落不全的位置。
图9是本发明的对比例1采用传统方法制作的实验动物兔的肌肉组织病理切片的显微镜下图；其中，箭头所指位置为部分切面不平整，厚度不均一，切片部分脱落不全的位置。
具体实施方式
为更确切说明本发明的技术方案和优化步骤更为明确，下面结合具体实施方式对本发明做进一步详细说明。
本发明实施例中应用主要试剂和主要仪器信息包括：甲醛、乙醇、二甲苯均购自国药集团化学试剂有限公司，石蜡购自德国徕卡Leica公司；KOS微波快速组织处理机(Milestone公司)，ASP6025自动组织脱水机(Leica公司)、HistoCore组织包埋机(Leica公司)，LeicaRM2255轮转切片机(Leica公司)，LeicaST5020自动组织切片染色机(Leica公司)。
以下各个实施例中，所有的动物实验均在医学伦理委员会批准的情况下进行动物手术。
实施例1：实验动物兔肌肉组织病理切片的制作
具体步骤如下：
(1)取材：使用乙酸注射1mL于实验兔右侧的股四头肌内，计划48小时后处死实验兔。使用乙酸注射是使实验兔股四头肌产生肌肉刺激，以确定注射股四头肌的位置。腹腔注射乌来糖麻醉，剂量1g/kg，麻醉后，5分钟内，使用颈动脉放血方法处死实验兔。
兔尸体置于解剖台，使用外科剪刀，剪开股四头肌上方皮肤，暴露股四头肌，可见股四头肌注射部位淤血，肌肉注射部位呈紫红色，沿股骨剖取股四头肌，处于离体状态。
(2)初切：使用生理盐水冲洗处于离体状态的股四头肌肉组织，确保肌肉组织再无血液流出，使用纱布擦干肌肉组织表面。沿肌肉组织肌丝方向，股四头肌正中纵向剖开肌肉，使用生理盐水冲洗剖开部分，擦干后充分暴露剖开面如图1所示，图1是本发明剖取实验动物兔的股四头肌肉组织，其中，方框内是股四头肌注射部位；观察肌肉组织情况，剖开后的肌肉组织内仍呈紫红色，质地稍硬，其中，肌肉组织内呈紫红色说明肌肉内存在少量淤血，淤血呈现紫红色，生理盐水不能完全冲洗干净，属于正常情况。
(4)固定：观察结束后，迅速将肌肉组织置入10％中性福尔马林固定，10％中性福尔马林是采用PBS(磷酸盐缓冲液pH7.4)配置而成固定液，固定液体积为肌肉组织体积的5倍，固定24小时后进行二次取材，固定期间置于37℃摇床内进行，以使固定完全，固定完成肌肉组织质地较硬，呈现淡黄色。
上述过程中，切勿将肌肉组织置于4℃的冷藏室内，肌肉组织容易收缩，容易造成不可逆转的改变。
(5)二次取材：肌肉组织完全固定后进行二次取材，为避免其他取材角度可能造成肌纤维剖面的不同，采用沿剖开面40～60°切取剖开面；取长1.5cm，宽1.0cm，厚0.2cm的固定后肌肉组织，制成切片所用肌肉组织标本，将该标本置于包埋框内，并在包埋框内的标本上下使用海绵压紧，以防止肌肉卷曲变形。二次取材后的肌肉组织呈现平整光滑状态，整个肌肉组织质地相同，取材部位包括病变区域及正常状态区域；其中，正常肌肉组织注射完后也可见病变区域，如局部淤血出现的紫红色淤血区域，病变通常指注射及注射周围区域。
(6)二次冲洗：二次取材后，使用流水冲洗4小时，确保肌肉组织标本表面固定液、及表明残渣的去除。所述流水冲洗是将含有肌肉组织样本块的包埋框置于广口瓶中，瓶口罩纱布并用线系牢，用橡皮管将自来水引流至广口瓶内，让水自下而上的溢出，实现冲洗作用。
(7)脱脂：冲洗后使用KOS微波快速组织处理机(KOS仪，Milestone公司)进行脱脂处理，KOS微波快速组织处理机本身为微波处理组织的仪器，通常为脱水，脱钙，抗原修复的功能使用；本发明使用的KOS微波机器，微波波长为12.25cm，频率为2450MHz，功率为800w，微波脱脂过程为较慢的过程，通过脱脂后溶液的颜色来判断是否脱脂结束，因此本发明采用在波长为12.25cm的微波条件下，使用80％乙醇溶液作为脱脂液,进行肌肉组织脱脂，将肌肉组织完全浸没在80％乙醇溶液中，加入80％乙醇溶液的体积应不小于组织样本的5倍；每2小时更换一次80％乙醇溶液，直至80％乙醇溶液清澈，一般更换不少于3次80％乙醇溶液后，脱脂液无色清澈，即为脱脂结束。表1为本发明采用不同微波装置进行脱脂效果比对，如表1所述本微波脱脂步骤也可使用传统微波炉对组织进行微波处理，可使用中火，每1小时观察组织一次，脱脂时间需要达到16h后才能够完全脱脂，并且传统微波炉容易产热，建议使用专业的微波处理设备，建议使用中火进行脱脂过程。
表1
注：脱脂液为80％乙醇溶液，每2小时更换一次脱脂液，脱脂效果判断为脱脂液清澈无色即为脱脂完全。
(8)脱水、透明、浸蜡处理：将脱脂后的肌肉组织置于ASP6025自动组织脱水机(Leica公司)完成脱水、透明、浸蜡处理：肌肉组织脱水经过七缸无水乙醇，每缸1小时；再经过三缸二甲苯溶液，每缸1小时进行透明，最后经过两缸液体石蜡组织，每缸至1小时进行浸蜡，具体设定程序为：步骤一：无水乙醇1h，步骤二：无水乙醇1h，步骤三：无水乙醇1h，步骤四：无水乙醇1h，步骤五：无水乙醇1h，步骤六：无水乙醇1h，步骤七：无水乙醇1h，步骤八：二甲苯1h，步骤九：二甲苯1h，步骤十：二甲苯1h，步骤十一：液体石蜡65℃1h，步骤十二：液体石蜡65℃1h。
(9)包埋处理：使用HistoCore组织包埋机进行包埋，选择大于肌肉组织标本的模具对标本进行包埋，切面为剖取面，制成蜡块。
(10)切片、染色：使用LeicaRM2255轮转切片机对肌肉标本蜡块进行切片，切片厚度为2～5μm之间，摊片温度控制在45～50℃之间，烤片温度控制在45～50℃之间。使用LeicaST5020自动组织切片染色机采用常规HE染色进行切片染色，其中使用多聚赖氨酸处理的载玻片以防止组织切片脱片。
实施例2：
与实施例1相比，本实施例2中在使用脱水机的情况下进行脱脂和脱水处理；其中脱脂处理过程仅采用80％乙醇，并未采用微波进行脱脂处理；脱水处理过程采用梯度乙醇进行脱水处理；具体步骤如下：
按照实施例1所述，依次进行取材、初切、固定、二次取材、二次冲洗的操作，冲洗后的肌肉组织进行如下操作：
(1)脱脂、脱水、透明、浸蜡处理：将冲洗后的肌肉组织置于ASP6025自动组织脱水机(Leica公司)完成脱脂、脱水、透明、浸蜡处理：冲洗后的肌肉组织依次经过含有70％和80％乙醇的缸中进行脱脂处理，每缸浸泡3小时后完成脱脂过程；脱脂后的肌肉组织再依次经过梯度酒精进行脱水处理，其中梯度酒精是指90％、95％、95％、100％、100％乙醇；即脱脂后的肌肉组织依次经过含有90％、95％、95％、100％、100％乙醇的缸中，每缸浸泡3小时后完成脱水过程；脱水后的肌肉组织再经过3缸二甲苯溶液进行透明处理，每缸浸泡1小时后完成透明过程，最后在65℃条件下，经过2缸液体石蜡进行浸蜡处理，每缸浸泡至少1小时浸蜡过程。
(2)包埋处理：使用HistoCore组织包埋机进行包埋，选择大于肌肉组织标本的模具对浸蜡后的肌肉组织标本进行包埋，切面为剖取面，制成肌肉标本蜡块。
(3)切片、染色：使用LeicaRM2255轮转切片机对肌肉标本蜡块进行切片，切片厚度为2～5μm之间，摊片温度控制在45～50℃之间，烤片温度控制在45～50℃之间。使用LeicaST5020自动组织切片染色机采用常规HE染色进行切片染色，其中使用多聚赖氨酸处理的载玻片以防止组织切片脱片。
实施例3：
与实施例1相比，本实施例3中使用KOS微波快速组织处理机进行脱脂处理；其中脱脂处理过程包括依次采用70％乙醇和80％乙醇在波长为12.25cm的微波进行脱脂处理；脱水处理过程是在不使用脱水机的情况下，采用梯度乙醇进行脱水处理；具体步骤如下：
按照实施例1所述，依次进行取材、初切、固定、二次取材、二次冲洗的操作，冲洗后的肌肉组织进行如下操作：
(1)脱脂：冲洗后使用KOS微波快速组织处理机(Milestone公司)进行脱脂处理，使用70％和80％乙醇溶液作为脱脂液，冲洗后的肌肉组织依次经过含有70％和80％乙醇的缸中进行脱脂处理，首先采用70％乙醇浸泡肌肉组织样本，2小时更换一次70％乙醇，更换2次，再采用80％乙醇浸泡肌肉组织样本，2小时更换一次80％乙醇，更换至少2次，直至溶液透明。
(2)脱水、透明、浸蜡处理：将脱脂后的肌肉组织置于ASP6025自动组织脱水机(Leica公司)完成脱水、透明、浸蜡处理：肌肉组织脱水经过七缸无水乙醇，每缸1小时；再经过三缸二甲苯溶液，每缸1小时进行透明，最后经过两缸液体石蜡组织，每缸至1小时进行浸蜡，具体设定程序为：步骤一：无水乙醇1h，步骤二：无水乙醇1h，步骤三：无水乙醇1h，步骤四：无水乙醇1h，步骤五：无水乙醇1h，步骤六：无水乙醇1h，步骤七：无水乙醇1h，步骤八：二甲苯1h，步骤九：二甲苯1h，步骤十：二甲苯1h，步骤十一：液体石蜡65℃1h，步骤十二：液体石蜡65℃1h。
(3)包埋处理：使用HistoCore组织包埋机进行包埋，选择大于肌肉组织标本的模具对浸蜡后肌肉标本进行包埋，切面为剖取面，制成肌肉标本蜡块。
(4)切片、染色：使用LeicaRM2255轮转切片机对肌肉标本蜡块进行切片，切片厚度为2～5μm之间，摊片温度控制在45～50℃之间，烤片温度控制在45～50℃之间。使用LeicaST5020自动组织切片染色机采用常规HE染色进行切片染色，其中使用多聚赖氨酸处理的载玻片以防止组织切片脱片。
实施例4：
与实施例1相比，本实施例4中全程使用脱水机进行脱脂和脱水处理；其中脱脂处理过程依次采用70％和80％乙醇进行脱脂，并未采用微波进行脱脂处理；脱水处理过程采用无水乙醇进行脱水处理，具体步骤如下：
按照实施例1所述，依次进行取材、初切、固定、二次取材、二次冲洗的操作，冲洗后的肌肉组织进行如下操作：
(1)脱脂、脱水、透明、浸蜡处理：将组织置于ASP6025自动组织脱水机(Leica公司)完成脱脂、脱水、透明、浸蜡处理：冲洗后的肌肉组织依次经过含有70％和80％乙醇的缸中进行脱脂处理，每缸浸泡3小时后完成脱脂过程；脱脂后的肌肉组织再依次经过5缸含无水乙醇的缸中进行脱水处理，每缸浸泡3小时后完成脱水过程；脱水后的肌肉组织再经过3缸二甲苯溶液进行透明处理，每缸浸泡1小时后完成透明过程，最后在65℃条件下，经过2缸液体石蜡进行浸蜡处理，每缸浸泡至少1小时浸蜡过程。
(2)包埋处理：使用HistoCore组织包埋机进行包埋，选择大于肌肉组织标本的模具对浸蜡后的肌肉组织标本进行包埋，切面为剖取面，制成蜡块。
(3)切片、染色：使用LeicaRM2255轮转切片机对肌肉标本蜡块进行切片，切片厚度为2～5μm之间，摊片温度控制在45～50℃之间，烤片温度控制在45～50℃之间。使用LeicaST5020自动组织切片染色机采用常规HE染色进行切片染色，其中使用多聚赖氨酸处理的载玻片以防止组织切片脱片。
实施例5：脱脂70％、80％乙醇，脱水使用梯度乙醇，全程未使用脱水机
与实施例1相比，本实施例5中使用KOS微波快速组织处理机进行脱脂处理；其中脱脂处理过程包括依次采用70％乙醇和80％乙醇，并采用波长为12.25cm的微波进行脱脂处理；脱水处理过程是在使用脱水机的情况下，采用梯度乙醇进行脱水处理；具体步骤如下：
按照实施例1所述，依次进行取材、初切、固定、二次取材、二次冲洗的操作，冲洗后的肌肉组织进行如下操作：
(1)脱脂、脱水、透明、浸蜡处理：冲洗后的肌肉组织依次经过含有70％和80％乙醇的缸中进行脱脂处理，每缸浸泡3小时后完成脱脂过程；脱脂后的肌肉组织再依次经过梯度酒精进行脱水处理，其中梯度酒精是指90％、95％、95％、100％、100％乙醇；即脱脂后的肌肉组织依次经过含有90％、95％、95％、100％、100％乙醇的缸中，每缸浸泡3小时后完成脱水过程；脱水后的肌肉组织再经过3缸二甲苯溶液进行透明处理，每缸浸泡1小时后完成透明过程，最后在65℃条件下，经过2缸液体石蜡进行浸蜡处理，每缸浸泡至少1小时浸蜡过程。
(2)包埋处理：使用HistoCore组织包埋机进行包埋，选择大于肌肉组织标本的模具对浸蜡后的肌肉组织标本进行包埋，切面为剖取面，制成蜡块。
(3)切片、染色：使用LeicaRM2255轮转切片机对肌肉标本蜡块进行切片，切片厚度为2～5μm之间，摊片温度控制在45～50℃之间，烤片温度控制在45～50℃之间。使用LeicaST5020自动组织切片染色机采用常规HE染色进行切片染色，其中使用多聚赖氨酸处理的载玻片以防止组织切片脱片。
对比例1：
与实施例1相比，本对比例1为传统的制作肌肉组织切片方法，在使用脱水机的情况下进行脱脂和脱水处理；依次采用70％和80％乙醇进行脱脂，并未采用微波进行脱脂处理；脱水处理过程采用梯度酒精进行脱水处理，具体步骤如下：
按照实施例1所述，依次进行取材、初切、固定、二次取材、二次冲洗的操作，冲洗后的肌肉组织进行如下操作：
(1)脱脂、脱水、透明、浸蜡处理：将组织置于ASP6025自动组织脱水机(Leica公司)完成脱脂、脱水、透明、浸蜡处理：将组织置于ASP6025自动组织脱水机(Leica公司)完成脱脂、脱水、透明、浸蜡处理：冲洗后的肌肉组织依次经过含有70％和80％乙醇的缸中进行脱脂处理，每缸浸泡3小时后完成脱脂过程；脱脂后的肌肉组织再依次经过梯度酒精进行脱水处理，其中梯度酒精是指90％、95％、95％、100％、100％乙醇；即脱脂后的肌肉组织依次经过含有90％、95％、95％、100％、100％乙醇的缸中，每缸浸泡3小时后完成脱水过程；脱水后的肌肉组织再经过3缸二甲苯溶液进行透明处理，每缸浸泡1小时后完成透明过程，最后在65℃条件下，经过2缸液体石蜡进行浸蜡处理，每缸浸泡至少1小时浸蜡过程。
(2)包埋处理：使用HistoCore组织包埋机进行包埋，选择大于肌肉组织标本的模具对浸蜡后的肌肉组织标本进行包埋，切面为剖取面，制成肌肉标本蜡块。
(3)切片、染色：使用LeicaRM2255轮转切片机对肌肉标本蜡块进行切片，切片厚度为2～5μm之间，摊片温度控制在45～50℃之间，烤片温度控制在45～50℃之间。使用LeicaST5020自动组织切片染色机采用常规HE染色进行切片染色，其中使用多聚赖氨酸处理的载玻片以防止组织切片脱片。
综合实施例1～对比例1的制作肌肉组织切片处理过程，结果表2所示：
表2
通过表2所示的制作肌肉组织切片结果，可以判断出实施例1的制作肌肉组织切片过程为最合适制作肌肉组织的过程，图3是本发明实施例1制作的肌肉组织病理切片的显微镜下图，其中，箭头所指的白圈是肌肉组织标本经过脱脂处理后，标本内去除脂肪组织留下的遗迹；图4是本发明实施例1制作的肌肉组织病理切片的显微镜下图；结果如图3和图4所示，采用80％乙醇联合波长为12.25cm的微波进行肌肉组织脱脂处理，在保证脱脂的情况下，使用脱水机在无水乙醇存在下充分脱水后，制作的肌肉组织切片结构完整，平整，干净无褶皱，无脱片现象，既保证质量，又确保效率。
图5是本发明的实施例2制作的肌肉组织病理切片的显微镜下图，如图5所示，在使用脱水机的情况下进行脱脂和脱水处理；其中脱脂处理过程仅采用80％乙醇，并未采用微波进行脱脂处理；脱水处理过程采用梯度乙醇进行脱水处理后制作的肌肉组织切片部分切面不平整，厚度不均一，切片部分脱落不全。
图6是本发明的实施例3制作的肌肉组织病理切片的显微镜下图，如图6所示，在使用KOS微波快速组织处理机进行脱脂处理；其中脱脂处理过程包括依次采用70％乙醇和80％乙醇在波长为12.25cm的微波进行脱脂处理；脱水处理过程是在不使用脱水机的情况下，采用梯度乙醇进行脱水处理后制作的肌肉组织切片，虽然结构完整，平整，干净无褶皱，无脱片现象，但相对于本发明的实施例1在脱脂过程增加了70％乙醇脱脂过程，增加了实验的复杂性。
图7是本发明的实施例4制作的肌肉组织病理切片的显微镜下图；如图7所示，在全程使用脱水机进行脱脂和脱水处理；其中脱脂处理过程依次采用70％和80％乙醇进行脱脂，并未采用微波进行脱脂处理；脱水处理过程采用无水乙醇进行脱水处理后制作的肌肉组织切片部分切面不平整，厚度不均一，切片部分脱落不全的位置。
图8是本发明的实施例5制作的肌肉组织病理切片的显微镜下图；如图8所示，在使用KOS微波快速组织处理机进行脱脂处理；其中脱脂处理过程包括依次采用70％乙醇和80％乙醇，并采用波长为12.25cm的微波进行脱脂处理；脱水处理过程是在使用脱水机的情况下，采用梯度乙醇进行脱水处理后制作的肌肉组织切片部分切面不平整，厚度不均一，切片部分脱落不全的位置。
图9是本发明的对比例1采用传统方法制作的实验动物兔的肌肉组织病理切片的显微镜下图；如图9所示，箭头所指位置为部分切面不平整，厚度不均一，切片部分脱落不全的位置。
因此，本发明在采用全程脱脂脱水处理过程中，仅使用80％乙醇和无水乙醇两种试剂，减少实验复杂性，增加质量保证。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

Claims (10)

1.一种动物肌肉组织病理切片的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取材处理：剖取动物肌肉组织样本，沿肌肉肌丝方向剖开肌肉组织，使用生理盐水冲洗除去血污；
S2、固定处理：将步骤S1冲洗后的肌肉组织样本浸泡于浓度为10wt％中性甲醛溶液中固定24～48小时，所述中性甲醛溶液的体积是所述肌肉组织样本体积的5倍以上；
S3、脱脂处理：将步骤S2固定后的肌肉组织样本，在波长为10cm～15cm的微波条件下，使用80％乙醇溶液作为脱脂液，对肌肉组织进行脱脂，每1～3小时更换一次肌肉组织样本中的脱脂液，所述肌肉组织样本中的脱脂液无色清澈即为脱脂结束；
S4、脱色透明：在步骤S3脱脂处理结束后，将肌肉组织样本用无水乙醇脱水5～9次，每0.5～3小时更换一次无水乙醇溶液；然后，将脱色后的肌肉组织样本用二甲苯透明2～4次，每0.5～3小时更换一次二甲苯；
S5、浸蜡包埋：将步骤S4脱水透明后的肌肉组织样本，在62～68℃条件下用液体石蜡浸蜡处理1～3次，每1～2小时更换一次液体石蜡，处理后进行包埋得到石蜡病理样本；
S6、病理切片、染色处理：将步骤S5得到的石蜡病理样本进行切片处理，最终进行病理染色。
2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述步骤S2还包括以下步骤：在所述固定处理完成后，沿所述剖开的剖开面40～60°切取剖开面，得到肌肉组织样本块，将所述样本块置于包埋框中进行流水冲洗3～6小时。
3.根据权利要求2所述的制作方法，其特征在于，在所述包埋框内的肌肉组织样本块上下设置有海绵。
4.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述动物肌肉组织包括兔的股四头肌肉组织。
5.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述步骤S2中的固定处理过程置于37℃摇床内进行，所述固定时间为24小时。
6.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述步骤S3，将固定后的肌肉组织样本，在波长为12.25cm的微波条件下，使用80％乙醇溶液作为脱脂液，对肌肉组织进行脱脂，每2小时更换一次肌肉组织样本中的脱脂液，更换脱脂液的次数不少于3次。
7.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述步骤S4，将脱脂处理后的肌肉组织样本用无水乙醇脱水7次，每1～2小时更换一次无水乙醇；然后，将脱色后的肌肉组织样本用二甲苯透明3次，每1～2小时更换一次二甲苯。
8.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述步骤S5，将脱水透明后的肌肉组织样本，在65℃条件下用液体石蜡浸蜡处理2次，每1小时更换一次液体石蜡，处理后进行包埋得到石蜡病理样本。
9.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述步骤S6中的切片处理包括对石蜡病理样本进行切片、摊片和烤片操作，所述切片的厚度为2～5μm，所述摊片的温度为45～50℃，所述烤片的温度为45～50℃。
10.根据权利要求2所述的制作方法，其特征在于，所述流水冲洗是将含有肌肉组织样本块的包埋框置于容器中，容器口罩上纱布并用线系牢，用橡皮管将自来水引流至容器内，让水自下而上的溢出，实现冲洗作用。
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