CN117347644A - 抗高m蛋白干扰的总胆红素检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及抗高M蛋白干扰的总胆红素检测试剂盒。本发明提供的抗高M蛋白干扰的总胆红素检测试剂盒，通过增溶分散剂的添加和金属离子的去除，阻止了样本在检测过程中被干扰，优化了试剂组分，有效避免和降低了高M蛋白对样本检测过程中的干扰。在测定试剂中增加增溶分散剂同时降低离子浓度，杜绝测定高M蛋白样本的检测过程中出现聚集产生沉淀的现象，使检测过程不再被干扰，来提高该类样本检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及抗高M蛋白干扰的总胆红素检测试剂盒。
背景技术
胆红素是由卟啉类化合物在人体内分解代谢生成的，经过血液的运输到肝脏后，对其进行处理。胆红素主要包括游离胆红素和结合胆红素，临床上主要用于诊断相关的肝脏疾病和胆道梗阻，是临床检验中最常规的项目之一，在肝胆等类疾病诊断中占有非常重要的地位。游离胆红素随血液循环到达肝脏后，在肝细胞细胞膜上特异性载脂蛋白的作用下，载体蛋白与胆红素结合，经过细胞的主动转运后，血液中的胆红素能够迅速地从肝细胞膜外表面转移至内表面，进而进入肝细胞的细胞质内。进入肝细胞胞质内的胆红素与存在于肝细胞细胞质内的载体蛋白结合，进而以复合物的形式被动转运至滑面内质网。在肝细胞的滑面内质网上的胆红素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶的催化作用下，复合物中胆红素的丙酸基能够迅速的与尿苷二磷酸-α-葡萄糖醛酸反应，生成胆红素葡萄糖醛酸单酯和双酯，从而转变为结合胆红素。
结合胆红素在肝细胞浆内可与胆汁酸盐一起，经胆汁分泌器(高尔基复合体、内质网、溶酶体等)，被分泌入毛细胆管中，随胆汁排出。肝脏作为人体内最大的多功能实质性器官，有“物质代谢中枢”之称。肝脏不仅是体内三大物质代谢的中心器官，而且还具有生物转化、分泌和排泄，参与机体体液平衡、血容量调节和免疫吞噬等重要功能。因此检测胆红素的代谢情况，作为肝胆疾病等诊断的重要指标已广泛应用于临床，是临床检验中最常规的项目之一。
M蛋白(即单克隆免疫球蛋白,亦称副蛋白，系单株B淋巴细胞或浆细胞异常增生而分泌的，一种在氨基酸组成和排列顺序上非常均一的异常免疫球蛋白分子或其片段。M蛋白多见于多发性骨髓瘤、重链病、轻链病、高丙种球蛋白血症、原发性巨球蛋白血症、恶性淋巴瘤、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症等B淋巴细胞或浆细胞克隆增殖性疾病其中以多发性骨髓瘤最为多见。多发性骨髓瘤系一种危及人类生命的常见的血液系统恶性肿瘤，是由骨髓中克隆性浆细胞珠异常增生所致，但其发病原因、发病机制尚未完全阐明。是当今世界上发病率以及病死率均较高的一种血液系统恶性肿瘤，在血液系统肿瘤中的排名为第二，其发病率占15％，占所有恶性肿瘤的1％。
随着社会文化的不断进步，不断有学者提出M蛋白可以对不同生化指标的检测产生干扰，并分析产生这种影响的可能机制。有文献报道M蛋白存在时会对高密度脂蛋白、C-反应蛋白、血清肌酐、胆红素等不同生化指标造成影响，其影响机理绝大部分为M蛋白其特殊的结构与检测试剂混合时产生了沉淀导致了患者样本的基线吸光度读数明显高于正常读数从而导致了检测结果的不准确性。
M蛋白对常规生化指标检测的干扰可能来自于特定分析，或与分析系统中特定分析成分特异或非特异性结合产生沉淀，以及分析过程产生的不同化学或免疫干扰。M蛋白也可以与许多预分析物质结合从而影响检测结果，这些预分析物质包括阳离子、阴离子、酶、激素和脂蛋白，取决于它们与这些预分析物抗原决定簇结合的亲和性，M蛋白可能会改变这些物质的功能或者新陈代谢。
当前临床上胆红素检测使用的方法多为化学氧化法，选取氧化剂多为亚硝酸盐和钒酸盐，反应液pH、离子强度、温度或溶剂性质等条件的改变均可导致蛋白质性质发生改变，使其溶解度下降而形成沉淀。当表面活性剂难以溶解M蛋白在酸性环境下产生的沉淀时，即出现干扰，故M蛋白存在时化学氧化法胆红素测定均存在干扰。目前从临床样本的检测中发现对于高M蛋白样本的检测结果受极大影响的案例，且对于血清中胆红素检测的试剂盒中均未提到需避免抗M蛋白干扰的问题，也未能提供解决相应抗M蛋白干扰的方法。
目前国际市场上，能够测定总胆红素的方法或者试剂盒均忽略了高离子浓度以及增溶分散剂的缺少在检测高M蛋白样本时带来的干扰，因此导致该类型样本在检测时结果不准确，影响临床诊断。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供抗高M蛋白干扰的总胆红素检测试剂盒，本发明提供的抗高M蛋白干扰的总胆红素检测试剂盒能够杜绝高M蛋白样本对检测的干扰，提高检测的准确度。
本发明提供了试剂组合，包括试剂1和试剂2，其中：
所述试剂1包括柠檬酸、TAGAT CH40、乳化剂OP-09、日本花王20AB和NaN3，所述柠檬酸、TAGAT CH40、乳化剂OP-09、日本花王20AB和NaN3的质量比为(19.213～57.639)：(10～20)：(10～20):(50～100)：(0.975～1.95)
所述试剂2包括三乙醇胺、氧化剂和Proclin，所述氧化剂包括亚硝酸钠或偏钒酸钠，所述三乙醇胺和氧化剂的质量比为(7.45～14.9)：(0.138～1.438)。
进一步地，所述试剂1包括：100～300mmol/L柠檬酸、10～20g/L TAGAT CH40、10～20g/L乳化剂OP-09、50～100g/L日本花王20AB和0.015～0.03mol/L NaN3；
所述试剂2包括：50～100mmol/L三乙醇胺、2～20mmol/L氧化剂和至少0.2wt％Proclin，所述氧化剂包括亚硝酸钠或偏钒酸钠。
与其他试剂组合相比，本发明提供的试剂组合，通过在测定试剂中增加增溶分散剂TAGAT CH40同时降低离子浓度(取消NaCl的添加)，杜绝测定高M蛋白样本的检测过程中出现聚集产生沉淀的现象，使检测过程不再被干扰，来提高检测试剂的反应度；所添加的增溶分散剂和离子浓度的下调可以在检测高M蛋白样本的测定过程中起到分散剂和电荷平衡作用，通过阻止沉淀的产生来确保样本检测过程不被干扰，从而提高该类样本检测的准确性，为这类患者的胆红素临床检测提供更准确的结果，由于所述试剂组合中各组分之间的相互配合，从何获得更准确的技术效果。
在一些实施例中，所述试剂1中:
所述柠檬酸的浓度为100mmol/L、200mmol/L或300mmol/L；
所述TAGAT CH40的浓度为10g/L、15g/L或20g/L；
所述乳化剂OP-09的浓度为10g/L、15g/L或20g/L；
所述日本花王20AB的浓度为50g/L、75g/L或100g/L；
所述NaN3的浓度为0.015mol/L、0.02mol/L或0.03mol/L。
在一些实施例中，所述试剂2中:
所述三乙醇胺的浓度为50mmol/L、75mmol/L或100mmol/L；
所述抗氧化剂选自7mmol/L亚硝酸钠、10mmol/L偏钒酸钠或20mmol/L偏钒酸钠；
所述Proclin的浓度为0.2wt％。
在一些具体实施例中，所述试剂1包括水、200mmol/L柠檬酸、15g/L TAGAT CH40、15g/L乳化剂OP-09、75g/L日本花王20AB和0.02mol/L NaN3；
所述试剂2包括水、75mmol/L三乙醇胺、7mmol/L亚硝酸钠和0.2wt％Proclin。
在一些具体实施例中，所述试剂1包括水、100mmol/L柠檬酸、10g/L TAGAT CH40、10g/L乳化剂OP-09、50g/L日本花王20AB和0.015mol/L NaN3；
所述试剂2包括水、50mmol/L三乙醇胺、10mmol/L偏钒酸钠和0.2wt％Proclin。
在一些具体实施例中，所述试剂1包括水、200mmol/L柠檬酸、20g/L TAGAT CH40、10g/L乳化剂OP-09、50g/L日本花王20AB和0.015mol/L NaN3；
所述试剂2包括水、50mmol/L三乙醇胺、10mmol/L偏钒酸钠和0.2wt％Proclin。
在一些具体实施例中，所述试剂1包括水、300mmol/L柠檬酸、20g/L TAGAT CH40、20g/L乳化剂OP-09、100g/L日本花王20AB和0.03mol/L NaN3；
所述试剂2包括水、100mmol/L三乙醇胺、20mmol/L偏钒酸钠和0.2wt％Proclin。
实验表明，在上述实施例中，所述试剂组合由于各组分及浓度之间的相互配合，能够更好的杜绝测定高M蛋白样本的干扰，更加准确的测定样本中总胆红素浓度，从而获得更准确的技术效果。
本发明提供了所述的试剂组合在制备抗高M蛋白干扰的总胆红素检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供了抗高M蛋白干扰的总胆红素检测试剂或试剂盒，包括所述的试剂组合。
本发明提供了所述的总胆红素的检测方法，包括采用所述的抗高M蛋白干扰的总胆红素检测试剂或试剂盒对样本进行检测。
本发明提供了抗高M蛋白干扰的总胆红素检测试剂盒，通过增溶分散剂的添加和金属离子的去除，阻止了样本在检测过程被干扰，优化了试剂组分，有效避免和降低了高M蛋白对样本检测过程中的干扰。在测定试剂中增加增溶分散剂同时降低离子浓度(取消NaCl的添加)，杜绝测定高M蛋白样本的检测过程中出现聚集产生沉淀的现象，使检测过程不再被干扰，来提高该类样本检测的准确性。所添加的增溶分散剂和离子浓度的下调可以在检测高M蛋白样本的测定过程中起到分散剂和电荷平衡作用，通过阻止沉淀的产生来确保样本检测过程不被干扰，从而提高该类样本检测的准确性，为这类患者的胆红素临床检测提供更准确的结果。
附图说明
图1示效果例中现有试剂与实施例2试剂检测40例临床病人样本相关性分析结果；
图2示效果例中现有试剂与实施例2试剂的样本反应曲线结果。
具体实施方式
本发明提供了抗高M蛋白干扰的总胆红素检测试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明主要通过在试剂中增加增溶分散剂和降低离子浓度来杜绝高M蛋白样本对检测的干扰，使试剂的抗M蛋白干扰的性能大大提高，为临床特殊样本的诊断提供了更高的可能性。
一种抗高M蛋白的总胆红素检测试剂盒：
其主要原理为：胆红素在表面活性剂以及增溶分散剂的作用下被化学氧化剂氧化为胆绿素，通过检测特定波长下吸光度的变化得到样本中总胆红素的浓度。
本发明中对于总胆红素浓度测定试剂盒为双试剂类型，前期的实验证明以下实验配比方式对总胆红素浓度的测定结果以及对高M蛋白样本检测都较为理想。本发明使用缓冲液为柠檬酸和三乙醇胺缓冲液。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得，其中TAGAT CH40购自北京阿匹斯生物科技有限公司、乳化剂OP-09购自上海泰坦科技股份有限公司、20AB购自日本花王公司。下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1
本实例描述的是一种双试剂抗高M蛋白的总胆红素检测试剂盒，其组分如下：包括：
试剂1：
在全自动生化分析仪上设定条件：温度：37℃，反应时间10分钟，起始吸光度0.005±0.005，测试主波长450nm，测试副波长548nm，被测总胆红素样本与试剂的体积比为1：30，反应为负反应，延迟时间60s，检测时间120s，理论K值为-900。
加入样本及试剂后使其充分混合，并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪，检测主波450nm下吸光度的下降幅度，从而得到所测样本的总胆红素的浓度。
实施例2
本实例描述的是一种双试剂抗高M蛋白的总胆红素，其组分如下：包括：
试剂1：
试剂2：
三乙醇胺 50mmol/L
偏钒酸钠 10mmol/L
Proclin 0.2％
在全自动生化分析仪上设定条件：温度：37℃，反应时间10分钟，起始吸光度0.005±0.005，测试主波长450nm，测试副波长548nm，被测总胆红素样本与试剂的体积比为1：30，反应为负反应，延迟时间60s，检测时间120s，理论K值为-900。
加入样本及试剂后使其充分混合，并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪，检测主波450nm下吸光度的下降幅度，从而得到所测样本的总胆红素的浓度。
实施例3
本实例描述的是一种双试剂抗高M蛋白的总胆红素，其组分如下：包括：
试剂1：
试剂2：
三乙醇胺 50mmol/L
偏钒酸钠 10mmol/L
Proclin 0.2％
在全自动生化分析仪上设定条件：温度：37℃，反应时间10分钟，起始吸光度0.005±0.005，测试主波长450nm，测试副波长548nm，被测总胆红素样本与试剂的体积比为1：30，反应为负反应，延迟时间60s，检测时间120s，理论K值为-900。
加入样本及试剂后使其充分混合，并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪，检测主波450nm下吸光度的下降幅度，从而得到所测样本的总胆红素的浓度。
实施例4
本实例描述的是一种双试剂抗高M蛋白的总胆红素，其组分如下：包括：
试剂1：
试剂2：
三乙醇胺 100mmol/L
偏钒酸钠 20mmol/L
Proclin 0.2％
在全自动生化分析仪上设定条件：温度：37℃，反应时间10分钟，起始吸光度0.005±0.005，测试主波长450nm，测试副波长548nm，被测总胆红素样本与试剂的体积比为1：30，反应为负反应，延迟时间60s，检测时间120s，理论K值为-900。
加入样本及试剂后使其充分混合，并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪，检测主波450nm下吸光度的下降幅度，从而得到所测样本的总胆红素的浓度。
对比例1
本实例描述的是一种双试剂抗高M蛋白的总胆红素，其组分如下：包括：
试剂1：
试剂2：
三乙醇胺 50mmol/L
偏钒酸钠 10mmol/L
Proclin 0.2％
在全自动生化分析仪上设定条件：温度：37℃，反应时间10分钟，起始吸光度0.005±0.005，测试主波长450nm，测试副波长548nm，被测总胆红素样本与试剂的体积比为1：30，反应为负反应，延迟时间60s，检测时间120s，理论K值为-900。
加入样本及试剂后使其充分混合，并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪，检测主波450nm下吸光度的下降幅度，从而得到所测样本的总胆红素的浓度。
效果例
实验数据及性能评价：
1)分析灵敏度：用以上方案配制不同批次试剂，同现有专利试剂一起进行分析灵敏度检测，其检测结果如下表1所示。
现有专利试剂：一种总胆红素检测试剂，该试剂包括稀释液和反应试剂，其中稀释液是由以下成分组成：
Tris缓冲液1(pH6.5)0.5mol/L；
Triton 5％(质量百分比)；
叠氮钠0.2％(质量百分比)；
维生素C氧化酶500KU/L；
其中所述反应试剂是由以下成分组成：
柠檬酸缓冲液2(pH3.0)：0.5mol/L；
氯化钠45g/L；
乙二胺四乙酸二钠2-10g/L；
吐温80 5-20ml/L；
十二烷基硫酸钠10-100g/L；
过硫酸钠100-200g/L；
硫酸0.1-2ml/L；
叠氮钠0.5g/L；
蔗糖20g/L。
表1
| 批次编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 现有发明分析灵敏度 | 0.1215 | 0.1218 | 0.1218 | 0.1247 | 0.1227 | 0.1215 |
| 具体实施案例二分析灵敏度 | 0.1265 | 0.1270 | 0.1220 | 0.1227 | 0.1215 | 0.1265 |
实验数据表明本发明具体实施案例二所得到的试剂其分析灵敏度较现有发明试剂相差不大。
2)相关性检测：用以上获得的试剂，同现有试剂一起检测40例临床病人样本并进行相关性比较(30例正常，10例异常)，结果如下表2所示。
表2
相关性数据如图1所示，结果表明，采用本发明提供的总胆红素检测试剂得到的检测结果，相关性数据良好。
3)重复性测试：在相同条件下，使用同一批号的试剂，在1天内对临床精密度样本、质控品重复测试20次。对每个样本求均值、SD，计算变异系数CV，结果如下表3和表4所示。
表3
表4
从实验结果的数据中可以清晰的看到本发明的具体实施案例在重复性上略优于现有发明。
4)高M蛋白样本测试：
1.将临床高M蛋白样本进行三种试剂共同检测，其检测结果如下表5所示。
表5
从实验结果的数据中可以清晰的看到现有发明在检测该类型特殊样本时由于受到干扰结果均是负值，因此本发明的具体实施案例在高M蛋白的检测上优于现有发明，同时对比例1的实验数据也表明TAGAT CH40的添加所起到的关键性作用。
2.样本反应曲线差异
从样本7的反应曲线(图2)可以很清晰的发现本发明的抗M蛋白干扰的性能要远优于现有发明，在试剂1段现有发明的反应曲线上升趋势明显，而本发明无被干扰的趋势，差异显著。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.试剂组合，其特征在于，包括试剂1和试剂2，其中：
所述试剂1包括柠檬酸、TAGAT CH40、乳化剂OP-09、日本花王20AB和NaN3，所述柠檬酸、TAGAT CH40、乳化剂OP-09、日本花王20AB和NaN3的质量比为(19.213～57.639)：(10～20)：(10～20):(50～100)：(0.975～1.95)所述试剂2包括三乙醇胺、氧化剂和Proclin，所述氧化剂包括亚硝酸钠或偏钒酸钠，所述三乙醇胺和氧化剂的质量比为(7.45～14.9)：(0.138～1.438)。
2.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，
所述试剂1包括：100～300mmol/L柠檬酸、10～20g/L TAGAT CH40、10～20g/L乳化剂OP-09、50～100g/L日本花王20AB和0.015～0.03mol/LNaN3；
所述试剂2包括：50～100mmol/L三乙醇胺、2～20mmol/L氧化剂和至少0.2wt％～0.5wt％Proclin。
3.根据权利要求1或2所述的试剂组合，其特征在于，所述试剂1中:
所述柠檬酸的浓度为100mmol/L、200mmol/L或300mmol/L；
所述TAGAT CH40的浓度为10g/L、15g/L或20g/L；
所述乳化剂OP-09的浓度为10g/L、15g/L或20g/L；
所述日本花王20AB的浓度为50g/L、75g/L或100g/L；
所述NaN3的浓度为0.015mol/L、0.02mol/L或0.03mol/L。
4.根据权利要求1或2所述的试剂组合，其特征在于，所述试剂2中:
所述三乙醇胺的浓度为50mmol/L、75mmol/L或100mmol/L；
所述抗氧化剂选自7mmol/L亚硝酸钠、10mmol/L偏钒酸钠或20mmol/L偏钒酸钠；
所述Proclin的浓度为0.2wt％。
5.根据权利要求1～4任一项所述的试剂组合，其特征在于，
所述试剂1包括水、200mmol/L柠檬酸、15g/LTAGAT CH40、15g/L乳化剂OP-09、75g/L日本花王20AB和0.02mol/LNaN3；
所述试剂2包括水、75mmol/L三乙醇胺、7mmol/L亚硝酸钠和0.2wt％Proclin。
6.根据权利要求1～4任一项所述的试剂组合，其特征在于，
所述试剂1包括水、100mmol/L柠檬酸、10g/LTAGAT CH40、10g/L乳化剂OP-09、50g/L日本花王20AB和0.015mol/LNaN3；
所述试剂2包括水、50mmol/L三乙醇胺、10mmol/L偏钒酸钠和0.2wt％Proclin。
7.根据权利要求1～4任一项所述的试剂组合，其特征在于，
所述试剂1包括水、200mmol/L柠檬酸、20g/LTAGAT CH40、10g/L乳化剂OP-09、50g/L日本花王20AB和0.015mol/LNaN3；
所述试剂2包括水、50mmol/L三乙醇胺、10mmol/L偏钒酸钠和0.2wt％Proclin。
8.根据权利要求1～4任一项所述的试剂组合，其特征在于，
所述试剂1包括水、300mmol/L柠檬酸、20g/LTAGAT CH40、20g/L乳化剂OP-09、100g/L日本花王20AB和0.03mol/LNaN3；
所述试剂2包括水、100mmol/L三乙醇胺、20mmol/L偏钒酸钠和0.2wt％Proclin。
9.权利要求1～8任一项所述的试剂组合在制备抗高M蛋白干扰的总胆红素检测试剂或试剂盒中的应用。
10.抗高M蛋白干扰的总胆红素检测试剂或试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～8任一项所述的试剂组合。
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