CN117327772A - 一种用于增强pcr抑制物耐受性的组合物、方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增强PCR抑制物耐受性的组合物、方法与应用，所述组合物含有海藻糖3‑7重量份、精氨酸0.5‑1.0重量份、牛血清白蛋白0.5‑1.0重量份、聚乙二醇0.005‑0.015重量份、甘油3‑7重量份和曲拉通X‑1000.5‑1.5重量份。本发明通过向PCR体系中引入保护剂，提高PCR体系对样本核酸中抑制物的耐受性，提高PCR检测的应用范围及准确度。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于增强PCR抑制物耐受性的组合物、方法与应用。
背景技术
1983年Mullis等人发明的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，以少量的DNA分子为模板，可以指数扩增复制出大量靶标；具有高特异性、高灵敏性等优点，其应用已扩展到医学、农业、环境、食品等众多领域。
以传统PCR为基础，逐渐衍生出众多应用平台，例如实时荧光定量PCR(qPCR)、一代Sanger测序、二代高通量测序、数字PCR等。qPCR在传统PCR基础上，引入荧光物质，将扩增产物转换为荧光信号，可实时检测产物扩增情况，是目前应用最为广泛的核酸检测技术；测序是指分析特定DNA片段的碱基序列的排列方式，通常需要依赖于高效的PCR反应；数字PCR是一种对核酸分子的绝对定量技术，通过将PCR反应体系分成众多反应单元(几万至几十万个)，检测各单元信号有无，结合软件分析，实现对初始样本中的靶标进行绝对定量，而无需依赖标准曲线。
以上各应用平台，靶标模板的质量高低均是PCR成功的关键。为了实现有效的核酸扩增，靶标模板的浓度与纯度均要满足一定要求。临床样本中通常含多种PCR抑制物，这些抑制物如果随样本核酸进入PCR反应体系，将显著降低扩增酶的工作效率，进而直接影响核酸定量检测的准确性。除了在核酸提取过程中尽可能消除这些抑制物，增强PCR体系对抑制物的耐受性，也是保证PCR准确性的重要手段。
发明内容
综上所述，亟需研究开发一种增强PCR抑制物耐受性的组合物、方法与应用，以提高核酸检测的应用范围及准确度。
本发明一方面涉及一种增强PCR抑制物耐受性的组合物，所述组合物含有海藻糖3-7重量份、精氨酸0.5-1.0重量份、牛血清白蛋白0.5-1.0重量份、聚乙二醇0.005-0.015重量份、甘油3-7重量份和曲拉通X-1000.5-1.5重量份。
在本发明的一个优选实施方式中，所述组合物含有海藻糖4-6重量份、精氨酸0.7-0.8重量份、牛血清白蛋白0.7-0.8重量份、聚乙二醇0.008-0.012重量份、甘油4-6重量份和曲拉通X-1000.8-1.2重量份。
本发明另一方面涉及上述组合物在增强PCR抑制物耐受性中的应用。
本发明另一方面还涉及一种PCR检测方法，其特征在于，在PCR体系中引入上述组合物。
在本发明的一个优选实施方式中，所述PCR检测方法为定量或定性检测方法。
在本发明的一个优选实施方式中，所述PCR检测方法的检测对象为粪便样本中幽门螺杆菌。
本发明的有益效果至少为：通过向PCR体系中引入保护剂，提高PCR体系对样本核酸中抑制物的耐受性，提高PCR检测的应用范围及准确度。
具体实施方式
实施例1：保护剂种类的筛选
以粪便样本中幽门螺杆菌核酸检测为例(荧光定量PCR)。PCR条件如下：
引物：上游引物：5’-gcgacctgctggaacattac-3’；下游引物：5’-agagactaagccctccaacaac-3’；探针：5’-tgacgctgattgcgcgaaagcgt-3’。
反应体系(25μL反应体积)：
| 组分 | 终浓度 |
| Tris-HCl(pH8.5) | 10mM |
| KCl | 50mM |
| (NH4)2SO4 | 20mM |
| MgCl2 | 4mM |
| dNTPs | 0.6mM |
| 上游引物 | 0.2μM |
| 下游引物 | 0.2μM |
| 探针 | 0.1μM |
| TaqDNA聚合酶 | 0.1U/μL |
反应程序：
将保护剂按照其化学属性，分为糖类、氨基酸、蛋白质、高分子聚合物、小分子化合物和表面活性剂6大类。每种保护剂按照中等浓度单独添加至PCR反应体系。添加与未添加保护剂的PCR反应体系同时检测同一批粪便样本核酸，通过比较Ct值，挑选6大类中对PCR体系有增强作用的保护剂。阈值循环数(Cycle threshold，Ct值)是反应液内荧光信号达到设定阈值所经历的循环数；理论上Ct值与起始拷贝数的对数存在线性关系：起始模板浓度越高，Ct值越小，起始模板浓度越低，Ct值越大。但若模板中存在可以抑制PCR反应的杂质物，将会导致PCR扩增速度变慢，从而使Ct值变大。实际应用时，通过阈值线与荧光曲线的交点的坐标值来确定Ct值，故Ct值可以是0至最大循环数之间的任意数字，通常保留2位小数。
数据表明(详见下表)，单独添加5％海藻糖、1.5％精氨酸、0.5％牛血清白蛋白、0.5％聚乙二醇、5％甘油和0.5％曲拉通X-100，均能提高PCR体系的扩增速度。
实施例2：保护剂浓度的优化
以粪便样本中幽门螺杆菌核酸检测为例(荧光定量PCR)。将实施例1中对PCR体系扩增有促进作用的6种保护剂，每种在工作浓度范围内，设定5个浓度梯度。采用正交(详见下表)配制出25个不同浓度的组合，以不添加任何保护剂的PCR反应体系为对照。
26个组别同时检测同一批粪便样本，通过比较Ct值，挑选对PCR体系有增强作用的保护剂浓度组合。结果表明组合12，即海藻糖5％、精氨酸0.75％、牛血清白蛋白0.75％、聚乙二醇0.01％、甘油5％和曲拉通X-1001％，能显著提高PCR体系的扩增速度。
实施例3：应用保护剂检测临床样本
以粪便样本中幽门螺杆菌核酸检测为例(荧光定量PCR)，将实施例2中挑选所得的最优保护剂组合12，添加至PCR体系。以未添加保护剂为对照组，检测同一批临床样本。统计PCR体系与临床诊断结果的一致性(详见下表)。
对于同一样本核酸，添加保护剂，扩增速度更快(Ct值更小)，且与临床诊断结果的阳性符合率更高。
实施例4：保护剂对PCR体系稳定性的提高
以粪便样本中幽门螺杆菌核酸检测为例(荧光定量PCR)，将添加有实施例2中挑的最优保护剂组合12的PCR体系避光密封放置于37℃，分别于不同天取出检测。以不添加保护剂的PCR体系为对照，比较放置不同天的检测效果(详见下表)。
通过添加本发明的保护剂，使PCR体系在明显高于储存温度的环境下，能够耐受更长的时间，保护剂能够显著提高PCR体系的稳定性。
以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。
Claims (6)
1.一种增强PCR抑制物耐受性的组合物，所述组合物含有海藻糖3-7重量份、精氨酸0.5-1.0重量份、牛血清白蛋白0.5-1.0重量份、聚乙二醇0.005-0.015重量份、甘油3-7重量份和曲拉通X-1000.5-1.5重量份。
2.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物含有海藻糖4-6重量份、精氨酸0.7-0.8重量份、牛血清白蛋白0.7-0.8重量份、聚乙二醇0.008-0.012重量份、甘油4-6重量份和曲拉通X-1000.8-1.2重量份。
3.权利要求1或2所述的组合物在增强PCR抑制物耐受性中的应用。
4.一种PCR检测方法，其特征在于，在PCR体系中引入权利要求1或2所述的组合物。
5.根据权利要求4所述的PCR检测方法，所述PCR检测方法为定量或定性检测方法。
6.根据权利要求4所述的PCR检测方法，所述PCR检测方法的检测对象为粪便样本中幽门螺杆菌。
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