CN117338856A - 一种黑枸杞花色苷组合物的制备方法和产品及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黑枸杞花色苷组合物的制备方法和产品及其应用，通过本发明制备方法制得的花色苷，所含黑枸杞花色苷组分种类多、含量高，分离效果好；黑枸杞花色苷对氧化损伤的细胞具有保护作用，增加氧化损伤细胞的存活率，并能激活抗氧化酶防御体系，抑制细胞中毒性物质MDA的生成，降低炎症相关基因Caspase‑1及炎症因子1L‑1β的表达水平，从而显著抑制细胞的氧化损伤。

Description

一种黑枸杞花色苷组合物的制备方法和产品及其应用
技术领域
本发明属于植物活性成分提取领域，具体涉及到一种黑枸杞花色苷组合物的制备方法和产品及其应用。
背景技术
黑枸杞(Lycium ruthenicum Murray)，属茄科、枸杞属，被作为一种珍贵的药材广泛使用，其具有抗氧化、改善肠道微生物、镇痛、降血糖、调节免疫力等作用。黑枸杞中富含可溶性糖、花青素、生物碱、有机酸、酚酸、黄酮类化合物、脂肪酸和亚精胺衍生物，因其独特的营养和功能特性而闻名。在这些成分中，花色苷具有广泛的生理和生物活性，已被医药和食品领域广泛关注。
黑枸杞中含有丰富的花青素，被誉为花青素之王，然而花青素在自然界中的状态并不稳定，需要与糖元结合，从而形成糖苷类化合物，因此称这种形态的物质为花色苷。植物中的花色苷多以溶剂提取法进行提取，但由于花色苷在酸性条件下更为稳定，大多采用酸化的醇溶液作为提取剂。目前，关于不同浓度乙醇洗脱液与花色苷成分差异变化的关系的研究却很少，同时黑枸杞花色苷成分差异变化则会致使其功效存在较大差异。
氧化应激是指机体受到外源性或内源性损伤后，使促氧化剂和抗氧化剂之间缺乏平衡而产生的现象。当机体内活性氧含量超过一定范围，生物体自身的防御系统不足以抵抗，便会产生氧化应激反应，会对机体中蛋白质、碳水化合物、脂质和DNA等生物大分子造成氧化损伤，与癌症、心血管疾病、肾脏疾病等有着密切联系。
目前，关于黑枸杞中花色苷的抗氧化活性和抗癌作用尚无报道。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种黑枸杞花色苷组合物的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种黑枸杞花色苷组合物的制备方法，包括，
将黑枸杞预处理，制得预处理后的黑枸杞原料；
将预处理后的黑枸杞原料加入乙醇溶液中，超声提取、静置、过滤、除醇，制得黑枸杞提取液；
将黑枸杞提取液通过大孔树脂纯化、冷冻干燥得到所述黑枸杞花色苷；
其中，大孔树脂为D101大孔树脂柱，洗脱液为15％浓度乙醇溶液，洗脱量为2个柱体积，洗脱流速为每小时1个柱体积，洗脱时间为2小时。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述黑枸杞预处理，包括，将黑枸杞清洗、粉碎、过筛、脱脂、烘干、二次粉碎，制得预处理后的黑枸杞原料。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述脱脂，包括将过筛后的原料浸泡在纯石油醚中超声处理20min，超声功率为100W。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述粉碎、过筛，其中，过筛为过60目筛。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述二次粉碎，其中，过筛为过60目筛。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述超声提取，其中，超声功率为100W，超声提取时间为20min。
作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述过滤为真空减压过滤，其中，滤膜孔径大小为0.2μm。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种黑枸杞花色苷组合物的制备方法制得的黑枸杞花色苷组合物，所述黑枸杞花色苷组分包括飞燕草素、锦葵色素、矢车菊素、天竺葵素、芍药色素和矮牵牛素。
本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种黑枸杞花色苷组合物在制备具有抗肿瘤活性及对正常细胞的氧化应激保护作用的药物中的应用。
本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种黑枸杞花色苷组合物在制备具有抗肿瘤活性表现为抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡药物中的应用。
本发明有益效果：
(1)与现有技术相比，通过本发明制备方法制得的花色苷，所含黑枸杞花色苷组分种类多、含量高，分离效果好；黑枸杞花色苷对氧化损伤的细胞具有保护作用，增加氧化损伤细胞的存活率，并能激活抗氧化酶防御体系，抑制细胞中毒性物质MDA的生成，降低炎症相关基因Caspase-1及炎症因子1L-1β的表达水平，从而显著抑制细胞的氧化损伤。
(2)本发明制得的黑枸杞花色苷可抑制Hela、Neuro-2a、A549细胞增殖，且随着黑枸杞花色苷含量和种类的增加，细胞凋亡率也在不断增大，黑枸杞花色苷可降低肿瘤细胞中线粒体膜电位；黑枸杞花色苷可促进促凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达，及使得Bcl-2抑制凋亡基因下调，从而促进细胞凋亡。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明实施例中黑枸杞花色苷总提取物HPLC图谱，其中，(a)为LRA-15的HPLC图谱，(b)为LRA-60的HPLC图谱，(c)为LRA-90的HPLC图谱。
图2为本发明实施例中黑枸杞花色苷组分分类含量分布及质谱数据的PCA得分图，其中，(a)为花色苷组分分类含量分布图，(b)为质谱数据的PCA得分图。
图3为本发明实施例中黑枸杞花色苷对NRK、BRL细胞中SOD、GPX、CAT活力的影响图，其中，(a)为黑枸杞花色苷对NRK细胞中SOD、GPX、CAT活力的影响，(b)为黑枸杞花色苷对BRL细胞中SOD、GPX、CAT活力的影响，**.与对照组比较差异极显著(P<0.01)；#.与损伤组比较差异显著(P<0.05)；##.与损伤组比较差异极显著(P<0.01)；L：25μg/mL，M：50μg/mL，H：100μg/mL。
图4为本发明实施例中黑枸杞花色苷对NRK、BRL细胞中Caspase-1、1L-1β基因表达的影响图，其中，(a)为黑枸杞花色苷对NRK细胞中Caspase-1、1L-1β基因表达的影响，(b)为黑枸杞花色苷对BRL细胞中Caspase-1、1L-1β基因表达的影响。
图5为本发明实施例中黑枸杞花色苷对Hela、Neuro-2a、A549抗细胞增殖活性影响图，(a)为黑枸杞花色苷对Hela抗细胞增殖活性影响，(b)为黑枸杞花色苷对Neuro-2a细胞抗增殖活性影响，(c)为黑枸杞花色苷对A549细胞抗增殖活性影响。
图6为本发明实施例中黑枸杞花色苷对A549抗细胞增殖活性影响图，其中，(a)为黑枸杞花色苷对Hela细胞凋亡的影响，(b)为黑枸杞花色苷对Hela细胞凋亡的影响，(c)为黑枸杞花色苷对A549细胞凋亡的影响，A：空白、B：LRA-15250μg/mL、C：LRA-15500μg/mL、D：LRA-15750μg/mL、E：LRA-60250μg/mL、F：LRA-60500μg/mL、J：LRA-60750μg/mL、H：LRA-90250μg/mL、I：LRA-90500μg/ml、J：LRA-90750μg/mL。
图7为本发明实施例中黑枸杞花色苷对Hela、Neuro-2a、A549细胞线粒体膜电位的影响，其中，(a)为黑枸杞花色苷对Hela细胞线粒体膜电位的影响，(b)为黑枸杞花色苷对Neuro-2a细胞线粒体膜电位的影响，(c)为黑枸杞花色苷对A549细胞线粒体膜电位的影响，A：空白、B：阳性对照、C：LRA-15250μg/mL、D：LRA-15750μg/mL、E：LRA-151250μg/mL、F：LRA-60250μg/mL、G：LRA-60750μg/mL、H：LRA-601250μg/mL、I：LRA-90250μg/mL、J：LRA-90750μg/mL、K：LRA-901250μg/mL。
图8为本发明实施例中黑枸杞花色苷对Hela、Neuro-2a、A549细胞凋亡相关基因表达的影响，其中，(a)为黑枸杞花色苷对Hela细胞凋亡相关基因表达的影响图，(b)为黑枸杞花色苷对Neuro-2a细胞凋亡相关基因表达的影图，(c)为黑枸杞花色苷对A549细胞凋亡相关基因表达的影响。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。本发明中的原料，均为普通市售产品。
实施例1
(1)黑枸杞花色苷制备方法
将黑枸杞进行清洗、粉碎、过60目筛、石油醚脱脂(在纯石油醚中超声处理20min，超声功率为100W)、烘干、二次粉碎处理后过60目筛，用盐酸将浓度为80％乙醇溶液的pH调至3.0，料液比1:5，超声提取20min，静置过夜，收集上清后用0.2μm的水性膜抽滤；
将所得的滤液进行旋蒸除醇，并选择15％、60％、90％浓度乙醇溶液作为洗脱液将粗提的黑枸杞花色苷从D101大孔树脂柱中洗脱纯化出来，其中，洗脱量为2个柱体积，洗脱流速为每小时1个柱体积，洗脱时间为2小时；
再分别将其冷冻干燥，冻干工艺为-80℃预冻24h，真空冷冻48h(冷阱温度-60℃，真空度45Pa，自动升华)，得到所述黑枸杞花色苷，分别命名为LRA-15、LRA-60、LRA-90。
黑枸杞花色苷含量检测结果见图1。
其中，LRA-15总花色苷含量为57.0mg/g，LRA-60总花色苷含量为6.9mg/g，LRA-90总花色苷含量为6.1mg/g。可知LRA-15总花色苷含量远高于LRA-60与LRA-90，由此推断15％浓度乙醇洗脱液更有利于花色苷成分的纯化。
(2)黑枸杞花色苷定性定量分析(HPLC-MS/MS)
样本处理：称取50mg的花色苷样本，溶解于500μL 50％甲醇水溶液(含0.1％盐酸)中；涡旋5min，超声5min，12000r/min，4℃离心3min，吸取上清，重复操作1次；合并两次上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤样品，并保存于进样瓶中，用于HPLC-MS/MS分析。
色谱条件：ACQUITY BEH C18(2.1mm×100mm，1.7μm)；A相为0.1％甲酸超纯水，B相为0.1％甲酸甲醇；梯度洗脱程序：0-6min；B相比例为5％，6-12min增至50％，12-14min增至95％，14min降至5％，并平衡2min；流速：0.35mL/min；柱温：40℃；进样量：2μL。
质谱条件：电喷雾离子源(ESI)温度550℃，正离子模式下质谱电压5500V，气帘气(CUR)35psi。
黑枸杞花色苷组分定性定量检测结果见表1。
LRA-15共检测出花色苷类成分25种，其中飞燕草素7种，锦葵色素5种，矢车菊素2种，天竺葵素4种，芍药色素2种，矮牵牛素5种；LRA-60共检测出花色苷类成分20种，其中飞燕草素6种，锦葵色素4种，矢车菊素2种，天竺葵素3种，芍药色素3种，矮牵牛素2种；LRA-90共检测出花色苷类成分23种，其中飞燕草素6种，锦葵色素5种，矢车菊素2种，天竺葵素2种，芍药色素3种，矮牵牛素5种。由此可知，三组样本中LRA-15含有的花色苷种类最多。
表1
注：含量单位为mg/kg，N/A表示未检测到该物质，原因可能为样本中该物质含量低于仪器检出限或者样本中不含该物质。Index为检测指标；RT为保留时间；Equation为线性方程；r为相关系数。
将HPLC-MS/MS测得样本组分数据，进行分类处理得图2(a)。结果表明LRA-15除天竺葵色素含量低于LRA-60以外，其余花色苷类组分含量均高于LRA-60、LRA-90，其中飞燕草素、锦葵色素、矢车菊素、天竺葵素、芍药花色素、矮牵牛素分别在LRA-15中占比10.99％、39.59％、1.78％、0.14％、0.52％、46.98％，在LRA-60中占比6.46％、55.22％、0.78％、0.76％、1.29％、35.49％，在LRA-90中占比11.14％、32.61％、0.86％、0.35％、1.09％、53.95％，由此可知飞燕草素、锦葵色素、矮牵牛素是组成LRA-15、LRA-60、LRA-90的主要成分。见图2(b)，通过将HPLC-MS/MS测得三组花色苷组分数据进行主成分分析(PrincipalComponent Analysis)后，发现LRA-60、LRA-90都与LRA-15之间的差异性大，且LRA-60与LRA-15之间的差异性大于LRA-90与LRA-15，LRA-60与LRA-90之间的差异性最小。说明不同浓度乙醇洗脱液会使花色苷组分之间产生差异。
实施例2
黑枸杞花色苷对NRK、BRL细胞氧化应激损伤的抑制：
细胞培养：NRK和BRL细胞均使用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基，在37℃，5％CO2条件下进行培养，待细胞贴壁至80％以上进行传代、冻存。氧化应激损伤模型的建立：将细胞悬液接种于含有不同浓度H2O2的完全培养基，并设置空白组，每组6个重复，分别干预3、6h，加入10μL CCK-8试剂，培养2h，450nm处测定吸光度。
(1)黑枸杞花色苷对NRK、BRL细胞中SOD、GPX、CAT、MDA的影响
SOD、GPX、CAT是细胞内抗氧化酶，可有效抵御活性氧引起的细胞损伤。MDA是氧自由基与脂质发生反应所得的最终产物，具有细胞毒性，会引起细胞内蛋白质、核酸等大分子物质发生交联聚合现象，是反应机体抗氧化能力的重要指标。
取对数生长期NRK、BRL细胞，调整细胞密度至1×105cell/mL，接种至10cm的细胞培养皿中，置培养箱内孵育至细胞贴壁60％左右，加入不同浓度的蒸馏水稀释的黑枸杞花色苷，并设置对照组(不加药物且不经过H2O2诱导)、损伤组(只经过H2O2诱导)、阳性组(加10μmol/L维生素E并经H2O2诱导)、保护组(加药物并经H2O2诱导)，干预24h后，取出造模，弃培养液，按照SOD、GPX、CAT、MDA试剂盒说明书进行后续步骤。
如图3所示，黑枸杞花色苷处理损伤细胞后，与不用花色苷处理的损伤细胞相比，NRK、BRL细胞内的SOD、GPX、CAT抗氧化酶活性有所升高，MDA含量在不断减少(P<0.01)。LRA-15对SOD酶活的影响高于同浓度其余两种花色苷，且在CAT活力测定中，LRA-15促进CAT分泌水平相比其他两种花色苷效果最好，而LRA-90与损伤组相比较，虽一定程度促进了CAT的分泌，但效果不显著(P>0.05)。说明黑枸杞花色苷可有效增强NRK、BRL细胞内抗氧化酶的活性，并减少氧自由基发生反应时毒性物质的产生。
(2)黑枸杞花色苷对NRK、BRL细胞中Caspase-1、1L-1β的影响
在细胞发生炎症时，Caspase-1可与炎性体结合从而被激活，可加工1L-1β、1L-18等炎症因子使其成熟并释放，在炎症反应中起着重要作用。测定细胞中Caspase-1、1L-1β表达水平，可有效评估细胞内炎症反应的状态。
取对数生长期NRK、BRL细胞，调整细胞密度至1×105cell/mL，接种至10cm的细胞培养皿中，置培养箱内孵育至细胞贴壁60％左右，加入不同浓度的蒸馏水稀释的黑枸杞花色苷，并设置对照组(不加药物且不经过H2O2诱导)、损伤组(只经过H2O2诱导)、阳性组(加10μmol/L维生素E并经H2O2诱导)、保护组(加药物并经H2O2诱导)，干预24h后，取出造模，弃培养液，按照Caspase-1试剂盒、IL-1β酶联免疫吸附测定试剂盒说明书进行试验。
由图4(a)所示，黑枸杞花色苷可降低Caspase-1、1L-1β表达水平。LRA-15及LRA-60处理损伤的NRK细胞后，其Caspase-1表达水平与损伤组相比较，差异极显著(P<0.01)；在1L-1β表达水平测定中，LRA-15与LRA-90随浓度增加，其表达水平不断降低，且LRA-15降低1L-1β表达水平能力优于LRA-90。由图4(b)所示黑枸杞花色苷可抑制氧化损伤BRL细胞中Caspase-1、1L-1β的表达，在三种花色苷中，LRA-15抑制Caspase-1表达水平的能力最强，其次是LRA-60，LRA-90抑制Caspase-1表达水平的能力相比其他两种花色苷较弱；在1L-1β表达水平测定中，随着黑枸杞花色苷及多糖的浓度增加，与1L-1β表达水平呈负相关，其中LRA-15抑制1L-1β表达水平的能力是三种花色苷中最强的。由上可知，黑枸杞花色苷可抑制氧化损伤细胞中炎症相关因子分泌，从而起到对氧化损伤细胞的保护作用。
实施例3
黑枸杞花色苷抗肿瘤活性的研究：
细胞培养：人宫颈癌细胞(Hela Cells)、人肺腺癌细胞(A549 Cells)、小鼠神经母细胞瘤细胞(Neuro-2a Cells)细胞均使用含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM培养基，在37℃，5％CO2条件下进行培养，细胞贴壁至80％以上进行传代、冻存。
(1)抗增殖活性测定
通过CCK-8试验测定三种花色苷的抗肿瘤增殖活性。将对数生长期的Hela、Neuro-2a、A549细胞调整至密度为5×104个/mL的细胞悬液，以每孔100μL接种至96孔板中，并设置空白孔与对照孔，置37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，弃培养基，加入完全培养基稀释不同浓度花色苷及多糖溶液，将培养板放置培养箱内分别继续孵育12、24h后，更换新鲜培养基，随后每孔加入10μLCCK-8溶液，在放置培养箱继续孵育1.5h，测定在450nm处的吸光值。
如图5所示，黑枸杞花色苷对Hela、Neuro-2a、A549细胞具有增殖抑制作用，并随浓度增加，抑制率不断升高。在三种花色苷对A549细胞抗增殖活性的研究中可以发现LRA-15抗增殖能力最强，其次是LRA-60，最后是LRA-90。
(2)Hoechst 33258染色观察细胞凋亡
取对数生长期的细胞，利用完全培养基将细胞密度调整至5×104个/mL，以每孔2mL接种至6孔板中，37℃，5％CO2培养箱孵育24h，弃培养基，加入含有不同浓度的花色苷及多糖的培养基并设置空白组，孵育24h后，弃培养基，用PBS洗2次，每次3-5min，每孔加入500μL的Hoechst 33258染色液，在避光并适宜细胞培养的温度下染色20-30min，弃染色液，用PBS洗涤3次。在荧光显微镜405nm发射光下观察细胞染色情况。
如图6所示，LRA-15、LRA-60、LRA-90都随着浓度的增高，致密性荧光斑点增多，细胞密度不断减小。通过对比三种花色苷作用Hela细胞时的荧光现象和细胞密度，发现LRA-15对Hela、Neuro-2a、A549细胞凋亡的影响最大，随后依次是LRA-60、LRA-90。表明黑枸杞花色苷会促进肿瘤细胞的凋亡。
实施例4
(1)线粒体膜电位(MMP)测定
通过JC-1红绿荧光转变，检测线粒体膜电位变化，可以判断细胞是否发生凋亡现象。将对数生长期的细胞密度调整至5×104个/mL，每孔2mL接种至6孔板中，37℃，5％CO2培养箱培养24h，弃培养基，加入含有不同浓度的花色苷及多糖的培养基，并设置空白组、阳性对照组(CCCP)，培养24h，弃培养基后，用PBS洗2次。然后加入500μL的JC-1工作液，于37℃，5％CO2培养箱孵育20min，弃培养液，用JC-1缓冲液清洗细胞2次。加入2mL细胞培养液于荧光显微镜下观察。
如图7所示，通过对比红绿荧光的比例及强度可以发现，三种花色苷随着浓度的增加，绿荧光也在不断的增强，说明线粒体膜电位随着花色苷的浓度增加而降低，从而推断黑枸杞花色苷可促进Hela、Neuro-2a、A549细胞的凋亡，其中LRA-15变化最明显，其次是LRA-60、LRA-90。
(2)凋亡相关基因表达分析
Caspase是一种含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，与细胞凋亡有着密切联系。Caspase-3起着细胞凋亡执行者的作用，是凋亡过程中最主要的终末剪切酶，Caspase-8、Caspase-9则起着细胞凋亡启动者的作用。Bcl-2则属于抑凋亡基因，可以有效阻断Caspase-3引起细胞凋亡，并增强对细胞中DNA损伤因子的抵抗性，Bcl-2的过度表达还可减少活性氧的产生和有毒代谢物的形成。
取对数生长期Hela、Neuro-2a、A549细胞，调整细胞密度至1×105cell/mL，接种至6cm的细胞培养皿中，置培养箱内孵育至细胞贴壁80％左右，加入不同浓度的黑枸杞花色苷或多糖溶液，并设置对照组(不含花色苷)、实验组(含有花色苷)，干预24h后，弃培养液，取Bcl-2相关蛋白ELISA检测试剂盒、Caspase-3活性测定试剂盒、Caspase-8活性测定试剂盒、Caspase-9活性测定试剂盒进行测定。
由图8所示，随着黑枸杞花色苷作用Hela、Neuro-2a、A549细胞时浓度的增加，促凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达水平也在不断增加，同时抑癌基因Bcl-2的表达水平有所降低。由上所述黑枸杞花色苷通过改变凋亡相关基因的表达水平达到促进细胞凋亡的目的。
作为本领域技术人员，总花色苷含量与抗肿瘤活性、总花色苷含量与氧化应激损伤抑制能力之间是没有必然关联，无法根据总花色苷含量的多少预测其抗肿瘤活性和氧化应激损伤抑制能力的强弱。本发明首次制备特定的黑枸杞花色苷，并发现对氧化损伤的细胞具有保护作用，增加氧化损伤细胞的存活率，并能激活抗氧化酶防御体系，抑制细胞中毒性物质MDA的生成，降低炎症相关基因Caspase-1及炎症因子1L-1β的表达水平，从而显著抑制细胞的氧化损伤；可抑制Hela、Neuro-2a、A549细胞增殖，且随着黑枸杞花色苷含量和种类的增加，细胞凋亡率也在不断增大，黑枸杞花色苷可降低肿瘤细胞中线粒体膜电位；黑枸杞花色苷可促进促凋亡基因Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达，及使得Bcl-2抑制凋亡基因下调，从而促进细胞凋亡。
本发明中三组洗脱获得的化合物分别代表不同极性，15％洗脱得到的为极性较高的一组化合物，90％洗脱获得的化合物为极性较低的一组化合物；伴随着洗脱液极性降低，获得的化合物种类和含量并不是线性变化的，也无法预测其含量和活性功能。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的范围当中。

Claims (10)

1.一种黑枸杞花色苷组合物的制备方法，其特征在于：包括，
将黑枸杞预处理，制得预处理后的黑枸杞原料；
将预处理后的黑枸杞原料加入乙醇溶液中，超声提取、静置、过滤、除醇，制得黑枸杞提取液；
将黑枸杞提取液通过大孔树脂纯化、冷冻干燥得到所述黑枸杞花色苷；
其中，大孔树脂为D101大孔树脂柱，洗脱液为15％浓度乙醇溶液，洗脱量为2个柱体积，洗脱流速为每小时1个柱体积，洗脱时间为2小时。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述黑枸杞预处理，包括，将黑枸杞清洗、粉碎、过筛、脱脂、烘干、二次粉碎，制得预处理后的黑枸杞原料。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述脱脂，包括将过筛后的原料浸泡在纯石油醚中超声处理20min，超声功率为100W。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述粉碎、过筛，其中，过筛为过60目筛。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述二次粉碎，其中，过筛为过60目筛。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述超声提取，其中，超声功率为100W，超声提取时间为20min。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述过滤为真空减压过滤，其中，滤膜孔径大小为0.2μm。
8.如权利要求1～7中任一所述的制备方法制得的黑枸杞花色苷组合物，其特征在于：所述黑枸杞花色苷组分包括飞燕草素、锦葵色素、矢车菊素、天竺葵素、芍药色素和矮牵牛素。
9.如权利要求8所述的黑枸杞花色苷组合物在制备具有抗肿瘤活性及对正常细胞的氧化应激保护作用的药物中的应用。
10.如权利要求8所述的黑枸杞花色苷组合物在制备具有抗肿瘤活性表现为抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡药物中的应用。
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