CN117402797A - 一种制备高产王浆酸前体反式-2-癸烯酸工程菌的构建方法 - Google Patents

一种制备高产王浆酸前体反式-2-癸烯酸工程菌的构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117402797A
CN117402797A CN202310124567.9A CN202310124567A CN117402797A CN 117402797 A CN117402797 A CN 117402797A CN 202310124567 A CN202310124567 A CN 202310124567A CN 117402797 A CN117402797 A CN 117402797A
Authority
CN
China
Prior art keywords
delta
aas
fadb
seq
engineering bacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310124567.9A
Other languages
English (en)
Inventor
刘犇
王瑞明
苏静
李燕
杨素珍
宿春丽
汪俊卿
王婷
李丕武
韩婷婷
袁春颖
张亦桑
上官思范
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Furida Biological Co ltd
Qilu University of Technology
Original Assignee
Shandong Furida Biological Co ltd
Qilu University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Furida Biological Co ltd, Qilu University of Technology filed Critical Shandong Furida Biological Co ltd
Priority to CN202310124567.9A priority Critical patent/CN117402797A/zh
Publication of CN117402797A publication Critical patent/CN117402797A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C12P5/026—Unsaturated compounds, i.e. alkenes, alkynes or allenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种制备高产王浆酸前体反式‑2‑癸烯酸工程菌的构建方法，属于生物发酵技术领域，具体为将大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、J中的aaS基因敲除，得到大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、JΔaaS；继续将其中的ftsQ基因敲除，敲除完成后进行质粒消除，得到大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ；利用转化法转入重组质粒pCDFDuet‑1‑MaMACS‑PpFadE、重组质粒pET28a‑SUMO‑ctYdiI，得到大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ‑MEI，本发明提供的工程菌有效促进了癸酸合成反式‑2‑癸烯酸。

Description

一种制备高产王浆酸前体反式-2-癸烯酸工程菌的构建方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种制备高产王浆酸前体反式-2-癸烯酸工程菌的构建方法。
背景技术
王浆酸(10-HDA)是一种既含有双键又含有不饱和键的中链脂肪酸衍生物，分子式为C10H18O3。相对分子质量为186.25，熔点为64℃，迄今为止，王浆酸在自然界中仅存在蜂王浆中，含量仅为1.4%-2.4 %。反式-2-癸烯酸是生物合成王浆酸途径中的重要的中间体，因此，反式-2-癸烯酸的生物合成将为未来10-HDA 的生物合成奠定基础。反式-2-癸烯酸除了可以用于合成王浆酸外，也是合成重要药物的化学中间体，还可作为配体来合成所需要的各向异性的纳米晶材料，除以上方面的用途，反式-2-癸烯酸还可被用来制作香料和香精等。因此，反式-2-癸烯酸作为中间产物或者最终产物都具有重要功能，具有极大的商业价值。
目前通过化学法合成反式-2-癸烯酸的方式是以辛醛和丙二酸或辛醛和二溴乙酸为原料反应，并经有机溶剂萃取得到。但是在利用各种不同原材料通过化学合成法合成目标物质的时候，普遍存在着对环境污染严重、反应可控程度低、安全保障系数低等缺点。所以，与传统方法相比，生物催化合成目标物质的方法因其具有安全性高、专一性强以及对环境污染性小等一系列优点引起了人们的广泛关注。目前生物合成王浆酸的瓶颈问题，就是底物癸酸和脂肪酸产物对发酵菌株具有一定的抑制作用，产量很难提高。
当前的基因编辑技术，其定向打靶都依赖于DNA序列特异性结合蛋白模块的合成，这一步骤繁琐费时，实验周期长，基因编辑效率较低。
中国专利文献CN114958700A（申请号：202210510742.3）公开了一种大肠杆菌工程菌及应用，该专利文献敲除的基因为FadB基因、FadR基因、FadJ基因，使用了RED重组法敲除基因；中国专利文献CN110684794A（申请号：201911038194.3）公开了一种以脂肪酸为原料利用大肠杆菌工程菌制备α、β不饱和脂肪酸的方法，该专利文献的方法通过过表达FadE、FadD和ydii基因，同时敲除FadR和FadB基因阻断了β氧化的影响和细胞调控子的调控，优化反-2-癸烯酸表达途径；中国专利文献CN109402182A（申请号：201811126048.1）公开了一种利用大肠杆菌工程菌静息细胞制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，该专利文献构建了含有重组质粒pET-28a-ydiI的大肠杆菌，并制备静息细胞实现了10-羟基-2-癸烯酸的大量生物合成；中国专利文献CN113106109B（申请号：202110211118.9）公开一种突变酶CYP153A M228L及以癸酸为原料两步法生物合成10-羟基-2-癸烯酸的方法，该专利通过改造CYP153A蛋白，构建了10-羟基-2-癸烯酸合成途径。现有专利文献公开的技术方案和技术效果与本发明明显不同。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种制备高产王浆酸前体反式-2-癸烯酸工程菌的构建方法。
本发明的目的在于提供一株能够高产反式-2-癸烯酸的工程菌株及其应用。
本发明的技术方案如下：
一种构建高产反式-2-癸烯酸工程菌株的方法，包括如下步骤：
（1）将大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J中的aaS基因利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除，所述aaS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，得到大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaS；
（2）将步骤（1）中的大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaS作为出发菌株，继续将其中的ftsQ基因利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除，所述ftsQ基因的核苷酸序列如SEQID NO.16所示，敲除完成后进行质粒消除，得到大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ；
（3）将步骤（2）获得的大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ利用转化法转入重组质粒pCDFDuet-1-MaMACS-PpFadE、重组质粒pET28a-SUMO-ctYdiI，得到大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI。
根据本发明优选的，步骤（1）、步骤（2）中，利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除的方法包括如下：
①通过网站CRISPRRGEN Tools (rgenome.net)设计sgRNA中含有20个碱基的基因；
该段基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
②设计引物，以原始大肠杆菌BL21的基因组为模板PCR扩增目的基因aaS的上游、下游
同源臂；
aaS基因上游同源臂的上游引物的核酸序列如SEQID NO.2所示，下游引物的核酸序列如SEQID NO.3所示，下游同源臂的上游引物的核酸序列如SEQID NO.4所示，下游引物的核酸序列如SEQID NO.5所示；
③利用overlap PCR将之前制备好的具有同源片段的上、下游同源臂连接形成DonorDNA-aaS线性片段；
④构建表达sgRNA的质粒
确定对应的N20序列，上游引物的核酸序列如SEQ ID NO.6所示，下游引物的核酸序列如SEQ ID NO.7所示；以pTargetF质粒作为模板反向PCR扩增pTargetF-N20/aaS线性片段，并利用试剂盒进行回收纯化，得到携带有目的基因N20序列的pTargetF-N20/aaS线性基因片段；
将pTargetF-N20/aaS线性基因片段化转进DH5α感受态细胞中完成环化，制得pTargetF-N20/aaS质粒，并使用试剂进行质粒提取；
⑤将大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J制成感受态，转化pCAS9质粒，随后将含pCAS9质粒的大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J细胞制备成电转感受态；
⑥重组sgRNA质粒与Donor DNA共转化：将制备的pTargetF-N20/aaS质粒与DonorDNA-aaS转化入含pCAS9质粒的大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J感受态细胞，筛选阳性克隆菌株；
⑦消除pTargetF质粒，消除后得到大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaS，将其制成电转感受态细胞，再进行基因ftsQ敲除操作，操作方法与所述步骤相同；最后消除Cas9质粒，得到大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ；
ftsQ基因的敲除过程中，设计的sgRNA中N20基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；上游同源臂的上游引物的核酸序列如SEQID NO.9所示，下游引物的核酸序列如SEQIDN0.10所示；下游同源臂的上游引物的核酸序列如SEQID NO.11所示，下游引物的核酸序列如SEQID NO.12所示；表达sgRNA的质粒中，上游引物的核酸序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物的核酸序列如SEQ ID NO.14所示。
上述大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI在生产反式-2-癸烯酸中的应用。
一种高产反式-2-癸烯酸的方法，包括如下步骤：
将上述大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI进行培养，当菌体量OD600=0.8-1.2时，按体积分数5-10%接种至发酵培养基，培养至OD600=0.8-1.2，加入终浓度为0.5-5 g/L的乳糖诱导，诱导条件为28-30 ℃，150-500 r/min，2-2.5h，得到发酵培养物，然后流加癸酸到发酵培养物中，进行全细胞催化，制得反式-2-癸烯酸。
根据本发明优选的，所述方法中，大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ- MEI接入LB液体培养基中，在35-37℃培养至菌液OD600为0.8-1.2。
根据本发明优选的，所述方法中，诱导条件为将培养的菌液降温至30℃后，再加入终浓度为2-5g/L的乳糖，150-500 r/min培养2-2.5h。
根据本发明优选的，所述方法中，发酵培养基组份包括如下：
氯化钠8-12 g/L、蛋白胨8-12 g/L、酵母浸粉2-6 g/L，卡那霉素40-60μg/mL、氨苄霉素50-150μg/mL和链霉素20-60μg/mL，余量水，pH7.0-7.2。
进一步优选的，所述方法中，发酵培养基组份包括如下:
氯化钠10g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L，卡那霉素50μg/mL、氨苄霉素100μg/mL和链霉素40μg/mL，余量水，pH7.0-7.2。
根据本发明优选的，所述方法中，流加癸酸到发酵培养物中，在28-37℃条件下反应6-60h，制得反式-2-癸烯酸。
进一步优选的，所述方法中，流加的癸酸的终浓度为0.5-6g/L。
上述大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、J，及该菌的构建方法是现有技术，已在专利文献CN113106109A中公开，具体参照第[00197]-[0221]段，专利名称：一种突变酶CPY153M228L及其在合成10-羟基-2-癸烯酸中的应用，申请号：202110211118.9，公开日期2021.07.13。
上述重组质粒pCDFDuet-1-MaMACS-PpFadE、重组质粒pET28a-SUMO-ctYdiI，构建以及转化是现有技术，已在中国专利文献CN113106109A中公开，具体参照第[0048]-[0065]。
有益效果
1、本发明提供的大肠杆菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI工程菌株在发酵过程中，大大提高了对底物癸酸的耐受性，有效促进了癸酸合成反式-2-癸烯酸。
2、本发明提供的敲除大肠杆菌内目标基因的方法，敲除效率更高，操作更加便捷。
附图说明
图1为敲除大肠杆菌aaS基因后的琼脂糖凝胶电泳图，设计基因原长3008bp，敲除后应为856bp；
图中，泳道M为Marker；泳道1-3为aaS基因条带。
图2为敲除大肠杆菌ftsQ基因后的琼脂糖凝胶电泳图，设计基因原长1716bp，敲除后应为885bp；
图中，泳道M为Marker；泳道1为ftsQ基因条带。
图3 为大肠杆菌BL21 ΔFadB、R、J-MEI与大肠杆菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI、大肠杆菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔpaL-MEI、大肠杆菌BL21 ΔFadB、R、JΔftsQ ΔpaL-MEI在不同浓度癸酸下的生长情况对比图。
图4 为大肠杆菌BL21 ΔFadB、R、J-MEI与大肠杆菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI、大肠杆菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔpaL-MEI、大肠杆菌BL21 ΔFadB、R、JΔftsQΔpaL-MEI催化癸酸生成反式-2-癸烯酸产量对比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例中未详加说明的内容均按本领域现有技术。
液体发酵培养基的成分组成：氯化钠10g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L，卡那霉素50μg/mL、氨苄霉素100μg/mL和链霉素40μg/mL，余量水，pH7.0-7.2。
LB液体培养基的成分组成：氯化钠10g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L，余量水，pH7.0-7.2。
正癸酸购自上海麦克林生化科技有限公司。
实施例1
一种构建高产反式-2-癸烯酸工程菌株的方法，包括如下步骤：
（1）构建大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J；所述大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J及该菌的构建方法是现有技术，已在专利文献CN113106109A中公开，具体参照第[00197]-[0221]段，专利名称：一种突变酶CPY153M228L及其在合成10-羟基-2-癸烯酸中的应用，申请号：202110211118.9，公开日期2021.07.13；
（2）将大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J中的aaS基因利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除，所述aaS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，得到大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaS；
（3）将步骤（2）中大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaS作为出发菌株，继续将其中的ftsQ基因用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除，所述ftsQ基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示，敲除完成后进行质粒消除，得到大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ。
步骤（2）、（3）中用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除的具体方法为：
①通过网站CRISPRRGEN Tools (rgenome.net)设计sgRNA中含有20个碱基的基因；
该段基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
②设计引物，以原始大肠杆菌BL21的基因组为模板PCR扩增目的基因aaS的上游、下游
同源臂；
aaS基因上游同源臂的上游引物的核酸序列如SEQID NO.2所示，下游引物的核酸序列如SEQID NO.3所示，下游同源臂的上游引物的核酸序列如SEQID NO.4所示，下游引物的核酸序列如SEQID NO.5所示，
PCR扩增体系如下，总体系50μL：
100μM上游引物2.0μL，100μM下游引物2.0μL，模板2.0μL，5U/μL phanta酶25μL ，ddH2O19μL；
PCR扩增条件如下：
98℃预变性3min；95℃变性10s，62℃退火5s，72℃延伸5s，循环30次，72℃彻底延伸1min。
③利用overlap PCR将之前制备好的具有同源片段的上、下游同源臂连接形成DonorDNA-aaS线性片段；
PCR扩增体系如下，总体系50μL：
100mΜaaS基因上游同源臂的上游引物2.0μL，100μMaaS基因下游同源臂的下游引物2.0μL，上游同源臂和下游同源臂作为模板各2.0μL，5U/μL phanta酶23μL ，ddH2O19μL；
PCR扩增条件如下：
98℃预变性3min；95℃变性10s，62℃退火5s，72℃延伸5s，循环30次，72℃彻底延伸1min。
④构建表达sgRNA的质粒
确定对应的N20序列，上游引物的核酸序列如SEQ ID NO.6所示，下游引物的核酸序列如SEQ ID NO.7所示。以pTargetF质粒作为模板反向PCR扩增pTargetF-N20/aaS线性片段，并利用试剂盒进行回收纯化，得到携带有目的基因N20序列的pTargetF-N20/aaS线性基因片段。
PCR扩增体系如下，总体系50μL：
100μM上游引物2.0μL ,100μM下游引物2.0μL，pTargetF质粒作为模板各2.0μL，5U/μL phanta酶25μL ，ddH2O19μL；
PCR扩增条件如下：
98℃预变性3min；95℃变性10s，62℃退火5s，72℃延伸15s，循环30次，72℃彻底延伸1min。
将pTargetF-N20/aaS线性基因片段化转进DH5α感受态细胞中完成环化，制得pTargetF-N20/aaS质粒，并使用试剂进行质粒提取。
⑤将大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J制成感受态，转化pCAS9质粒（该质粒为温度敏感型，培养温度为30℃），随后将含pCAS9质粒的菌株制备成电转感受态。
挑单菌落接种至LB+Kan（卡那抗生素50μg/mL）液体培养基中，30 ℃，200r过夜培养。将培养好的携带有pCas质粒的BL21ΔFadB、R、J菌液接种到40mL LB+Kan（卡那抗生素50μg/mL）培养基中，再加入阿拉伯糖至终浓度为60mM，调整加入菌液的量，使OD值达到0.04-0.1之间，30 ℃，200r培养菌体至对数期时停止培养，即为诱导完成的菌液。随后将诱导好的并携带有pCas质粒的大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J细胞制备成为感受态细胞。
⑥重组sgRNA质粒与Donor DNA共转化
将之前制备的pTargetF-N20/aaS质粒与Donor DNA-aaS在冰上解冻，并按顺序依次在电击杯中加入约100ng的pTargetF-N20/aaS质粒、400ng的Donor DNA-aaS及50μL制备好的携带有pCas质粒并完成诱导的大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J感受态细胞，进行电转化操作。转化完毕后复苏、涂布。
⑦菌落PCR筛选阳性克隆菌株。
设计基因原长3008bp，敲除后应为856bp，电泳检测结果见图1。
⑧消除pTargetF质粒，消除后得到大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaS，将其制成电转感受态细胞，再进行基因ftsQ敲除操作，操作方法与上述步骤相同。最后消除Cas9质粒，即可得到所需的大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ。
ftsQ基因的敲除过程中，设计的sgRNA中N20基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；上游同源臂的上游引物的核酸序列如SEQID NO.9所示，下游引物的核酸序列如SEQIDN0.10所示；下游同源臂的上游引物的核酸序列如SEQID NO.11所示，下游引物的核酸序列如SEQID NO.12所示；表达sgRNA的质粒中，上游引物的核酸序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物的核酸序列如SEQ ID NO.14所示。设计基因原长1716bp，敲除后应为885bp，电泳检测结果见图2。
对比例1
以实施例1中得到的大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、JΔaaS为出发菌株，利用与实施例1相同的方法敲除另一个控制细胞分裂的paL基因，得到大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔpaL，所述paL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
对比例2
以实施例1提到的大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J为出发菌株，利用与实施例1相同的方法先敲除ΔftsQ，得到BL21 ΔFadB、R、JΔftsQ，再利用与实施例1相同的方法敲除另一个控制细胞分裂的paL基因，得到大肠杆菌BL21 ΔFadB、R、JΔftsQΔpaL，所述paL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
实施例2
所述重组质粒pCDFDuet-1-MaMACS-PpFadE、重组质粒pET28a-SUMO-ctYdiI构建以及转化是现有技术，已在中国专利文献CN113106109A中公开，具体参照第[0048]-[0064]，按照现有技术方法将重组质粒pCDFDuet-1-MaMACS-PpFadE、重组质粒pET28a-SUMO-ctYdiI，分别转化到大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J、实施例1、对比例1、对比例2中构建的基因工程菌中，接入浓度50μg/mL卡那霉素、100μg/mL氨苄霉素和40μg/mL链霉素的LB液体培养基中，分别获得大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J-MEI、大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI、BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔpaL-MEI和BL21 ΔFadB、R、JΔftsQΔpaL-MEI。
效果例1
实施例2构建的大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI在不同浓度癸酸下的生长情况，步骤如下：
取五瓶50mlLB培养基，分别加入终浓度为0.5g/L、1g/L、2.5g/L、3g/L、5g/L的癸酸，然后分别加入800μL的大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI菌液，在37℃，200 r/min的摇床内培养12h，然后利用分光光度计测量OD值，检测结果见表1。
表1
底物浓度g/L OD值
0.5 12.3
1 11.5
2.5 10.7
3 10.2
5 9.6
对比例3
测量大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、J-MEI在不同浓度癸酸下的生长情况，实验步骤与效果例1一致，检测结果见表2。
表2
底物浓度g/L OD值
0.5 11.7
1 7.9
2.5 6.3
3 5.8
5 3.1
对比例4
测量大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、JΔftsQΔpaL-MEI在不同浓度癸酸下的生长情况，实验步骤与效果例1一致，检测结果见表3。
表3
底物浓度g/L OD值
0.5 11.82
1 6.6
2.5 4.1
3 3.5
5 2.8
对比例5
测量大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、JΔaaSΔpaL-MEI在不同浓度癸酸下的生长情况，实验步骤与效果例1一致，检测结果见表4。
表4
底物浓度g/L OD值
0.5 10.12
1 7.35
2.5 6.5
3 4.8
5 4.2
效果例2
在1L发酵罐内利用大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI进行发酵产反式-2-癸烯酸，步骤如下：
接种50μl菌液于50mlLB培养基，在37℃培养至菌液OD600为0.8-1.2，得到发酵所需的种子液。
将50ml种子液接种于含有800mL发酵培养基的发酵罐中，37℃、500r/min培养2h，提前降温30℃，培养至OD600=0.8-1.2。
发酵培养基的组成：氯化钠10g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L，卡那霉素50μg/mL、氨苄霉素100μg/mL和链霉素40μg/mL，余量水，pH7.0-7.2。
加入诱导剂100g/L的乳糖40ml（终浓度5g/L），在30℃，500r/min的条件下诱导2h后，加入600g/L的底物癸酸701μl（终浓度1.5g/L），在37℃、500r/min的条件下进行培养，流加底物条件为每6h流加0.5g/L。以加入癸酸的时间为基点，每隔6h取样10ml，检测结果见表5。
表5
时间h 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60
反式-2-癸烯酸产量g/L 0.47 0.80 1.35 1.88 2.32 2.86 3.63 3.76 4.32 4.86
对比例6
在1L发酵罐内利用大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J-MEI进行发酵产反式-2-癸烯酸，实验步骤与效果例2一致，检测结果见表6。
表6
时间h 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60
反式-2-癸烯酸产量g/L 0.31 0.60 1.28 1.78 2.16 2.45 2.82 3.15 3.24 3.59
对比例7
在1L发酵罐内利用大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔftsQΔpaL-MEI进行发酵产反式-2-癸烯酸，实验步骤与效果例2一致，检测结果见表7。
表7
时间h 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60
反式-2-癸烯酸产量g/L 0.29 0.69 1.33 1.66 1.79 1.97 2.23 2.56 2.89 3.43
对比例8
在1L发酵罐内利用大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔpaL-MEI进行发酵产反式-2-癸烯酸，实验步骤与效果例2一致，检测结果见表8。
表8
时间h 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60
反式-2-癸烯酸产量g/L 0.42 0.75 1.35 1.72 1.87 1.96 2.78 2.96 3.7 3.76
由效果例1与对比例3、对比例4、对比例5的实验结果可以看出，见图3，大肠杆菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI在不同浓度癸酸下的生长情况最好，由效果例2与对比例6、对比例7、对比例8的实验结果可以看出，见图4，发酵60h后，大肠杆菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI消耗癸酸产反式-2-癸烯酸的产量可以达到4.86g/L，转化率可以达到97.2％。由此可以得出，敲除aaS基因和ftsQ基因可以显著提高了大肠杆菌工程菌对癸酸的抗逆性，并显著提高了反式-2-癸烯酸的产量。
本发明提供的大肠杆菌BL21ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI工程菌株在发酵过程中，大大提高了对底物癸酸的耐受性，有效提高了癸酸合成反式-2-癸烯酸。

Claims (10)

1.一种构建高产反式-2-癸烯酸工程菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J中的aaS基因利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除，所述aaS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，得到大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaS；
（2）将步骤（1）中的大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaS作为出发菌株，继续将其中的ftsQ基因利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除，所述ftsQ基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.16所示，敲除完成后进行质粒消除，得到大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ；
（3）将步骤（2）获得的大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ利用转化法转入重组质粒pCDFDuet-1-MaMACS-PpFadE、重组质粒pET28a-SUMO-ctYdiI，得到大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）、步骤（2）中，利用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除的方法包括如下：
①通过网站CRISPRRGEN Tools (rgenome.net)设计sgRNA中含有20个碱基的基因；
该段基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
②设计引物，以原始大肠杆菌BL21的基因组为模板PCR扩增目的基因aaS的上游、下游
同源臂；
aaS基因上游同源臂的上游引物的核酸序列如SEQID NO.2所示，下游引物的核酸序列如SEQID NO.3所示，下游同源臂的上游引物的核酸序列如SEQID NO.4所示，下游引物的核酸序列如SEQID NO.5所示；
③利用overlap PCR将之前制备好的具有同源片段的上、下游同源臂连接形成DonorDNA-aaS线性片段；
④构建表达sgRNA的质粒
确定对应的N20序列，上游引物的核酸序列如SEQ ID NO.6所示，下游引物的核酸序列如SEQ ID NO.7所示；以pTargetF质粒作为模板反向PCR扩增pTargetF-N20/aaS线性片段，并利用试剂盒进行回收纯化，得到携带有目的基因N20序列的pTargetF-N20/aaS线性基因片段；
将pTargetF-N20/aaS线性基因片段化转进DH5α感受态细胞中完成环化，制得pTargetF-N20/aaS质粒，并使用试剂进行质粒提取；
⑤将大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J制成感受态，转化pCAS9质粒，随后将含pCAS9质粒的大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J细胞制备成电转感受态；
⑥重组sgRNA质粒与Donor DNA共转化：将制备的pTargetF-N20/aaS质粒与Donor DNA-aaS转化入含pCAS9质粒的大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、J感受态细胞，筛选阳性克隆菌株；
⑦消除pTargetF质粒，消除后得到大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaS，将其制成电转感受态细胞，再进行基因ftsQ敲除操作，操作方法与所述步骤相同；最后消除Cas9质粒，得到大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ；
ftsQ基因的敲除过程中，设计的sgRNA中N20基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；上游同源臂的上游引物的核酸序列如SEQID NO.9所示，下游引物的核酸序列如SEQID N0.10所示；下游同源臂的上游引物的核酸序列如SEQID NO.11所示，下游引物的核酸序列如SEQID NO.12所示；表达sgRNA的质粒中，上游引物的核酸序列如SEQ ID NO.13所示，下游引物的核酸序列如SEQ ID NO.14所示。
3. 权利要求1-2任一项构建的大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI在生产反式-2-癸烯酸中的应用。
4.一种高产反式-2-癸烯酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1-2任一项构建的大肠杆菌工程菌BL21 ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI进行培养，当菌体量OD600=0.8-1.2时，按体积分数5-10%接种至发酵培养基，培养至OD600=0.8-1.2，加入终浓度为0.5-5 g/L的乳糖诱导，诱导条件为28-30 ℃，150-500 r/min，2-2.5h，得到发酵培养物，然后流加癸酸到发酵培养物中，进行全细胞催化，制得反式-2-癸烯酸。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法中，大肠杆菌工程菌BL21ΔFadB、R、JΔaaSΔftsQ-MEI接入LB液体培养基中，在35-37℃培养至菌液OD600为0.8-1.2。
6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法中，诱导条件为将培养的菌液降温至30℃后，再加入终浓度为2-5g/L的乳糖，150-500 r/min培养2-2.5h。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法中，发酵培养基组份包括如下：
氯化钠8-12 g/L、蛋白胨8-12 g/L、酵母浸粉2-6 g/L，卡那霉素40-60μg/mL、氨苄霉素50-150μg/mL和链霉素20-60μg/mL，余量水，pH7.0-7.2。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中，发酵培养基组份包括如下：
氯化钠10g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L，卡那霉素50μg/mL、氨苄霉素100μg/mL和链霉素40μg/mL，余量水，pH7.0-7.2。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法中，流加癸酸到发酵培养物中，在28-37℃条件下反应6-60h，制得反式-2-癸烯酸。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法中，流加的癸酸的终浓度为0.5-6g/L。
CN202310124567.9A 2023-02-16 2023-02-16 一种制备高产王浆酸前体反式-2-癸烯酸工程菌的构建方法 Pending CN117402797A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310124567.9A CN117402797A (zh) 2023-02-16 2023-02-16 一种制备高产王浆酸前体反式-2-癸烯酸工程菌的构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310124567.9A CN117402797A (zh) 2023-02-16 2023-02-16 一种制备高产王浆酸前体反式-2-癸烯酸工程菌的构建方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117402797A true CN117402797A (zh) 2024-01-16

Family

ID=89496729

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310124567.9A Pending CN117402797A (zh) 2023-02-16 2023-02-16 一种制备高产王浆酸前体反式-2-癸烯酸工程菌的构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117402797A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jeong et al. Genetic engineering system for syngas-utilizing acetogen, Eubacterium limosum KIST612
CN105051181B (zh) 2，3-丁二醇的生成能力增加的重组微生物及利用其的2，3-丁二醇的制备方法
CN114874964A (zh) 一种高产2′-岩藻糖基乳糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用
CN111849846A (zh) 一种高产单鼠李糖脂的基因改造方法及其应用
CN109055417B (zh) 一种重组微生物、其制备方法及其在生产辅酶q10中的应用
CN105647958B (zh) 一种产2-苯乙醇的酿酒酵母工程菌及其制备方法与应用
CN108588108B (zh) 一种高效代谢甘油的芽胞杆菌的制备方法和应用
CN117402797A (zh) 一种制备高产王浆酸前体反式-2-癸烯酸工程菌的构建方法
CN116083332A (zh) 一株产己二酸的重组大肠杆菌的构建及其应用
CN113249240B (zh) 一种高产羟基酪醇的酿酒酵母及其构建方法
Laptev et al. New recombinant strains of the yeast Yarrowia lipolytica with overexpression of the aconitate hydratase gene for the obtainment of isocitric acid from rapeseed oil
CN113136382B (zh) 基于CRISPRi调控的利用谷氨酸棒状杆菌合成乙醛酸的方法
CN112852847A (zh) 一种重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用
EP3591063A1 (en) A long chain dibasic acid with low content of long chain dibasic acid impurity of shorter carbon-chain and preparation method thereof
CN114806982B (zh) 改造的1,3-丙二醇生产菌株及其应用
CN117384933B (zh) 利用木糖生产3-羟基丙酸的菌株及其构建方法和应用
CN116024278B (zh) 一种发酵法制备d-泛酸的方法
CN112175850B (zh) 一种高产核酸的工业酿酒酵母及其应用
CN114875003B (zh) 一种短链脱氢酶的突变体、编码基因及编码基因获得方法、突变体的应用
CN114774421B (zh) 运动发酵单胞菌内源性启动子突变体
CN113913448B (zh) 一种提高甲基营养菌吡咯喹啉醌产量的方法及应用
CN111718948B (zh) 一段基因及其在生产计曼尼醇中的应用
CN117701548A (zh) 一种檀香烯合成酶突变体以及应用
CN117965587A (zh) 一种含hok/sok基因的菌株及其制备与应用
CN107475269B (zh) 一种热带假丝酵母的酰基—CoA硫脂酶基因及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination