CN117338838A - 一种中药组合物及其在水生动物抗病毒药物中应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中药组合物及其在水生动物抗病毒药物中应用。本发明所述的中药组合物提取自中药原料空心苋、甜菊叶、荞麦壳和黑丁香，所述中药组合物具有延缓病害的发生时间，降低发病严重程度，降低死亡率，提高患病动物的存活率的功效，对预防、缓解或治疗常见水生动物病毒病有良好的预防及治疗效果，有效率达70%以上，减少了病毒病造成的损失。

Description

一种中药组合物及其在水生动物抗病毒药物中应用

技术领域

本发明属于中兽药及水产动物饲料技术领域，具体涉及一种中药组合物及其在水生动物抗病毒药物中应用。

背景技术

渔业不仅是国民收入的重要组成部分，而且为国家粮食安全和社会发展作出了贡献。然而，疾病的流行给水产养殖业带来了不少的损失。在养殖过程中，常见病毒病有鲈鱼虹彩病毒病、鳜鱼虹彩病毒病、鲈鱼弹状病毒病、石斑鱼神经坏死病毒病、草鱼出血病、鲫鱼鳃出血、鲤春病毒病、黄颡鱼杯状病毒病、对虾白斑病、对虾虹彩病毒病、黄头病毒病、肌肉坏死病、河蟹抖抖病等，一旦发生，死亡率达60-80%，发病严重的会出现全部死亡，然而目前并没有有效的药物可以进行治疗。

目前全球已获商业许可的水生动物类疫苗，主要为鱼的疫苗，大多数疫苗只能注射免疫且只针对单一病毒病，限制了在鱼类养殖中的应用。而具有抗病毒作用的药物，由于研发周期太长，投入的人力物力过多，大多数企业研制积极性不高，新渔药的短缺导致传统渔药越来越难以胜任目前人们对水产养殖的用药需求，严重制约着水产养殖业的健康发展和壮大。

中草药具有来源广泛、有效成分多种多样、功能多样、多靶点作用、作用广谱、安全可靠、无残留、用药方便等特点，开发的产品逐渐应用于水产养殖病害防治领域，产生了良好的经济效益和社会效益。利用中草药开发一种具有广谱抗病毒作用的组方、制剂及饲料等产品很有必要。

发明内容

针对当前水生动物类抗病毒治疗方法局限的问题，本发明提供一种中药组合物，其能够预防、缓解或治疗常见水生动物病毒病且安全有效，属于绿色药物。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种中药组合物，由包括如下原料制得：空心苋100重量份、甜菊叶20-400重量份、荞麦壳20-400重量份、黑丁香20-200重量份。

优选地，所述中药组合物由如下原料制得：空心苋100份、甜菊叶100份、荞麦壳100份、黑丁香100份。

第二方面，本发明进一步提供所述中药组合物的制备方法，包括如下步骤：将空心苋、甜菊叶、荞麦壳、黑丁香分别提取，合并提取液，得到所述中药组合物。

所述提取按照下述步骤进行：将各药材分别加水，煎煮；

所述水的用量为药材重量的8-20倍；

所述煎煮的次数为1-5次，优选为3次，时间为1-4小时。

第三方面，本发明进一步提供一种中药制剂，包括如下组成：上述中药组合物和药学上可接受的辅料；

所述辅料为丙二醇、聚山梨酯60、吐温80、吐温20、甘油、葡萄糖、脱脂奶粉、糊精、淀粉、辅美粉、玉米芯粉、氯化钠、明胶、黄原胶和水中的一种或几种。

每1g或1ml所述中药制剂中的生药量为0.1-2.0g，优选为0.5 g。

所述中药制剂的剂型为口服液、粉剂、喷剂、膏剂、注射剂和胶囊剂中的任意一种。

所述口服液按照下述步骤获得：向所述中药组合物的浓缩液中加入辅料A，调节pH值至中性，加水定容，即得口服液。

所述辅料A为丙二醇、聚山梨酯60、吐温80、吐温20、甘油和水中的一种或几种。

所述辅料A的用量为所述浓缩液质量的0.1-10%，优选为2%。

所述口服液中，生药量为0.1~2.0g/mL，优选为0.2~1.5g/mL，进一步优选为0.5~1.0 g/mL，更进一步优选为0.5g/mL。

所述粉剂按照下述步骤获得：向所述中药组合物的清膏中加入辅料B，搅拌，烘干，粉碎，用淀粉和葡萄糖补足，即得粉剂。

所述辅料B为葡萄糖、脱脂奶粉、糊精、淀粉、辅美粉、玉米芯粉和氯化钠中的一种或几种。

所述辅料B的用量为所述清膏质量的0.5-10倍，优选为2倍。

所述清膏的pH为6.8-7.5，优选7.0。

所述烘干的条件为：温度为70-90℃，时间为18-24h。

所述粉剂中，生药量为0.1~0.8g/g粉剂，优选为0.2~0.7g/ g粉剂，进一步优选为0.3~0.6 g/ g粉剂，更进一步优选为0.5g/g粉剂。

所述膏剂按照下述步骤获得：将所述中药组合物的浓缩液调节pH至中性，向浓缩液中加入辅料，搅拌并补足至一定重量，即得膏剂。

所述膏剂中，所述辅料选自葡萄糖、脱脂奶粉、糊精、淀粉、辅美粉、玉米芯粉、氯化钠、明胶和黄原胶中的一种或几种。

第四方面，本发明进一步提供所述中药组合物或中药制剂在制备预防、缓解或治疗水生动物病毒病的产品中的应用。

所述水生动物病毒病包含鱼类病毒病、虾类病毒病、蟹类病毒病、贝类病毒病中的一种或多种。

所述病毒为草鱼呼肠孤病毒、草鱼呼肠孤病毒II型、鲫造血器官坏死病病毒、疱疹病毒I型、疱疹病毒II型、鲤春病毒、蛙虹彩病毒、弹状病毒、细胞肿大病毒、小RNA病毒（杯状病毒）、杆套病毒等。

优选地，所述水生动物病毒病为鲈鱼蛙虹彩病毒病、草鱼出血病病毒病（草鱼呼肠孤病毒）、鲤鱼疱疹病毒病、斑点叉尾鮰病毒病、鲫造血器官坏死病病毒病、对虾白斑病、对虾虹彩病毒病、黄头病毒病、肌肉坏死病和河蟹抖抖病等。

第五方面，本发明进一步提供一种水生动物饲料，其含有上述中药组合物或中药制剂。

所述水生动物饲料中，所述中药组合物或中药制剂的质量分数为0.1%-10%，优选为0.2-1.0%。

进一步的，所述水生动物饲料包括但不限于鲈鱼饲料、乌鳢饲料、黄颡鱼饲料、鮰鱼饲料、大黄鱼饲料、石斑鱼饲料、草鱼饲料、鲤鱼饲料、鲫鱼饲料、泥鳅饲料、青鱼饲料、鲢鱼饲料、鳙鱼饲料、鳊鱼饲料、鲂鱼饲料、大菱鲆饲料、金鲳鱼饲料、鳜鱼饲料、虹鳟鱼饲料、罗非鱼饲料、鳗鲡饲料、甲鱼饲料、对虾饲料、罗氏沼虾饲料、小龙虾饲料、河蟹饲料、青蟹饲料、牛蛙饲料、青蛙饲料、林蛙饲料、鲍鱼饲料。

本发明取得的有益效果如下：

本发明的中药提取物所用中药材是通过大量的动物试验首次筛选获得。由其制备的中药制剂对常见水生动物病毒病起到了意想不到的良好效果，有效率达70%以上，具有延缓病害的发生时间，降低发病严重程度，降低发病动物的死亡率，提高发病动物的存活率等功能。特别是对多动物多种病毒病均有效果，具有广谱高效的特点。经实验室试验及田间临床试验验证有效的病毒病有草鱼出血病、鲤鱼疱疹病毒病、鲈鱼虹彩病毒病、对虾白斑病和对虾虹彩病等。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试剂、材料、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 空心苋、甜菊叶、荞麦壳、黑丁香口服液的制备

步骤如下：

（1）将空心苋、甜菊叶、荞麦壳、黑丁香各取100g，分别加水1000mL，煎煮3次，每次1小时，得到四种原料药的提取液，合并煎液，滤过，得到滤液；

（2）将滤液浓缩至600ml，加入丙二醇和聚山梨酯60，加入量为浓缩液重量的2%，丙二醇和聚山梨酯60的质量比为1：1，搅拌使溶解，调节pH值至7.0左右，加水至8000ml，搅匀，滤过，即得口服液，生药量为0.5g/mL。

实施例2 空心苋、甜菊叶、荞麦壳、黑丁香粉剂的制备

步骤如下：

（1）同实施例1的步骤（1）；

（2）将浓缩液继续浓缩至250g的清膏，加入2倍清膏重量的淀粉和葡萄糖，淀粉和葡萄糖质量比例为1：1，搅拌均匀，低温烘干，粉碎，用淀粉和葡萄糖补足重量至800g，混合均匀，即得粉剂，生药量为0.5g/g粉剂。

效果验证

一、体外抗病毒试验报告

1材料与方法

1.1实验材料

大口黑鲈(Micropterus salmoides)：购买自河北某鲈鱼苗场，体表光滑无损伤，经显微观察无寄生虫感染，随机取10尾经BHI培养基分离未发现病原感染，并经PCR检测不携带蛙虹彩病毒。

蛙虹彩病毒液的制备：寻找发生虹彩病毒病的鲈鱼，经PCR检测确诊后，取病灶组织，加入液氮进行研磨，加入生理盐水定容到一定体积，分别过0.45μm、0.2μm以及0.1μm的有机滤膜过滤，同时对药液在BHI、TSA培养基以及含0.2%胎牛血清的M199培养基上进行培养以确保不含杂菌，稀释到一定浓度用于体外抗病毒试验。

MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒：购自广州永津生物科技有限公司；QIAampDNA Mini Kit/QIAamp RNA Mini Kit购自上海浦泉生物科技中心。

实验用中药制剂：实施例1所制备的口服液药物，由北京生泰尔科技股份有限公司提供，放置于-40℃冰箱保存备用。

1.2实验方法

1.2.1药物的配制：取保存的药物放于流水槽中进行解冻，解冻后将药物分别过0.45μm、0.2μm以及0.1μm的有机滤膜过滤，同时对药液在BHI、TSA培养基以及含0.2%胎牛血清的M199培养基上进行培养以确保不含杂菌。将获得的药液进行10倍、100倍和1000倍稀释后用于体外抗病毒试验。

1.2.2体外抗病毒试验：每种药物设置3个浓度梯度，每个浓度设置3个重复。将过滤后的药物根据设置的药物浓度与病毒液一起混匀后，加入至事先准备好的含10⁶个鲈鱼细胞的96孔细胞板中，放置在28°C的细胞培养箱中进行培养5d，每天观察细胞生长情况及形态变化，后弃去培养液，用MTT法测定OD490nm值，计算细胞存活率。

细胞存活率(%)=(病毒或药物组OD490nm值/（空白对照组OD490nm）×100%

2结果

2.1体外模型的构建结果：

大口黑鲈蛙虹彩病毒病毒可在鲈鱼细胞上较好的生长，且在接毒后可观察到的明显噬斑，同时使用药物后病理变化显著减少，表明体外模型构建成功。

2.2体外抗病毒结果

细胞存活率结果见表1：三个浓度梯度的中药提取物均具有一定的抗病毒效果，均显著提高了接种病毒后的细胞存活率。

表1 细胞存活率结果

二、中药组合物制剂对蛙虹彩病毒引起的大口黑鲈病毒病治疗效果试验

1、试验目的

构建鲈鱼虹彩病毒病模型，验证实施例1和实施例2制备的中药组合物制剂对大口黑鲈虹彩病毒病治疗效果。

2、试验仪器与材料

2.1试验用鱼

鲈鱼，大口黑鲈，规格：20g/尾，购自河北某鲈鱼苗场。

2.2攻毒用病毒液

蛙虹彩病毒液的制备：寻找发生虹彩病毒病的鲈鱼，经PCR检测确诊后，取病灶组织，加入液氮进行研磨，加入生理盐水定容到一定体积，分别过0.45μm、0.2μm以及0.1μm的有机滤膜过滤，同时对药液在BHI、TSA培养基以及含0.2%胎牛血清的M199培养基上进行培养以确保不含杂菌，稀释到一定浓度用于攻毒。

2.3受试药品

实施例1和实施例2制备的中药组合物制剂。

3、试验方法

3.1分组及处理

大口黑鲈(平均体重20g)暂养，调整各缸水温稳定在28℃，摄食稳定后开始试验。

取120尾鲈鱼分装在容积为150L的玻璃鱼缸内，分为4个组，每组3个重复，每个重复1个试验缸，每缸10尾鲈鱼。分别为空白对照组（不染毒不给药）、攻毒对照组（染毒不给药）、实施例1组（2ml/kg饲料）、实施例2组（2g/kg饲料）。

分组结束后，各试验组饲喂其对应的药饵，空白对照组、攻毒对照饲喂空白饲料，各组每天上午9:00和下午16:00分别饲喂一次，以2%投饵率进行投喂。饲喂3天后，除空白对照组外，每组鲈鱼以0.1ml/尾病毒液进行腹腔注射。空白对照组以相同方式注射生理盐水。攻毒结束后，继续饲喂相应的饵料，连续观察14天。

3.2药饵制作

空白对照组饵料：准确量取20mL纯净水置于喷壶中，均匀喷洒在200g鲈鱼颗粒饲料上，喷洒期间不断搅拌，使其充分混合均匀。50℃的烘箱中烘干后，标记，放于4℃冰箱保存，备用。

攻毒对照组饵料：同空白对照组饵料。

实施例1组：准确量取0.4mL实施例1药液，加纯净水稀释到20ml，置于喷壶中，均匀喷洒在200g鲈鱼颗粒饲料上，喷洒期间不断搅拌，使其充分混合均匀。50℃的烘箱中烘干后，标记，放于4℃冰箱保存，备用。

实施例2组：准确称取0.4g实施例2药粉，加20ml纯净水溶解稀释，置于喷壶中，均匀喷洒在200g鲈鱼颗粒饲料上，喷洒期间不断搅拌，使其充分混合均匀。50℃的烘箱中烘干后，标记，放于4℃冰箱保存，备用。

3.3观察指标

3.3.1一般临床观察

试验期间，每天观察各组鲈鱼的健康状况、外观体征、游泳情况、摄食情况、死亡情况。

3.3.2剖检观察

每日发现死亡鲈鱼进行拍照，观察其体表状况，剖检观测其内脏病变情况。对于鱼苗期大口黑鲈，该病主要表现为腹鳍基部充血发红，鳃盖红肿、体表出现大量溃疡点、肝肾有白色结节。

3.3.3感染死亡率统计

第14天，统计各组感染死亡率，比较各组间差异，判断各药物的治疗效果。

4、实验结果及分析

4.1一般临床观察结果

试验开展后，各组鲈鱼游泳正常，以投饵率为2%进行饲喂，可以达到抢食的状态。攻毒后，各组鲈鱼摄食有所变慢，但摄食量变化不大。攻毒四天后，可观察到部分缸的鲈鱼开始出现死亡，并可在个别鲈鱼鳍基两侧观察到充血、出血状况。鲈鱼死亡的高峰期主要集中在5~10天。空白对照组由于没有进行攻毒，整个试验期间未出现发病症状及死亡情况，攻毒对照组陆续全部死亡，各试验组出现部分死亡，但死亡数量显著少于攻毒对照组，且发病鱼的症状相对攻毒对照组要轻。

4.2外观及剖检观察结果

对死亡鲈鱼进行体表观察及剖检并拍照记录，发现死亡鲈鱼符合鲈鱼虹彩病毒病症状，主要表现为体表溃烂、鳍条基部充血发红、鳃盖充血发红及肝脏出现白点、白色结节。

4.3感染死亡率统计结果

各组鲈鱼死亡情况见表2，空白对照组在整个试验过程中无死亡情况发生，表明鲈鱼养殖条件及方法不存在问题。攻毒对照组三个重复的死亡率均达到了100%，表明本次试验造模成功。

实施例1组2个平行的死亡率分别为在30%、20%，实施例2组2个平行的死亡率分别为20%、40%，两个实施例组各重复间差异较小，且死亡率均较低，效果均较好。与攻毒对照组相比，实施例1组的平均有效率为75%，实施例2组的平均有效率为70%，两个实施例组的有效率均达到70%以上。

表2 各组鲈鱼死亡情况统计

5、结论

实施例1和实施例2对鲈鱼虹彩病毒病具有良好的防治效果，有效率达70%以上。

三、各实施例在养殖过程中针对水生动物常见病毒病的治疗效果试验报告

以下测试例，选取鲈鱼虹彩病毒病、草鱼出血病、鲤鱼疱疹病毒病、对虾白斑病和对虾虹彩病做了如下的效果验证。

测试例1：实施例1所制备的药饵在鲈鱼虹彩病毒病上的使用效果实例

天津某养殖场，养殖对象：加州鲈，经临床症状诊断及配合PCR检测，确诊为：鲈鱼虹彩病毒病。

症状：病鱼表现为头部、鳃盖、鳍条基部充血发红，皮肤上出现白点、出血斑、溃疡，肝肿呈灰白色，肿大，有的出现斑点状出血，脾、肾肿大，出现淤血、斑点状出血；肠壁变薄，肠腔内充满大量含血的或淡黄色的液体。镜检发现全身组织器官广泛性充血、出血、发炎，特别是肾、肝、胃肠道、脾和皮肤肌肉的损伤较为严重，并在病变组织观察到结节。每天死亡300尾，有不断增多趋势。

服用实施例1制成的药饵，按每公斤饲料添加本品10ml计算药量（以投饵率为1.0%计算），拌饲料连续投喂7天，用药3天后，死亡量开始出现下降，5天后，每天捞出死鱼量由用药前的300尾，下降到20尾，用药7天后，每天捞出死鱼量下降到3尾，治疗效果明显。

测试例2：实施例1所制备的药饵在草鱼出血病毒上的使用效果实例

湖北仙桃某养殖场，养殖对象：草鱼苗，经剖检观察诊断，确诊为：草鱼出血病。主要症状为：病鱼口腔、下颚、鳃盖、鳍条基部有明显充血症状，将病鱼皮肤剥离，发现肌肉出现点状或片状充血，有的全身肌肉呈充血现象，鳃部颜色变浅，发白，肠道点状或片状充血，局部因充血而呈鲜红色，肠系膜和周围脂肪伴有明显的点状充血，但肠道仍很有韧性，没有糜烂易拉断的情况，肠道无腐烂或水肿等情况出现。部分病鱼的肝、脾、肾等出现灰白色或局部充血，鳔壁充满血丝，剖检时，打开腹腔，腹腔中有大量血水，严重的肾脏糜烂。每天死亡200尾左右。

每天服用实施例1制成的药饵，按每公斤饲料添加本品5ml计算药量（以投饵率为1.0%计算），拌饲料连续投喂10天，用药第5天，每天死亡下降到80尾，用药10天后，每天死亡2尾，结果表明，实施例1对草鱼出血病治疗效果良好。

测试例3：实施例2所制备的药饵在鲤鱼疱疹病毒病上的使用效果实例

湖北荆州某养殖场，养殖对象为鲤鱼，经诊断为：鲤鱼疱疹病毒病。病鱼症状为：多数病鱼表现为眼球凹陷，部分头部皮肤凹陷。鳃丝出现腐烂，体表分泌大量黏液，每天死亡100多斤。

服用实施例2制成的药饵，按每公斤饲料添加本品10g计算药量（以投饵率为1.0%计算），拌饲料连续投喂10天，用药第5天，病鱼死亡量开始出现下降，降为每天死亡70斤，用药第7天，死亡量降为20斤，用药第10天，不再出现死亡，结果表明，实施例2对鲤鱼疱疹病毒病治疗效果良好。

测试例4：实施例1在对虾白斑病上的使用效果实例

江苏如东某养殖场，养殖对象：南美白对虾，经荧光定量pcr检测，确诊为对虾白斑病毒病。对虾在甲壳的内侧有白点，头胸甲与其下方的组织分离，容易剥下，严重的吃食较差或不摄食，行动迟钝，弹跳无力，眼球无反光，腹肌微白，表皮微红，漫游于水面或伏于池边水底不动，很快死亡。每天从料台可以看到大量病虾，占到料台虾数量的50%左右，部分虾死亡，每个料台大约有10只死虾。

服用实施例1制成的药饵，按每公斤饲料添加本品20ml计算药量（以投饵率为0.5%计算），拌饲料连续投喂7天，同时外泼实施例1药液，连泼3次，用药3天后，每天从料台见到的病虾明显减少，大约还有20%的病虾，有1-2只死虾，用药5天后，从料台见到的病虾明显减少，大约还有5%的病虾，没有发现死虾，用药7天后，料台上基本看不到病虾和死虾。结果表明，实施例1对对虾白斑病毒病治疗效果良好。

测试例5：实施例2在对虾虹彩病毒病上的使用效果实例

山东滨州乔庄某养殖场，养殖对象：南美白对虾，经实验室核酸诊断确诊为：对虾虹彩病毒病。症状：肝胰腺颜色变浅、空肠空胃、体节明显、有的出现黑脚的现象。虾体外表会出现彩色斑点或条纹，体色发红，对虾体重增长缓慢，体型发育不良，食欲减退，活动力下降，游动能力减弱等。症状明显，体色发红的对虾大约占80%，但死亡不是很多，每天死亡50多条，若不进行治疗，会进一步恶化，出现大量死亡。

服用实施例2制成的药饵，按每公斤饲料添加本品10g计算药量（以投饵率为1.0%计算），拌饲料连续投喂10天，用药5天后，体色发红对虾大约占30%，每天捞出死虾，由用药前的50多条下降到20条左右，用药10天后，体色发红的对虾基本消失，只有零星几个，不再出现死虾情况，治疗效果良好。

总结：本试验结果表明实施例1或实施例2对患病毒病的水生动物进行拌饵投喂，连续投喂7-10天，对摄食较差或不摄食的患病动物进行外泼治疗，可以迅速降低患病动物的死亡数量，临床治疗效果良好；实施例1和实施例2对多种水生动物的多种病毒病均有良好的治疗效果，说明本发明的抗病毒效果是广谱且高效的。实施例2治疗效果与实施例1相比差异不显著，且治愈率相对较高，均在70%以上，表明实施例1跟实施例2均有良好的治疗效果，且两者效果相当。

四、不同组方中药组合物制剂对蛙虹彩病毒引起的大口黑鲈病毒病治疗效果对比试验

1、试验目的

构建鲈鱼虹彩病毒病模型，验证实施例1和实施例2制备的中药组合物制剂和不同组方的对比例对大口黑鲈虹彩病毒病治疗效果。

2、试验仪器与材料

2.1试验用鱼

鲈鱼，大口黑鲈，规格：20g/尾，购自河北某鲈鱼苗场。

2.2攻毒用病毒液

蛙虹彩病毒液的制备：寻找发生虹彩病毒病的鲈鱼，经PCR检测确诊后，取病灶组织，加入液氮进行研磨，加入生理盐水定容到一定体积，分别过0.45μm、0.2μm以及0.1μm的有机滤膜过滤，同时对药液在BHI、TSA培养基以及含0.2%胎牛血清的M199培养基上进行培养以确保不含杂菌，稀释到一定浓度用于攻毒。

2.3受试药品

实施例1和实施例2制备的中药组合物制剂以及8个对比例，具体组方见下表。

表3 各中药组合物配比及含量

3、试验方法

3.1分组及处理

大口黑鲈(平均体重20g)暂养，调整各缸水温稳定在28℃，摄食稳定后开始试验。

取1000尾鲈鱼分装在容积为300L的鱼缸内，分为10个组，每组100尾。分别为空白对照组（不染毒不给药）、攻毒对照组（染毒不给药）、实施例1组（2ml/kg饲料）、实施例2组（2g/kg饲料）、对比例1组（2g/kg饲料）、对比例2组（2g/kg饲料）、对比例3组（2g/kg饲料）、对比例4组（2g/kg饲料）、对比例5组（2g/kg饲料）、对比例6组（2g/kg饲料）、对比例7组（2g/kg饲料）、对比例8组（2g/kg饲料）、对比例9组（2g/kg饲料）、对比例10组（2g/kg饲料）。

分组结束后，各试验组饲喂其对应的药饵，空白对照组、攻毒对照组饲喂空白饲料，各组每天上午9:00和下午16:00分别饲喂一次，以2%投饵率进行投喂。饲喂3天后，除空白对照组外，每组鲈鱼以0.1ml/尾病毒液进行腹腔注射。空白对照组以相同方式注射生理盐水。攻毒结束后，继续饲喂相应的饵料，连续观察14天。

3.2药饵制作

空白对照组饵料：准确量取20mL纯净水置于喷壶中，均匀喷洒在200g鲈鱼颗粒饲料上，喷洒期间不断搅拌，使其充分混合均匀。50℃的烘箱中烘干后，标记，放于4℃冰箱保存，备用。

攻毒对照组饵料：同空白对照组饵料。

实施例1组：准确量取0.4mL实施例1药液，加纯净水稀释到20ml，置于喷壶中，均匀喷洒在200g鲈鱼颗粒饲料上，喷洒期间不断搅拌，使其充分混合均匀。50℃的烘箱中烘干后，标记，放于4℃冰箱保存，备用。

实施例2组：准确称取0.4g实施例2药粉，加20ml纯净水溶解稀释，置于喷壶中，均匀喷洒在200g鲈鱼颗粒饲料上，喷洒期间不断搅拌，使其充分混合均匀。50℃的烘箱中烘干后，标记，放于4℃冰箱保存，备用。

其它测试例药饵制作参照实施例。

3.3观察指标

第14天，统计各组死亡率，计算有效率，判断各药物的治疗效果。

死亡率=死亡鱼数/试验鱼数*100%

有效率=攻毒对照组死亡率-治疗组死亡率

4、实验结果及分析

各中药组合物治疗结果见表2，空白对照组在整个试验过程中无死亡情况发生，表明鲈鱼养殖条件及方法不存在问题。攻毒对照组死亡率达到了100%，表明本次试验造模成功，攻毒后所有鲈鱼均发病，在不治疗的情况下最终全部死亡。

实施例1组的有效率为81%，实施例2组的有效率为79%，两个实施例组的有效率均达到70%以上，效果最好。对比例1-4为各单方药材制成的制剂，虽然生药量及饲料中添加剂量与实施例1和2相同，但效果明显要差，有效率为55-58%。对比例5-8为各3种药材组方制成的制剂，其有效率为65-69%，效果要优于单方制剂，但效果要明显差于实施例1和实施例2。由此可以说明，实施例1和实施例2中的4味药材组方后，效果明显优于单方药材和少一味药材的组方，表明4味药材有协同增效的作用。

表4 各中药组合物治疗结果

5、结论

实施例1和实施例2对鲈鱼虹彩病毒病具有良好的防治效果，有效率达70%以上，效果明显优于单方药材和少一味药材的组方，表明4味药材有协同增效的作用。

综上，本发明提供的中药制剂不仅对引起常见水生动物病毒病的病毒具有体外抑制效果，将其拌入饲料中喂养患病毒病的水生动物后，还能够起到明显的治疗作用。本发明的中药制剂安全有效、绿色环保，填补了目前水生动物病毒病药物研发的空白，首次筛选得到具有广谱高效的抗水生动物病毒病的中药组方，应用前景广阔。

本发明的中药组合物制剂制作过程采用的为中药提取后配制，制剂中的有效成分含量高、杂质少、适口性好，可以被水生动物充分快速吸收，迅速发挥药效，解决了水生动物消化道结构简单，对原药材难以直接进行消化吸收的难题。

本发明还提供了一种新剂型，并验证了新剂型的有效性，与传统中药剂型相比有显著的效果优势。通过开展大量的临床筛选与药效评价，确定了最佳的中药组方，并对不同剂型的制备工艺进行了深入研究，解决了养殖过程中对不同剂型的使用需求，使该组方可以全方位的用于常见水生动物病毒病的防治过程中。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种中药组合物，其特征在于：由包括以下原料制得：空心苋100重量份、甜菊叶20-400重量份、荞麦壳20-400重量份、黑丁香20-200重量份。

2.权利要求1所述中药组合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：将空心苋、甜菊叶、荞麦壳、黑丁香分别提取，合并提取液，得到所述中药组合物。

3.根据权利要求2所述的中药组合物的制备方法，其特征在于：所述提取按照下述步骤进行：将各药材分别加水，煎煮；

所述水的用量为药材重量的8-20倍；

所述煎煮的次数为1-5次，时间为1-4小时。

4.一种中药制剂，其特征在于：包括权利要求1所述的中药组合物和药学上可接受的辅料。

5.根据权利要求4所述的中药制剂，其特征在于：每1g或1ml所述中药制剂中生药量为0.1-2.0g。

6.根据权利要求4或5所述的中药制剂，其特征在于：所述中药制剂的剂型为口服液、粉剂、喷剂、膏剂、注射剂和胶囊剂中的任意一种。

7.权利要求1所述中药组合物或权利要求4-6任一项所述中药制剂在制备预防、缓解或治疗水生动物病毒病的产品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述水生动物病毒病包含鱼类病毒病、虾类病毒病、蟹类病毒病和贝类病毒病中的一种或多种；

所述病毒为草鱼呼肠孤病毒、草鱼呼肠孤病毒II型、鲫造血器官坏死病病毒、疱疹病毒I型、疱疹病毒II型、鲤春病毒、蛙虹彩病毒、弹状病毒、细胞肿大病毒、小RNA病毒、杆套病毒中的一种或多种。

9.一种水生动物饲料，其特征在于：包括权利要求1所述中药组合物或权利要求4-6任一项所述中药制剂。

10.根据权利要求9所述的水生动物饲料，其特征在于：所述中药组合物或中药制剂的质量分数为0.1%-1.0%。