CN117368473A - 护理点测定法 - Google Patents

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H·范
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Abstract

提供了一种适于护理点评估肝疾病或功能的免疫测定法，所述免疫测定法包括：使来自受试者的血液样品与识别ALT1的表位的特异性结合剂接触以形成抗原‑结合剂复合物，并且使用与可检测报告物连接或包含可检测报告物的第二或进一步的结合剂检测所述复合物，当啮齿类抗体在人血浆的存在下时所述表位不被所述啮齿类抗体识别；以及依据所述样品中的ALT1的质量浓度，检测所述受试者中的肝疾病或肝功能。还提供了适于测量来自受试者的血液样品中的ALT1的质量浓度以测定肝功能的包含兔类动物抗体或含有其抗原结合组分的结合剂的试剂盒或装置。

Description

护理点测定法
本申请是申请号为201780073575.8、申请日为2017年09月28日、发明名称为“护理点测定法”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
说明书的领域是护理点测试，并且更具体是用于鉴定受试者中的异常酶水平或异常肝功能的测定法和试剂盒。还提供了筛选测定法。
背景技术
在说明书的末尾还列出了本说明书中的参考文献的书目详情。
参考本说明书中的任何现有技术不是并且不应理解为承认或以任何形式提出此种现有技术在任何国家形成常见的公知常识。
肝疾病或肝炎是全球的主要卫生保健负担。肝疾病可以由病毒(包括甲肝、乙肝、丙肝、丁肝和戊肝病毒)或其它感染，或者由药物毒性(包括过度饮酒，和用于治疗疾患，如人免疫缺陷病毒或肺结核感染的药物)，或者经由异常代谢过程(包括非酒精脂肪肝疾病[NAFLD]和非酒精脂肪肝炎[NASH])引起。例如，超过3.6亿人患有慢性乙肝并且超过2亿人患有慢性丙肝，高风险的持续肝疾病导致肝纤维化、硬化和肝细胞癌，同时升高的肥胖水平已经导致NASH流行性的大幅增加，现在估计影响超过全球人口的25％(Younossi等人，2016)。肝疾病也是管理先兆子痫中的主要问题，其中需要监测母体中的肝功能以允许在可能的最大孕龄时，但是在肝疾病变得过于严重(在此处它会危及母体和婴儿两者的健康)前诱导或手术分娩新生儿。
有效的药物正变得更为广泛可用于治疗乙肝和丙肝，并且可以用针对抗体或抗原的血清学测试和/或针对病毒DNA或RNA的分子测试确定诸如HBV或HCV等感染的存在。用于诸如NAFLD和NASH等疾患的许多疗法也在开发中，而新生儿的即时分娩在先兆子痫中可以是有效的。然而，有效使用这些药物、疗法和干预的主要障碍是鉴定具有最高健康风险并且最需要治疗或干预的那些患者，因为肝疾病呈现非特异性体征和症状并且不能仅根据临床检查诊断。
最方便地，通过对血液或血浆进行的生物化学测试以检测异常量的肝特异性酶如丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)或γ谷氨酰胺转移酶(GGT)，或代谢物如胆红素的存在来检测并诊断肝疾病。使用ALT作为实例，人ALT1同种型主要在肝的肝细胞的胞质区室中表达，并且肝疾病期间对肝细胞的破坏导致可溶性ALT释放到血浆中，在那里其酶活性可以使用多种生物化学测试测定方法测量。在这些方法中，ALT的酶活性将底物转化为产物，并且仪器测量底物或产物的颜色、吸光度或荧光的变化以计算样品中存在的ALT浓度。然后，将此浓度与在测试条件和研究的群体下预期的“正常”、健康水平比较。这些方法是本领域中公知的并且在可以使用全血、血浆或血清作为样品的各种自动化和半自动化分析仪器中可用。也已经描述了ALT测试，其中可以在不需要仪器的情况下在POC装置中检测底物的可视颜色反应，但是此测试的视觉动态范围限制它对鉴定具有高度升高的ALT水平(正常上限的>3倍，或120IU/L)的样品的有用性(Pollock等人2012)。一种更优选的测试将能够相对于由欧洲肝研究协会(European Association for the Study of the Liver，EASL)推荐的边界值区分样品，该欧洲肝研究协会推荐40IU/L ALT的上限用于管理慢性乙肝和其它疾患。
然而，这些方法的主要限制是普遍需要用于两种目的的仪器；(a)在固定温度下进行酶促反应，因为酶活性是高度温度敏感的，和(b)在准确的时间时或者在提供精确测量的动力学条件下测量酶促产物。
在ALT的情况下的进一步限制是人存在第二同种型ALT2，其在肌肉组织中较为丰富，但是从受损的细胞中同样释放，例如在肢体锻炼或心脏衰竭后。由于酶测定法不能区分ALT1与ALT2，因此血液、血浆或血清中ALT2酶活性水平升高可能导致肝疾病的错误诊断。甚至进一步地，据观察，在酶水平降低的严重疾病的情况下，ALT酶测定法不能进行诊断。
因此，对肝功能或疾病测试存在着未得到满足的需要，所述肝功能或疾病测试可适用于在护理点(POC)处或POC附近使用，以扩大肝功能测试用于全球资源不足的环境，以及甚至在资源丰富的环境中方便用于临床的使用机会。我们在这里特别描述了新的方法和途径，其已经允许使用完善建立的侧向流免疫层析技术来开发针对ALT1作为肝疾病甚至严重肝疾病的生物标志物并且对ALT1同种型而非ALT2同种型具有特异性的POC测试。这些方法一般会适用于在无法评估酶活性或更广泛地如本文所述的护理点处进行测量所需的针对其它肝酶和其它酶及其代谢物的诊断测试。虽然适用于护理点，但是主题方法也可以用于任何便利的免疫测定形式。
发明内容
因而，一方面，说明书提供了适于但不限于护理点检测和量化来自受试者的血液样品中的肝酶的免疫测定法。在一个实施方案中，所述测定法包括：(i)从受试者获得血液样品，并且(ii)检测样品中肝酶的存在和量。具体而言，这通过使来自受试者的血液样品与特异性识别肝酶(抗原)的表位的特异性结合剂接触实现，当啮齿类抗体在血浆的存在下时所述肝酶的表位不被大多数啮齿类抗体识别。在一个实施方案中，结合剂是兔或其它兔类动物中形成的抗体或者是其免疫球蛋白结构域。结合剂甚至在人血浆的存在下结合肝酶并且形成抗原-结合剂复合物。然后使用与可检测报告物连接的第二结合剂检测所述复合物的存在和量。在一些实施方案中，特异性结合剂和第二结合剂相同。在为多克隆抗体的结合剂的情况下，多克隆抗体的相同制剂可以用于抗原结合和可检测报告物两者。
在一些实施方案中，使用肝酶，如ALT1或AST或GGT的质量浓度确定受试者是否可以由一般从业人员/在社区安全治疗或者受试者是否需要由专业人员，如肝脏病学家或肠胃科学家治疗。因此，如果ALT水平是超常的(特别是例如超过40IU/L或等同质量浓度)，则受试者需要由专业人员治疗。然而，如果肝酶水平是正常的，则受试者可以由一般从业人员/在社区治疗。在一些实施方案中，还在免疫测定法中评估血小板水平以提供肝酶/血小板比率，例如APRI比率(其是本领域中已知的AST:血小板比率指数)作为肝功能不良/肝纤维化的指征。
如本文中测定，针对人ALT1的啮齿类(鼠)抗体基本上被人血浆中的组分阻断而不能结合人ALT1。因而，在本发明的方法中采用不识别抗原的免疫显性区或者不与针对抗原的啮齿类/鼠抗体竞争的抗体。因此，采用即使在人血浆的存在下也识别肝酶的表位的抗体。在一个实施方案中，这通过在兔类动物(兔)中形成抗体实现。也可以通过在人血浆的存在下筛选结合来开发合适的结合剂，如本文所述。在另一个实施方案中，采用肝酶抗原的非免疫显性部分产生不受人血浆抑制的抗体。合适的筛选和开发方法是本领域中已知的。
在一个实施方案中，结合剂是抗体或其抗原结合部分，包括本领域中已知的免疫球蛋白结构域，或本领域中已知的另一种特异性结合剂，如配体、受体、化学配体、适体等。
在一个实施方案中，特异性抗体或结合剂识别人ALT1而不识别人ALT2或基本上不识别ALT2。
在一个实施方案中，血液样品可以是全血、血浆或血清。
在一个实施方案中，肝酶选自丙氨酸转氨酶(ALT1)、天冬氨酸转氨酶(AST)或γ谷氨酰胺转移酶(GGT)。
在一个实施方案中，肝酶的质量浓度在有用的诊断范围内与酶活性正相关。这意味着可以在肝酶的水平高于正常阈值(在ALT的情况下等同于40IU/L的质量浓度)时早期检出肝疾病。现有技术的测定法远没有那么灵敏，因为ALT水平需要比通过测定法可检出的正常水平高3-4倍。
在另一个实施方案中，本说明书提供了适于护理点评估来自受试者的血液样品中的肝疾病或功能的免疫测定法，所述测定法包括：
(i)使来自受试者的血液样品与特异性识别肝酶或其代谢物的表位的特异性结合剂接触以形成抗原/表位-结合剂复合物，并且使用与可检测报告物连接的或包含可检测报告物的第二或进一步的结合剂检测所述复合物，当肝酶在血浆(人血浆)的存在下时所述表位不被啮齿类/小鼠抗体有效识别或基本上不识别；并且
(ii)当肝酶或代谢物的质量浓度超过公认的参考水平时检测受试者中的肝疾病。
如本文所确定的，由于确立了ALT酶活性水平与肝疾病之间的正相关性和公认的参考水平，尽管不是针对严重的肝疾病，但现在使用本发明的方法确定的ALT1质量浓度也与ALT1酶水平正相关这一发现允许用户在质量浓度或等同酶水平的测量中确定肝疾病。在患严重肝疾病或存在患严重肝疾病风险或可能患严重肝疾病的受试者中，该质量浓度提供对肝疾病、或治疗进展然后是酶活性水平的更准确的定量评估。因此，参考水平可以表示为质量浓度或酶活性单位，或适当时表示为比率。技术人员将理解，使用标准方法作为常规开发任务来确定参考水平和合适的对照。因此，例如，ALT1质量浓度水平的比较可以在受试者之间或受试者组之间进行以确定参考水平，测试结果可以与健康对照的参考水平或患有肝疾病的对照进行比较，因此根据所选的参考水平可以预期较高或较低的比较水平。
在一个实施方案中，特异性结合剂不与针对抗原/酶产生的鼠抗体有效竞争。
在一个实施方案中，通过筛选缺乏人血浆对其针对肝酶的反应性的抑制选择抗体。
在一个实施方案中，肝酶选自丙氨酸转氨酶(ALT1)、天冬氨酸转氨酶(AST)或γ谷氨酰胺转移酶(GGT)。也就是说，该实例公开了针对ALT1的测试结果，但替代性地也可以测试AST或GGT。
在一个实施方案中，其中特异性结合剂是兔类动物抗体或包含其抗原结合部分，或者其中特异性结合剂是兔抗体或者与兔抗体识别相同表位。
在一个实施方案中，受试者是人。
在一个实施方案中，肝酶或其代谢物的质量浓度与没有严重肝疾病的受试者的酶促活性正相关。
在一个实施方案中，并且如本文使用主题方法所测定，肝酶或代谢物的质量浓度与增加的肝疾病正相关。
一般地，不小于约70％的相关性会是有效的。涵盖71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的水平。
在一个实施方案中，肝酶或其代谢物非常高的质量浓度诊断晚期肝疾病或肝衰竭。相比之下，肝酶水平在晚期肝疾病中经常是降低的并且酶测试会导致肝疾病的假阴性测试。
在另一个实施方案中，说明书提供了适于护理点评估肝疾病或功能的免疫测定法，所述测定法包括：
(i)使来自人类受试者的血液样品与特异性识别ALT1的表位的特异性结合剂接触以形成抗原-结合剂复合物，并且使用与可检测报告物连接的第二或进一步的结合剂检测所述复合物，当ALT1在人血浆的存在下时所述ALT1的表位不被所述啮齿类抗体有效识别；并且
(ii)当ALT1的质量浓度超过公认的参考水平时检测受试者中的肝疾病。
在一个实施方案中，特异性结合剂是兔抗体或包含其抗原结合部分，或者其中特异性结合剂与兔抗体识别相同表位。
在一个实施方案中，ALT1的质量浓度与没有严重肝疾病的受试者的ALT酶活性正相关。
在一个实施方案中，ALT1的质量浓度与增加的肝疾病正相关。
在一个实施方案中，在测定法中评估两种或更多种肝酶或其代谢物。
在一个实施方案中，涵盖等同于40IU/L ALT的参考水平。涵盖2-300IU的ALT活性，包括其间的所有整数。
在一个实施方案中，结合剂是抗体或其抗原结合片段，抗原结合构建体，如affimer或适体、配体或其结合部分。
在一个实施方案中，测定法是酶联免疫吸附(ELISA)型或免疫层析型测定法并且特异性结合剂固定于支持物上。
在一个实施方案中，免疫测定法是本领域中已知的ELISA型或免疫层析型或微流体型测定法。
在一个实施方案中，通过将所述血液样品涂到免疫层析或微流体装置的样品部分使所述血液样品与所述结合剂接触，其中所述装置样品部分与所述装置的间隔捕获部分可操作连接，从而所述样品的组分从所述装置样品部分流到并且流过所述装置捕获部分，并且其中一个捕获部分包含特异性结合样品中的所述抗原的结合剂，使得所述抗原被所述结合剂捕获以在所述捕获部分中形成结合剂-抗原复合物。
在一个实施方案中，使用特异性结合所述抗原并且直接或间接提供可检测信号的结合剂，如抗体或抗原结合片段、配体或affimer检测抗原复合物的量，所述可检测信号可以以视觉或以光度测定，包括以荧光测定(通过仪器读取器)量化。
在一个实施方案中，视觉定量是相对于内部参考的(美国专利8,409,818中公开了类似的测定法)。
在一个实施方案中，特异性结合剂与可检测标志物或包含可检测标志物的微粒偶联，所述可检测标志物提供可检测信号。
在一个实施方案中，捕获部分是测试线。
在另一个方面中，在测定法内评估血小板水平。
在一个实施方案中，来自抗原测试线的视觉或光度测定计算的信号与来自血小板标志物测试线的视觉或光度测定计算的信号的比率提供肝酶-血小板比率指数。
在一个实施方案中，肝酶-血小板比率指数提供肝纤维化的诊断。在此测定法的一个实施方案中，肝酶是ALT1或AST。
在一个实施方案中，本发明提供了用于测量ALT1的质量浓度或用于检测肝疾病的试剂盒，其包含：(i)层析装置，所述层析装置包含与样品部分、一个或多个捕获(测试)部分和任选下列一项或多项可操作连接的多孔膜：缀合物(检测标志物)部分、吸入器部分、合适的对照部分和任选细胞裂解或溶解部分，和(ii)识别ALT1的表位并且形成ALT1-兔抗体复合物的兔类动物抗体或包含其抗原结合组分的结合剂，和(iii)任选关于使用所述装置测定肝功能的说明书。
在一个实施方案中，装置适于反向流或侧向流免疫层析形式。
在另一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，其包含(i)层析装置，所述层析装置包含与样品部分、两个或更多个捕获(测试)部分、和任选下列一项或多项可操作连接的多孔膜或微流体装置：缀合物(检测标志物)部分、吸入器部分、合适的对照部分和任选细胞裂解或溶解部分，和(ii)特异性兔类动物抗体或包含其抗原结合部分的结合剂或特异性结合剂，其识别肝酶或代谢物的表位，如当肝酶或代谢物在血浆的存在下时不被啮齿类抗体识别的表位，并且形成肝酶-抗体/结合剂复合物，和第二结合剂，所述第二结合剂特异性结合样品中的血小板并且形成血小板标志物-结合剂复合物，其中结合剂被固定以分开捕获部分和/或包含在缀合物部分内，和(iii)任选关于使用装置测定肝酶-血小板比率指数作为肝纤维化的量度的说明书。
在一个实施方案中，形成的比率是AST/血小板比率或ALT1/血小板比率，或其组合。
在一个实施方案中，试剂盒是反向流或侧向流免疫层析形式。
在一个实施方案中，结合剂包含免疫球蛋白结构域。
在一个实施方案中，试剂盒采用本文描述的任一种测定法或其已知的变型。
在一个实施方案中，说明书提供了治疗肝疾病的方法，所述方法包括：(i)评估来自受试者的血液样品中的ALT1的质量浓度，包括使来自人类受试者的血液样品与兔类动物抗体接触以形成抗原-抗体复合物，并且使用与可检测报告物连接的第二结合剂检测所述复合物，所述兔类动物抗体在血浆的存在下特异性识别ALT1的表位，并且(ii)如果ALT1的水平超过正常/对照的ALT1水平，则推荐治疗程序或治疗所述受试者。
在一个实施方案中，说明书提供了治疗肝疾病的方法，所述方法包括：(i)评估来自受试者的血液样品中的ALT1的质量浓度，包括使来自人类受试者的血液样品与兔类动物抗体或包含其抗原结合组分的结合剂接触以形成抗原-抗体复合物，并且使用与可检测报告物连接或包含可检测报告物的第二或进一步的(例如第三)结合剂检测所述复合物，所述兔类动物抗体在血浆的存在下特异性识别ALT1的表位，并且(ii)依据受试者中的ALT1的观测水平或质量浓度，推荐治疗程序或治疗所述受试者。
在一个实施方案中，所述方法是灵敏的，并且能够检测等同于约40IU/L ALT或20-200IU/L ALT的人ALT1质量浓度。
合适的治疗是本领域中已知的并且包括抗病毒剂、饮食改变、身体锻炼，、瑜伽、减肥药物、葡萄糖控制剂、降脂药、细胞保护剂、抗糖尿病药物(如抗TNF单克隆抗体)、腺苷系统药物、肾运输葡萄糖阻断剂(如PPAR激动剂)、草药产品、抗高血压药、外周大麻素激动剂、甲状腺激素类似物、法尼醇X(farnesoid X)受体激动剂、胰岛素增敏剂、铁耗尽药物等。
影响肝的疾患包括但不限于肝炎、先兆子痫、药物毒性、代谢疾病、非酒精性脂肪肝疾病、非酒精性脂肪肝炎、肝纤维化、硬化、肝细胞癌等。
在另一个实施方案中，本说明书提供了筛选基本上不受血浆抑制而不能结合抗原的结合剂的方法：所述方法包括在不同浓度的血浆的存在下使抗原和潜在的抗原结合剂接触以确定所述结合剂是否能在血浆的存在下结合所述抗原。
在一个实施方案中，结合剂是抗体、单克隆抗体或其抗原结合部分、肽配体、核酸结合配体。
在一个实施方案中，选择适于主题测定法的抗体的方法通过筛选缺乏人血浆对其针对ALT的反应性的实质性抑制确定。这样，从包括小鼠、大鼠、兔的任何物种形成不受血浆影响的抗体试剂(即它们识别不被血浆阻断的非免疫显性位点)。
在一个实施方案中，本发明提供了选择除了适于用于如本文中描述的测定法的抗体以外的结合试剂的方法，其通过筛选缺乏人血浆对其针对ALT1的反应性的实质性抑制来进行。在一个实施方案中，方便的结合剂包括通过噬菌体展示或相关方法形成蛋白质配体、核酸适体配体、化学配体等。
在一个实施方案中，说明书提供了筛选基本上不受血浆抑制而不能结合抗原的抗体或其它特异性结合剂的方法，所述方法包括在不同浓度的血浆的存在下使抗原和潜在的抗原结合剂接触以确定所述结合剂是否能在血浆的存在下结合所述抗原。
在一个实施方案中，抗原是肝酶，如ALT1。
除非另有明确规定，否则本说明书中的每个实施方案在作必要修改后应当适用于每个其它实施方案。
上述概述不视为并且不应以任何方式视为对本公开的所有实施方案的彻底叙述。
附图说明
图1说明了ELISA，其显示了表观ALT质量与ALT酶活性的不良相关性和血浆稀释的效果。上图：ELISA，使用单克隆抗体4A9捕获，单克隆抗体M02A检测，用于具有不同酶促ALT水平的4份人血浆样品，或者兔血清作为阴性对照。注意到较少稀释的样品中抗原反应性的强烈抑制(钟形状曲线或前带)和在酶促ALT水平和观测到的抗原反应性之间缺乏相关性。下图：用于ALT的商用Elabscience ELISA试剂盒，用于具有不同酶促ALT水平的3份人血浆样品。注意到较少稀释的样品中抗原性反应性的可变抑制(钟形状曲线或前带)和在酶促ALT水平和观测到的抗原反应性之间缺乏相关性。
图2说明了ELISA，其显示了针对直接包被在ELISA板上的ALT(Lee Bioscience)的小鼠单克隆抗体反应性的抑制，这取决于还添加的人血浆的浓度。甚至在样品1:8稀释时，所示每种抗体对患者血清的存在也展示出敏感性。对于针对ALT的另12种小鼠单克隆抗体观测到类似结果。
图3(A-C)提供了人和小鼠中的ALT1的氨基酸序列的比较。人ALT1与来自小鼠(图3A)、大鼠(图3B)的ALT1或来自兔的ALT2(图3C)的序列比对，注意到兔没有ALT1基因的紧密同源物并且仅表达ALT2。注意到来自人、小鼠和大鼠的ALT1的紧密同一性和相似性，而与人ALT1相比，兔ALT2仅70％相同，导致许多差异区域的免疫原性提高。
图4说明了兔在用纯化的人ALT1免疫后产生强力抗体应答。经重组ALT1免疫的兔展示其血清中高水平的抗体(未示出)或纯化IgG。在用生物素标记纯化IgG后，使用所示形式的ELISA用于比较每种兔测试出血捕获并检测ALT(Lee Bioscience)的能力。注意所有兔样品在稀释于没有血浆的实验室缓冲液时能够捕获并检测Lee ALT。
图5说明了使用与图2相同的ELISA形式，我们证明了针对ALT的兔多克隆抗体反应性不受高浓度的人血浆的存在影响(血浆的1:2、1:4或1:8稀释液产生与不添加血浆相同的反应性)。
图6说明了侧向流免疫层析测试条中利用的检测系统的示意图。
图7说明了用于检测血浆或全血中的ALT的侧向流免疫层析测试的实例。上图：盒中运行的测试条的照片，并且对具有155U/L、60U/L或10U/L ALT的3份样品显示出不同水平的测试活性(与“350”标记相邻的线)。中间图：测定方法。下图：ALT酶活性(U/L)与对>30U/L的患者样品(n＝7)的测试线反应性和对于较低ALT水平(n＝4)仅微弱的反应性的强度的视觉相关性。
图8A-B说明了使用AX-2仪器(图10C中示出)测量测试线活性，证明了ALT酶活性(U/L)和测试线峰高(峰)之间的显著相关性。来自墨尔本(n＝48，图8A)或南京(n＝174，图8B)的肝炎患者的样品都展示出显著的相关性水平，一些患者显示比从总体相关性预期更高的峰高，这与更为进行性的肝疾病中总ALT相对于酶促ALT的水平升高一致。
图9说明了CD4 T细胞测试，在测试(T)线处表示的CD4抗原的量与CD4 T细胞的数量成正比。然后，以视觉或者通过仪器读取器相对于表示CD4 T细胞的临床相关水平的一条或多条参考线比较测试信号，在图中，350个T细胞/μl的实例，其由WHO推荐用于在HIV感染中抗逆转录病毒疗法的优先排序。类似地，对于ALT，采用与ALT的一个或多个临床相关量对应的参考线，包括由EASL推荐的40IU/L水平。图10中示出了提出的半定量ALT测试的示意图。
图10说明了针对ALT的侧向流免疫层析POC测试的可能形式。Visitect CD4测试(A)，提出的ALT测试的透视图和示意图(B，红色方框)，和Axxin AX-2读取器(C)。对于视觉解读，可以认为高于参考线的ALT线的强度诊断高于边界值如40IU/L的ALT水平，然而，使用读取器，如Axxin AX-2读取器(图10C)，可以测定完全定量结果。
图11A-B说明了可以用于鉴定适于检测人血浆样品中的ALT1的多克隆抗体、单克隆抗体或其它结合剂的ELISA的设计。使用图11B中示意性示出的形式，在测定表面上包被ALT，接着是人血浆的各个稀释液，之后添加结合剂(例如抗体)，然后是检测试剂。比较在血浆存在下与无血浆时的结合量可以证明结合试剂适于所述目的，如在图11A左上图中对没有血浆影响的兔抗rALT(经亲和纯化)所示，这相对于不适于所述目的的试剂而言，如在其余图中对一系列单克隆抗体所示，其中在血浆的存在下存在可变的抑制水平(Hu03、5H2、3H12、6B5单克隆抗体)或甚至在血浆不存在时反应性不良(3B4单克隆抗体)。
图12说明在ELISA测定中ALT1结合测定法对ALT1具有特异性而对酶学等同水平的ALT2缺乏反应性。将代表等同水平的酶ALT活性的未纯化的人ALT1或人ALT2(SEQ ID:6)包被在ELISA板上，然后用针对ALT1的兔抗体检测，对于所有浓度的酶ALT，仅ALT1观察到ELISA反应性，而ALT2则未观察到，证明了试剂和测定法对ALT1而不是ALT2的特异性。
图13说明在免疫层析试纸条测定中ALT1结合测定法对ALT1具有特异性而对酶学等同水平的ALT2缺乏反应性。使代表等同水平的酶ALT活性的未纯化的人ALT1或人ALT2(SEQ ID:6)接受免疫层析测定，如图7所示，仅ALT1在免疫层析测试中检出。
序列表检索表
SEQ ID NO:1人丙氨酸氨基转移酶1的氨基酸序列(残基1-496)
SEQ ID NO:2小鼠丙氨酸氨基转移酶1的氨基酸序列
SEQ ID NO:3大鼠丙氨酸氨基转移酶1的氨基酸序列
SEQ ID NO:4人丙氨酸氨基转移酶1的氨基酸序列(残基17-496)
SEQ ID NO:5兔丙氨酸氨基转移酶2的氨基酸序列
SEQ ID NO:6人丙氨酸氨基转移酶2的氨基酸序列
具体实施方式
本公开不限于药剂的特定筛选方案、具体的药剂配制剂和各种医学方法，因为它们可以变化。
本说明书通篇，除非上下文另有要求，否则词语“包括”或其变型如“包含”或“含有”将被理解为暗示包括陈述的要素或整数或要素或整数的组，但不排除任何其它要素或整数或要素或整数的组。“由......组成”意指包括并且限于短语“由......组成”后的任何项。因此，短语“由......组成”指示所列要素是需要的或强制性的，并且不能存在其它要素。“基本上由......组成”意指包括短语后列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于本公开对所列要素指定的活性或作用的其它要素。
如本领域中已知，本文中提及“抗体”包括全抗体或抗体的抗原结合部分，即抗体的免疫球蛋白结构域。
如本文中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个/种”和“该/所述”包括复数方面。因此，例如，提及“组合物”包括单一组合物，以及两种或更多种的组合物；提及“剂”包括一种剂，以及两种或更多种剂；提及“本公开”包括本公开的单个和多个方面，等等。
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。可以使用与本文中描述的那些材料和方法相似或等同的任何材料和方法来实践或测试本公开。关于定义和技术术语及本领域技术人员已知的其它方法，从业人员特别参见Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，增刊47，John Wiley&Sons,New York,1999；Colowick和Kaplan编，Methods In Enzymology,Academic Press,Inc.；Weir和Blackwell编，Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷，Blackwell Scientific Publications,1986。
针对ALT和其它肝疾病标志物的测试的临床实用性得到可用且广泛使用的大量仪器和测试充分证明，但是所有这些测试是设计用于具有可靠电力供应、经过培训的技术人员和在资源不足环境中通常缺乏的其它基础设施的实验室或临床机构。此外，将血液或血浆运输到中心化机构进行测试依赖于快速、冷冻运输来维持样品的酶活性。
Kim等人，2009)报告了使用小鼠中产生的单克隆抗体(MAb)的组合呈酶联免疫吸附测定法(ELISA)的形式对ALT质量浓度的测试。然而，Kim等人工作的突出特征是下述观测结果：在他们的测试条件下，ALT酶活性和质量浓度之间的相关性非常低。类似地，Hu等人(2016)报道了使用在小鼠中产生的单克隆抗体(MAb)的组合的用于ALT1的侧向流动免疫层析测试，其中与酶ALT水平也具有非常低的相关性。
生物化学测试在有严重或进展的肝疾病的受试者中是不准确的，并且酶功能降低。Kim等作者观测到，尽管与酶促ALT的相关性低，但用于检测具有更严重形式的病毒性肝炎(硬化和肝细胞癌)的患者的ALT ELISA具有良好实用性，其中ALT质量浓度增加，但是酶促ALT的量稍微降低。肝疾病测试的主要需要是在患者达到肝疾病的此类晚期阶段前鉴定患者，例如EASL推荐40IU/L ALT的上限以管理慢性乙肝，并且对药物毒性、先兆子痫和其它急性或慢性疾患中的肝酶测试存在类似需要。
另外，卫生保健工作人员会具有如下期望，即新的ALT测试应当与建立的酶促测试技术显示合理的相关性水平。此外，可以理解，根据本公开，过量ALT质量浓度的检出在肝疾病诸如慢性病毒性肝炎的更晚期形式中提供额外的临床实用性。如Hu等人(2016)所述的用于ALT1的免疫层析测试不符合这一预期，因为作者描述了与酶ALT水平表现出非常低相关性的测定法。
用于测量人血浆中的ALT的商品化ELISA也展现与酶促ALT水平非常差的相关性，并且令人惊讶地，产生高度依赖于用于血清或血浆的样品稀释的结果(参见图1)。
免疫测定法是一种有用的测定法形式，其利用抗体-抗原反应的特异性、强度和多样性分析样品并且检测其中的特异性组分。各种免疫测定法技术可用，如在Wild D.“TheImmunoassay Handbook”Nature Publishing Group,2001及后续创新中经典描述的那些技术。新近创新是在包含免疫球蛋白结构域及其衍生物的抗原结合片段领域中。还考虑到了肽适体、affimer和化学配体，并且在制备和属性，如特异性、长期性/稳定性和敏感性领域上提供优势。
侧向流测定法以及最近的非侧向流和微流体法为生物测定提供了有用的设置。此类测定法可以是定性的、定量的或半定量的。在微流体装置中，小体积的液体通过例如芯片或盒(cartridge)中产生的微通道移动。有多种检测试剂可用，这些检测试剂包括金属纳米颗粒、有色或发光材料。生物共轭金属纳米颗粒的共振增强吸附(REA)提供快速处理时间和其它优点。装置可以与条形码技术组合以识别患者和被测试的分析物。用于评估输入数据的计算机软件和硬件包含在本公开中。
用于检测针对特定抗原/酶的抗体的多种方法也是已知的。例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western和斑点印迹测定以及放射免疫测定(RIA)通常用在实验室中。还使用阵列和高通量筛选方法。
提供中间诊断或明确诊断的定性测定需要允许将样品评定为可能具有或不具有某种病症的集成截止值(cutoff)、门(gate)或窗(window)。仪器读取器和软件通常用于整理数据并通过诊断算法或决策树对其进行处理。
对于护理点诊断学，直接监测酶活性是不可行的，因为这需要相当复杂的评估。由于大多数酶，包括感兴趣的酶是蛋白质，所以提出了可以通过检测作为抗原的蛋白质(“质量浓度”)的血清学测试，而非通过酶活性来检测此类酶的量。最常见地，用于检测抗原的血清学测试将使用一对结合剂，并且尤其是小鼠或其它物种中生成的单克隆抗体，以首先结合讨论的抗原，接着检测该抗原。本文所述的令人惊讶且新颖的观测结果是用一系列小鼠单克隆抗体在抗原反应性的水平上具有由人血浆引起的强烈干扰。这引导发明人推断，血浆中的干扰性物质结合并且遮蔽ALT1中能够在小鼠中诱导免疫应答的一种或多种抗原表位。应当进一步理解，可以应用这种通用方法以开发测试测定法，且尤其是针对其它酶的POC测试测定法，所述酶包括但不限于可以用于不同目的的其它肝特异性酶。例如，可以使用天冬氨酸转氨酶(AST)代替ALT以测量肝疾病。
本发明人推理人血浆中存在的一种或多种因子可以干扰鼠抗体与ALT和其它抗原的结合，因此妨碍使用这种方法开发针对ALT质量浓度的有用灵敏性测定法。
用一系列的小鼠MAb在ALT抗原反应性的水平上对由人血浆引起的强烈干扰的令人惊讶且新颖的观测结果引导发明人推断，血浆中的干扰性物质可以结合并且遮蔽ALT1中能够在小鼠中诱导免疫应答的一种或多种抗原表位。
发明人通过利用下述已知实情设计针对此问题的解决方案：兔没有人ALT1蛋白或基因的同源物，而仅具有ALT2蛋白的同源物，其在身体组织的所有形式中似乎提供相关的生物化学功能。因此，可以预期人ALT1蛋白的所有部分(并且尤其是蛋白质的表面部分)在兔中具免疫原性，这与在小鼠中仅小鼠和人ALT1之间的差异区域将具免疫原性的情况大不相同。如图4中所示，兔在用纯化的人ALT1免疫后产生强力的抗体应答。在一个实施方案中，使用兔抗ALT捕获人血浆中的ALT，和经生物素标记的兔抗ALT和经辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白检测捕获的ALT建立ELISA。如图5中所示，此ELISA没有受到人血清/血浆的存在的不利影响，使得它适于分析测定人临床标本中的ALT质量浓度。由于测试的灵敏性，现在将有可能检测受试者中的诊断有用的ALT1水平。为了使护理点的ALT1检测成为可能，图6说明了使用胶体金作为ELISA的备选检测系统的ALT1检测方法。使用这种胶体金测试形式，显示有可能在侧向流免疫层析测试条的形式中检测出人血浆或全血中的ALT(图7)。
虽然与POC ALT测试联合使用仪器，如AX-2仪出于许多原因是期望的，但是也需要可以根据EASL准则给出“正常”(健康)与异常”(升高，不健康)ALT水平，例如<40IU/L或≥40IU/L的简单、视觉读出的测试。这使用先前在开发用于测量CD4 T细胞的侧向流POC测试中描述的方法(美国专利8,409,818和其它领域)容易实现(图9)。这提供了额外的优点，即类似仪器、测试盒和生产方法可以用于各种测试装置。
在一个实施方案中，涵盖采用流式细胞术定量技术(例如荧光微珠)、微流体、盒、IFA、ELISA型和侧向流动装置等中的一种或多种且任选地与评价和比较ALT1和/或血小板水平的仪器读取器和/或相关软件一起的测定法和试剂盒。
本领域技术人员应当理解，这种测试可以进一步修改为提供对ALT和一种或多种其它相关生物标志物，例如ALT加上血小板水平(它们都是管理先兆子痫中的重要标志物)的同时测量。
应当进一步理解，可以应用这种通用方法开发测试测定法，且尤其是针对其它酶的POC测试测定法，所述酶包括但不限于可以用于不同目的的其它肝特异性酶。例如，可以使用天冬氨酸转氨酶(AST)代替ALT以测量肝疾病。
另外，ALT加上血小板水平的组合可以通过与酶促AST和血小板水平类比提供可用于肝纤维化程度的非侵入性生物标志物，其中AST-血小板比率指数(APRI)得分是AST的样品结果的算术乘积(除以正常水平)，乘以100并且除以血小板计数(以每ml 109计)。世界卫生组织推荐APRI得分用于非侵入性测量肝纤维化，其中不能使用备选方法，如Fibroscan(专业化超声)。类似地，用于APRI的POC测试会联合如本文中对ALT描述的AST水平和血小板水平的测量。
虽然本文中描述的ALT测定法已经利用兔中制备的经亲和纯化的多克隆抗体，但是应当理解可以使用单克隆抗体或本领域中已知的其它抗原结合剂。用于产生兔单克隆抗体的技术现在是可获得的，并且由于兔中缺乏内源ALT1预期针对ALT1的兔MAb可以容易地获得。然而，在小鼠(最常用于产生MAb的物种)中，内源ALT1的存在导致大多数MAb针对可以易于被人血浆中存在的因子封闭的表位，并且在也表达ALT1的大鼠中情况也可能如此。然而，本文中描述的用于测量ALT1的测定法并且尤其是ELISA测定法使我们开发出用于筛选和选择不易受此类血浆封闭和抑制，并且因此适于用于临床测定法，如本文描述的ALT测定法的抗体且尤其是MAb的新颖测定法。
如图11所示，当在ELISA板上包被纯化的重组ALT，接着按序添加人血浆(或无血浆作为对照)和感兴趣的抗体或MAb的合适稀释液时，可以测定由血浆的添加引起的抑制水平，并且因此可以鉴定基本上不受抑制的抗体制剂或MAb。本领域技术人员应当理解，相同技术可以适用于在任何动物物种中或者通过重组手段产生的抗体，并且也适用于非抗体结合剂，如通过噬菌体展示和其它方法鉴定的affimer、适体、肽配体，或通过各种新方法鉴定的核酸结合配体。
可以以本领域中已知的任何方便形式进行免疫测定法。这些包括Western印迹、免疫组织化学测定法和ELISA测定法。在免疫测定法中使用单克隆抗体是普遍的，这是由于有能力大量产生单克隆抗体及产物的同质性。多克隆抗体也广泛使用。用于单克隆抗原生产的杂交瘤细胞系的制备通过融合永生细胞系和针对感兴趣的抗原(在一个非限制性的实例中，抗体是在CD4多肽、其肽1或2或同源物、衍生物、变体的情况下)敏化的淋巴细胞衍生或者可以通过本领域技术人员公知的技术进行。(参见例如Douillard和Hoffman，BasicFacts about Hybridomas,in Compendium of Immunology第II卷，Schwartz编，1981；Kohler和Milstein，Nature 256:495-499,1975；European Journal of Immunology 6:511-519,1976或新近的参考文献Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第3版，CSHLP,CSH,NY,2001)。
可以使用ELISA型方案评估复合物的存在。各种免疫测定法技术可用，如可以通过参考美国专利No.4,016,043、4,424,279和4,018,653看到。这些包括非竞争类型的单位和双位或“夹心”测定法两者，以及传统的竞争结合测定法。
夹心测定法是最有用且常用的测定法之一。存在夹心测定法技术的许多变型，并且本文中意图涵盖所有。简言之，在典型的正向测定法中，在固体或半固体基底上固定抗体，并且使有待测试的样品接触结合的分子。在适当的温育期，持续足以允许抗体-抗原复合物形成的时间段后，然后(在洗涤步骤之前或之后)添加用能够产生可检测信号的报告分子标记的、对抗原有特异性的第二抗体并且温育，允许足以形成另一种抗体-抗原-经标记抗体复合物的时间。可以洗去任何未反应的材料，并且通过观测由可检测标志物(报告分子)产生的信号确定标志物的存在。通过对可见信号的简单观测结果可以是定性或定量的，或者可以通过与含有已知量的标志物的对照样品比较定量。正向测定法上的变化包括同时测定法，其中向结合的抗体同时添加样品和经标记的抗体两者。这些技术是本领域技术人员公知的，包括将显而易见的任何微小的变化。根据本发明，样品通常是包含生物流体的生物样品，并且最方便是全血样品，如毛细血管血或静脉血，其可以任选用抗凝剂处理。
在典型的正向夹心测定法中，使对标志物具有特异性的第一抗体共价或被动结合到固体或半固体支持物。支持物通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是硝酸纤维素、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯或这些的混合物或衍生物。固体支持物可以呈管、珠粒、盘或微板的形式，或者适于进行免疫测定法的任何其它表面。结合过程是本领域中公知的并且一般由将聚合物-抗体复合物交联共价结合或物理吸附到固体表面组成，然后在测试样品的制备中洗涤所述固体表面。然后，将有待测试的样品等分试样添加到固相复合物并且在合适的条件下(例如室温到约37℃，包括25℃)温育足够的时间段(例如2-40分钟或过夜，若更方便的话)，以允许抗体中存在的任何亚基结合。在温育期后，洗涤抗体亚基固相并且与对抗原的一部分有特异性的第二抗体一起温育。第二抗体与可检测标志物连接，所述可检测标志物用于指示第二抗体与抗原的结合。
备选方法牵涉固定生物样品中的靶分子，然后将固定的靶标暴露于特异性抗体，所述特异性抗体可以用或不用可检测的标志物标记。根据靶标的量和来自可检测标志物的信号的强度，可以通过用抗体直接标记检出结合的靶标。或者，将对第一抗体有特异性的经标记的第二抗体暴露于靶标-第一抗体复合物以形成靶标-第一抗体-第二抗体三级复合物。通过由报告分子发出的信号检测复合物。基于珠粒的方法的重大改进牵涉用独特的标识符标签，如寡核苷酸或电泳标签给每个珠粒加上标签，从而利于每个文库成员的氨基酸序列的鉴定。这些改进的基于珠粒的方法在国际公开No.WO 93/06121中有描述。
在其它实施方案中，方法是液相法。在液相免疫测定法的一个实例中(参见例如美国专利No.6,632,603)，使样品与能够结合标志物的药剂和检测剂接触，所述检测剂包括视觉可检测的药剂，如经胶体金或银标记的。测试样品通过流到不溶性多孔支持膜的限定区域上来涂敷，所述不溶性多孔支持膜具有的孔径对于标志物和其靶标之间，和(若存在的话)与结合物质和检测剂物质形成的复合物不能通过，但是在期望靶标不存在时保持未复合时对结合物质和检测剂物质可通过。若靶标存在于测试标本中，则检测剂物质与靶标和结合物质结合以在多孔支持膜的表面上形成视觉可检查的复合物。在将测试样品涂到多孔支持物后，对多孔支持物的表面视觉检查颜色以测定所测定的标志物的存在和数量或不存在。
在另一种测定法中，使用结合标志物的磁性抗体对标志物加标签，并且使用高Tc超导量子干扰装置测量游离的和结合的抗体的量，因此测量CSAP的存在或水平。例如，脂质体免疫迁移，液相竞争条免疫测定法在Glorio-Paulet等人J Agric Food Chem 48(5):1678-1682,2000中有描述。
用于进行各种形式的ELISA的一般形式和方案是本领域中公开的并且是诊断学领域的技术人员已知的。例如，可以参考Ausubel(编辑)Current Protocols in MolecularBiology，第5版的第11章，John Wiley&Sons,Inc,NY,2002。G等人描述了lateral Flow immunoassay using Europium(III)Chelate Microparticles and Time-Resolved Fluorescence for eosinophils and neutrophils in Whole Blood.ClinicalChemistry 53,342–348(2007)，其并入本文。
术语“水平”还涵盖生物标志物的水平的比率。
ECLIA、ELISA和Luminex LabMAP免疫测定法是检测ALT1水平的合适测定法的实例。在一个实例中，第一特异性结合剂附着于支持表面，并且包含可检测基团的第二结合试剂/抗体结合到第一抗原结合剂上。可检测基团的实例包括例如但不限于：荧光染料、酶、用于结合第二结合试剂的表位(例如，当第二结合试剂/抗体是通过荧光标记的抗小鼠抗体检测的小鼠抗体时)，例如抗原或结合对(例如生物素和抗生物素蛋白)的成员。表面可以是平坦表面，例如在典型的网格型阵列(例如但不限于96孔板和平面微阵列)的情况下，或者可以是非平坦表面，如带涂层的珠粒阵列技术，其中珠粒的每个“种类”用例如荧光染料(例如美国专利号6,599,331、6,592,822和6,268,222中描述的Luminex技术)或量子点技术(例如，如美国专利号6,306.610中描述)标记。此类测定法也可被视为实验室信息管理系统(LIMS)：
在珠粒型免疫测定法中，可以使用Luminex LabMAP系统。LabMAP系统包含聚苯乙烯微球，这些微球内部用两种光谱上不同的荧光染料染色。使用这些荧光染料的精确比率，产生由具有特定光谱地址的不同微球组组成的阵列。每个微球组可以在其表面上具有不同的反应物。因为微球组可以通过它们的光谱地址来区分，所以它们可加以组合，从而允许在单个反应容器中同时测量多达100种不同的分析物。与报告分子偶合的第三荧光染料对在微球表面发生的生物分子相互作用进行定量。当微球在Luminex分析仪中经过两个单独的激光时，它们在快速流动的流体流中被单独询问。高速数字信号处理基于微球光谱地址对微球进行分类，并以每个样品几秒的时间对表面上的反应定量。
本文考虑的受试者通常是人类受试者，并且也可以称为患者、个体或受体。人类受试者可以是男性或女性新生儿或婴儿、儿童、少年、青年、年轻成人、成人或老年人。对照受试者通常是被称为受试者/患者群体的所选的受试者组。例如，测试样品通常来自怀疑患有肝疾病或存在肝疾病风险的受试者，然而，也可以在为了排除肝病而进行的个体或一般群体筛选中从受试者收集样品。对照样品可以反映不同的亚组，例如患有严重肝疾病、肝炎等的受试者。任何受试者组均可以有用地用作对照群体，包括“不健康”受试者，例如免疫低下或老年人群。
结合剂可以方便地是抗体或其抗原结合片段。其它合适的结合剂是本领域已知的，并包括抗原结合构建体，例如affimer、适体。如本文所述，提供了用于筛选潜在特异性结合剂在人(或适当的其它物种)血浆存在下结合ALT1的能力以实现所述方法的测定法。
术语“结合剂”和类似术语是指能够特异性或基本上特异性地(即，具有有限的交叉反应性)与生物标志物上的表位结合的任何化合物、组合物或分子。“结合剂”通常具有单一特异性。尽管如此，本文也涵盖对两种或更多种生物标志物具有多种特异性的结合剂。结合剂(或配体)通常是抗体，例如单克隆抗体、或其衍生物或类似物，但也包括但不限于：Fv片段；单链Fv(scFv)片段；Fab'片段；F(ab')2个片段；人源化抗体和抗体片段；骆驼化抗体和抗体片段，以及它们的多价形式。适当时，也可以使用多价结合试剂，包括但不限于：单特异性或双特异性抗体；例如二硫键稳定的Fv片段、scFv串联物[(scFv)2片段]、双抗体、三抗体或四抗体，它们通常是共价连接或以其它方式稳定的(即，亮氨酸拉链或螺旋稳定的)scFv片段。“结合剂”还包括适体，如本领域所述。
制备抗原特异性结合剂(包括抗体及其衍生物和类似物以及适体)的方法是本领域熟知的。可以通过动物的免疫来产生多克隆抗体。可以根据标准(杂交瘤)方法制备单克隆抗体。抗体衍生物和类似物(包括人源化抗体)可以通过从编码单克隆抗体的DNA中分离DNA片段并根据标准方法将适当的V区亚克隆到适当的表达载体中而以重组方式制备。噬菌体展示和适体技术在文献中有描述。
在一些实施方案中，提供了层析装置，其包含具有的孔径允许或促进所述方法的组分的毛细管流动的材料。在一些实施方案中，该装置包含含有不同孔径的材料，或非多孔材料的部分，该材料与第一材料是连续的并且设计为接收样品或接收或贮存所述方法的组分。在一些实施方案中，层析装置的所述部分是分开的、连续的或重叠的或设计为在使用中集合。
在一些实施方案中，样品垫与装置的测试部分层析连接，所述测试部分包含结合剂，如抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，样品垫与装置的测试部分层析连接，所述测试部分包含结合剂，如抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，当有待测试的样品的层析活性部分从样品垫移向并且移过测试部分时，酶或肝酶或代谢物或ALT1被捕获到装置的测试或对照部分(包括条)上，并且从样品垫流出的剩余样品未被捕获。在一些实施方案中，将测试样品的未捕获组分经层析收集到吸收垫中，所述吸收垫相对于测试部分定位于任何方向。受试者样品的组分，如红细胞或特定白细胞可以保留于样品垫中，例如，通过选择合适网孔或孔径的垫和/或通过纳入特异性试剂，如抗体或凝集素以结合并保留这些组分。
在一些实施方案中，一旦已经将免疫层析装置的测试部分暴露于(假设)受试者样品中的ALT1，就通过使测试部分和检测结合剂之间接触而继续所述方法。在一些实施方案中，检测标志物贮存在试剂盒的单独部分中。
在一些实施方案中，检测标志物包括视觉可检测报告物分子，并且在免疫层析装置的测试和/或对照部分中基本上可以立即观测到阳性结果。在其它实施方案中，检测标志物可以使用另外的检测方案和装置检测，其对于本领域普通技术人员将是公知的。例如，胶体金属或金属氧化物颗粒或胶体非金属颗粒或染料或有色胶乳是方便使用的。
用于结合剂，如抗体或其抗原结合片段的许多标记物是可用的，其通常可以分类。可以使用例如Current Protocols in Immunology，第1和2卷，Coligen等人编Wiley-Interscience,New York,N.Y.,Pubs.(1991)中描述的技术用放射性同位素标记结合剂，并且可以使用闪烁计数测量放射性。可以使用荧光标记物，如稀土螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺(Lissamine)、藻红蛋白(phycoerythrin)和德克萨斯红(Texas Red)是可用的。可以使用Current Protocols in Immunology(见上文)中公开的技术将荧光标记物与结合剂偶联。可以使用荧光计量化荧光。各种酶-底物标记物是可用的并且美国专利No.4,275,149提供了这些中的一些的综述。酶一般催化生色底物的化学变化，其可以使用各种技术测量。例如，酶可以催化底物的颜色变化，其可以用分光光度法测量。或者，酶可以改变底物的荧光或化学发光。
上文描述了用于量化荧光变化的技术。化学发光底物被化学反应电子激发，然后可以发射可以测量(例如使用化学发光计)的光或者将能量献给荧光接受体。酶标记物的实例包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、.β.-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于偶联酶与抗体的技术在O'Sullivan等人，Methods for the PreparationofEnzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay，于Methods inEnzym.(J.Langone和H.Van Vunakis编)，Academic press,New York,73:147-166(1981)中有描述。
酶-底物组合的实例包括例如：辣根过氧化物酶(HRPO)利用过氧化氢来氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；]碱性磷酸酶(AP)以对硝基苯基磷酸酯作为生色底物；和3)β-D-半乳糖苷酶与生色底物(例如对硝基苯基-.β.-D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形基-.β.-D-半乳糖苷酶(4-methylumbelliferyl-.beta.-D-galactosidase)。许多其它酶-底物组合对于本领域技术人员是可用的。关于这些的一般综述，参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。
有时，标记物可以与抗体间接偶联。熟练技术人员会知道用于实现这点的各种技术。例如，抗体可以与生物素偶联，并且上文提及的三大类标记物中的任一种可以与抗生物素蛋白(avidin)或链霉抗生物素蛋白偶联，或者反之亦然。生物素选择性结合抗生物素蛋白，并且因此标记物可以以这种间接方式与抗体偶联。或者，为了实现标记物与抗体的间接偶联，使抗体与小的半抗原(例如地高辛(digoxin)或生物素)偶联，并且使上文提及的不同类型的标记物之一与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体或抗生物素抗体)偶联。因此，可以实现标记物与抗体的间接偶联。在另一个实施方案中，不需要标记抗体，并且其存在可以使用结合抗体的经标记抗体检测。可以在任何已知的测定方法中采用结合剂，如竞争结合测定法、直接和间接夹心测定法和免疫沉淀测定法。Zola,Monoclonal Antibodies:AManualof Techniques，第47-158页(CRC Press,Inc.2011)。
为了用于本文中描述或建议的应用，还提供了诊断测定试剂盒或制品。此类试剂盒可以包含载体装置，该载体装置经区室化以呈密闭限制容纳一个或多个容器装置，如小瓶、管等，每个容器装置包含要用于所述方法的独立要素之一。例如，容器装置之一可以包含报告工具，如与报告分子，如酶、荧光或放射性同位素标记物结合的生物素-结合蛋白，如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白。
诊断测定试剂盒通常会包含上文描述的容器和一个或多个其它容器，所述其它容器含有从商业和使用者观点看期望的材料，包括缓冲液、稀释剂、滤器、针、注射器和关于使用说明的包装插页。在容器上可以存在标签以指示组合物用于特定疗法或者非治疗应用，并且也可以指示使用说明，如上文描述的那些用途的方向。试剂盒中的其它任选组分包括一种或多种缓冲液(例如封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等)、其它试剂如底物(例如色原体)(其通过酶标记物化学改变)、表位恢复溶液、对照样品(阳性和/或阴性对照)、对照载玻片等。
术语“全长抗体”或“全抗体”可互换使用，指与抗体的抗原结合片段形成对比呈其基本上完整的形式的抗体。具体地，全抗体包括那些具有包含恒定区的重链和轻链的抗体。恒定区可以是野生型序列恒定区或其氨基酸序列变体。
术语“抗原结合蛋白”在本文中包括单一多肽链(即通过肽键连接的一系列连续氨基酸)，或者彼此共价或非共价连接的一系列多肽链(即多肽复合物)，其能够以本文中描述和/或要求保护的方式结合(假设)ALT1。例如，可以使用合适的化学或二硫键共价连接一系列多肽链。非共价键的实例包括氢键、离子键、范德华力(Van der Waals force)和疏水相互作用。本公开涵盖的非共价键是VH和VL之间的相互作用，例如在双链抗体(diabody)或三链抗体(triabody)或四链抗体(tetrabody)或Fv的一些形式中。
如本文中所用，“可变区”指能够特异性结合抗原并且包括互补决定区“CDR”，即CDRl、CDR2、和CDR3，和FR的氨基酸序列的抗体的轻链和/或重链或仅重链抗体(例如骆驼抗体或软骨鱼免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR))的部分。例如，可变区包含三个或四个FR(例如，FR1、FR2、FR3和任选FR4)以及三个CDR。VH指重链的可变区。VL指轻链的可变区。
如本文中所用，术语“Fv”应当理解为指由多个多肽或单一多肽构成的任何蛋白质，其中VL和VH缔合并且形成具有抗原结合结构域，即能够特异性结合抗原(例如ALT1)的复合物。形成抗原结合结构域的VH和VL可以在单一多肽链中或在不同多肽链中。该术语应当理解为涵盖直接衍生自抗体的片段以及使用重组手段产生的蛋白质。在一些实例中，VH不与重链恒定结构域CH1连接和/或VL不与轻链恒定结构域(CL)连接，例如结构域抗体。示例性的含有Fv的多肽或蛋白质包括Fab片段、Fab’片段、F(ab’)片段、scFv、双链抗体、三链抗体、四链抗体或更高级的复合物，或者与其恒定区或结构域，例如CH2或CH3结构域连接的任何前述物质，例如微型抗体(minibody)。
“Fab片段”由免疫球蛋白的单价抗原结合片段组成，并且可以通过用酶木瓜蛋白酶消化全抗体，以产生由完整轻链和重链的一部分组成的片段产生或者可以使用重组手段产生。抗体的“Fab’片段”可以通过用胃蛋白酶处理全抗体，接着还原以产生由完整轻链和包含VH和单一恒定结构域的重链部分组成的分子获得。每个以这种方式处理的抗体获得两个Fab’片段。也可以通过重组手段产生Fab’片段。抗体的“F(ab’)2片段”由通过两个二硫键保持在一起的两个Fab’片段的二聚体组成，并且通过用酶胃蛋白酶处理全抗体分子，在没有后续还原的情况下获得。“Fab2”片段是一种重组片段，其包含使用例如亮氨酸拉链或CH3结构域连接的两个Fab片段。“单链Fv”或“scFv”是含有抗体的可变区片段(Fv)的重组分子，其中轻链的可变区和重链的可变区通过合适的柔性多肽接头共价连接。
如本文中所用，术语“抗原结合结构域”应当理解为指能够特异性结合抗原的抗体区域，即如本文中定义的VH或VL或Fv或可变区。抗原结合结构域不需要在整个抗体的背景中，即它可以呈分离(例如结构域抗体)或另一种形式，如scFv。
如本文中所用，术语“结合”在提及蛋白质或其抗原结合结构域与抗原的相互作用时意指相互作用依赖于抗原上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在。例如，抗体一般识别并且结合特定的蛋白质结构而非蛋白质。如果抗体结合表位“A”，则在含有经标记的“A”和抗体的反应中含有表位“A”(或游离的、未标记的“A”)的分子的存在会降低与抗体结合的经标记的“A”的量。
如本文中所用，术语“特异性结合”或“特异性结合剂”或“特异性抗体”意指结合剂与特定抗原反应或缔合比它与备选抗原反应或缔合更频繁、更快速、持续时间更长和/或亲和力更高。例如，特异性结合抗原的蛋白质比它结合其它抗原，例如结合ALT2更高的亲和力(例如高20倍或40倍或60倍或80倍至100倍或150倍或200倍的亲和力)、亲合力，更容易和/或以更长的持续时间结合该抗原。在一些实施方案中，结合剂选择性结合抗原，这意味着结合对于指定抗原而言是排他的。
说明书包括以下非限制性实施例来说明本发明。
实施例1-人血浆强烈干扰一系列小鼠抗体结合ALT的能力
用于测量人血浆中的ALT的商品化ELISA也展现与酶促ALT水平非常差的相关性，并且令人惊讶地，产生高度依赖于用于血清或血浆的样品稀释的结果(参见图1)。
如图2所示，发明人在本文中公开的初步实验提供了类似的结果。使用一系列使用ALT1蛋白作为免疫原在小鼠中产生的MAb(图2)，结果高度依赖于用于血清或血浆的样品稀释。然而，本发明人推理人血浆中存在的一种或多种因子可以干扰ALT与抗体的抗原反应性，因此妨碍使用这种方法开发针对ALT质量浓度的有用测定法。
用一系列小鼠MAb在ALT抗原反应性的水平上对由人血浆引起的强烈干扰的令人惊讶且新颖的观测结果引导发明人推断，血浆中的干扰性物质可以结合并且遮蔽ALT1中能够在小鼠中诱导免疫应答的一种或多种抗原表位。
实施例2-兔产生针对人ALT1的强力抗体
发明人比较了人和小鼠中的ALT1的氨基酸序列(参见图3A)，并且鉴定蛋白质具有高水平的同一性。因而，可以预期仅蛋白质表面的某些部分在人(抗原)和小鼠(宿主动物)之间足够不同，从而能够发挥外源抗原的功能以诱导免疫应答。此外，有限数量的高度抗原表位可以与结合人血浆中存在的因子的位点重叠，从而当使用针对此类位点的抗体在人血浆中测定时妨碍ALT蛋白的正确识别。
发明人通过利用下述已知实情设计针对此问题的解决方案：兔没有人ALT1蛋白或基因的同源物，而仅具有ALT2蛋白的同源物，其在身体组织的所有形式中似乎提供相关的生物化学功能。因此，可以预期基本上人ALT1蛋白的所有部分(并且尤其是蛋白质的表面部分)在兔中具免疫原性，这与在小鼠中仅小鼠和人ALT1之间的有限差异区域将具免疫原性的情况大不相同。
如图4所示，兔在用纯化的人ALT1免疫后产生强力的抗体应答。
实施例3-在兔抗体ELISA的结果中缺乏由人血浆引起的干扰
在通过抗原亲和层析从总兔IgG纯化特异性抗ALT抗体后，使用兔抗ALT捕获人血浆中的ALT，和经生物素标记的兔抗ALT和经辣根过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白检测捕获的ALT建立ELISA。
如图5所示，这种ELISA没有受到人血清/血浆存在的不利影响，使得它适合于分析测定人临床标本中的ALT质量浓度。图6说明了用于将测试的ELISA形式转化为适合于侧向流免疫层析的胶体金检测方法的策略。
实施例4-以侧向流免疫层析测试条形式检测人血浆或全血中的ALT
使用相同亲和纯化的兔抗ALT的其它样品和图6中说明的策略，显示有可能以侧向流免疫层析测试条形式检测人血浆或全血中的ALT(图7)。
在这些实施例中，容易观测到临床标本中的ALT的酶促水平与POC测试条中的ALT测试线的强度显示出视觉相关性。使用AX-2仪器测量ALT测试线强度(图10)提供了每项测试的数值，并且允许测试线强度(峰高)和有待测定的酶促ALT值之间的相关性(图8A和图8B)，显示了两个值间的紧密相关性。这与Hu等人(2016)描述的使用小鼠单克隆抗体的用于ALT1的侧向流免疫层析测试形成对比，在该侧向流免疫层析测试中，与酶ALT水平的相关性非常低，可能是因为如我们已经在本文提到的不同的血浆蛋白干扰程度所致。
令人感兴趣地，在我们的实施例中，当与平均相关性水平(最佳拟合线)相比时，少量样品相对于酶促ALT展示出ALT质量浓度的量大幅升高，这可以代表患有更晚期形式的肝疾病，并且具有与酶促ALT相比升高的ALT质量浓度的患者，如由Kim等人(2006)报告。因此，本文描述的ALT测试提供了以下益处：与标准酶促ALT测试的强烈相关性(与Hu等人[2016]形成对比)，但是具有额外的检测具有晚期肝疾病的患者中升高的ALT质量浓度的能力，其中在通过酶促活性测量时ALT生成或活性可能受损，从而给出ALT水平正常(健康)的假指示。
实施例5-“正常”(健康)与“异常”(升高，不健康)ALT水平的视觉读出
虽然与POC ALT测试联合使用仪器，如AX-2仪器出于许多原因是期望的，但是也需要可以根据EASL准则给出“正常”(健康)与“异常”(升高，不健康)ALT水平，例如分别为<40IU/L或≥40IU/L的简单、视觉读出的测试。这使用先前在开发用于测量CD4 T细胞的侧向流POC测试中描述的方法(美国专利8,409,818和其它领域)容易实现(图9)。这提供了额外的优点，即类似的仪器、测试盒和生产方法可以用于各种测试装置。
在CD4 T细胞测试中，在测试(T)线处表示的CD4抗原的量与CD4 T细胞的数量成正比。然后，以视觉或者通过仪器读取器相对于表示CD4 T细胞的临床相关水平的一条或多条参考线比较测试信号，在图中，350个T细胞/μl的实例，其由WHO推荐用于在HIV感染中抗逆转录病毒疗法的优先排序。类似地，对于ALT，我们制备与ALT的一个或多个临床相关量对应的参考线，包括由EASL推荐的40IU/L水平。图10中示出了提出的半定量ALT测试的示意图。
本领域技术人员应当理解，这种测试可以进一步修改为提供对ALT和一种或多种其它相关生物标志物，例如ALT加上血小板水平(它们都是管理先兆子痫中的重要标志物)的同时测量。
应当进一步理解，可以应用这种通用方法开发测试测定法，且尤其是针对其它酶的POC测试测定法，所述酶包括但不限于可以用于不同目的的其它肝特异性酶。例如，可以使用天冬氨酸转氨酶(AST)代替ALT以测量肝疾病。
另外，ALT加上血小板水平的组合可以通过与酶促AST和血小板水平类比提供可用于肝纤维化程度的非侵入性生物标志物，其中AST-血小板比率指数(APRI)得分是AST的样品结果的算术乘积(除以正常水平)，乘以100并且除以血小板计数(以每ml 109计)。世界卫生组织推荐APRI得分用于非侵入性测量肝纤维化，其中不能使用备选方法，如Fibroscan(专业化超声)。类似地，用于APRI的POC测试会联合如本文中对ALT描述的AST水平和血小板水平的测量。
实施例6-筛选结合ALT或其它酶的药剂
虽然本文中描述的ALT测定法已经利用兔中产生的经亲和纯化的多克隆抗体，但是应当理解出于此目的，可以优选单克隆抗体或其它结合剂。用于产生兔单克隆抗体的技术现在是可获得的，并且由于兔中缺乏内源ALT1预期针对ALT1的兔MAb可以容易地获得。然而，在小鼠(最常用于产生MAb的物种)中，内源ALT1的存在导致大多数MAb针对可以易于被人血浆中存在的因子封闭的表位，并且在也表达非常类似于人的ALT1的大鼠中情况也可能如此(图3B)。然而，本文中描述的用于测量ALT1的测定法和尤其是ELISA测定法使我们开发出用于筛选和选择不易受此类血浆封闭和抑制，并且因此适于用于临床测定法，如本文描述的ALT测定法的抗体且尤其是MAb的新颖测定法。
如图11A所示，当在ELISA板上包被纯化的重组ALT，接着按序添加人血浆(或无血浆作为对照)和感兴趣的抗体或MAb的合适稀释液时，可以测定由血浆的添加引起的抑制水平，并且因此可以鉴定基本上不受抑制的抗体制剂或MAb。本领域技术人员应当理解，相同技术可以适用于在任何动物物种中或者通过重组手段产生的抗体，并且也适用于非抗体结合剂，如通过噬菌体展示和其它方法鉴定的肽配体，或通过各种方法鉴定的核酸结合配体(适体)。
实施例7-测定法对肝特异性ALT1同种型的特异性
如上所述，在人类中，ALT1同种型主要在肝中表达，而ALT2同种型主要在肌肉和其它组织中表达，因此预期相对于ALT2对ALT1具有特异性的测定法对于检测和监测肝疾病具有更大的临床实用性。
如图12所示，当将代表等同水平的酶ALT活性的未纯化的人ALT1或人ALT2(SeqID:6)包被在ELISA板上，然后用针对ALT1的兔抗体检测时，对于所有浓度的酶ALT，仅ALT1观察到ELISA反应性，而ALT2则未观察到，证明了试剂和测定法对ALT1而不是ALT2的特异性。
类似地，在图13中，当使代表等同水平的酶ALT活性的未纯化的人ALT1或人ALT2(Seq ID:6)接受免疫层析测定时，如图7(实施例4)所示，仅ALT1在免疫层析测试中检出。
许多修改在不偏离本发明范围的前提下对于熟练收件人将是明显的。
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Claims (10)

1.一种适于护理点评估肝疾病或功能的免疫测定法，所述测定法包括：
(i)使来自人类受试者的血液样品与识别ALT1的表位的特异性结合剂接触以形成抗原-结合剂复合物，并且使用与可检测报告物连接或包含可检测报告物的第二或进一步的结合剂检测所述复合物，当啮齿类抗体在人血浆的存在下时所述ALT1的表位不被啮齿类抗体识别；以及
(ii)依据所述样品中的ALT1的质量浓度检测所述受试者中的肝疾病或肝功能。
2.根据权利要求1所述的测定法，其中所述特异性结合剂是兔类动物抗体或者包含其抗原结合部分，或者其中所述特异性结合剂与所述兔抗体识别相同的表位。
3.根据权利要求1或2所述的测定法，其中所述ALT1的质量浓度与ALT1酶活性正相关。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的测定法，其中所述ALT1的质量浓度与增加的肝疾病正相关。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的测定法，其中所述结合剂是抗体或包含其免疫球蛋白结构域。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的测定法，其中所述测定法是酶联免疫吸附(ELISA)型或免疫层析型或微流体测定法，并且所述结合剂固定于支持物上。
7.根据权利要求6所述的测定法，其中所述测定法是免疫层析型测定法并且其中通过将所述血液样品涂到免疫层析装置的样品部分使所述血液样品与所述结合剂接触，其中所述装置样品部分与所述装置的间隔捕获部分可操作连接，从而所述样品的组分从所述装置样品部分流到并且流过所述装置捕获部分，并且其中一个捕获部分包含特异性结合至所述样品中的所述抗原的所述结合剂，使得所述抗原被所述结合剂捕获以在所述捕获部分中形成结合剂-抗原复合物。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的测定法，其中使用特异性结合所述抗原并且直接或间接提供可检测信号的结合剂，如抗体或抗原结合片段、配体或affimer检测所述抗原复合物，所述可检测信号可以以视觉或通过仪器读取器量化。
9.根据权利要求7-8中任一项所述的测定法，其中所述捕获部分是测试线。
10.一种用于测量ALT1的质量浓度的试剂盒，所述试剂盒包含：(i)层析装置，所述层析装置包含与样品部分、一个或多个捕获(测试)部分和任选下列一项或多项可操作连接的多孔膜或微流体装置：缀合物(检测标志物)部分、吸入器部件、合适的对照部分和任选的细胞裂解或溶解部分，和(ii)识别ALT1的表位并且形成ALT1-兔类动物抗体/结合部分复合物的兔类动物抗体或包含其抗原结合部分的剂，和(iii)任选的关于使用所述装置测定肝功能的说明书。
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