CN117343117A - 一种新型甜菊糖苷衍生物莱鲍迪苷m8的制备方法 - Google Patents

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饶义剑
张艳
杨丽烽
平千
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Abstract

本发明公开了一种新型甜菊糖苷衍生物莱鲍迪苷M8的制备方法，属于生物催化合成领域。本发明通过挖掘得到一种具有催化莱鲍迪苷D单糖基化活性的糖基转移酶UGT94E13，通过LC‑MS、1D和2D NMR波谱对产物的完整结构进行分析，得到全新的的甜菊醇糖苷——莱鲍迪苷D单糖基化衍生物莱鲍迪苷M8。本发明将糖基转移酶UGT94E13与蔗糖合酶AtSuSy构建偶联反应，实现以莱鲍迪苷D为底物高效催化合成莱鲍迪苷M8，高效合成5.71g/L的莱鲍迪苷M8，莱鲍迪苷M8产率达到88.52％，为莱鲍迪苷M8的生产提供了一条高效且绿色的新途径。

Description

一种新型甜菊糖苷衍生物莱鲍迪苷M8的制备方法
技术领域
本发明涉及一种新型甜菊糖苷衍生物莱鲍迪苷M8的制备方法，属于生物催化合成技术领域。
背景技术
近年来，全世界范围内龋齿、肥胖症、糖尿病、高血压、心血管疾病的患病风险不断增加，因此，消费者对低热量或无热量甜味剂的需求不断增加。从甜叶菊中提取得到的甜菊糖苷因其高甜度(是蔗糖的50-450倍)、无热量、安全，被认为是目前最具吸引力的甜味剂。此外，甜叶菊苷还被发现具有重要的药理活性，如降糖、降压、利尿、抗炎、抗肿瘤和免疫调节作用。如今已从甜叶菊中发现六十余种甜菊糖苷，其中甜菊糖(占叶子干重的5-10％)和莱鲍迪苷A(占叶子干重的2-4％)是含量最丰富的两种成分，也是目前市面上商用的甜菊糖苷类添加剂的主要成分。不幸的是，食用甜菊糖苷后会带有一种挥之不去的苦味，这也限制了甜菊糖苷更成功的商业化应用。
目前已发现甜菊糖苷C-13位和/或C-19位所连接的糖的数量和位置能明显影响甜味和口感，但具体的结构与甜味的关系还未得到充分解析。解决这一问题较为有效的方法是在不同位置引入一个单一的糖基单元。因此，相关研究者对甜菊糖苷进行了许多的化学与生物修饰，以阐明甜菊糖苷结构与功能的关系并期望能获得具有更优甜味品质的甜菊糖苷。到目前为止，已有多种酶被报道用于甜菊糖苷的糖基化修饰，如环糊精糖基转移酶、葡聚糖酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、果糖苷酶等。但这些酶存在产率较低、产物混杂等缺点，并且往往还会在底物上同时引入多个糖基单元，相较而言，UDP-糖基转移酶具有高转化率和区域选择性。因此，挖掘UDP-糖基转移酶以实现对莱鲍迪苷D不同位置的单糖基化，对阐明甜菊糖苷结构与甜味品质的关系具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明挖掘来自栀子的糖苷转移酶UGT94E13催化莱鲍迪苷D合成单糖基化衍生物莱鲍迪苷M8，该酶在大肠杆菌中能够实现可溶性高效表达，并且在尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)存在的情况下具有催化莱鲍迪苷D合成莱鲍迪苷M8的活性。并通过构建尿苷二磷酸葡萄糖UDPG循环再生体系，利用大肠杆菌裂解液实现高效生物合成莱鲍迪苷M8，为莱鲍迪苷M8的工业化应用提供了一种有效的方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一种化合物，所述化合物的化学结构为13-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-3-O-(6-O-β-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]ent-kaur-16-en-19-oic acid-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)ester]，化学结构式如下所示：
本发明的第二个目的是提供一种甜味剂组合物，所述甜味剂组合物含有所述化合物。
在一种实施方式中，所述甜味剂组合物还含有莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷O、菊糖、β-葡聚糖、罗汉果糖、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、三氯蔗糖、阿斯巴甜、安赛蜜或纽甜中的一种或多种。
在一种实施方式，所述甜味剂组合物中还含有矫味剂。
在一种实施方式，所述矫味剂为核糖、木糖及木糖醇、葡萄糖、山梨醇、乳糖、蔗糖、帕拉金糖、海藻糖、麦芽糊精或淀粉、乳酸、苹果酸和柠檬酸中的一种或多种。
本发明的第三个目的是提供所述化合物或所述甜味剂组合物在制备食品或药品中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述化合物或所述甜味剂组合物在制备甜味剂中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种食品，所述食品中含有所述化合物或所述甜味剂组合物。
本发明的第六个目的是提供一种合成所述化合物的重组菌，所述重组菌过表达糖基转移酶UGT94E13，所述糖基转移酶UGT94E13的氨基酸序列的NCBI登录号为MN944055.1。
在一种实施方式中，所述糖基转移酶UGT94E13的核苷酸序列的NCBI登录号为ARU08119.1。
在一种实施方式中，所述重组菌还表达蔗糖合酶。
在一种实施方式中，所述蔗糖合酶的氨基酸序列可以是任意来源的具有蔗糖合酶活性的氨基酸序列。
在一种实施方式中，所述蔗糖合酶的氨基酸序列的NCBI登录号为NP_001031915。
在一种实施方式中，所述蔗糖合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一种实施方式中，所述重组菌以大肠杆菌为宿主细胞。
在一种实施方式中，所述重组菌以pET系列为表达载体。
在一种实施方式中，所述重组菌以pET-21b(+)为表达载体。
本发明的第三个目的是提供一种催化合成所述化合物的方法，所述方法包括(a)或(b)：
(a)以UDP-葡萄糖为糖基供体，以莱鲍迪苷D为底物，利用糖基转移酶UGT94E13和蔗糖合酶催化反应；
(b)发酵培养所述重组菌，收集菌液，破碎后收集上清，以UDP-葡萄糖为糖基供体，以莱鲍迪苷D为底物，利用上清进行催化反应。
在一种实施方式中，所述催化反应的条件为：以2～10mmol/L莱鲍迪苷D、0-800mmol/L蔗糖、5-25％(v/v)DMSO、80～120mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液，80～120mmol/LNaCl为反应体系，20-50℃糖基化反应0-48h。
在一种实施方式中，所述缓冲液pH为5.5-9.0。
本发明还提供了糖基转移酶UGT94E13或所述重组菌或所述方法在制备所述化合物或含有所述化合物的产品中的应用。
有益效果：
本发明以UDPG为糖基供体，以莱鲍迪苷D为底物，利用糖基转移酶UGT94E13催化合成一个全新的甜菊醇糖苷——莱鲍迪苷D单糖基化衍生物莱鲍迪苷M8，为食品产业提供了一个新的甜味剂。为阐明甜菊糖苷结构与甜味的关系提供了一个新的类似物。进一步的，本发明将糖基转移酶UGT94E13与蔗糖合酶AtSuSy联用，构建UDPG循环再生体系。通过偶联反应体系条件优化，实现利用5.64g/L(5mmol/L)莱鲍迪苷D以88.52％的高产率合成5.71g/L的莱鲍迪苷M8。本发明构建的重组菌株共表达栀子来源的糖基转移酶和拟南芥来源的蔗糖合酶，利用重组菌株诱导表达后制备得到的细胞裂解液催化莱鲍迪苷D合成莱鲍迪苷M8，无需添加糖基供体，也不需要额外使用细胞通透剂，显著降低成本且绿色环保。
附图说明
图1显示糖基转移酶UGT94E13催化莱鲍迪苷D产生莱鲍迪苷M8的生物合成途径。
图2为实施例2中糖基转移酶UGT94E13蛋白表达及纯化分析。泳道1：Marker；泳道2：无IPTG诱导表达样品；泳道3：粗酶液；泳道4：粗酶液上清；泳道5：粗酶液沉淀；泳道6：纯化穿透液；泳道7：洗涤杂蛋白质样品；泳道8：目的蛋白质洗脱样品。
图3为实施例3中糖基转移酶UGT94E13催化莱鲍迪苷D合成莱鲍迪苷M8的UPLC分析图。
图4为实施例3中莱鲍迪苷D糖基化反应产物莱鲍迪苷M8质谱分析。
图5为实施例4中产物莱鲍迪苷M8的核磁共振波谱分析氢谱。
图6为实施例4中产物莱鲍迪苷M8的核磁共振波谱分析碳谱。
图7为实施例4中产物莱鲍迪苷M8的核磁共振波谱分析COSY谱。
图8为实施例4中产物莱鲍迪苷M8的核磁共振波谱分析TOCSY谱。
图9为实施例4中产物莱鲍迪苷M8的核磁共振波谱分析HSQC谱。
图10为实施例4中产物莱鲍迪苷M8的核磁共振波谱分析HMBC谱。
图11为实施例4中产物莱鲍迪苷M8的核磁共振波谱分析ROESY谱。
图12为实施例6中UGT94E13-AtSuSy糖基化偶联反应裂解液蛋白表达分析。泳道1：Marker；泳道2：无IPTG诱导表达样品；泳道3：粗酶液；泳道4：粗酶液上清；泳道5：粗酶液沉淀。
图13为实施例7中pH对糖基化偶联反应缓冲溶液的影响。
图14为实施例8中温度对糖基化偶联反应的影响。
图15为实施例9中DMSO浓度对糖基化偶联反应的影响。
图16为实施例10中蔗糖浓度对糖基化偶联反应的影响。
图17为实施例11中反应时间对糖基化偶联反应的影响。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。
下述实施例中涉及到的培养基：
LB固体培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，20g/L琼脂粉。
2×YT液体培养基：16g/L蛋白胨，10g/L酵母粉，5g/L NaCl。
下述实施例中涉及到的方法：
糖基转移酶酶学性质的测定：糖基转移酶UGT94E13对莱鲍迪苷D的动力学分析是在200μL反应体系中进行的，反应体系含有5mM UDPG、10mM MnCl2、50mM Tris pH 8.0和5μg纯化蛋白样品(糖基转移酶UGT94E13)，莱鲍迪苷D的浓度为0-0.5mM。反应温度为35℃，反应时间为2h，反应混合物在35℃下反应2h；然后在95℃条件下加热5min淬灭反应，并将反应混合物用2倍体积甲醇稀释；20000×g离心5min以去除沉淀物；取上层液体用0.22μm滤膜过滤后用于UPLC分析。
酶活的定义：在1h内合成1μM莱鲍迪苷M8所需的酶量。
莱鲍迪苷M8的产率的测定：利用二甲基亚砜溶解糖基化产物，制得5mM的母液。再利用甲醇稀释母液配制一系列浓度的溶液：0、0.1、0.25、0.5、0.75、1mM。所制溶液经0.22μM滤膜过滤后，利用UPLC对标准溶液进行分析，获得莱鲍迪苷M8浓度标准曲线方程为y＝2601014.39560x-3188.57143，R2＝0.99877。根据标准曲线换算得到莱鲍迪苷M8的产率。产率＝莱鲍迪苷M8实际产量/莱鲍迪苷M8理论产量。
Waters Acquity UPLC系统：采用BEH C18 1.7μM色谱柱(2.1×50mm)，液相条件为：有机相--乙腈、水相--超纯水；流速0.3mL/min；柱温40℃；紫外检测波长210nm；检测程序：0-1min 15％有机相、6min40％有机相、7-8min 15％有机相。
实施例1糖基转移酶UGT94E13基因的获取和重组菌株的构建
从Genbank中下载栀子糖基转移酶氨基酸序列(登录号：MN944055.1)及核苷酸序列(登录号：ARU08119.1)，由亦欣生物科技有限公司进行基因合成并连接至载体pET-21b(+)的多克隆酶切位点，得到重组质粒pET-21b(+)-UGT94E13。
将所得质粒pET-21b(+)-UGT94E13进行测序鉴定并转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，采用含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板进行筛选，得到重组菌株E.coli BL21(DE3)pET-21b(+)-UGT94E13。
实施例2重组菌株的诱导表达及目的蛋白纯化
将实施例1中构建的重组菌株E.coli BL21(DE3)pET-21b(+)-UGT94E13接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的1L 2×YT液体培养基中，在135rpm，37℃条件下培养至OD600为0.6-0.8后，培养温度降至18℃，加入终浓度为0.1mmol/L的异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导培养8h。
将诱导表达的菌液离心(7000rpm，7min，4℃)，弃上清，收集菌体。将菌体用裂解缓冲液(50mmol/LTris-HCl pH 8.0，300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，10％甘油)按照1g菌体每10mL裂解缓冲液进行重悬。利用高压匀浆机进行破碎，然后将破碎后的菌液进行离心(40000×g，30min)，取上清即获得粗酶液。
将粗酶液利用Ni+柱进行亲和层析纯化，上样结束后，10倍体积裂解液冲洗杂蛋白，用洗脱缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，10％甘油)进行目的蛋白洗脱。收集洗脱的目的蛋白，通过脱盐柱(HistrpTM 5mL Desalting)进行脱盐，脱盐缓冲液(25mmol/L Tris-HCl，150mmol/LNaCl，10％甘油)。脱盐后浓缩至10mg/mL，进行后续反应。纯化的蛋白通过10％ SDS-PAGE凝胶电泳进行检测，结果见图2，成功获得目的条带清晰蛋白大小准确的纯酶。测得UGT94E13对莱鲍迪苷D的Km值为0.89±0.05mM，kcat值为0.33±0.08min-1。并测得纯酶UGT94E13的酶活为360mU/mg。
实施例3UGT94E13催化莱鲍迪苷D反应合成莱鲍迪苷M8的糖基化反应
将实施例2获得的纯化后的糖基转移酶UGT94E13用于糖基化反应(图1)。
糖基化反应在200μL反应体系中进行，反应体系如下：50mmol/L Tris pH 8.0，5mmol/L UDPG，10mmol/L MnCl2，0.5mmol/L莱鲍迪苷D，实施例2中所获得纯酶UGT94E13浓度为5μM。在35℃下反应4h。然后在95℃条件下加热5min淬灭反应，并将反应混合物用2倍体积甲醇稀释；20000×g离心5min以去除沉淀物；取上层液体用0.22μm滤膜过滤后用于UPLC和LC-MS分析。Waters Acquity UPLC系统采用BEH C18 1.7μM色谱柱(2.1×50mm)，液相条件为：有机相-乙腈、水相-超纯水；流速0.3mL/min；柱温40℃；紫外检测波长210nm；检测程序：0-1min 15％有机相、6min 40％有机相、7-8min 15％有机相。
通过液相分析可得知，结果如图3所示，与莱鲍迪苷D标准品对比可知，在反应体系中有明显的新产物生成，并对反应混合物进行质谱(MS)分析(图4)，LC-MS的负离子模式结果显示，在m/z 1289.5421处有一个[M-H]-离子的峰，对应分子式C56H90O33，表明产物是莱鲍迪苷D的单糖基衍生物。
实施例4新型莱鲍迪苷D单糖基化衍生物的结构鉴定
利用糖基转移酶UGT94E13用于大规模(100mL)糖基化反应制备新型衍生物，反应体系如下：2mM Reb D，10μM糖基转移酶，5mM UDPG，10mM MnCl2，50mM Tris pH8.0。反应混合物在35℃下反应24h，然后在95℃条件下加热5min淬灭反应，20000×g离心5min以去除沉淀物；取上层液体用0.22μm滤膜过滤后，使用半制备高效液相色谱系统进行纯化，系统采用Shim-pack GIST C18色谱柱(10×250mm，5μm，SHIMADZU，Japan)，液相条件为：有机相--乙腈、水相--超纯水；流速5mL/min；时间程序：0-28min 23％有机相；28.5-30.5min 60％有机相；31-35min 23％有机相。柱温：40℃；紫外检测波长210nm。所得样品用氘代吡啶溶解，通过1D(1H和13C)和2D NMR(COSY、TCOSY、HSQC、HMBC和ROESY)波谱对产物的完整结构进行分析。用Bruker Avance III 600MHz spectrometer(Bruker BioSpin,Karlsruhe,Germany)收集数据，1H谱检测频率为600MHz，13C谱为151MHz。1H-NMR具有典型的甜菊糖苷信号特征。化学位移小于2.8ppm的峰来自于萜烯苷元，化学位移从3.6-6.3ppm的峰来自于糖环。
从1H和1H-13C HSQC波谱显示在δH 6.29(δC 93.45)、δH 5.53(δC 104.28)、δH 5.46(δC 105.43)、δH 5.25(δC 104.37)、δH 5.06(δC 97.38)、δH 4.81(δC 104.26)存在6个异常质子，证实产物的结构中存在6个糖单元。同时，在δH 6.29(7.3Hz)、δH 5.53(7.8Hz)、δH5.46(7.7Hz)、δH 5.25(7.9Hz)、δH5.06(7.5Hz)、δH 4.81(7.7Hz)处观察到高J偶极矩表明6个葡萄糖残基均为β构型。通过1D和2D HMR对新衍生物的H和C的化学位移进行了详细的归属(图5～图11)，如表1所示。确定新产物为莱鲍迪苷D二萜核心的C-13位的葡萄糖基上通过β-1,6-键连接了一个葡萄糖基，将其命名为莱鲍迪苷M8。结构式为13-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-3-O-(6-O-β-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)oxy]ent-kaur-16-en-19-oic acid-[(2-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyranosyl)ester]。
表1 1H和13C化学位移归属表(pyridine-d5)
实施例5糖基转移酶和蔗糖合酶重组质粒及重组菌株的构建
从Genbank中下载来源于拟南芥的蔗糖合酶AtSuSy氨基酸序列(登录号:NP_001031915)以及其核酸序列(登录号:NM_001036838.2)，由亦欣生物科技有限公司进行大肠杆菌偏好的密码子优化及基因合成。将编码蔗糖合酶基因AtSuSy连接至pACYCDuet-1的多克隆酶切位点，构建重组质粒pACYCDuet-1-AtSuSy，将所得质粒进行测序鉴定，并与pET-21b(+)-UGT94E13共转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，采用含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的LB固体平板进行筛选，得到重组菌株E.coli BL21(DE3)UGT94E13-AtSuSy。
实施例6糖基转移酶和蔗糖合酶偶联反应细胞裂解液的制备
将实施例5中构建的重组菌株E.coli BL21(DE3)UGT94E13-AtSuSy接种于添加含有100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素的5L 2×YT培养基中，37℃、135rpm振荡培养。待菌体生长至OD600值为0.6-0.8时，降温至18℃，向其中添加终浓度为0.2mM IPTG，继续在18℃诱导表达8h后，7000×g离心7min，收集菌体，菌体用裂解缓冲液(100mM K2HPO4-KH2PO4(KPi)pH 8.0,100mM NaCl)洗涤三次然后重悬。细胞用高压匀浆机破碎。立即用40000×g离心30min，除去细胞碎片。取上清即获得偶联反应细胞裂解液。并进行蛋白胶检测。
结果如图12所示，结果显示糖基转移酶和蔗糖合酶都能够良好表达。细胞裂解液中蛋白浓度利用Nano-Drop 2000UV-Vis分光光度计进行测定。制备的细胞裂解液进行分装后-80℃保存，或作为粗酶液直接用于偶联反应。
实施例7pH对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响
将糖基化偶联反应体系置于不同pH值的缓冲液中进行反应，测定pH对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响，选择的缓冲液为100mM KPi pH 5.5-8.0(含有100mMNaCl)、100mM Tris pH 7.0-9.0(含有100mM NaCl)。
将按照实施例6所述制备偶联反应细胞裂解液，糖基化偶联反应体系为1mL，其中含有40mg/mL粗酶，5mM Reb D，200mM蔗糖，5％二甲基亚砜(v/v)。反应混合物在35℃下反应3h；然后在95℃条件下加热5min淬灭反应，并将反应混合物用4倍体积甲醇稀释；20000×g离心5min以去除沉淀物；取上层液体用0.22μm滤膜过滤后用于UPLC分析。液相检测方法按照实施例3中所述进行，并计算莱鲍迪苷M8的产率，结果显示当缓冲液为100mmol/L KPi pH8.0，100mmol/L NaCl时，莱鲍迪苷M8的产率可以达到32％以上(图13)。
实施例8温度对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响
将糖基化偶联反应体系置于不同温度(20～50℃)中进行反应，测定温度对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响。
按照实施例6所述制备偶联反应细胞裂解液，偶联反应体系为1mL，其中含有40mg/mL粗酶，5mM Reb D，200mM蔗糖，5％二甲基亚砜(v/v)，100mM KPi pH 8.0(含有100mMNaCl)。反应混合物在20-50℃下反应3h；然后在95℃条件下加热5min淬灭反应，并将反应混合物用4倍体积甲醇稀释；20000×g离心5min以去除沉淀物；取上层液体用0.22μm滤膜过滤后用于UPLC分析。液相检测方法按照实施例3中所述进行，并计算莱鲍迪苷M8的产率，结果显示当温度在40～45℃时，莱鲍迪苷M8的产率可以达到43％以上(图14)。
实施例9DMSO浓度对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响
将糖基化偶联反应体系中添加不同浓度的DMSO(5％-25％(v/v))中进行反应，测定DMSO浓度对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响。
按照实施例6所述制备偶联反应细胞裂解液，偶联反应体系为1mL，其中含有40mg/mL粗酶，5mM Reb D，200mM蔗糖，二甲基亚砜(5％-25％(v/v))，100mM KPi pH 8.0(含有100mM NaCl)。反应混合物在35℃下反应3h；然后在95℃条件下加热5min淬灭反应，并将反应混合物用4倍体积甲醇稀释；20000×g离心5min以去除沉淀物；取上层液体用0.22μm滤膜过滤后用于UPLC分析。液相检测方法按照实施例3中所述进行，并计算莱鲍迪苷M8的产率，结果显示当DMSO浓度在5％～15％(v/v)时，莱鲍迪苷M8的产率维持稳定(图15)。
实施例10蔗糖浓度对糖基转移酶和蔗糖合酶偶联反应的影响
将糖基化偶联反应体系中添加不同浓度的蔗糖(50-800mmol/L)中进行反应，测定蔗糖浓度对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响。
按照实施例6所述制备偶联反应细胞裂解液，偶联反应体系为1mL，其中含有40mg/mL粗酶，5mM Reb D，0-800mM蔗糖，5％二甲基亚砜，100mM KPi pH 8.0(含有100mM NaCl)。反应混合物在35℃下反应3h；然后在95℃条件下加热5min淬灭反应，并将反应混合物用4倍体积甲醇稀释；20000×g离心5min以去除沉淀物；取上层液体用0.22μm滤膜过滤后用于UPLC分析。液相检测方法按照实施例3中所述进行，并计算莱鲍迪苷M8的产率，结果显示当蔗糖浓度为400mmol/L时，莱鲍迪苷M8的产率可以达到34％以上(图16)。
实施例11反应时间对糖基转移酶和蔗糖合酶偶联反应的影响
将糖基化偶联反应体系反应不同的时间(0-24h)，测定蔗糖浓度对糖基转移酶和蔗糖合酶糖基化偶联反应的影响。
按照实施例6所述制备偶联反应细胞裂解液，偶联反应体系为20mL，其中含有40mg/mL粗酶，5mM Reb D，400mM蔗糖，5％二甲基亚砜(v/v)，100mM KPi pH 8.0(含有100mMNaCl)，45℃条件下反应，反应时间优化范围为0-24h。在一系列时间点时(0-24h，时间间隔为3h)取样，然后在95℃条件下加热5min淬灭反应，并将反应混合物用4倍体积甲醇稀释；20000×g离心5min以去除沉淀物；取上层液体用0.22μm滤膜过滤后用于UPLC分析。液相检测方法按照实施例3中所述进行，并计算莱鲍迪苷M8的产率，结果显示最终在反应12h时，以5mmol/L莱鲍迪苷D浓度时，以88.52％的产率获得5.71g/L的莱鲍迪苷M8(图17)。
实施例12莱鲍迪苷M8的甜味测试
使用莱鲍迪苷D作为对照进行莱鲍迪苷M8的甜味测试。莱鲍迪苷D样品购自毕得医药。其中莱鲍迪苷M8纯度为98％。
SA402B电子舌系统用于糖基化产物的甜味分析。将20mg Reb D或20mg糖基化产物充分溶解在50mL超纯水(浓度为400ppm)中，配制甜味分析所用样品溶液；SA402B电子舌系统采用脂质膜传感器(GL1)和参比电极(Ag/AgCl)，使用时提前利用参比溶液(30mM KCl和0.3mM酒石酸)浸泡传感器至少24h；然后将活化后的传感器在参比溶液中平衡后依次浸没于参比溶液和样品溶液中，分别测得膜电势Vr和Vs，按照如下公式计算味觉信号值(R)，每个样品溶液循环测定4次，取后三次数据的平均值作为测试结果：
R＝Vs-Vr (1)
如表2所示，分析结果表明Reb M8的R(味觉信号值)值高于Reb D，即Reb M8的甜味高于Reb D，说明C-13位的单β-1,6-O-糖基化均能有效改善Reb D的甜味性质，为新型甜菊糖苷类天然甜味剂的开发提供了重要信息。
表2 Reb M8和Reb D的电子舌分析
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种化合物，其特征在于，所述化合物的化学结构式如下所示：
2.一种甜味剂组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的化合物。
3.根据权利要求2所述的甜味剂组合物，其特征在于，含有莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷O、菊糖、β-葡聚糖、罗汉果糖、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、三氯蔗糖、阿斯巴甜、安赛蜜或纽甜中的一种或多种。
4.权利要求1所述化合物，或权利要求2或3所示甜味剂组合物在制备食品或药品中的应用。
5.权利要求1所述化合物，或权利要求2或3所示甜味剂组合物在制备甜味剂中的应用。
6.一种合成权利要求1所述化合物的重组菌，其特征在于，表达糖基转移酶UGT94E13；所述糖基转移酶UGT94E13氨基酸序列的NCBI登录号为MN944055.1。
7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌还表达蔗糖合酶。
8.根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于，所述蔗糖合酶的氨基酸序列可以是任意来源的具有蔗糖合酶活性的氨基酸序列。
9.一种合成权利要求1所述化合物的方法，其特征在于，所述方法包括(a)或(b)：
(a)以UDP-葡萄糖为糖基供体，以莱鲍迪苷D为底物，利用糖基转移酶UGT94E13和蔗糖合酶催化反应；
(b)发酵培养权利要求6～8任一所述重组菌，收集菌液，破碎后收集上清，以UDP-葡萄糖为糖基供体，以莱鲍迪苷D为底物，利用上清进行催化反应。
10.糖基转移酶UGT94E13或权利要求6～8任一所述重组菌或权利要求9所述方法在制备权利要求1所述化合物或含有权利要求1所述化合物的产品中的应用；所述糖基转移酶UGT94E13氨基酸序列的NCBI登录号为MN944055.1。
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