CN117402946A - 评价Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶性能的质控品及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于评价Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶性能的质控品、试剂盒及其相关制备方法和应用。本发明中的质控品包括若干含有Q61K突变的细胞系DNA。进一步的，本发明还进一步提供了包含上述质控品、用于扩增含有Q61K突变的细胞系DNA的通用引物对、野生型探针以及突变型探针的试剂盒。本发明提供的用于评估Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶性能的质控品和试剂盒中采用含有Q61K突变的细胞系DNA试剂，可有效得实现对热启动Taq DNA聚合酶性能的全面检测和评估，填补了国内对此类酶性能评估领域的空白。

Description

评价Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶性能的质控品及制 备方法和应用
技术领域
本发明涉及酶性能评价领域，具体涉及一种用于评价Taqman探针法热启动TaqDNA聚合酶性能的质控品、试剂盒及其相关制备方法和应用。
背景技术
Taq DNA聚合酶(也可简称为Taq酶)是一种十分特殊的热稳定性DNA聚合酶，由于其自身的热稳定性，广泛应用于PCR反应中。Taqman探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的外切酶活性，切断探针，产生荧光信号。Taqman探针法荧光定量PCR在各大公司或实验机构的质谱组、捕获组、肿瘤组、测序组等研究和实验中都有广泛的应用，同时，Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶也是是IVD行业中的关键物料。
Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶(Taqman探针法热启动Taq酶)，在低温(通常是50℃左右)下无活性，需通过95℃加热5-10min后才能完全恢复活性。热启动Taq DNA聚合酶可以提高PCR扩增的特异性，降低引物二聚体、非特异性条带的扩增。同时，用于Taqman探针法的热启动Taq DNA聚合酶还必须具有较强的5’-3’外切酶活性，故用于Taqman探针法的热启动Taq DNA聚合酶通常需单独测试。
目前，对于Taqman探针法的热启动Taq DNA聚合酶的性能没有统一的评价标准，无法做到标准化的评价，每个公司及产品均在各自设置的不同标准体系下进行性能与质量评估，无法系统地对各产品的性能进行比较和规范。因此，亟需一种可以对该类酶产品进行统一且规范的评价的产品或方法，有效评估相关酶产品的性能，以更好的进行质量把控。
发明内容
因此，本发明提供了一种可用于评价Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶性能的质控品、试剂盒及其制备方法和应用。
根据第一方面，本发明提供了一种质控品，该质控品用于评价Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶的性能，其包括若干含有Q61K突变的细胞系DNA。
在本发明的一种具体实施方式中，上述质控品中设置了若干已知Q61K突变频率的不同DNA浓度的梯度试剂，即该质控品中包括一系列不同DNA浓度的试剂。同时，上述质控品还包括至少两种不同Q61K突变频率的细胞系DNA，即该质控品中包括至少两种不同Q61K突变频率的试剂。
同时，本发明还提供了上述质控品的制备方法，即采用含Q61K突变的突变型细胞系和野生型细胞系进行制备。具体的，可采用突变型细胞系NCIH2087和野生型细胞系N002制备该质控品。在本申请的一种具体实施方式中，制备步骤包括：
1)选用含有Q61K突变的突变型细胞系NCIH2087，将该突变型细胞系培养后提取细胞系DNA并测定细胞系DNA浓度，使用ddPCR定量，测定在该细胞系DNA中Q61K的突变频率，得到含有Q61K突变的细胞系DNA且已知其DNA浓度和Q61K突变频率的质控品原液；
2)将步骤1)质控品原液与TE缓冲液按比例混合稀释成若干不同DNA浓度的梯度试剂，即得到一系列不同DNA浓度的试剂；
3)根据步骤1)中测定的突变频率，使用野生型细胞系N002对上述质控品原液进行稀释，得到含Q61K突变频率为1％的细胞系DNA。
根据第二方面，本发明提供了一种用于评价Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶性能的试剂盒，具体的，该试剂盒包括：含有Q61K突变的细胞系DNA的质控品，用于扩增所述细胞系DNA的通用引物对、野生型探针以及突变型探针。
根据第三方面，本发明提供了含有Q61K突变的细胞系DNA或细胞系在评估Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶的性能中的应用。具体的，将所述含有Q61K突变的细胞系DNA作为质控品应用上述性能的评估。或者对含有Q61K突变的细胞系进行细胞系DNA提取后，将提取得到的细胞系DNA作为质控品加以应用。上文第一方面中关于质控品的具体设置均可作为该应用的具体实施方式，此处不再累述。
本发明提供的用于评价Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶性能的质控品和试剂盒中采用含有Q61K突变的细胞系DNA试剂，可有效得实现对热启动Taq DNA聚合酶性能的全面检测和评价，填补了国内对此类酶性能评价领域的空白。
附图说明
图1为实施例2中采用QPCR TB Green法分析得到的熔解曲线图。
具体实施方式
随着分子生物学的不断深入研究，对Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶的研究也不断扩展，尤其是在IVD领域，Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶为检测技术的发展提供了强大的支持，越来越多的厂商也加入到Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶的制造、生产和使用中。然而，由于缺乏明确的标准，各上游酶原料厂商往往无法准确了解和清楚认识自己产品，进而有针对性地对酶进行优化及升级。而对于下游IVD厂商而言，进行原料酶的筛选也同样缺乏明确的参考标准。在种类众多的可能的参考体系中，如何提供一种有效的质控品用于评价Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶本身也非常困难。
本发明通过对大量的细胞系DNA及相关突变的研究和筛选，发现含有Q61K突变的细胞系DNA能有效的实现对Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶的性能评价。与众多突变细胞系类似，Q61K为常见的代表性突变类型，为代KRAS/NRAS/BRAF/PI3KCA基因突变检测国家参考品中的重要组成部分，因此，该突变细胞系本身具有较高的代表性。在NCBI数据库Blast中的数据也显示，该突变位点段的序列特异性较好，故用设计引物去扩增，无非特异扩增产生。COSMIC数据库检索显示，Q61K突变位点附近，无其他高频突变位点，因此在此区域设计扩增引物和探针时，相对不会对扩增产生影响。
但更为特别的是，本发明通过进一步的研究和实验，发现：较其他常见突变细胞系，含有Q61K突变的细胞系DNA在进行酶性能评价时，具有更大的区分度，这使其更适合用于酶的性能评价。本发明将含有Q61K突变的细胞系DNA与另外5款常见突变细胞系DNA进行实验比较，具体的，使用数字PCR分别对上述含突变的细胞系DNA进行精确定量，并对此开发出相应的突变检测体系，在同样使用各1％低频突变的细胞系DNA对10款不同品牌的Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶(A-J)进行测试，其中每个细胞系均采用其各自对应的扩增引物和特异性突变探针进行扩增测试，测试结果如下表1所示(表1中的数据为不同酶A-J实验测得的平均Ct值)。其中，细胞系A为T790M突变细胞系，细胞系B为V600E突变细胞系，细胞系C为L858R突变细胞系，细胞系D为G12C突变细胞系，细胞系E为E545K突变细胞系。
表1不同突变系DNA评价Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶(A-J)的扩增情况
实验中可通过计算CV值来评估每种细胞系DNA对不同酶性能的区分度，CV值越大，则表明该细胞系DNA对不同酶的区分度越高，越适合用于酶的性能评估。通过上表1的计算可发现，使用Q61K细胞系DNA进行测试时，各品牌酶的性能区分度与其他突变细胞系DNA对比显著较大，因此，其将作为评价酶性能的质控品有着突出的优势。
为更好的评价Taqman探针法热启动DNA聚合酶性能，本发明从扩增效率、准确性、保真性、真实情况稳定性等多角度对热启动Taq酶的性能进行评估和分析。故，本发明中的质控品包括一系列含Q61K突变的细胞系DNA试剂。本发明使用经过数字PCR定制的Q61K突变细胞系DNA，通过与缓冲液、野生型细胞系DNA分别以一定的比例混合，配置出已确定突变频率的不同DNA浓度的梯度试剂，同时还配置出不同突变频率的细胞系DNA试剂，这些不同试剂的配置可进一步配合上述不同角度的检测。同时，本发明的质控品中还可进一步包括空白模板，即空白质控品，以便通过空白模板进行对照实验进一步测试酶反应体系的稳定性。
需要说明的是，在本发明中，在确定Q61K突变频率后设置不同DNA浓度的梯度试剂主要是为了便于对Taqman探针法热启动DNA聚合酶的扩增效率和准确性进行检测。一方面，通过设置不同DNA浓度的梯度试剂，可绘制出待测酶的标准曲线，从而计算出各种待测酶相应的扩增效率。另一方面，在进行准确性评价时，可根据各待测酶在不同DNA浓度下的Ct值来计算误差率，从而有效判断各待测酶的准确性。关于具体如何设置不同DNA浓度的梯度试剂，在本发明的一种具体实施方式中，优选分别设置了各5种不同DNA浓度的梯度试剂，其中，扩增效率实验中梯度试剂的稀释倍数为逐级增大10倍，准确性实验中梯度试剂的稀释倍数则为2倍、3倍、7倍、9倍、11倍。事实上，本领域技术人员可以基于本发明的说明，根据需要对上述梯度试剂的稀释的倍数进行适当调整。
关于上述配置不同突变频率的细胞系DNA试剂，需要说明的是，通过ddPCR定量可测得所选择的Q61K突变细胞系DNA的突变频率，例如在本申请的一种实施方式中，采用突变型细胞系NCIH2087制备质控品时，突变频率为35％。在进行扩增效率、准确性、真实情况稳定性评价时，均可采用上述突变频率为35％的细胞系DNA。而在进行保真性评估时，需要采用低频突变的质控品进行检测，因此，需要将上述较高突变频率的细胞系DNA进行突变频率的稀释，以便更好地测试酶的保真性。在本申请的一种具体实施方式，进行保真性评价时优选细胞系DNA的Q61K突变频率为0.2％～4％，更优选为0.5％～3％，进一步优选为0.8％～2％，进一步优选为0.8％～1.5％，进一步优选为0.8％～1.2％，最优选为1％。本领域技术人员应理解，在本发明中是否需要设置至少两种突变频率的细胞系DNA或具体如何选择突变频率，可基于本发明中的具体实施方式，根据实验的需求来进行设置和调整。例如，针对保真性性能的测试优选低频突变，此时可选择将质控品原液试剂中的较高突变频率的细胞DNA与野生型细胞系DNA进行稀释以获得较低突变频率的细胞系DNA以满足测试要求，例如将突变频率稀释到1.5％或0.5％等。而针对其他性能评价时，例如扩增效率、准确性等评价，所获得的细胞系DNA则可不进行上述稀释或稀释到其他设定的突变频率。换而言之，突变频率具体值的设置并不构成对本发明的限制。
进一步的，本发明还提供了包括上述质控品以及用于检测Q61K突变以及野生型背景的引物及探针，并提供了适配该引物探针的PCR反应体系，用于酶的性能评价。本发明的提供的试剂盒中的质控品包括若干已知Q61K突变频率的不同DNA浓度的试剂，以及至少两种不同Q61K突变频率的细胞系DNA试剂。关于上述引物和探针的具体选择，可将设计好的引物和探针通过QPCR TB Green法看熔解曲线进行验证判断是否适用于性能评价，若熔解曲线在单荧光通道内为单一的峰，则可确定引物为特异性扩增，即相关探针引物是适用的。在本发明的一种具体实施方式中，优选的引物探针序列如下表2所示，即：用于扩增所述细胞系DNA的通用引物对为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。优选的突变型探针为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。优选的野生型探针为SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。其中，前述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，在本发明的具体实施方式中采用的淬灭基团为MGB，野生型探针的5’荧光报告基团为FAM，突变型探针的5’荧光报告基团为HEM。本领域技术人员可以对上述荧光报告基团和荧光淬灭基团进行适当调整，相关荧光基团的具体选择并不构成对本发明的限制。
表2引物探针序列
同时，本发明还进一步提供了上述试剂盒进行性能评价时的PCR反应体系，在本申请的一种具体实施方式中，反应体系中各组分具体如下表3所示。在本申请的一个具体实施方式中，优选的反应程序为：95℃，预变性5分钟；95℃变性15秒，60℃退火30秒，45个循环。
表3PCR反应体系
组分 体积(μL)
Taq酶+配套Buffer+H2O 依据待测酶产品说明书而定
Q61K-F(10nm) 1
Q61K-R(10nm) 1
野生型探针Q61K-WT(5nm) 0.5
突变型探针Q61K-Mut(5nm) 0.5
DNA(质控品) 2
Total 25
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
实施例1：质控品的制备及定值过程
本例中制备质控品选用含有Q61K突变的细胞系NCIH2087，将该细胞系细胞培养后提取细胞系DNA并测定DNA浓度，其DNA浓度为75ng/μL。使用ddPCR定量，测定在该细胞系中Q61K的突变频率为35％，此时，制备得到质控品原液试剂。
本例中的质控品按照评价项目分为5个类别，包括扩增效率质控品、准确性质控品、保真性质控品、稳定性质控品和空白质控品，具体包括以下13种试剂。其中：
(1)扩增效率质控品，包括5种梯度试剂，具体为：S0质控品、S1质控品、S2质控品、S3质控品和S4质控品。具体制备如下：
S0(质控品原液试剂)：浓度为75ng/μL的Q61K突变细胞系DNA，突变频率为35％；
S1：S0质控品与TE缓冲液按1：9的比例混合而成；
S2：S1质控品与TE缓冲液按1：9的比例混合而成；
S3：S2质控品与TE缓冲液按1：9的比例混合而成；
S4：S3质控品与TE缓冲液按1：9的比例混合而成。
(2)准确性质控品，包括5种梯度试剂，具体为：Z1质控品、Z2质控品、Z3质控品、Z4质控品和Z5质控品。具体制备如下：
Z1：S0质控品与TE缓冲液按1：1的比例混合而成；
Z2：S0质控品与TE缓冲液按1：2的比例混合而成；
Z3：S0质控品与TE缓冲液按1：6的比例混合而成；
Z4：S0质控品与TE缓冲液按1：8的比例混合而成；
Z5：S0质控品与TE缓冲液按1：10的比例混合而成。
(3)保真性质控品(B0质控品)，具体制备如下：
B0：S0质控品、浓度为75ng/μL的野生型细胞系DNA、以及TE缓冲液按1：34：17.5的比例混合而成，最终浓度为50ng/μL，突变频率为1％。
(4)稳定性质控品(W0质控品),具体制备如下：
W0：S2质控品与TE缓冲液按1：9的比例混合而成，即S4质控品
(5)空白质控品(K0质控品)，为TE缓冲液。
实施例2：探针引物的设计和验证
(1)制备引物对及探针，其具体为：
通用引物对，用于扩增Q61K突变位点附近的片段，包括：
上游引物Q61K-F(SEQ ID No.1)；
下游引物Q61K-R(SEQ ID No.2)；
野生型探针Q61K-WT(SEQ ID No.3)：
FAM-AGCTGGACAAGAAGAGTACAGTGCC-MGB；
突变型探针Q61K-Mut(SEQ ID No.4)：
HEX-AGCTGGAAAAGAAGAGTACAGTGCC-MGB。
(2)验证
本例中采用的引物探针特异性验证体系如下表4所示。
表4引物探针特异性验证体系
组分 体积(μL)
Taq酶 0.2
PCRbuffer 12.5
Q61K-F(10nm) 0.5
Q61K-R(10nm) 0.5
突变型探针Q61K-Mut(5nm) 0.5
DNA(实施例1质控品原液试剂) 2
H2O 8.8
Total 25
本例中的反应程序为95℃，预变性5分钟；95℃变性15秒，60℃退火30秒，45个循环。
本例采用QPCR TB Green法分析熔解曲线。本例中得到的熔解曲线如图1所示，在单荧光通道内为单一的峰，确定引物为特异性扩增。
实施例3：用于评价Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶性能的试剂盒
本例中的试剂盒采用实施1中的质控品以及实施例2中的引物探针。本例中试剂盒包括以下组分，具体如表5所示(各质控品的相关浓度、突变频率同实施例1)。
表5试剂盒的组成
实施例4：不同酶的评价实验及评价结果
本例中采用实施例3的试剂盒对市面上一些常见品牌的热启动Taq酶(A-J)进行性能评价。
(1)扩增效率评估
1)实验步骤
a.根据各品牌待测试酶(A-J)的试剂说明书，配置该款酶推荐的最佳qPCR反应体系，以5个梯度稀释的质控品S0-S4作为不同浓度试剂样品各设置5个技术性重复，根据酶试剂说明书的反应程序进行qPCR反应。其中，质控品S0-S4、引物和探针的用量如前文中的表3所示。
b.根据各质控品浓度计算不同梯度试剂样品的起始拷贝数。qPCR反应结束后，以起始拷贝数的log值为X轴，对应的Ct值为Y轴，绘制标准曲线。
2)评估方法(扩增效率和相关系数的评估)
a.扩增效率：根据标准曲线的斜率计算不同品牌酶的扩增效率E，计算公式为E＝10-1/斜率-1，对不同品牌酶的扩增效率进行排名比较，扩增效率越高表示越好。若酶试剂标准曲线的E<0.9或E>1.1，则可直接判定为不合格。
b.相关系数：相关系数R2评估了不同起始浓度样品是否获得同样的扩增效率，酶标准曲线的相关系数R2越接近1说明数据越准确，扩增效率越统一。若酶试剂标准曲线的R2<0.95，则可直接判定为不合格。
3)评估结果
根据测定5个浓度梯度试剂样品的Ct值及5个梯度试剂样品的拷贝数，计算测试酶的标准曲线和扩增效率如下表6所示：
表6不同酶(A-J)的扩增效率评估结果
根据此评估方法，扩增效率测试合格的品牌为B、C、D、E、F。
(2)准确性评估
1)实验步骤
a.根据各款待测试酶(A-J)的试剂说明书，对5个梯度稀释的质控品Z1-Z5的Ct值进行实际测定，每个梯度试剂均设置5个技术性重复，得到实际测定的Ct值，其中，质控品Z1-Z5、引物和探针的用量如前文中的表3所示。
b.根据上述(1)得到的酶试剂的标准曲线，计算稀释2倍(Z1)、3倍(Z2)、7倍(Z3)、9倍(Z4)、11倍(Z5)后的真实Ct值，即理论Ct值。
2)评估方法
计算实际测定的Ct值和理论Ct值的相对误差，相对误差越小，说明酶试剂的准确度越高。有两次及以上结果相对误差大于2％，则判为不合格。
3)检测结果
计算和测试得到十款酶测定Ct值与理论Ct值的相对误差如下表7所示：
表7不同酶(A-J)的测定Ct值与理论Ct值的相对误差
相对误差 A B C D E F G H I J
稀释2倍(Z1) 0.22％ 1.00％ 0.66％ 0.05％ 0.41％ 0.14％ 0.17％ 1.06％ 4.63％ 0.17％
稀释3倍(Z2) 0.97％ 1.65％ 2.89％ 0.4％ 1.13％ 0.45％ 0.21％ 0.72％ 2.25％ 0.21％
稀释7倍(Z3) 1.03％ 0.87％ 1.78％ 0.39％ 0.21％ 1.21％ 0.56％ 0.13％ 5.17％ 0.56％
稀释9倍(Z4) 1.38％ 1.20％ 1.51％ 0.74％ 0.34％ 0.48％ 0.11％ 0.07％ 5.83％ 0.11％
稀释11倍(Z5) 1.72％ 1.41％ 3.82％ 0.23％ 0.31％ 0.98％ 0.48％ 0.26％ 3.52％ 0.48％
根据以上结果，除了产品C和I外，其余8款产品准确性表现较好，相对误差均控制在2％以内，H、G、D表现最佳。针对扩增效率判定合格的5款酶，准确性结果排名为D>E>F>B>C。
(3)保真性评估
1)实验步骤
根据各款待测试酶(A-J)的试剂说明书，使用B0质控品作为模板，进行测试，每款酶设置3个技术性重复，其中，质控品B0、引物和探针的用量如前文中的表3所示。
2)评估方法
若B0测得的Ct值落在正常范围内(15-35个循环)，则证明酶试剂的保真性较好。
3)检测结果
根据上述方法10款酶(A-J)使用B0质控品测试的平均Ct值结果如下表8所示：
表8不同酶(A-J)使用B0质控品测试的平均Ct值及相关结果
结果显示，十款酶的保真性能均合格，但C酶测试结果SD值偏大。
(4)模拟真实使用的稳定性测试
1)实验步骤
将配置好的不同品牌酶(A-J)的反应体系(包含探针、引物、W0质控品、酶、buffer、dNTP等)，分别于25℃放置0h、1h、3h、5h后上机，模拟样本量大或处理不及时的情况。测试时每次均设置5个技术性重复。
2)评估方法
计算放置1h、3h、5h时测量值与放置0h的相对误差，误差越小，说明酶试剂的稳定性越高，准确性也较高，适用于样本通量大时使用。有两次及以上结果CV大于2％，则判为不合格。
3)检测结果
根据上述方法10款酶(A-J)使用W0质控品测试的Ct值及相关误差结果如下表9所示：
表9不同酶(A-J)使用W0质控品测试的Ct值及相关误差结果
根据测试结果，G和B产品的稳定性表现良好，A产品的表现较差。除了A以外，其余酶整体的相对误差较小，表现较好。
(5)空白模板测试反应体系稳定性
1)实验步骤
以空白质控品(K0质控品)为模板，设置5个技术性重复，进行不同品牌酶(A-J)的上机测试。
2)评估方法
该测试的理论Ct值应为无Ct，若实际测试中，5个技术性重复结果均为无Ct或均为恒定值，则该酶反应体系的稳定性较好。若5个技术性重复的结果波动较大，则说明该酶反应体系的稳定性较差。
3)检测结果
测试结果显示，除B产品外，其余品牌酶的空余模板测试结果均为“No Ct”，B产品的5个技术重复中有两个孔有Ct值。由于本例试剂盒中提供的扩增Q61K突变的引物和探针，具有单一的熔解曲线，故排除引物二聚体及非特异性扩增对实验的干扰。B产品使用空白质控品进行测试的C6和E6孔，均有Ct值检出，并且B6和D6也有翘尾的趋势，提示有污染的可能或该试剂的反应体系存在不稳定的问题。
(6)不同酶(A-J)的性能评估结论
本试剂盒从五个维度对酶(A-J)的性能进行了综合评估，评估结果如下表10所示：
表10不同酶(A-J)的性能综合评估结果
由上表10可知，合格的酶包括B、D、E、F，结合具体测试评价结果可进一步得到排名如下：D>E>F>B。
因此，使用本发明的质控品及配套试剂盒能够达到统一、系统、有效地对热启动Taq酶进行评估的作用。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (10)

1.一种质控品,其特征在于，所述质控品包括若干含有Q61K突变的细胞系DNA，所述质控品用于评估Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶的性能。
2.如权利要求1所述的质控品，其特征在于，所述质控品包括若干已知Q61K突变频率的不同浓度的细胞系DNA。
3.如权利要求1所述的质控品，其特征在于，所述质控品包括至少两种不同Q61K突变频率的细胞系DNA；
优选的，其中一种所述细胞系DNA的Q61K突变频率为0.2％～4％。
4.制备如权利要求1-3任一项所述质控品的方法，其特征在于，采用含Q61K突变的突变型细胞系和野生型细胞系制备所述质控品；
优选的，采用突变型细胞系NCIH2087和野生型细胞系N002制备所述质控品。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)选用含有Q61K突变的突变型细胞系NCIH2087，将所述细胞系培养后提取细胞系DNA测定DNA浓度，使用ddPCR定量，测定在所述细胞系DNA中Q61K的突变频率，得到质控品原液；
2)将所述质控品原液与TE缓冲液按比例混合稀释成若干不同DNA浓度的梯度试剂；
3)根据所述步骤1)的突变频率，使用野生型细胞系N002对所述质控品原液试剂进行稀释，得到含Q61K突变频率为1％的细胞系DNA。
6.一种用于评估Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶的试剂盒，其特征在于，包括：含有Q61K突变的细胞系DNA的质控品，用于扩增所述细胞系DNA的通用引物对、野生型探针以及突变型探针。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述质控品包括若干已知Q61K突变频率的不同浓度的细胞系DNA；
优选的，所述质控品包括至少两种不同Q61K突变频率的细胞系DNA；
优选的，所述用于扩增所述细胞系DNA的通用引物对为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
所述野生型探针为：SEQ ID NO：3；
所述突变型探针为：SEQ ID NO：4；
其中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。
8.如权利要求6或权7所述的试剂盒，其特征在于，采用试剂盒进行检测时，反应程序为：95℃，预变性5分钟；95℃变性15秒，60℃退火30秒，45个循环。
9.含有Q61K突变的细胞系DNA或细胞系在评价Taqman探针法热启动Taq DNA聚合酶的性能中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述含有Q61K突变的细胞系DNA作为质控品；
优选的，所述质控品包括若干已知Q61K突变频率的不同浓度的细胞系DNA；
优选的，所述质控品包括至少两种不同Q61K突变频率的细胞系DNA；
优选的，所述细胞系DNA的Q61K突变频率为0.2％～4％。
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