CN117320706A - 用作免疫调节剂的氨基硫醇酯化合物或其衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于调节受试者免疫应答的氨基硫醇酯化合物。具体地，所述化合物包含在脂质纳米胶囊中。本发明还涉及包含至少一种氨基硫醇酯化合物和免疫检查点抑制剂的药物组合物和组合产品，以及它们用于治疗癌症的用途。

Description

用作免疫调节剂的氨基硫醇酯化合物或其衍生物
技术领域
本发明涉及用于调节受试者的免疫应答的氨基硫醇酯化合物。具体地，所述化合物包含在脂质纳米胶囊中。本发明还涉及包含至少一种氨基硫醇酯化合物和免疫检查点抑制剂的药物组合物和组合产品，以及它们用于治疗癌症的用途。
背景技术
免疫应答的调节是许多疾病的重要治疗轴。事实上，例如，改善感染患者的免疫应答就非常重要。
此外，免疫应答的刺激在许多方面都是重要的机制。
长期以来，嗜中性粒细胞一直被认为是先天免疫应答的一个组成部分。事实上，嗜中性粒细胞历来被认为是对宿主生存至关重要的第一反应细胞，因为它们能够遏制和消除细菌、寄生虫、病毒和真菌病原体(Witter AR,Okunnu BM,Berg RE.The Essential Roleof Neutrophils during Infection with the Intracellular Bacterial PathogenListeria monocytogenes.J Immunol.2016；197(5):1557-1565)。在感染条件下，粒细胞生成增加，嗜中性粒细胞被募集到循环系统中，然后到达感染的外周部位。
嗜中性粒细胞上表达的特异性粘附分子包括LFA-1(CD11a/CD18)和Mac-1(CD11b/CD18,CR3)。LFA-1表达限制嗜中性粒细胞募集到感染部位，导致细菌负担增加，而Mac-1，具体是CD11b成分，对于中性粒细胞募集和感染控制至关重要(Witter AR,Okunnu BM,BergRE.The Essential Role of Neutrophils during Infection with the IntracellularBacterial Pathogen Listeria monocytogenes.J Immunol.2016；197(5):1557-1565)。
本发明的发明人惊奇地发现下述式(I)的氨基硫醇酯化合物能够刺激和促进嗜中性粒细胞的成熟和活化并且治疗和/或预防感染性病症。
此外，巨噬细胞被认为是先天免疫的边防战士。由于其免疫监视作用，巨噬细胞感知广泛的刺激，从病毒、微生物和寄生虫抗原、免疫复合物、凋亡或坏死细胞到其他细胞释放的各种介质(T.Understanding the Mysterious M2 Macrophage throughActivation Markers and Effector Mechanisms.Mediators Inflamm.2015；2015:816460)。为了响应它们感知到的刺激，巨噬细胞被激活，这使它们能够对抗病原体，发挥免疫调节作用，并维持组织完整性(F.O.Martinezand S.Gordon,“The M1 and M2 paradigmof macrophage activation:time for reassessment,”F1000Prime Reports,vol.6,article13,2014)。近十年来，开发了一种模型，该模型将巨噬细胞活化的复杂机制描述为向两种相反状态(M1或经典状态，以及M2或替代活化)的极化(F.O.Martinezand S.Gordon,“The M1 and M2 paradigm of macrophage activation:time for reassessment,”F1000Prime Reports,vol.6,article 13,2014)。
M2巨噬细胞具有高吞噬能力，产生细胞外基质(ECM)成分、血管生成因子和趋化因子以及IL-10(L.Fuentes,T.Roszer,and M.Ricote,“Inflammatory mediators andinsulin resistance in obesity:role of nuclear receptor signaling inmacrophages,”Mediators of Inflammation,vol.2010,Article ID 219583,10pages,2010)。除了病原体防御之外，M2巨噬细胞还可以清除凋亡细胞，减轻炎症反应，促进伤口愈合(A.Sica and A.Mantovani,“Macrophage plasticity and polarization:in vivoveritas,”The Journal ofClinical Investigation,vol.122,no.3,pp.787-795,2012)。毫不奇怪，它们在当前文献中被广泛称为抗炎、促消退、伤口愈合、组织修复以及营养性或调节性巨噬细胞，并被认为是M1活化的巨噬细胞的良性对立面(J.W.Pollard,“Trophicmacrophages in development and disease,”Nature Reviews Immunology,vol.9,no.4,pp.259-270,2009；F.O.Martinez and S.Gordon,“The M1 and M2 paradigm ofmacrophage activation:time for reassessment,”F1000Prime Reports,vol.6,article13,2014；S.J.Forbes and N.Rosenthal,“Preparing the ground for tissueregeneration:from mechanism to therapy,”Nature Medicine,vol.20,pp.857-869,2014.；E.Muraille,O.Leo,and M.Moser,“TH1/TH2 paradigm extended:macrophagepolarization as an unappreciated pathogen-driven escape mechanism？”Frontiersin Immunology,vol.5,article 603,2014)。这些M2巨噬细胞的任务具有生物医学影响。例如，维持某些组织驻留巨噬细胞(例如库普弗细胞(Kupffer cells)和脂肪组织巨噬细胞)的M2样状态，将减少炎症介质的产生，因此可能是治疗诸如下列自身免疫性疾病的一种治疗方法：类风湿性关节炎、炎症性肠病、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、牛皮癣和代谢性炎症性疾病(如动脉粥样硬化)、2型糖尿病、慢性肾病、非酒精性脂肪肝和肥胖症，包括影响脂肪组织、肝脏、骨骼肌、胰腺、肠道和下丘脑等重要代谢组织的内脏肥胖症等。最后，由于M2巨噬细胞也是器官发育、组织更新和血管生成中不可或缺的参与者，因此M2巨噬细胞的组织重塑活动在再生医学中具有潜在用途。
在组织修复和再生的背景下，不受控制的炎症幅度和持续时间会阻碍再生，例如，慢性炎症环境(如类风湿性关节炎中的环境)会阻碍再生。TRAF6被认为是在宿主防御和炎症性疾病中触发和传播17型免疫应答的核心因素，这些炎症性疾病包括类风湿性关节炎等自身免疫性疾病(Teruki Dainichi,Reiko Matsumoto,Alshimaa Mostafa,KenjiKabashima,“Immune Control by TRAF6-Mediated Pathways of Epithelial Cells inthe EIME(Epithelial Immune Microenvironment)”,Front Immunol,16；10:1107,2019)。TRAF6也是NF-kB通路的关键介质，而该通路反过来对于诱导与免疫和炎症反应以及肿瘤发生相关的基因非常重要。
本发明的发明人惊奇地发现下述式(I)的氨基硫醇酯化合物能够诱导单核细胞相关巨噬细胞的动员并活化M2型巨噬细胞。
此外，癌症疗法的新兴领域一直专注于使用靶向细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、程序性细胞死亡1(PD-1)受体及其配体(PD-L1和PD-L2)等的免疫检查点抑制剂(ICI)，以增强免疫系统以破坏肿瘤。(Gilad,Y.,Eliaz,Y.,Yu,Y.et al.AuthorCorrection:Drug-induced PD-L1 expression and cell stress response in breastcancer cells can be balanced by drug combination.Sci Rep.2020；10,4463)。检查点封锁是一种系统性方法，主要靶向患者的免疫系统，而不是癌细胞本身，以释放免疫应答并重新活化耗尽的T细胞来对抗癌细胞。值得注意的是，对于难以治愈的癌症类型，如晚期转移性黑色素瘤癌症，其存活率和应答持久性令人鼓舞。然而，尽管肿瘤和免疫系统之间经常存在显著的相互作用，但30％-60％的患者对ICI没有应答。因此，可能通过将免疫疗法与其他药物相结合来提高对免疫疗法的敏感性。
由于ICPI的施用增强免疫系统，因此ICI使用的主要安全问题是诱导免疫相关不良事件(irAE)(Ref)。在ICI治疗的个体中已有皮疹、牛皮癣、内分泌病、肝炎、结肠炎、肺炎、关节炎和肌炎的描述，并且irAE的范围仍在扩大。
癌症免疫疗法的另一个好处可能是减少免疫相关不良事件(irAE)，有助于管理免疫耐受并避免自身免疫的出现。
本发明的发明人惊奇地发现下述式(I)的氨基硫醇酯化合物能够改善肿瘤对免疫疗法的敏感性并增强肿瘤部位的抗肿瘤应答，同时减弱irAE的发生。
发明概述
本发明的发明人已经证明下述式(I)的氨基硫醇酯具有免疫调节特性。
他们还表明它们可以与ICI组合使用，具体是用于癌症的治疗。令人惊讶的是，他们已经表明这种组合在预防和/或治疗癌症方面具有协同作用。
因此，本发明涉及至少一种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体，用于调节受试者的免疫应答：
其中：
R1和R2相同或不同且选自：C1-C10烷基、苯基、苄基、CHR5CHR6OR4和(CHR5)vOR4，或R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成杂环，具体是哌啶或吗啉；
所述苯基和苄基任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：直链或支链(C1-C7)烷基、卤素、NO2和CONH2；
-R3选自直链或支链(C1-C7)烷基，
-R4选自：H、直链或支链(C2-C7)烷基、直链或支链(C2-C7)烯基、-CONR7R8、芳基、杂芳基、(C2-C7)环烷基、直链或支链-(C1-C7)烷基-芳基和直链或支链-(C1-C7)烷基-杂芳基；
所述芳基、(C2-C7)环烷基和杂芳基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：卤素、任选被一个或多个卤素原子取代的直链或支链(C1-C7)烷基、任选地被一个或多个卤素原子取代的直链或支链(C1-C7)烷氧基、-COOH、芳基、-NRR'、-NO2，或所述芳基和杂芳基任选地被稠合以形成杂环烷基；
-R5和R6相同或不同且独立地选自：H和直链或支链(C1-C7)烷基，或
R5和R6连接在一起以与它们所连接的碳原子形成环烷基、芳基或杂芳基，或
R5是H，并且R1和R6连接在一起以与连接到R1的氮原子形成杂环烷基或杂芳基，或
R6是H，并且R1和R5与R1连接在一起以与连接到R1的氮原子形成杂环烷基；
-v选自2至4；
-R7是-(C1-C3)烷基；
-R8是-(C1-C3)烷基NRR’；
-R和R’相同或不同且独立地选自H和直链或支链(C1-C7)烷基。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物包含在脂质纳米胶囊中。
本发明还涉及药物组合物，其包含至少一种如本文所定义的式(I)的化合物和免疫检查点抑制剂(ICI)。
本发明还涉及用于预防和/或治疗癌症的药物组合物，其包含至少一种如本文所定义的式(I)的化合物和免疫检查点抑制剂(ICI)。
发明详述
式(I)的化合物
“至少一种式(I)的化合物”是指1、2、3、4、5、6、10、15或更多种式(I)的化合物。
当考虑多于一种式(I)的化合物时，该化合物可以是相同或不同的式(I)的化合物，具体是相同的。
式(I)的化合物如上所述，并与它们的制备方法描述于专利EP1296946和专利申请PCT/EP2020/071640中。
具体地，式(I)的化合物的特征在于R3是直链或支链(C1-C7)烷基，优选甲基；R1是直链或支链(C1-C7)烷基，优选甲基；R2是C1-C10烷基基团优选甲基或辛基、CHR5CHR6OR4、(CHR5)vOR4；或R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成杂环，具体是吗啉；并且R5和R6是H。
例如，R4选自H、直链或支链(C2-C7)烷基、直链或支链(C2-C7)烯基、-CONR7R8、(C2-C7)环烷基、直链或支链-(C1-C7)烷基杂芳基，芳基或苄基；所述(C2-C7)环烷基被一个或多个选自直链或支链(C1-C7)烷基的取代基取代；所述苄基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：任选被一个或多个卤素原子取代的直链或支链(C1-C7)烷基、任选被一个或多个卤素取代的直链或支链(C1-C7)烷氧基、卤素，或者所述苄基任选地被稠合形成1,3-苯并间二氧杂环戊烯。
或者，具体地，R4选自H、直链或支链(C2-C7)烷基、直链或支链(C2-C7)烯基、-(C1-C7)烷基-杂芳基、芳基、-(C1-C7)烷基-芳基或苄基；所述苄基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：任选被一个或多个卤素原子取代的直链或支链(C1-C7)烷基、任选被一个或多个卤素原子取代的直链或支链(C1-C7)烷氧基、卤素或吡啶基，或所述苄基任选被稠合形成1,3-苯并间二氧杂环戊烯。
或者，具体地，R5和R6是H，并且R4选自H、直链或支链(C2-C7)烷基、直链或支链(C2-C7)烯基、直链或支链-(C1-C7)烷基-杂芳基、-(C1-C7)直链或支链烷基-芳基或苄基；所述苄基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：任选被一个或多个卤素原子取代的直链或支链(C1-C7)烷基、任选被一个或多个卤素原子取代的直链或支链(C1-C7)烷氧基、卤素。
或者，更具体地，式(I)的化合物的特征在于R5和R6是H，并且R4选自(C2-C7)环烷基、直链或支链-(C1-C7)烷基-杂芳基或苄基；优选苄基；所述(C2-C7)环烷基被一个或多个选自直链或支链(C1-C7)烷基的取代基取代，所述苄基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：任选被一个或多个卤素原子取代的直链或支链(C1-C7)烷基、任选被一个或多个卤素原子取代的直链或支链(C1-C7)烷氧基、卤素。
作为变体，甚至更具体地，R1是甲基，并且R4选自：H、CONR7R8，其中R7是甲基，并且R8是NRR’，其中R和R’是甲基、乙基、丙烯、苄基、吡啶基、苄氧基丁基、被一个或多个甲基取代的甲基-环己烯基，和被一个或多个氟、氯、甲氧基或甲基取代的苄基。
作为变体，甚至更具体地，R1是甲基，并且R4选自：H、乙基、丙烯、苄基、吡啶基、苄氧基丁基，和被氟、氯、甲氧基或甲基之一取代的苄基。
甚至更具体地，所述至少一种式(I)的化合物选自：
4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-[2-烯丙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-[2-苄氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-甲基-4-[甲基-[2-(间甲苯基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-[2-[(3,4-二甲基苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-[2-[(4-甲氧基苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-[2-[(3,4-二甲氧基苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-[2-[(3-氯苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-[2-[(3-氟苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-甲基-4-[甲基-[2-(2-吡啶基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-甲基-4-[甲基-[2-(3-吡啶基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-甲基-4-[甲基-[2-(4-吡啶基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-((4-(苄氧基)丁基)(甲基)氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-((2-羟乙基)(甲基)氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-甲基-4-[甲基-[2-(2-萘基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-甲基-4-[甲基-[2-[(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)甲氧基]乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
2,5,10,11,11-五甲基-6-氧代-7-氧杂-2,5,10-三氮杂十四碳-12-炔-14-硫代酸S-甲酯；
4-甲基-4-[甲基(2-苯氧基环戊基)氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
(S)-4-(2-((苄氧基)甲基)吡咯烷-1-基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-[3(苄氧基)-1-吡咯烷基])-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
1-4-二甲氨基-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
5-4-甲基-4-吗啉-4-基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-甲基-4-[甲基(辛基)氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
除非另有说明，上下文中使用的关于式(I)的化合物的术语具有如下含义：
v选自2至4，表示取代基“CHR5”重复两次为CHR5CHR5OR4，重复三次为CHR5CHR5CHR5OR4，重复四次为CHR5CHR5CHR5CHR5OR4。
“卤素”是指氟、氯、溴或碘原子，具体是氟或氯原子。
“烷基”表示可以是直链或支链的脂肪族烃基，链(C1-C10)烷基、(C1-C7)烷基或(C2-C7)烷基中具有1至10、1至7或2至7个碳原子，除非另有说明。具体地，烷基在链(C1-C3)烷基中具有1至3个碳原子。支链是指一个或多个烷基如甲基、乙基或丙基连接到直链烷基链上。示例性的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、辛基、2,2-二甲基丁基、正戊基、正己基、正庚基，具体是甲基、乙基或辛基。
“烯基”是指含有碳-碳双键的脂肪族烃基，可以是直链或支链的，在链(C2-C7)烯基中具有2至7个碳原子，除非另有说明。优选的烯基在链(C2-C3)烯基中具有2至3个碳原子。示例性的烯基包括乙烯基、正丙烯基、异丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、2,2-二甲基丁-1-烯基、正戊烯基，具体是丙烯基。
“烷氧基”代表如前所定义的与氧单键结合的烷基。直链或支链(C1-C7)烷氧基的实例包括甲氧基(CH3O-)和乙氧基(CH3CH2O-)。
“芳基”是指6至14个碳原子、优选6至10个碳原子的芳族单环或多环烃环系统。示例性芳基包括苯基、萘基、苄基、菲基、联苯基，具体是苯基。
“杂芳基”是指5至14、优选5至10元芳族单环、双环或多环，其中环的至少一个成员是杂原子。杂原子可以是O或N，具体是N。具体地，每个环包含1至3个杂原子。实例包括吡咯基、吡啶基、哌啶基、吡唑基、嘧啶基、吡嗪基、吲哚基、咪唑基，具体是吡啶基。
“环烷基”是指2至7个碳原子、优选3至6个碳原子的饱和单环或双环非芳族烃环，其可包含一个或多个不饱和度。单环环烷基的具体实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基。优选地，环烷基是环己烯基。
“-(C1-C7)烷基-芳基”或“-(C1-C7)烷基-杂芳基”是指R4通过烷基的碳与氧原子连接；具体地，-(C1-C7)烷基-芳基是苄基。
“杂环”或“杂环烷基”是指饱和或部分不饱和的非芳族稳定的3至14、优选5至10元单环、双环或多环，其可以任选地桥接，并且其中该环的至少一个成员是杂原子。通常，杂原子包括但不限于O或N。具体地，每个环包含1至3个杂原子。合适的杂环还公开于Handbookof Chemistry and Physics,76th Edition,CRC Press,Inc.,1995-1996,pages 225to226，其公开内容通过引用并入本文。杂环烷基的实例包括但不限于四氢吡啶基、四氢吡喃基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、咪唑烷基或苯并间二氧杂环戊烯，具体是1,3苯并间二氧杂环戊烯。
除非另有说明，术语“取代的”是指被一个或多个取代基取代，所述取代基可以相同或不同，例如选自直链或支链的(C1-C7)烷基、卤素、NO2和CONH2，被一个或多个卤原子取代的直链或支链(C1-C7)烷基、直链或支链(C1-C7)烷氧基、被一个或多个卤原子取代的直链或支链(C1-C7)烷氧基、芳基、-COOH、-COOCH2CH3、-NRR’、NH2、NH烷基和N(烷基)2。实例具体包括甲基、甲氧基、氯、氟、CF3和OCF3。
本文所述的式(I)的化合物可包含一个或多个不对称碳原子。因此它们可以以对映异构体或非对映异构体的形式存在。这些对映异构体和非对映异构体以及它们的混合物，包括外消旋混合物，构成本发明的一部分。
本文所述的式(I)的化合物可以以游离碱的形式或以与酸的加成盐的形式提供，这也构成本发明的一部分。
这些盐有利地用药学上可接受的酸制备，但与其他酸的盐，例如可用于纯化或分离本文所述的式(I)的化合物的盐，也构成本发明的一部分。
如本文所用，表述“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题并发症的，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、赋形剂、组合物或剂型。
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸式盐或碱式盐而被修饰。药学上可接受的盐包括例如由无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，此类常规的无毒盐包括衍生自无机酸(如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等)的那些盐，包括其单盐、二盐或三盐；以及由有机酸(如乙酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、苯磺酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲苯磺酸、草酸、富马酸、马来酸、乳酸等)制备的盐。其他的加成盐包括铵盐如氨丁三醇、葡甲胺、吡咯乙醇等，金属盐如钠、钾、钙、锌或镁盐。
本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的量的适当的碱或酸，在水或有机溶剂或两者的混合物中反应来制备。通常，优选非水介质，如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列表可见于Remington’s PharmaceuticalSciences,第20版,Mack Publishing Company,Easton,PA,2000，其公开内容通过引用并入本文。
式(I)的化合物的制备方法
式(I)的化合物可以通过本领域技术人员熟知的多种方法制备。例如，可以通过应用或调整下述方法或如本领域技术人员所理解的其变化来合成化合物。适当的修改和替换对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且是众所周知的或容易从科学文献中获得。
具体地，式(I)的化合物可以根据专利EP1296946和专利申请PCT/EP2020/071640中描述的方法来制备。
应当理解，式(I)的化合物可以含有一个或多个不对称取代的碳原子，并且可以旋光或外消旋形式分离。因此，结构的所有手性、非对映体、外消旋形式、异构体形式都是预期的，除非具体指出具体的立体化学或异构体形式。如何制备和分离此类光学活性形式是本领域众所周知的。例如，立体异构体的混合物可通过标准技术分离，包括但不限于外消旋形式的拆分、正相、反相和手性色谱、优先成盐、重结晶等，或通过手性合成由手性原料或通过有意合成目标手性中心来分离。
式(I)的化合物可以通过多种合成途径制备。试剂和原料是可商购的，或者由本领域普通技术人员通过众所周知的技术容易地合成。除非另有说明，所有取代基均如先前所定义。
在下文描述的反应中，可能需要保护反应性官能团，例如羟基、氨基、亚氨基、硫代基或羧基，其中这些是最终产物中所需要的，以避免它们不希望地参与反应。可以根据标准实践使用常规保护基团，例如参见T.W.Greene and P.G.M.Wuts in Protective Groupsin Organic Chemistry,第四版(2007),John Wiley&Sons Inc.,1999；J.F.W.McOmie inProtective Groups in Organic Chemistry,Plenum Press,1973。
一些反应可以在碱存在下进行。对于该反应中使用的碱的性质没有具体限制，并且在该类型的反应中常规使用的任何碱都可以同样地使用，只要它对分子的其他部分没有不利影响，除非另有说明。合适的碱的实例包括：氢氧化钠、碳酸钾、三乙胺、碱金属氢化物，如氢化钠和氢化钾；烷基锂化合物，如甲基锂和丁基锂；以及碱金属醇盐，如甲醇钠和乙醇钠。
通常，反应在合适的溶剂中进行。可以使用多种溶剂，只要它对反应或所涉及的试剂没有不利影响。
合适的溶剂的实例包括：烃，其可以是芳族、脂肪族或脂环族烃，如己烷、环己烷、苯、甲苯和二甲苯；酰胺，如二甲基甲酰胺；醇，如乙醇和甲醇，以及醚，如二乙醚和四氢呋喃。
反应可以在很宽的温度范围内发生。一般而言，发现在0℃至150℃(更优选约室温至100℃)的温度下进行反应是方便的。反应所需的时间也可能有很大差异，这取决于许多因素，尤其是反应温度和试剂的性质。然而，只要反应在上述优选条件下进行，通常3小时至20小时就足够了。
由此制备的化合物可以通过常规方法从反应混合物中回收。例如，可以通过从反应混合物中蒸馏出溶剂来回收化合物，或者如果需要，可以在从反应混合物中蒸馏出溶剂后，将残余物倒入水中，然后用与水不混溶的有机溶剂萃取，并从萃取液中蒸馏出溶剂来回收化合物。另外，如果需要，产物可以通过各种众所周知的技术，如重结晶、再沉淀或各种色谱技术，尤其是柱色谱或制备型薄层色谱进一步纯化。
例如，式(I)的化合物可以通过以下步骤获得：
a)使式(II)的化合物与有机或无机酸反应
b)使步骤a)得到的化合物与碱反应；
c)使步骤b)得到的化合物与CO2反应；
d)使步骤c)得到的化合物与氯甲酸烷基酯、能够与步骤c)得到的化合物形成酰基卤的试剂，或能够与步骤c)得到的化合物形成混合酸酐的试剂反应；
e)使步骤d)得到的化合物与阴离子前体化合物SMe-反应；其中R1和R2如本文所定义。
具体地，步骤b)的碱具有大于25的pKa，优选步骤b)中使用的碱选自锂碱或镁碱，优选碱选自丁基锂或己基锂。
具体地，式(II)化合物通过步骤a1)使3-氯-3-甲基丁-1-炔与R1R2NH在水性介质中反应获得。
具体地，步骤a1)得到的所述化合物通过一次或多次过滤纯化，例如过滤或连续2至10次过滤，优选连续2至5次过滤，例如4次过滤。
在一个实施方案中，3-氯-3-甲基丁-1-炔通过使2-甲基丁-3-炔-2-醇与盐酸在铜催化剂存在下反应的反应步骤获得。
在另一个实施方案中，酸是选自盐酸、磷酸、硝酸、硫酸的无机酸，优选盐酸。
在另一个实施方案中，步骤d)通过以下物质进行：
-具有(C1-C6)烷基的氯甲酸烷基酯，其可包含至少一个双键，优选氯甲酸甲酯、氯甲酸乙酯、氯甲酸异戊二烯酯、氯甲酸叔丁酯或氯甲酸异丁酯，优选氯甲酸异丁酯；或者
-能够与步骤c)得到的化合物形成混合酸酐的试剂，其选自酰基氯，例如新戊酰氯；或者
-能够与步骤c)得到的化合物形成酰基卤的试剂，其选自SOCl2、COCl2、PCl3、PCl5、PBr3或PPh3 Br2。
在一个实施方案中，阴离子前体化合物SMe-选自式XSMe的盐，其中X表示碱金属或碱土金属，例如Na、甲硫醇或(SMe)2，优选NaSMe。
该过程详细描述于专利申请PCT/EP2017/053457，其内容通过引用并入。
或者，式(I)的化合物可以由相应的乙炔胺依次用BuLi、COS和MeI处理来制备。详细的制备过程可以例如见于G.Quash等人,European Journal of Medicinal Chemistry43(2008)906-916，其内容通过引用并入，具体地在材料和方法部分的第2部分中。
本领域技术人员可以通过应用或调整下文实施例中说明的方法来进行上述反应。
进一步地，该过程还可以包括分离式(I)或(II)的化合物的附加步骤。这可以由技术人员通过任何已知的常规手段，如上述回收方法来完成。
一般而言，起始产物主要可从Aldrich或Acros或其他典型化学品供应商商购获得，或者可以通过应用或调整任何已知方法或实施例中描述的那些方法来获得。
脂质纳米胶囊
如上所述，在一个实施方案中，至少一种式(I)的化合物包含在脂质纳米胶囊中。
“脂质纳米胶囊”或NCL是指具有油作为增溶剂的无溶剂调配剂，增溶剂使得能够包封脂溶性活性成分。
在本发明的上下文中并且如本文所提到的，纳米胶囊包含油性核(具体地在室温下为液体/半液体)和包围油性核的壳(具体地在室温下为刚性的)，并且壳的熔化/转变温度高(即具体地在40℃-85℃)。因此，颗粒的核由油组成，这里是中链甘油三酯。有效成分(至少一种式(I)的化合物)溶解在纳米胶囊中心的该相中。纳米胶囊或壳的表面由亲水性表面活性剂和脂质表面活性剂形成。
这种结构可以用图1来说明。
具体地，所述纳米胶囊包含：
-油性核，其包含相对于纳米胶囊总重量，按重量计25％-90％、优选60％-80％的中链甘油三酯，和所述至少一种式(I)的化合物；和
-包围油性核的壳，其包含相对于纳米胶囊的总重量，按重量计3％-25％的至少一种脂质表面活性剂和至少一种亲水性表面活性剂；并且
其中中链甘油三酯和至少一种式(I)的化合物相对于纳米胶囊总重量的重量比为至少4。
具体地，所述纳米胶囊的直径为25-115nm，更具体地为40-80nm，例如30nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm或70nm。
该尺寸具体地可以确保纳米胶囊在体内的最佳效率。
具体地，所述纳米胶囊的PDI或多分散指数小于0.2、具体地小于0.1。该指标也称为分散度，是本领域技术人员已知的常识，即混合物中分子或颗粒尺寸的不均匀性的量度。这具体地允许纳米胶囊的尺寸分布是单分散的。
如上所述，油性核包含相对于纳米胶囊的总重量，按重量计25％-90％，优选60％至80％的中链甘油三酯，例如按重量计40％、50％、55％、60％或70％的中链甘油三酯。
“中链甘油三酯”是指本领域技术人员已知的常识，即其中甘油的三个羟基被中链脂肪酸酯化的甘油三酯。
术语“中链”应理解为具体地是指6至12个碳原子的链。
它们主要存在于椰子油、棕榈油和黄油中。
具体地，中链甘油三酯选自饱和脂肪酸、具体地是辛酸和癸酸的甘油三酯的混合物。
脂肪酸可以获自从椰子(Cocos nucifera L.)的蛋白的硬的、干燥的部分中提取的油，或者从油棕(Elaeis guineensis Jacq.)的干燥蛋白中提取的油，脂肪酸满足欧洲药典的先决条件，如更具体地MCT 70、810N、812N赋形剂和优选
具体地，油性核包含相对于纳米胶囊的总重量，按重量计25％-90％，优选60％-80％的例如40％、50％、55％、60％或70％。
如上所述，包围油性核的壳包含基于纳米胶囊总重量的3％-25％的至少一种脂质表面活性剂。具体地，壳包含相对于纳米胶囊的总重量，按重量计3％-20％的至少一种脂质表面活性剂，更具体地5％-20％，例如5％、6％、8％、10％、12％或20％。
该脂质表面活性剂的比例具体地使得可以改善纳米胶囊在其低温储存期间的稳定性。这里所说的低温是指低于0℃的温度。
“脂质表面活性剂”是指本领域技术人员已知的常识，即对脂质溶液具有增加的趋向性并且使得可以稳定纳米胶囊的乳化剂。
具体地，所述至少一种脂质表面活性剂选自从大豆油获得的卵磷脂，其具有大于90％的磷脂酰胆碱百分比，符合欧洲药典的先决条件，具体地是优选S100。
更具体地，壳包含相对于纳米胶囊的总重量，按重量计3％-20％的S100，更具体地5％-20％，例如5％、6％、8％、10％、12％或20％。
如上所述，包围油性核的壳还包含至少一种亲水性表面活性剂。
“亲水性表面活性剂”是指本领域技术人员已知的常识，即允许和稳定纳米颗粒并使后者可溶于水的两亲性分子和/或乳化剂。
具体地，所述至少一种亲水性表面活性剂选自满足欧洲药典中描述的先决条件的非离子增溶剂和/或乳化剂，具体地是聚乙二醇15羟基硬脂酸酯，更具体地是优选HS15。
具体地，壳包含相对于纳米胶囊的总重量，按重量计15％-60％的至少一种亲水性表面活性剂，更具体地20％-50％，例如15％；20％；30％；35％；40％或50％。
更具体地，壳包含相对于纳米胶囊的总重量，按重量计15％-60％的HS15，更具体地20％-50％，例如15％；20％；30％；35％；40％或50％。
具体地，在本发明的上下文中，所述至少一种式(I)的化合物可以以5-15mg/mL、更具体地8-13mg/mL，例如9mg/mL、10mg/mL或11mg/mL的浓度包含在纳米胶囊中。
该浓度具体地可以防止式(I)的化合物随时间的结晶，同时限制其水解。
如上所述，根据本发明的纳米胶囊包含的中链甘油三酯和所述至少一种式(I)的化合物相对于纳米胶囊总重量的重量比为至少4，具体地是至少5。
“至少4”具体地是指4-100，更具体是5-50，例如4、5、6、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100。
“至少5”具体地是指5-100，更具体是10-50，例如5、6、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100。
该比例具体地可以避免式(I)的化合物的结晶。
因此，根据本发明的纳米胶囊的特征可以例如在于其包含：
-油性核，其包含相对于纳米胶囊的总重量，按重量计25％-90％，优选60％-80％的和
-包围油性核的壳，其包含相对于纳米胶囊总重量，按重量计3％-25％的S100，以及相对于纳米胶囊的总重量，按重量计15％-60％的HS15，具体地是20％-50％，例如15％；20％；30％；35％；40％或50％；
其中油性核包含至少一种如上所述的式(I)的化合物；
其中与所述至少一种式(I)的化合物相对于纳米胶囊总重量的重量比为至少4，优选至少5。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-[2-烯丙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-[2-苄氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-甲基-4-[甲基-[2-(间甲苯基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-[2-[(3,4-二甲基苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-[2-[(4-甲氧基苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-[2-[(3,4-二甲氧基苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-[2-[(3-氯苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-[2-[(3-氟苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲基酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-甲基-4-[甲基-[2-(2-吡啶基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-甲基-4-[甲基-[2-(3-吡啶基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-甲基-4-[甲基-[2-(4-吡啶基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-((4-(苄氧基)丁基)(甲基)氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-((2-羟乙基)(甲基)氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-甲基-4-[甲基-[2-(2-萘基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-甲基-4-[甲基-[2-[(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)甲氧基]乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是2,5,10,11,11-五甲基-6-氧代-7-氧杂-2,5,10-三氮杂十四碳-12-炔-14-硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-甲基-4-[甲基(2-苯氧基环戊基)氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是(S)-4-(2-((苄氧基)甲基)吡咯烷-1-基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-[3(苄氧基)-1吡咯烷基])-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是1-4-二甲氨基-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是5-4-甲基-4-吗啉-4-基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
具体地，所述至少一种式(I)的化合物是4-甲基-4-[甲基(辛基)氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体。
脂质纳米胶囊的制备
脂质纳米胶囊可以如实验部分中提到的那样制备。
例如，纳米胶囊的制备如下：
-称量中链甘油三酯，添加至少一种式(I)的化合物并在搅拌下混合；
-称量所述至少一种亲水性表面活性剂和所述至少一种脂质表面活性剂，添加NaCl和水；
-在搅拌下将水相转移至油相；
-转移到油浴中并在强力搅拌下加热溶液；
-达到一定温度后，转移到冰中冷却；
-转移回油浴中加热；
-额外重复几次冷却和加热步骤；
-在最后一个加热步骤结束时，转移到冰浴中并冷却；
-当调配剂达到一定温度时，添加冷水；
-移开冰浴并搅拌；
-将调配剂转移到适当的容器中。
在一个实施方案中，纳米胶囊可以配制在包含水和盐(如NaCl)的调配剂中。
因此，该调配剂包含纳米颗粒，相对于调配剂总重量，按重量计50％-70％，例如60％的水，和相对于调配剂总重量，按重量计1％至5％，例如2％或3％的盐。
在一个实施方案中，所述式(I)的化合物或所述脂质纳米胶囊包含在药物组合物中。
这种组合物可以制备用于口服施用，具体地是片剂或胶囊剂的形式，具体地是口腔分散(lyoc)片剂；或肠胃外施用，具体地是以液体溶液剂、混悬剂或乳剂的形式。其可以通过制药领域熟知的任何方法来制备，例如，如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第20版；Gennaro,A.R.,Ed.；Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,2000中所描述的。药学相容的粘合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分包含在内。口服组合物通常包含惰性稀释剂载体或可食用载体。它们可以以单位剂量形式施用，其中术语“单位剂量”是指能够向患者施用并且可以容易地处理和包装的单剂量，其保持为物理和化学稳定的单位剂量，其包含活性化合物本身，或作为药学上可接受的组合物。
片剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、锭剂等可含有一种或多种任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素或黄蓍胶；稀释剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如淀粉和纤维素衍生物；润滑剂，如硬脂酸镁；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷或水杨酸甲酯。胶囊剂可以是硬胶囊或软胶囊的形式，其通常由任选地与增塑剂混合的明胶混合物制成，以及淀粉胶囊的形式。此外，剂量单位形式可以包含改变剂量单位的物理形式的各种其他材料，例如糖、紫胶或肠溶剂的包衣。其他口服剂型糖浆或酏剂可含有甜味剂、防腐剂、染料、着色剂和调味剂。此外，活性化合物可掺入快速溶解、调节释放(modified-release)或持续释放制剂和调配剂中，并且其中此类持续释放调配剂优选是双峰的。
用于施用的液体制剂包括无菌水性或非水性溶剂、混悬剂和乳剂。液体组合物还可包含粘合剂、缓冲剂、防腐剂、螯合剂、甜味剂、调味剂和着色剂等。非水性溶剂包括醇、丙二醇、聚乙二醇、丙烯酸酯共聚物、植物油如橄榄油、以及有机酯如油酸乙酯。水性载体包括醇和水的混合物、水凝胶、缓冲介质和盐水。具体地，生物相容性、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以是控制活性化合物释放的有用赋形剂。静脉内媒介物可以包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，如基于林格氏葡萄糖的那些等。
施用方式的实例包括肠胃外施用，例如皮下、肌内、静脉内、皮内以及口服施用。
用途
如已经提到的，本发明涉及至少一种本文所述的式(I)的化合物，其用于调节受试者的免疫应答。
如上所述，该化合物可以包含在脂质纳米颗粒中，并且所述化合物或所述脂质纳米颗粒可以包含在药物组合物中。
在本发明的范围内，“免疫调节”特性或允许“免疫应答的调节”被理解为通常赋予这些术语并且为本领域技术人员所熟知的含义，具体地是任何可能刺激或减缓受试者免疫应答的特性。
具体地，本发明涉及所述至少一种式(I)的化合物用于刺激受试者的免疫应答。
更具体地，本发明的发明人发现式(I)的化合物能够增强白细胞和对感染的反应，具体地是通过刺激和促进嗜中性粒细胞的成熟和活化。
因此，本发明更具体地涉及至少一种式(I)的化合物，其用于治疗和/或预防感染性病症，具体地是通过刺激和促进嗜中性粒细胞的成熟和/或活化。
“感染性病症”是指由生物体如细菌、病毒、真菌或寄生虫引起的疾病。例如，可以列举细菌感染，包括沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Staphylococcus aureus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、细菌性脑膜炎、衣原体真菌感染，包括曲霉病、真菌性脑膜炎、组织胞浆菌病；寄生虫感染，包括疟疾、弓形体病、滴虫病、贾第虫病、绦虫和蛔虫感染、利什曼病和病毒感染，包括水痘、流感、疱疹人乳头瘤病毒、传染性单核细胞增多症、腮腺炎、玫瑰疹、天花、第五疾病、麻疹、风疹和基孔肯雅病毒感染。
具体地，式(I)的化合物可以用于治疗中性粒细胞计数低的患者以促进嗜中性粒细胞恢复。所述用途尤其可用于管理患有药物诱发的嗜中性粒细胞减少症的患者，所述药物包括化疗剂如烷化剂、蒽环类药物、喜树碱、丝裂霉素C、紫杉烷、长春花碱、羟基脲等，以及引起可能成为长期并发症的迟发性嗜中性粒细胞减少症的非化疗药物，如利妥昔单抗、卡比马唑、氯氮平、氨苯砜、安乃近、他巴唑、苯唑西林、万古霉素、青霉素G、普鲁卡因酰胺、丙硫氧嘧啶、柳氮磺吡啶和噻氯匹定，以及以较低速率引起嗜中性粒细胞减少症的常用药物，如血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、H2阻滞剂、非甾体抗炎药(NSAID)和抗心律失常药物等。
此外，本发明的发明人发现式(I)的化合物能够改善伤口愈合和/或组织修复；具体地通过促进血管生成、M2分化和M2相关生长因子(如VEGFA和IGF-1)的产生，这有助于组织再生。此外，他们发现所述化合物能够控制自身免疫病理状况和/或代谢疾病，具体地引起炎症的自身免疫病理状况和/或代谢疾病，具体地通过动员和募集单核细胞成为组织驻留的M2巨噬细胞。
因此，本发明还更具体地涉及至少一种式(I)的化合物，其用于治疗和/或预防伤口愈合和/或组织修复；自身免疫病理状况和/或代谢疾病，具体地为引起炎症的疾病。
“自身免疫病理状况”是指对于本领域技术人员而言的正常含义，即由对功能性身体部分的异常免疫应答引起的病症。可以列举以下病症作为实例：类风湿性关节炎、炎症性肠病、系统性红斑狼疮、多发性硬化症和牛皮癣。
“代谢疾病”是指对于本领域技术人员而言的正常含义，即体内异常化学反应改变正常代谢过程的疾病。可以列举以下疾病作为实例：动脉粥样硬化、2型糖尿病、慢性肾病、非酒精性脂肪肝病和肥胖症，包括影响脂肪组织、肝脏、骨骼肌、胰腺、肠和下丘脑的内脏肥胖。
在一个实施方案中，至少一种式(I)的化合物与免疫检查点抑制剂组合。
“免疫检查点抑制剂”或“ICI”是本领域技术人员熟知的化合物。这些化合物是可以阻断称为检查点的蛋白质的一种药物，这些蛋白质由某些类型的免疫系统细胞(如T细胞)和一些癌细胞产生。
本发明优选的免疫检查点抑制剂选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIGIT、TIM-3、LAG-3CD160和2B4化合物，具体地选自PD1/PDL1化合物。
除非另有说明，术语“患者”或“受试者”是指患有或有可能患有一种或多种本文描述的疾病和病症的温血动物，如哺乳动物，具体地是人类，男性或女性。
本发明上下文中使用的术语“治疗”是指其中目的是消除或减轻症状的治疗性治疗。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的消除、症状的减轻、病症程度的减轻、病症的稳定(即，不恶化)状态、病症进展的延迟或减慢。
如本发明的上下文中所使用的，术语“预防”是指预防疾病或病状或一种或多种其症状的发作、复发或传播。在某些实施方案中，该术语是指在症状出现之前，用本文提供的化合物治疗或施用本文提供的化合物，具体地施用于具有本文提供的疾病或病状风险的患者。该术语涵盖特定疾病的症状的抑制或减少。在某些实施方案中，具体地是具有疾病家族史的受试者预防方案的候选者。此外，有复发症状史的受试者也是预防的潜在候选者。在这点上，术语“预防”可以与术语“预防性治疗”互换使用。
在本发明的上下文中，如上所述进行需要治疗本文所述的疾病和病症的受试者的鉴定，并且完全在本领域技术人员的能力和知识范围内。本领域技术人员可以通过上述技术容易地鉴定那些需要这种治疗的受试者。
作为本领域技术人员，主治诊断医师可以通过使用常规技术并通过观察在类似情况下获得的结果而容易地确定治疗有效量。在确定治疗有效量时，主治诊断医生考虑许多因素，包括但不限于：受试者的物种；其体型、年龄和总体健康状况；所涉及的具体疾病；疾病的参与程度或严重程度；个体受试者的反应；施用的特定化合物；施用方式；所施用制剂的生物利用度特征；选择的剂量方案；伴随药物的使用；及其他相关情况。
如本文所用，“有效量”是指有效减少、消除、治疗或控制本文所述疾病和病症的症状的量。术语“控制”旨在指其中可能减慢、中断、阻止或停止本文描述的疾病和病症进展的所有过程，但不一定表示所有疾病和病症症状的完全消除，并且旨在包括预防性治疗和长期使用。
实现所需生物效应所需的本发明化合物的量将根据许多因素而变化，包括待施用药物的剂量、所用化合物的化学特性(例如疏水性)、化合物的效力、疾病的类型、患者的疾病状态以及施用途径。
本文提供的化合物可以任选地通过与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合而配制成药物组合物。
此类组合物可以制备用于口服施用，具体地以片剂或胶囊剂的形式，具体地以口腔分散(lyoc)片剂的形式；或肠胃外施用，具体地以液体溶剂、混悬剂或乳剂的形式。它可以通过制药领域熟知的任何方法来制备，例如，如Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,第20版；Gennaro,A.R.,Ed.；Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,2000中所描述的。药学相容的粘合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分包含在内。口服组合物通常包含惰性稀释剂载体或可食用载体。它们可以以单位剂量形式施用，其中术语“单位剂量”是指能够向患者施用并且其可以容易地处理和包装的单剂量，其保持为物理和化学稳定的单位剂量，其包含活性化合物本身，或作为药学上可接受的组合物。
片剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、锭剂等可含有一种或多种任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素或黄蓍胶；稀释剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如淀粉和纤维素衍生物；润滑剂，如硬脂酸镁；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷或水杨酸甲酯。胶囊剂可以是硬胶囊或软胶囊的形式，其通常由任选地与增塑剂混合的明胶混合物制成，以及淀粉胶囊的形式。此外，剂量单位形式可以包含改变剂量单位的物理形式的各种其他材料，例如糖、紫胶或肠溶剂的包衣。其他口服剂型糖浆或酏剂可含有甜味剂、防腐剂、染料、着色剂和调味剂。此外，活性化合物可掺入快速溶解、调节释放或持续释放制剂和调配剂中，并且其中此类持续释放调配剂优选是双峰的。
用于施用的液体制剂包括无菌水性或非水性溶剂、混悬剂和乳剂。液体组合物还可包含粘合剂、缓冲剂、防腐剂、螯合剂、甜味剂、调味剂和着色剂等。非水性溶剂包括醇、丙二醇、聚乙二醇、丙烯酸酯共聚物、植物油如橄榄油、以及有机酯如油酸乙酯。水性载体包括醇和水的混合物、水凝胶、缓冲介质和盐水。具体地，生物相容性、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以是控制活性化合物释放的有用赋形剂。静脉内媒介物可以包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，如基于林格氏葡萄糖的那些等。
施用方式的实例包括肠胃外施用，例如皮下、肌内、静脉内、皮内以及口服施用。
具体地，当组合使用时，所述至少一种式(I)的化合物和ICI分开、依次或同时施用，优选分开施用。
例如，如果所述至少一种式(I)的化合物(无论是否封装)和所述ICI依次施用，则至少一种式(I)的化合物可以在施用ICI之前施用。
或者，首先施用ICI，然后施用至少一种式(I)的化合物。
药物组合物和产品
本发明还涉及药物组合物，其包含至少一种如上所定义的式(I)的化合物和免疫检查点抑制剂。
本发明还涉及包含至少一种如上所定义的式(I)的化合物和免疫检查点抑制剂的产品，其作为用于同时使用、分开使用或随时间分散开使用的组合制剂。
本发明还涉及用作药物的至少一种如上所定义的式(I)的化合物，其中所述至少一种式(I)的化合物与免疫检查点抑制剂组合。
具体地，如上所述，所述至少一种式(I)的化合物可以包含在脂质纳米胶囊中。
如上所述，“免疫检查点抑制剂”或“ICI”是本领域技术人员熟知的化合物。这些化合物是一种可以阻断称为检查点的蛋白质的药物，这些蛋白质是由某些类型的免疫系统细胞(如T细胞)和一些癌细胞产生的。
本发明优选的免疫检查点抑制剂选自PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIGIT、TIM-3、LAG-3CD160和2B4化合物，具体地选自PD1/PDL1化合物。
更具体地，所述药物组合物、产品或至少一种式(I)的化合物与ICI组合用于预防和/或治疗癌症。
如本文所用且除非另有定义，“癌症”是指体内异常细胞的生长、分裂或增殖。它是指任何类型的恶性(即非良性)肿瘤。恶性肿瘤可以对应于原发性肿瘤或继发性肿瘤(即转移瘤)。此外，肿瘤可以对应于实体恶性肿瘤，其包括例如癌、腺癌、肉瘤、黑色素瘤、间皮瘤、母细胞瘤，或对应于血癌，如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。癌症可以例如对应于黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、急性髓性白血病、肝细胞癌、鳞状细胞头颈癌、肾细胞癌、宫颈癌、梅克尔细胞癌、PMBCL、经典霍奇金淋巴瘤、胃癌和GEJ癌。
具体地，待预防和/或治疗的癌症是黑色素瘤、肺癌和结肠癌。
仍然具体地，所述癌症是化学抗性和/或辐射抗性癌症。
“化学抗性”是指化学疗法对其不起作用或停止起作用的本文所述的癌症。
“放射抗性”是指放射疗法对其不起作用或停止起作用的本文所述的癌症。
具体地，需要抗癌治疗的受试者是患有此类疾病的受试者。
除非另有说明，术语“患者”或“受试者”是指患有或有可能患有本文所述的一种或多种疾病和病症的温血动物，如哺乳动物，具体地是人类，男性或女性。
本发明上下文中使用的术语“治疗”是指其中目的是消除或减轻症状的治疗性治疗。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的消除、症状的减轻、病症程度的减轻、病症的稳定(即，不恶化)状态、病症进展的延迟或减慢。
如本发明的上下文中所使用的，术语“预防”是指预防疾病或病状或一种或多种其症状的发作、复发或传播。在某些实施方案中，该术语是指在症状出现之前，用本文提供的化合物治疗或施用本文提供的化合物，具体地施用于具有本文提供的疾病或病状风险的患者。该术语涵盖特定疾病的症状的抑制或减少。在某些实施方案中，具体地是具有疾病家族史的受试者预防方案的候选者。此外，有复发症状史的受试者也是预防的潜在候选者。在这点上，术语“预防”可以与术语“预防性治疗”互换使用。
在本发明的上下文中，如上所述进行需要治疗本文所述的疾病和病症的受试者的鉴定，并且完全在本领域技术人员的能力和知识范围内。本领域技术人员可以通过上述技术容易地鉴定那些需要这种治疗的受试者。
作为本领域技术人员，主治诊断医师可以通过使用常规技术并通过观察在类似情况下获得的结果而容易地确定治疗有效量。在确定治疗有效量时，主治诊断医生考虑许多因素，包括但不限于：受试者的物种；其体型、年龄和总体健康状况；所涉及的具体疾病；疾病的参与程度或严重程度；个体受试者的反应；施用的特定化合物；施用方式；所施用制剂的生物利用度特征；选择的剂量方案；伴随药物的使用；及其他相关情况。
如本文所用，“有效量”是指有效减少、消除、治疗或控制本文所述疾病和病症的症状的量。术语“控制”旨在指其中可能减慢、中断、阻止或停止本文描述的疾病和病症进展的所有过程，但不一定表示所有疾病和病症症状的完全消除，并且旨在包括预防性治疗和长期使用。
实现所需生物效应所需的本发明化合物的量将根据许多因素而变化，包括待施用药物的剂量、所用化合物的化学特性(例如疏水性)、化合物的效力、疾病的类型、患者的疾病状态以及施用途径。
本文提供的化合物可以任选地通过与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合而配制成药物组合物。
此类组合物可以制备用于口服施用，具体地以片剂或胶囊剂的形式，具体地以口腔分散(lyoc)片剂的形式；或肠胃外施用，具体地以液体溶剂、混悬剂或乳剂的形式。它可以通过制药领域熟知的任何方法来制备，例如，如Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,第20版；Gennaro,A.R.,Ed.；Lippincott Williams&Wilkins:Philadelphia,PA,2000中所描述的。药学相容的粘合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分包含在内。口服组合物通常包含惰性稀释剂载体或可食用载体。它们可以以单位剂量形式施用，其中术语“单位剂量”是指能够向患者施用并且可以容易地处理和包装的单剂量，其保持为物理和化学稳定的单位剂量，其包含活性化合物本身，或作为药学上可接受的组合物。
片剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、锭剂等可含有一种或多种任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素或黄蓍胶；稀释剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如淀粉和纤维素衍生物；润滑剂，如硬脂酸镁；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷或水杨酸甲酯。胶囊剂可以是硬胶囊或软胶囊的形式，其通常由任选地与增塑剂混合的明胶混合物制成，以及淀粉胶囊的形式。此外，剂量单位形式可以包含改变剂量单位的物理形式的各种其他材料，例如糖、紫胶或肠溶剂的包衣。其他口服剂型糖浆或酏剂可含有甜味剂、防腐剂、染料、着色剂和调味剂。此外，活性化合物可掺入快速溶解、调节释放或持续释放制剂和调配剂中，并且其中此类持续释放调配剂优选是双峰的。
用于施用的液体制剂包括无菌水性或非水性溶剂、混悬剂和乳剂。液体组合物还可包含粘合剂、缓冲剂、防腐剂、螯合剂、甜味剂、调味剂和着色剂等。非水性溶剂包括醇、丙二醇、聚乙二醇、丙烯酸酯共聚物、植物油如橄榄油、以及有机酯如油酸乙酯。水性载体包括醇和水的混合物、水凝胶、缓冲介质和盐水。具体地，生物相容性、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以是控制活性化合物释放的有用赋形剂。静脉内媒介物可以包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，如基于林格氏葡萄糖的那些等。
施用方式的实例包括肠胃外施用，例如皮下、肌内、静脉内、皮内以及口服施用。
具体地，至少一种式(I)的化合物和ICI分开、依次或同时施用，优选分开施用。
例如，如果所述至少一种式(I)的化合物(无论是否封装)和所述ICI依次施用，则至少一种式(I)的化合物可以在施用ICI之前施用。
或者，首先施用ICI，然后施用至少一种式(I)的化合物。
在本发明的上下文中，应当理解，“用于治疗或预防的化合物”等同于“用于治疗或预防的化合物的用途”和“用于制造用于治疗或预防的药物的用途”。
通过下面通过附图和实施例对本发明作进一步说明。注：在下图和实施例中，DIMATE对应于1-4-二甲氨基-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯。
附图
图1：根据本发明的纳米胶囊的图示。
图2：用负载DIMATE(LNP-DIMATE)或未负载(LNP)的脂质纳米颗粒调配剂处理的免疫活性小鼠中，嗜中性粒细胞和粒细胞-巨噬细胞血细胞亚群的流式细胞术门控策略和定量。对照包括用PBS(药物载体)或免疫检查点抑制剂抗PDL1处理的小鼠。
图3：用负载DIMATE(LNP-DIMATE)或未负载(LNP)的脂质纳米颗粒调配剂处理的免疫活性小鼠中，单核细胞衍生的巨噬细胞和M2型巨噬细胞(M2)血细胞亚群的定量。如图2所示，对照包括用PBS(药物载体)或免疫检查点抑制剂抗PDL1处理的小鼠。
图4：经DIMATE处理后与未处理的细胞相比，HL60细胞中与NFkB信号传导通路(NFKB2、IKBKB、NFKB1、RELB、NFKBIA、TRAF6)、M2(AXL、CHI3L1)，以及分化、细胞增殖和血管生成(VEGFA、TGFA)相关的基因的基因表达谱。HL60细胞系是淋巴母细胞样形态的早幼粒细胞系，已知表现出吞噬活性和对趋化刺激的应答性。在横坐标轴上，样品分为两组(NT：未处理，D10：DIMATE(10μM))，N＝4个独立实验)。在纵坐标上，探针代表差异表达的基因)。
图5：A用负载DIMATE(LNP-DIMATE)或未负载(LNP)的脂质纳米颗粒调配剂处理的Tyr-BRAF免疫活性黑色素瘤小鼠模型的瘤内环境中NK细胞、CD8+T细胞和T效应细胞亚群的定量。对照包括用PBS(药物媒介物)或免疫检查点抑制剂抗PDL1处理的小鼠。B在癌症免疫疗法的动物模型中，LNP-DIMATE与抗PDL1组合对黑色素瘤、结肠癌和肺癌肿瘤生长的协同抑制作用。
图6：A 暴露于DIMATE的人源NK细胞的裂解活性，并表示为死亡靶细胞(k562细胞)的百分比。N＝6；比例尺＝标准误差。B HL60和kasumi 3造血细胞系中c-IAP2和XIAP蛋白表达对DIMATE的应答。上样对照对应于WES Protein Simple的制造商提供的内部系统对照。
实施例
第1部分-式(I)的化合物的制备
代表性的式(I)的化合物总结于下表1中：
表1
式(I)的代表性化合物可以根据以下程序合成。
一般分析程序
1H和13C NMR谱在来自Broker的Broker Advance ALS300和DRX400 MHz上记录。化学位移以ppm(δ)报告，并参考DMSO-d6(1H，2.50ppm；13C，39.52ppm)或CDCl3(7.26ppm)。耦合常数(J)以Hz为单位给出。
HRMS-ESI质谱在具有电喷雾电离(ESI)离子源的混四极杆串联飞行时间质谱仪(MicroTOFQ-ll,Broker Daltonics,Bremen)上以正离子模式记录。对于低分辨率质谱仪，LRMS-ESI质谱在Thermo Finnigan MAT 95XL光谱仪中记录。
实施方案1：4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯
N-(2-乙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺的制备：
在室温下，向N-甲基-N-(2’羟乙基)-3-氨基-3甲基-1-丁炔(Easton,Nelson R.；Hennion,George F.U.S.(1967),US 3337625 19670822.)(1.0g，7.08mmol)和碘乙烷(0.98mL，7.6mmol)的THF(12mL)溶液添加NaH(0.459g，11.5mmol)，并将混合物回流3h。然后在室温下用水仔细水解混合物，并用EtOAc(3x25 mL)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化粗产物(石油醚/EtOAc＝70/30)，得到纯的N-(2-乙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺(0.479g，40％)。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ3.45-3.36(m,4H),3.11(s,1H),2.51(t,J＝6.7Hz,.2H),2.20(s,3H),1.27(s,6H),1.09(t,J＝7.0Hz,3H).
ESI-LRMS170.0[M+H]+.
4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
在-70℃下，向N-(2-乙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺(0.367g，2.17mmol)的THF(11mL)溶液滴加2.28M n-BuLi的己烷溶液(1.14mL，2.60mmol)。在-70℃下5分钟后，将反应混合物温热至0℃，在此温度下保持10分钟，然后在-70℃下冷却，然后将硫化羰(COS)鼓泡通过溶液30分钟。将黄色溶液温热至0℃，在此温度下再搅拌10分钟，然后滴加碘甲烷(0.162mL，2.60mmol)。将混合物搅拌2小时，在0℃下仔细地用水水解并用乙醚萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并真空浓缩。通过硅胶色谱法(石油醚/EtOAc＝90/10)纯化粗产物，得到近无色油状的4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯(0.369g，70％)。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ3.42(t,J＝6.3Hz,2H),3.42(q,J＝7.0Hz,2H),2.56(t,J＝6.3Hz,2H),2.39(s,3H),2.25(s,3H),1.36(s,6H),1.10(t,J＝7.0Hz,3H).
ESI-HRMS C12H22NO2S[M+H]+计算值:244.1366,实测值:244.1362.
实施例2：4-[2-烯丙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯
N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺的制备：
在0℃下，向N-甲基-N-(2’羟乙基)-3-氨基-3甲基-1-丁炔(Easton,Nelson R.；Hennion,George F.U.S.(1967),US 3337625 19670822.)(1.0g，7.08mmol)的THF(12mL)溶液添加NaH(0.340g，8.50mmol)。在0℃下15分钟并在室温下15分钟后，在0℃下一次性添加n-Bu4NI(0.026g，0.071mmol)，随后滴加烯丙基溴(0.735mL，8.50mmol)。使反应混合物达到室温，搅拌过夜，然后仔细地用水水解并用乙醚(3x25 mL)萃取。合并的有机层用盐水洗涤(25mL)，经Na2SO4干燥并真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/乙醚＝80/20至70/30)，得到油状的纯N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺(0.941g，73％)。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ5.88(ddt,J＝17.3,10.5,5.3Hz,1H),5.24(ddd,J＝17.3,3.8,1.7Hz,1H),5.16-5.09(m,1H),3.93(dt,J＝5.3,1.6Hz,2H),3.43(t,J＝6.4Hz,2H),3.12(s,1H),2.55(t,J＝6.4Hz,2H),2.21(s,3H),1.27(s,6H).
ESI-LRMS182.0[M+H]+.
4-[2-烯丙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺开始，获得化合物。规模：2.2mmol。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝90/10至80/20)。收率：65％。近无色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ5.88(ddt,J＝17.3,10.5,5.3Hz,1H),5.24(ddd,J＝17.3,3.8,1.7Hz,1H),5.17-5.10(m,1H),3.94(dt,J＝5.3,1.5Hz,2H),3.45(t,J＝6.2Hz,2H),2.58(t,J＝6.2Hz,2H),2.39(s,3H),2.26(s,3H),1.36(s,6H).
ESI-HRMS C13H22NO2S[M+H]+计算值:256.1366,实测值:256.1364.
实施例3：4-[2-苄氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯
N-(2-苄氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺的制备：
使用与针对N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺[实施例2]所述的相同方法，使用1.015eq的NaH和1.01eq的溴化苄，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝90/10)。收率：81％。无色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.39-7.24(m,5H),4.47(s,2H),3.49(t,J＝6.3Hz,2H),3.12(s,1H),2.58(t,J＝6.3Hz,2H),2.21(s,3H),1.27(s,6H).ESI-LRMS232.0[M+H]+.
4-[2-苄氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从N-(2-苄氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺开始，获得化合物。规模：2.2mmol。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝90/10)。收率：79％。无色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.37-7.26(m,5H),4.48(s,2H),3.52(t,J＝6.1Hz,2H),2.62(t,J＝6.1Hz,2H),2.38(s,3H),2.26(s,3H),1.36(s,6H).
ESI-HRMS C17H24NO2S[M+H]+计算值:306.1522,实测值:306.1514.
替代方案：
在-70℃下，向N-(2-苄氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺(0.650g，2.81mmol)的THF(8mL)溶液滴加2.28M n-BuLi的己烷溶液(1.36mL，3.09mmol)。在-70℃下5分钟后，将反应混合物温热至0℃，在此温度下保持30分钟，并将CO2鼓泡通过溶液30分钟。将混合物在5分钟内升温至室温，然后在0℃下重新冷却。滴加氯甲酸异丁酯(0.40ml，3.08mmol)并将混合物搅拌10分钟，然后一次性添加甲醇钠(0.236g，3.37mmol)。将混合物温热至室温，在此温度下再搅拌15分钟，然后在0℃下仔细地用水水解并用乙醚萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化粗产物(石油醚/EtOAc＝90/10)，得到纯的4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯(0.307g，36％)。
实施例4：4-甲基-4-[甲基-[2-(间甲苯基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲 酯
N-2-二甲基-N-[2-(间甲苯基甲氧基)乙基]丁-3-炔-2-胺的制备：
使用与针对N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺[实施例2]所述的相同方法，使用3-甲基苄溴获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝90/10)。规模：4.5mmol。收率：79％。无色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.26-7.19(m,1H),7.16-7.05(m,3H),4.43(s,2H),3.48(t,J＝6.3Hz,2H),3.12(s,1H),2.57(t,J＝6.3Hz,2H),2.30(s,3H),2.21(s,3H),1.27(s,6H).
ESI-LRMS246.1[M+H]+.
4-甲基-4-[甲基-[2-(间甲苯基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从N-2-二甲基-N-[2-(间甲苯基甲氧基)乙基]丁-3-炔-2-胺开始，获得化合物。规模：1.3mmol。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝90/10)。收率：77％。无色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.26-7.19(m,1H),7.16-7.05(m,3H),4.44(s,2H),3.50(t,J＝6.1Hz,2H),2.62(t,J＝6.1Hz,2H),2.38(s,3H),2.30(s,3H),2.26(s,3H),1.36(s,6H).
ESI-HRMS C18H26NO2S[M+H]+计算值:320.1679,实测值:320.1667.
实施例5：4-[2-[(3,4-二甲基苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫 代酸S-甲酯
N-[2-[(3,4-二甲基苯基)甲氧基]乙基]-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺的制备：
使用与针对N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺[实施例2]所述的相同方法，使用3,4-二甲基苄溴，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝60/40)。规模：3.8mmol。收率：60％。无色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.12-7.06(m,2H),7.04-6.99(m,1H),4.39(s,2H),3.45(t,J＝6.3Hz,2H),3.12(s,1H),2.56(t,J＝6.3Hz,2H),2.20(s,6H),2.19(s,3H),1.27(s,6H).
ESI-LRMS182.0[M+H]+.ESI-LRMS260.0[M+H]+.
4-[2-[(3,4-二甲基苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从N-[2-[(3,4-二甲基苯基)甲氧基]乙基]-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺开始，获得化合物。规模：1.3mmol。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝90/10)。收率：77％。近无色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.12-7.06(m,2H),7.05-6.99(m,1H),4.40(s,2H),3.48(t,J＝6.2Hz,2H),2.60(t,J＝6.2Hz,2H),2.38(s,3H),2.25(s,3H),2.20(s,3H),2.19(s,3H),1.36(s,6H).
ESI-HRMS C19H28NO2S[M+H]+计算值:334.1835,实测值:334.1825.
实施例6：4-[2-[(4-甲氧基苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代 酸S-甲酯
N-[2-[(4-甲氧基苯基)甲氧基]乙基]-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺的制备：
使用与针对N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺[实施例2]所述的相同方法，使用1-(溴甲基)-4-甲氧基苯，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(DCM/MeOH＝99/1至97.5/2.5)。规模：4.0mmol。收率：53％。无色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.27-7.20(m,2H),6.93-6.86(m,2H),4.39(s,2H),3.74(s,3H),3.45(t,J＝6.3Hz,2H),3.12(s,1H),2.55(t,J＝6.4Hz,2H),2.20(s,3H),1.27(s,6H).
ESI-LRMS261.9[M+H]+.
4-[2-[(4-甲氧基苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从N-[2-[(4-甲氧基苯基)甲氧基]乙基]-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺开始，获得化合物。规模：1.3mmol。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝80/20)。收率：74％。近无色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.27-7.21(m,2H),6.93-6.87(m,2H),4.40(s,2H),3.74(s,3H),3.48(t,J＝6.2Hz,2H),2.60(t,J＝6.2Hz,2H),2.38(s,3H),2.25(s,3H),1.36(s,6H).
ESI-HRMS C18H26NO3S[M+H]+计算值:336.1628,实测值:336.1613.
实施例7：4-[2-[(3,4-二甲氧基苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔 硫代酸S-甲酯
N-[2-[(3,4-二甲氧基苯基)甲氧基]乙基]-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺的制备：
使用与针对N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺[实施例2]所述的相同方法，使用4-(溴甲基)-1,2-二甲氧基苯，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(DCM/MeOH＝99/1至97.5/2.5)。规模：4.0mmol。收率：67％。无色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ6.94-6.88(m,2H),6.87-6.80(m,1H),4.39(s,2H),3.74(s,3H),3.73(s,3H),3.46(t,J＝6.3Hz,2H),3.12(s,1H),2.56(t,J＝6.3Hz,2H),2.21(s,3H),1.27(s,6H).
ESI-LRMS292.0[M+H]+.
4-[2-[(3,4-二甲氧基苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从N-[2-[(3,4-二甲氧基苯基)甲氧基]乙基]-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺开始，获得化合物。规模：1.0mmol。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝90/10)。收率：67％。近无色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ6.94-6.87(m,1H),6.87-6.81(m,1H),4.40(s,2H),3.74(s,3H),3.73(s,3H),3.48(t,J＝6.1Hz,2H),2.61(t,J＝6.2Hz,2H),2.38(s,3H),2.26(s,3H),1.36(s,6H).
ESI-HRMS C19H28NO4S[M+H]+计算值:366.1734,实测值:336.1720.
实施例8：4-[2-[(3-氯苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S- 甲酯
N-[2-[(3-氯苯基)甲氧基]乙基]-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺的制备：
使用与针对N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺[实施例2]所述的相同方法，使用3-氯苄溴，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝70/30)。规模：4.0mmol。收率：71％。无色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.43-7.25(m,4H),4.49(s,2H),3.50(t,J＝6.2Hz,2H),3.12(s,1H),2.58(t,J＝6.2Hz,2H),2.22(s,3H),1.28(s,6H).
ESI-LRMS266.0[M+H]+.
4-[2-[(3-氯苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从N-[2-[(3-氯苯基)甲氧基]乙基]-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺开始获得化合物，不同之处在于在添加n-BuLi之后在COS鼓泡之前，将反应混合物维持在-70℃30分钟。规模：1.3mmol。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝75/25)。收率：63％。近无色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.44-7.24(m,4H),4.50(s,2H),3.52(t,J＝6.0Hz,2H),2.63(t,J＝6.0Hz,2H),2.38(s,3H),2.27(s,3H),1.37(s,6H).
ESI-HRMS C17H23ClNO2S[M+H]+计算值:340.1133,实测值:340.1120.
实施例9：4-[2-[(3-氟苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S- 甲酯
N-[2-[(3-氟苯基)甲氧基]乙基]-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺的制备：
使用与针对N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺[实施例2]所述的相同方法，使用3-氟苄溴，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝80/20)。规模：4.0mmol。收率：71％。无色油。
4-[2-[(3-氟苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从N-[2-[(3-氟苯基)甲氧基]乙基]-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺开始获得化合物，不同之处在于在添加n-BuLi之后在COS鼓泡之前，将反应混合物维持在-70℃30分钟。规模：1.3mmol。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝70/30)。收率：87％。近无色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.44-7.34(m,1H),7.20-7.05(m,3H),4.51(s,2H),3.53(t,J＝6.1Hz,2H),2.63(t,J＝6.1Hz,2H),2.38(s,3H),2.27(s,3H),1.37(s,6H).
ESI-HRMS C17H23FNO2S[M+H]+计算值:324.1428,实测值:324.1415.
实施例10：4-甲基-4-[甲基-[2-(2-吡啶基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S- 甲酯
N-2-二甲基-N-[2-(2-吡啶基甲氧基)乙基]丁-3-炔-2-胺的制备：
使用与针对N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺[实施例2]所述的相同方法，从2-(溴甲基)吡啶氢溴酸盐开始，使用4eq的NaH，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(DCM/MeOH＝99/1至95/5)。规模：2.1mmol。收率：71％。黄色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.50(ddd,J＝4.8,1.8,0.9Hz,1H),7.80(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.44(d,J＝7.8Hz,1H),7.32-7.24(m,1H),4.55(s,2H),3.56(t,J＝6.2Hz,2H),3.13(s,1H),2.61(t,J＝6.2Hz,2H),2.23(s,3H),1.28(s,6H).
ESI-LRMS233.1[M+H]+.
4-甲基-4-[甲基-[2-(2-吡啶基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从N-2-二甲基-N-[2-(2-吡啶基甲氧基)乙基]丁-3-炔-2-胺开始，使用1.5eq的n-BuLi、1.5eq的MeI和DCM萃取获得化合物。规模：0.9mmol。通过硅胶色谱法纯化(DCM/MeOH＝99/1至90/10)。收率：18％。黄色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.54-8.48(m,1H),7.80(td,J＝7.7,1.8Hz,1H),7.44(d,J＝7.8Hz,1H),7.28(dd,J＝6.7,5.1Hz,1H),4.56(s,2H),3.59(t,J＝6.1Hz,2H),2.65(t,J＝6.1Hz,2H),2.38(s,3H),2.28(s,3H),1.37(s,6H).).
ESI-HRMS C16H23N2O2S[M+H]+计算值:3071475,实测值:307.1471.
实施例11：4-甲基-4-[甲基-[2-(3-吡啶基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S- 甲酯
N-2-二甲基-N-[2-(3-吡啶基甲氧基)乙基]丁-3-炔-2-胺的制备：
使用与针对N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺[实施例2]所述的相同方法，从3-(溴甲基)吡啶氢溴酸盐开始，使用4eq的NaH，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(DCM/MeOH＝99/1至95/5)。规模：2.1mmol。收率：67％。黄色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.56-8.52(m,1H),8.49(dd,J＝4.8,1.7Hz,1H),7.78-7.70(m,1H),7.38(ddd,J＝7.8,4.8,0.8Hz,1H),4.52(s,2H),3.52(t,J＝6.2Hz,2H),3.12(s,1H),2.58(t,J＝6.2Hz,2H),2.21(s,3H),1.27(s,6H).
ESI-LRMS233.1[M+H]+.
4-甲基-4-[甲基-[2-(3-吡啶基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从N-2-二甲基-N-[2-(3-吡啶基甲氧基)乙基]丁-3-炔-2-胺开始，使用1.5eq的n-BuLi、1.5eq的MeI和DCM萃取获得化合物。规模：0.4mmol。通过硅胶色谱法纯化(DCM/MeOH＝99/1至95/5)。收率：15％。黄色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.54(d,J＝1.5Hz,1H),8.49(dd,J＝4.8,1.7Hz,1H),7.78-7.70(m,1H),7.38(ddd,J＝7.8,4.8,0.8Hz,1H),4.53(s,2H),3.54(t,J＝6.1Hz,2H),2.63(t,J＝6.1Hz,2H),2.38(s,3H),2.26(s,3H),1.36(s,6H)).
ESI-HRMS C16H23N2O2S[M+H]+计算值:3071475,实测值:307.1474.
实施例12：4-甲基-4-[甲基-[2-(4-吡啶基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S- 甲酯
N-2-二甲基-N-[2-(4-吡啶基甲氧基)乙基]丁-3-炔-2-胺的制备：
使用与针对N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺[实施例2]所述的相同方法，从4-(溴甲基)吡啶氢溴酸盐开始，使用4eq的NaH，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(DCM/MeOH＝99/1至95/5)。规模：2.1mmol。收率：95％。黄色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.56-8.49(m,2H),7.38-7.27(m,2H),4.54(s,2H),3.53(t,J＝6.2Hz,2H),3.13(s,1H),2.61(t,J＝6.2Hz,2H),2.23(s,3H),1.28(s,6H).
ESI-LRMS233.1[M+H]+.
4-甲基-4-[甲基-[2-(4-吡啶基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从N-2-二甲基-N-[2-(4-吡啶基甲氧基)乙基]丁-3-炔-2-胺开始，使用1.5eq的n-BuLi、1.5eq的MeI和DCM萃取获得化合物。规模：1.0mmol。通过硅胶色谱法纯化(DCM/MeOH＝99/1至95/15)。收率：24％。黄色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.60-8.45(m,2H),7.37-7.26(m,2H),4.55(s,2H),3.56(t,J＝6.0Hz,2H),2.65(t,J＝6.0Hz,2H),2.38(s,3H),2.28(s,3H),1.37(s,6H).
ESI-HRMS C16H23N2O2S[M+H]+计算值:3071475,实测值:307.1470.
实施例13：4-((4-(苄氧基)丁基)(甲基)氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯4-(甲基(2-甲基丁-3-炔-2-基)氨基)丁-1-醇的制备：
通过之前描述的用于合成N-甲基-N-(2’羟乙基)-3-氨基-3甲基-1-丁炔的标准方案(Easton,Nelson R.；Hennion,George F.U.S.(1967),US 333762519670822.)，从市售的4-(甲基氨基)丁-1-醇开始制备该化合物。获得4-(甲基(2-甲基丁-3-炔-2-基)氨基)丁-1-醇，为亮黄色油。规模：3mmol。收率：99％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ4.41(t,J＝5.2Hz,1H),3.42-3.33(m,2H),3.09(s,1H),2.38-2.29(m,2H),2.14(s,3H),1.45-1.36(m,4H),1.27(s,6H).
ESI-LRMS:170.1[M+H]+.
N-(4-(苄氧基)丁基)-N,2-二甲基丁-3-炔-2-胺的制备：
使用与针对N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺[实施例2]所述的相同方法，从4-(甲基(2-甲基丁-3-炔-2-基)氨基)丁-1-醇开始，使用1.015eq的NaH和1.01eq的溴化苄，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(环己烷/EtOAc＝80/20)。规模：2.4mmol。收率：55％。黄色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.39-7.22(m,5H),4.44(s,2H),3.42(t,J＝6.3Hz,2H),3.08(s,1H),2.34(t,J＝6.9Hz,2H),2.13(s,3H),1.60-1.37(m,4H),1.26(s,6H).
ESI-LRMS:260.2[M+H]+.
4-((4-(苄氧基)丁基)(甲基)氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从N-(4-苄氧基丁基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺开始，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(环己烷/EtOAc＝90/10)。规模：0.77mmol。收率：80％。黄色油。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.38-7.19(m,5H),4.48(s,2H),3.47(t,J＝6.1Hz,2H),2.45(t,J＝6.9Hz,2H),2.35(s,3H),2.26(s,3H),1.73-1.48(m,4H),1.39(s,6H).
ESI-HRMS C19H28NO2S[M+H]+计算值:334.1835,实测值:334.1840.
实施例14：4-((2-羟乙基)(甲基)氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯
a)参见Easton,Nelson R.；Hennion,George F.,U.S.(1966),US 3285913；b)3,4-DHP，pTSA，DCM(70％)；c)nBuLi，THF，-70℃，硫化羰然后MeI，0℃(59％)；d)pTSA，MeOH，室温(90％)
化合物3：N,2-二甲基-N-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)丁-3-炔-2-胺的制备：
在室温下，向2-(甲基(2-甲基丁-3-炔-2-基)氨基)乙醇2(3.00g，21.2mmol)和3,4-二氢-2H-吡喃(5.0eq)的无水DCM(135mL)溶液，添加对甲苯磺酸(0.1eq)。将反应混合物搅拌过夜，用饱NaHCO3水溶液(30mL)洗涤，然后用盐水(30mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。首先使用Kugelrohr装置(10-12托，烘箱155℃)通过短程蒸馏纯化残余物，然后通过硅胶快速色谱法(石油醚/乙酸乙酯95/5至60/40)纯化，得到油状化合物3(收率：70％)。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ4.60-4.50(m,1H),3.82-3.70(m,1H),3.59-3.56(m,1H),3.49-3.35(m,2H),3.12(s,1H),2.55(t,J＝6.5Hz,2H),2.21(s,3H),1.77-1.35(m,6H),1.27(s,6H).
化合物4：4-甲基-4-(甲基(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙基)氨基)戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
向乙炔胺3(1.00g,4.44mmol)的无水THF(22mL)溶液滴加正丁基锂溶液(在己烷中2.2M，1.5eq)。使混合物在10分钟内达到0℃，然后在硫化羰鼓泡之前重新冷却至-70℃。30分钟后，将亮黄色溶液仔细地温热至0℃，在此温度下搅拌30分钟并滴加碘甲烷(1.2eq)。将反应混合物在0℃搅拌2小时，然后用水水解。通过DCM进行萃取后处理(用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并减压浓缩)得到粗产物，将其通过硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯90/10至60/40)纯化，得到油状化合物4(收率：59％)。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ4.58(t,J＝3.2Hz,1H),3.75(ddd,J＝11.4,7.9,3.3Hz,1H),3.70-3.60(m,1H),3.49-3.38(m,2H),2.59(t,J＝6.3Hz,2H),2.39(s,3H),2.27(s,3H),1.77-1.39(m,6H),1.36(s,6H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ176.62(C＝O),98.94(CH),96.46(C),80.97(C),66.55(CH2),62.37(CH2),55.19(C),52.43(CH2),37.92(CH3),30.75(CH2),28.01(2xCH3),25.59(CH2),19.63(CH2),12.61(CH3).
化合物5：4-((2-羟乙基)(甲基)氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
在室温下，向氨基硫醇酯4(1.00g，3.34mmol)的甲醇(15mL)溶液添加对甲苯磺酸(1.1eq)。将反应混合物搅拌过夜，用饱和NaHCO3水溶液(30mL)洗涤，然后用盐水(30mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。将残余物通过硅胶快速色谱纯化(石油醚/乙酸乙酯80/20至20/80)，得到油状化合物5(收率：90％)。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ4.42(t,J＝5.6Hz,1H),3.44(td,J＝6.7,5.6Hz,2H),2.46(,J＝6.7Hz,2H),2.39(s,3H),2.24(s,3H),1.36(s,6H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ176.46(C＝O),95.56(C),80.89(C),58.92(CH2),54.99(C),53.52(CH2),36.12(CH3),27.88(2xCH3),12.53(CH3).
ESI-HRMS C10H18NO2S[M+H]+计算值：216.1053，实测值：216.1043.
实施例15：4-甲基-4-[甲基-[2-(2-萘基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲 酯
N,2-二甲基-N-[2-(2-萘基甲氧基)乙基]丁-3-炔-2-胺的制备：
使用与针对N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺[实施例2]所述的相同方法，使用1.015eq的NaH和1.01eq的2-萘基溴，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝90/10)。收率：61％。橙色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.91-7.88(m,4H),7.50-7.48(m,3H),4.65(s,2H),3.55(t,6.1Hz,2H),3.13(s,1H),2.62(t,6.2Hz,2H),2.23(s,3H),1.28(s,6H).
4-甲基-4-[甲基-[2-(2-萘基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从N,2-二甲基-N-[2-(2-萘基甲氧基)乙基]丁-3-炔-2-胺开始，获得化合物。规模：0.65mmol。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝85/15)。收率：28％。黄色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.95-7.82(m,4H),7.55-7.41(m,3H),4.66(s,2H),3.57(t,J＝6.2Hz,2H),2.66(t,J＝6.1Hz,2H),2.38(s,3H),2.28(s,3H),1.37(s,6H).
ESI-HRMS C21H26NO2S计算值：356.1683,实测值：356.1679[M+H]+.
实施例16：4-甲基-4-[甲基-[2-[(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)甲氧基]乙基]氨 基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯
N,2-二甲基-N-[2-[(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)甲氧基]乙基]丁-3-炔-2-胺的制备：
使用与针对N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺[实施例2]所述的相同方法，使用1.015eq的NaH和1.01eq的2-(溴甲基)-1,3,3-三甲基-1-环己烯(通过已知方案从β-环柠檬醛制备(WO 2015048363))，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝95/05)。收率：67％。淡黄色油。
3.86(s,2H),3.41(t,J＝6.5Hz,2H),3.12(s,1H),2.53(t,J＝6.4Hz,2H),2.20(s,3H),1.90(t,J＝5.9Hz,2H),1.62(s,3H),1.57-1.49(m,2H),1.41-1.33(s,2H),1.27(s,6H),0.97(s,6H).
4-甲基-4-[甲基-[2-[(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)甲氧基]乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从N,2-二甲基-N-[2-[(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)甲氧基]乙基]丁-3-炔-2-胺开始，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝90/10)。收率：63％。黄色油。
H NMR(300MHz,DMSO)δ3.87(s,2H),3.44(t,J＝6.3Hz,2H),2.57(t,J＝6.3Hz,2H),2.38(s,3H),2.26(s,3H),1.91(t,J＝6.2Hz,2H),1.62(s,3H),1.57-1.49(m,2H),1.36(s,6H),1.39-1.34(m,2H),0.97(s,6H).
ESI-HRMS C20H34NO2S[M+H]+计算值:352.2305,实测值:352.2289.
实施例17：2,5,10,11,11-五甲基-6-氧代-7-氧杂-2,5,10-三氮杂十四碳-12-炔- 14-硫代酸S-甲酯
化合物6的制备：
在0℃下，将对硝基氯甲酸酯(140mg，0.70mmol，1.5eq)的二氯甲烷(DCM)(2.5mL)溶液滴加至实施例14的化合物5(100mg；0.46mmol)和三乙胺(TEA)(1.5eq)的DCM(1.5mL)溶液中。在0℃下10分钟后，将反应混合物在搅拌下加热至室温直至完全转化(通过TLC验证，1小时)。然后将混合物稀释在DCM(30mL)中，然后用盐水(30mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱法(石油醚/乙酸乙酯100/70/30)纯化，得到无定形固体形式的化合物6(收率：82％)。
1H NMR(300MHz,DMSO):δ(ppm)8.35-8.30(m,2H),7.59-7.53(m,2H),4.30(t,J＝5.7Hz,2H),2.75(t,J＝5.7Hz,2H),2.39(s,3H),2.30(s,3H),1.39(s,6H).
2,5,10,11,11-五甲基-6-氧代-7-氧杂-2,5,10-三氮杂十四碳-12-炔-14-硫代酸S-甲酯的制备：
在室温下，向实施例18的化合物6(200mg，0.53mmol)的3mL DCM(3mL)溶液添加TEA(1.2eq)。在0℃下，向反应混合物中添加N,N,N’-三甲基乙二胺(1.2eq)的二氯甲烷(2.3mL)溶液。将亮黄色反应混合物温热至室温并搅拌过夜。将亮黄色的反应混合物在室温下搅拌过夜，用二氯甲烷(40mL)稀释，然后用盐水(30mL)洗涤。将有机层经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/乙酸乙酯75/25至20/80)。收率：70％。油。
通过硅胶色谱法纯化DCM/MeOH(85/15)。收率：34％。黄色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ4.01(t,J＝5.9Hz,2H),3.32-3.25(m,2H),2.83(大s,3H),2.62(t,J＝5.8Hz,2H),2.6-2.5(m被溶剂峰部分隐藏,2H),2.39(s,3H),2.27(s,3H),2.17(大s,6H),1.36(s,6H).
ESI-HRMS C16H30N3O3S[M+H]+计算值:344.1992,实测值:344.1993.
实施例18：4-(((1R,2R)-2-(苄氧基)环戊基)(甲基)氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸 S-甲酯
(1R,2R)-2-苄氧基-N-(1,1-二甲基丙-2-炔基)环戊胺的制备：
在室温下，向市售(1R,2R)-2-(苄氧基)环戊胺(0.93g，4.86mmol)、3-氯-3-甲基丁-1-炔(1.3eq)和三乙胺(1.3eq)的THF(20mL)溶液添加CuI(8mol％)。将混合物搅拌过夜。减压蒸发溶剂，然后将粗产物稀释在饱和NaHCO3水溶液中，用乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用2％ NH4OH水溶液洗涤，然后用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并减压蒸发溶剂。获得棕色油状的(1R,2R)-2-苄氧基-N-(1,1-二甲基丙-2-炔基)环戊胺。收率：99％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.37-7.16(m,5H),4.56-4.36(m,2H),3.72-3.58(m,1H),3.28-3.19(m,1H),3.08(s,1H),2.00-1.88(m,1H),1.86-1.67(m,2H),1.65-1.49(m,3H),1.40-1.28(m,1H),1.25(s,3H),1.25(s,3H).
(1R,2R)-2-(苄氧基)-N-甲基-N-(2-甲基丁基-3-炔-2-基)环戊胺的制备：
向(1R,2R)-2-(苄氧基)-N-(2-甲基丁-3-炔-2-基)环戊胺(0.25g，0.97mmol)添加5eq的甲酸和1.5eq的甲醛(37％水溶液)。将混合物回流过夜，然后加入2N HCl直至达到pH1，并用乙醚洗涤。将水层用1N NaOH碱化，并用DCM萃取。将有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并在减压下蒸发溶剂。然后将粗产物通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝80/20)，得到黄色油。收率：68％。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.43-7.17(m,5H),4.52(m,2H),3.94-3.78(m,1H),3.62-3.49(m,1H),3.11(s,1H),2.20(s,3H),1.78-1.45(m,6H),1.37(s,3H),1.34(s,3H).
ESI-LRMS:272.1[M+H]+.
4-(((1R,2R)-2-(苄氧基)环戊基)(甲基)氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从(1R,2R)-2-(苄氧基)-N-甲基-N-(2-甲基丁-3-炔-2-基)环戊胺开始，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝80/20，然后DCM＝100)。规模0.64mmol。收率：47％。黄色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.35-7.20(m,5H),4.51(s,2H),3.92-3.80(m,1H),3.59-3.45(m,1H),2.36(s,3H),2.24(s,3H),1.78-1.49(m,6H),1.45(s,3H),1.42(s,3H).
ESI-HRMS C20H28NO2S[M+H]+计算值:346.1835,实测值:346.1824.
实施例19：(S)-4-(2-((苄氧基)甲基)吡咯烷-1-基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲 酯：
(S)-2-((苄氧基)甲基)-1-(2-甲基丁-3-炔-2-基)吡咯烷的制备：
使用与针对N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺[实施例2]所述的相同方法，从(S)-(1-(2-甲基丁-3-炔-2-基)吡咯烷-2-基)甲醇开始，使用1.015eq的NaH和1.01eq的溴化苄，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(二氯甲烷/甲醇＝95/5)。规模3.0mmol。收率：60％。橙色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.41-7.19(m,5H),4.46(s,2H),3.24(dd,J＝8.3,2.7Hz,1H),3.14(dd,J＝7.6,3.2Hz,1H),3.11-3.02(m,2H),2.86(dd,J＝8.4,6.0Hz,1H),2.65-2.54(m,1H),1.81-1.51(m,4H),1.25(s,3H),1.23(s,3H).
ESI-LRMS:258.1[M+H]+.
(S)-4-(2-((苄氧基)甲基)吡咯烷-1-基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从(S)-2-((苄氧基)甲基)-1-(2-甲基丁-3-炔-2-基)吡咯烷开始，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝80/20)。规模：1.2mmol。收率：50％。橙色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.46-7.18(m,5H),4.47(s,2H),3.29-3.23(m,1H),3.17-3.03(m,2H),2.94(dd,J＝8.5,5.7Hz,1H),2.62-2.53(m,1H),2.38(s,3H),1.85-1.58(m,4H),1.34(s,3H),1.32(s,3H).
实施例20：(R)-4-(3-(苄氧基)吡咯烷-1-基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯
(R)-3-(苄氧基)-1-(2-甲基丁-3-炔-2-基)吡咯烷的制备：
使用与针对N-(2-烯丙氧基乙基)-N,2-二甲基-丁-3-炔-2-胺[实施例2]所述的相同方法，从(R)-1-(2-甲基丁-3-炔-2-基)吡咯烷-3-醇开始，使用1.01eq的NaH和1.01eq的溴化苄，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(二氯甲烷/甲醇＝98/2)。规模：3.3mmol。收率：69％。橙色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)5 7.40-7.17(m,5H),4.42(s,2H),4.07(tt,J＝7.3,3.7Hz,1H)3.13(s,1H),2.86(dd,J＝9.6,6.7Hz,1H),2.75-2.65(m,2H),2.60-2.53(m,1H),2.06-1.95(m,1H),1.75-1.65(m，1H)，1.29(s，6H)。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.40-7.17(m,5H),4.42(s,2H),4.07(tt,J＝7.3,3.7Hz,1H)3.13(s,1H),2.86(dd,J＝9.6,6.7Hz,1H),2.75-2.65(m,2H),2.60-2.53(m,1H),2.06-1.95(m,1H),1.75-1.65(m,1H),1.29(s,6H).
ESI-LRMS244.1[M+H]+.
(R)-4-(3-(苄氧基)吡咯烷-1-基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备：
使用与针对4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯[实施例1]所述的相同方法，从(R)-3-(苄氧基)-1-(2-甲基丁-3-炔-2-基)吡咯烷开始，获得化合物。通过硅胶色谱法纯化(二氯甲烷/甲醇＝98/2)。规模：1.2mmol。收率：69％。橙色油。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ7.32(m,5H),4.44(s,2H),4.09(dq,J＝10.2,3.5Hz,1H),2.97-2.83(m,1H),2.80-2.65(m,2H),2.65-2.55(m,1H),2.37(s,3H),2.11-1.90(m,1H),1.83-1.67(m,1H),1.37(s,6H).
ESI-HRMS C18H24NO2S[M+H]+计算值:318.1522,实测值:318.1518.
实施例21：4-二甲基氨基-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备
在-70℃下，向0.855g 3-二甲基氨基-3-甲基-丁-1-炔[HENNION,G.F.,NELSON,K.W.(1957)J.Am.Chem.Soc.,79,2142-2144](2.80mmol)的14ml四氢呋喃溶液，5分钟内加入4.07ml(9.24mmol)2.27M的正丁基锂的己烷溶液。5分钟后，将反应介质升至0℃并在此温度下再搅拌30分钟。返回至-70℃后，将2ml先前冷凝的氧硫化碳插管，并将该混合物在-70℃下搅拌30分钟。然后在30分钟内使反应介质达到0℃，然后加入0.575ml(9.24mmol)碘甲烷，并在0℃下继续搅拌2小时。用250ml乙醚稀释，用饱和氯化钠溶液(3×30ml)洗涤，经硫酸钠干燥。真空蒸发并通过硅胶色谱法(用石油醚/乙酸乙酯混合物＝70/30洗脱)纯化后，分离出1.16g无色油形式的化合物(收率：81％)。
1H NMR(300MHz,CDCl3):v＝1.42(s,6H,(CH3)2C),2.31(s,6H,(CH3)2N),2.39(s,3H,CH3S).
实施例22：4-甲基-4-吗啉-4-基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯的制备
该制备与实施例21中描述的相同，使用3-二正丙氨基-3-甲基-丁-1-炔[HENNION,G.F.,HANZEL,R.F.,J.Am.Chem.Soc.,82,4908-4912,(1960)]代替3-甲基-3-吗啉-4-基-丁-1-炔。数量：1.5mmol，通过硅胶色谱法纯化(洗脱液石油醚/乙酸乙酯＝60/40)，收率：77％。白色固体。
1H NMR(300MHz,CDCl3):ν＝1.43(s,6H,(CH3)2C),2.40(s,3H,CH3S),2.65(m,4H,CH2O),3.97(m,4H,CH2N).
实施例23：4-甲基-4-[甲基(辛基)氨基]戊-2-炔硫代酸S甲酯的制备
在-70℃下，向N-甲基-N-(2-甲基丁-3-炔-2-基)庚-1-胺(511mg，2.62mmol)的无水THF(5mL)溶液滴加nBuLi 2.28M的己烷溶液(1.26mL，1.1eq)。将反应介质降至0℃，并通过针鼓泡30分钟将CO2气体引入溶液中。继续鼓泡5-10分钟，同时溶液升至室温。返回至0℃后，滴加氯甲酸异丁酯(1.1eq)。继续搅拌15分钟，然后一次性添加MeSNa(1.2eq)。将反应介质升至室温并搅拌15分钟，然后用水水解。处理包括用乙酸乙酯(x3)萃取，然后用饱和氯化钠水溶液洗涤合并的有机相。经Na2SO4干燥并在旋转蒸发器上浓缩后，反应粗产物通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc＝95/5)，得到硫醇酯(445mg)。收率：63％。白色固体。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ2.38(s,3H),2.37(t,J＝7.0Hz,2H),2.18(s,3H),1.35(s,6H),1.42-1.20(m,10H),0.86(t,J＝6.7Hz,3H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ176.38(C),96.50(C),81.03(C),54.98(C),52.39(CH2),36.39,31.85(CH2),29.25(CH2),28.79(CH2),27.81(2CH3),27.41(CH2),22.62(CH2),14.09(CH3),12.41(CH3).ESI-LRMS270.2[M+H]+.
第2部分-式(I)的化合物的用途
材料和方法
流式细胞术免疫表型分析
对免疫活性的雌性C57BI6小鼠施用DIMATE(15mg/kg)、抗PDL1(12.5mg/kg)或PBS对照，每周3次(静脉注射)，总共21天。在终点获得血样并收集在肝素中。
在不同的环境中，免疫活性小鼠模型皮下植入肿瘤细胞(参见下文“癌症免疫疗法的动物模型”下的描述)。当肿瘤体积达到50-100mm3时，向小鼠施用DIMATE(15mg/kg)、抗PDL1(12.5mg/kg)或PBS对照，每周3次(静脉注射)，总共21天。在终点获得肿瘤，用透明质酸酶和胶原酶进行酶消化。
在免疫染色之前使用GentleMACS细胞均质化将细胞均质化。偶联抗体的淋巴组(T效应细胞和NK细胞)和骨髓组(粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、M2型巨噬细胞、中间巨噬细胞和单核细胞)来自Beckman Coulter，如表2中所述。
表2：用于分析不同免疫细胞群的免疫表型流式细胞术组
PerfixNC试剂盒购自Beckman Coulter。
将含有抗凝剂的全血(100μl)与10μl Perfix-NC R1缓冲液混合，立即涡旋2-3秒，并在室温下避光孵育15分钟。添加约600μl Perfix-NC R2缓冲液，将355μl转移至Duraclone管中并添加相应的抗体。涡旋后，将管在室温下避光孵育60分钟。将PBS1×(3ml)添加到管中，在室温下避光孵育5分钟，然后以250g离心6分钟。除去上清液，使颗粒状物干燥，将细胞重悬于3ml1×Perfix-NC R3缓冲液中，然后再以250g离心6分钟。将颗粒状物干燥并重悬于300μl 1×R3缓冲液中。将管避光保存在40℃下，直到在接下来的24小时内通过流式细胞仪采集数据。
使用Kaluza 1.3软件(Beckman Coulter)分析流式细胞术数据。使用Prism6.0(GraphPad)软件进行统计分析。T检验Mann-Whitney用于比较匹配对。认为P<0.05是显著的。
RT-PCR分析HL-60AML细胞系用于进行转录组分析。该细胞系购自ATCC。HL-60在RPMI 1640培养基、GlutaMAXTM补充剂(GibcoTM)和10％胎牛血清中培养，并在潮湿培养箱中保持在37℃、5％ CO2下。每种条件重复4次：未处理的细胞，和在6孔板中用10μM DIMATE处理6小时的细胞，在培养基中的密度为500000个细胞/孔，培养基总体积为3mL。孵育后，收集细胞，用PBS洗涤3次，并处理颗粒状物以提取RNA。
使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，法国)根据制造商的说明提取总RNA，包括DNase处理。使用NanoDrop 1000分光光度计(Nano Drop Technologies,San Diego,CA,USA)对RNA进行定量。在260nm和280nm处测量光密度，保留比率260/280(>1.8)作为良好纯度的指标。使用Agilent 2100 BioanalyzerTM(Agilent Technologies，Santa Clara，CA.LISA)验证提取的RNA的质量。每个样本都会自动获得0-10的分数，并与RNA完整性数(RIN)相对应。样品的RIN值为9-10。
随后，使用基于单色微阵列的基因表达分析：低输入快速放大(Low Input QuickAmp，LIQA)标记方案对100纳克总RNA进行标记。使用SurePrint G3 human GE 8x60K V2芯片(Agilent Technologies，Santa Clara，California)将0.6μg纯化的Cy3标记的cRNA在65℃、60rpm下杂交17小时。微阵列由62928个特征组成。芯片上合成的探针大小为60个核苷酸。使用基因表达洗涤缓冲液试剂盒(安捷伦科技)洗涤微阵列，并通过标准安捷伦方案进行扫描。使用特征提取软件处理数据。
AgiND库在R软件中实现，用于分析和可视化数据。AgiND是在Bioconductor库模型上开发的，用于诊断数据质量和数据微阵列归一化。使用分位数方法对数据进行归一化以使微阵列强度的分布均匀化。对行数据进行过滤以删除对照，然后进行第二次过滤以删除每组中至少100％的样本在背景下表达的基因。
为了鉴定在未处理的HL-60和用DIMATE处理的HL-60之间差异表达的基因，对归一化和过滤的数据进行树类微阵列显著性分析(SAM)测试。进行了多次测试修正，错误发现率(FDR)固定为5％。使用“TMeV”(Tigr MultiExperiment Viewer)MeV:MultiExperimentViewer|TM4微阵列软件套件(2)的一部分，根据基因和样本的表达，将监督层次聚类应用于调整的基因表达中值调整数据，以对基因和样本进行分组。使用Pearson相关性，并根据平均连锁法对聚类进行分组。差异表达的目的基因(自定义基因列表)在热图中可视化。
毛细管电泳(WES)
对于蛋白质表达分析，将细胞在含有1/200蛋白酶抑制剂(539134-1ML，MilliporeSigma)和1/100磷酸酶抑制剂(524625-1SET，Millipore Sigma)的RIPA缓冲液(50mM Tris-HCl pH7、1％ NP-40、0.5％ Na-脱氧胆酸盐、0.1％ SDS、150mM NaCl和2mM EDTA)中裂解。使用Lowry方法和PierceTM 蛋白测定试剂盒(23225，Thermo Fisher Scientific)对蛋白进行定量。
根据制造商的说明，使用12-230kDa分离模块(ProteinSimple，SM-W004)和测定模块抗兔HRP检测模块(ProteinSimple，DM-001)在WES系统(ProteinSimple)上分离总蛋白提取物。将样品在0.1X样品缓冲液(分离模块中提供的10x缓冲液)中稀释为0.5mg/mL，然后与荧光主混合物混合，涡旋并在95℃下加热5分钟，然后保存在冰上直至使用。将检测模块中提供的样品、封闭试剂(抗体稀释液)、一抗(抗体稀释液中)、HRP偶联的二抗和化学发光底物移液到板中(分离模块中也提供)。
使用仪器默认设置：375V下堆叠和分离25分钟；封闭剂5分钟，一抗和二抗均30分钟；鲁米诺/过氧化物化学发光检测约15分钟(曝光1-2-4-8-16-32-64-128-512秒)。分析所得图表并将其可视化为泳道。XIAP和clAPs蛋白的一抗来自Cell Signaling Technology。
NK裂解活性
在不存在或存在DIMATE(10μM)的情况下，使用从新鲜收集的细胞单采术中获得的健康人PBMC得到的NK细胞和K562(一种不表达I类MHC分子的人红白血病肿瘤细胞系)作为靶标，评估NK细胞特异性裂解活性。
使用两种荧光染料来区分效应细胞和靶细胞以及活靶细胞和死靶细胞。按照制造商的说明，使用绿色荧光染料3,3’-双十八烷基氧杂碳菁氯酸盐(DIOC，Sigma/MerckD4292-20MG)来标记K562的质膜。简言之，将1x106个K562细胞重悬于RPMI(不含苯酚)中并添加5μl DIOC(1mM)。将细胞在37℃、5％CO2下孵育10分钟，然后用培养基洗去过量的DIOC，使用3个250g离心循环，每次5分钟。
健康的PBMC用DIMATE(10μM)预处理6小时。然后，洗掉药物并将PBMC与K562靶细胞一起孵育21小时。第二种染料碘化丙啶(PI)是一种膜不可渗透的红色荧光染料，在测定结束时添加，以对因NK细胞裂解活性而细胞膜受损的靶细胞进行复染。
在靶-效应细胞接触之前和之后通过流式细胞术监测荧光。该测试总共对10名健康捐献者进行。细胞裂解百分比计算如下：[DIOC和PI阳性细胞/DIOC标记细胞总数]*100)-自发裂解。
化合物的脂质纳米颗粒调配剂
氨基硫醇酯化合物(例如DIMATE)被配制为脂质纳米颗粒，由2.5％S100(Lipoid gmbh，路德维希港，德国)、20％ Labrafac Lipophile WL1349(Gattefossé，法国)、17％ Kolliphor HS15(Sigma)、3％氯化钠(NaCI，(AppliChem)、60％的水和12.2mg/mL的氨基硫醇酯化合物(例如DIMATE)组成。程序如下：将DIMATE(或另一种氨基硫醇酯化合物)与Labrafac混合，并保持转向直至完全溶解。在单独的Falcon管中，将Kolliphor、NaCl和水混合。该最后的溶液(水相)在搅拌下转移至油相(DIMATE加Labrafac)中，放入硅油浴(硅油-50℃—+200℃，Sigma Aldrich)中，并在剧烈搅拌下加热至85℃。重复进行3次冷却和加热步骤。在最后一个加热步骤结束时，将混合物转移至冰浴中并冷却至70℃。一旦调配剂达到70℃，就添加冷水(4℃)以淬灭并将调配剂进一步搅拌5分钟。
癌症免疫疗法的动物模型
为了测试LNP-DIMATE单独使用或与免疫检查点抑制剂抗PDL-1组合使用的体内功效，在免疫活性的雌性C57BL6小鼠(4周龄)中建立了三种不同的动物模型。将2x 106个用于结肠癌模型的CT26小鼠细胞、用于肺癌模型的LLC2小鼠细胞或用于黑色素瘤模型的Tyr-NRAS小鼠细胞(来自法国里昂的Antineo)皮下植入动物侧腹。当肿瘤达到50-100mm3体积时，将小鼠随机分为同型对照组、空脂质纳米颗粒(LNP)组、抗PD-L1组、LNP封装的DIMATE(LNP-DIMATE)组、LNP-DIMATE加同型对照组和LNP-DIMATE加抗PDL1组。每组由10只动物组成。抗PDL1和同种型对照以12.5mg/kg施用。LNP和LNP-DIMATE以15mg/kg施用。所有治疗每周进行3次(静脉注射)，总共21天。通过卡尺测量的肿瘤体积用于监测对治疗的反应。
结果
结果如图2至6所示。
具体地，它表明：
式(I)的化合物增加ROS，促进粒细胞生成，增加嗜中性粒细胞动员和CD11b表达，CD11b是嗜中性粒细胞募集和控制感染所必需的成分(图2)。这一特性有助于在中性粒细胞计数低的患者的治疗中促进中性粒细胞恢复，尤其适用于治疗药物引起的中性粒细胞减少症患者，所述药物包括化疗药物如烷化剂、蒽环类药物、喜树碱、丝裂霉素C、紫杉烷、长春花碱、羟基脲等，以及引起可能成为长期并发症的迟发性嗜中性粒细胞减少症的非化疗药物，如利妥昔单抗、卡比马唑、氯氮平、氨苯砜、安乃近、他巴唑、苯唑西林、万古霉素、青霉素G、普鲁卡因酰胺、丙硫氧嘧啶、柳氮磺吡啶、噻氯匹定，以及以较低速率引起嗜中性粒细胞减少症的常用药物，如血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂、H2阻滞剂、非甾体抗炎药(NSAID)和抗心律失常药物等；
式(I)的化合物诱导单核细胞相关巨噬细胞的动员、M2型巨噬细胞活化，其在病原体防御的作用众所周知，并且还在清除凋亡细胞、促进伤口愈合和减轻加剧的炎症反应中发挥作用(图3)。因此，式(I)的化合物还诱导抗炎分子，如M2标志物CHI3L1和AXL，同时通过下调TRAF6、抑制NF-kB信号传导通路和减少依赖NFkB的促炎细胞因子(如CCL4、IL-1b和TNFα)的基因表达，表现出抗炎功能。重要的是，式(I)的化合物诱导VEGFA和TGFα，VEGFA和TGFα涉及细胞增殖、细胞分化、伤口愈合和促进血管生成(图4)。这些数据表明，式(I)的化合物可用于组织修复和再生，以减轻炎症过程不受控制的幅度和持续时间，已知炎症过程会阻碍再生，或例如引起慢性炎症环境，例如类风湿性关节炎；
式(I)的化合物诱导T效应细胞和NK细胞在肿瘤内环境中的募集—已知这些细胞促进免疫抗肿瘤应答(图5A)。与这些发现一致，式(I)的化合物与免疫检查点阻断具有协同作用，表明它们与免疫检查点抑制剂(ICI)如抗PDL-1的组合是增强其抗肿瘤作用的有前途的策略(图5B)，并且式(I)的化合物不影响体外人NK细胞的活力或裂解活性，并且诱导XIAP和cIAP蛋白的降解。使用IAP拮抗剂阻断这些内在因子已被证明可以破坏TRAF-cIAP E3复合物，并在癌症免疫疗法的动物模型中提供有希望的结果(图6)。

Claims (16)

1.至少一种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体，用于调节受试者的免疫应答：
其中：
-R1和R2相同或不同且选自：C1-C10烷基、苯基、苄基、CHR5CHR6OR4和(CHR5)vOR4，或R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成杂环，具体是哌啶或吗啉；
所述苯基和苄基任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：直链或支链(C1-C7)烷基、卤素、NO2和CONH2；
-R3选自直链或支链(C1-C7)烷基，
-R4选自：H、直链或支链(C2-C7)烷基、直链或支链(C2-C7)烯基、-CONR7R8、芳基、杂芳基、(C2-C7)环烷基、直链或支链-(C1-C7)烷基-芳基和直链或支链-(C1-C7)烷基-杂芳基；
所述芳基、(C2-C7)环烷基和杂芳基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：卤素、任选被一个或多个卤素原子取代的直链或支链(C1-C7)烷基、任选被一个或多个卤素原子取代的直链或支链(C1-C7)烷氧基、-COOH、芳基、-NRR'、-NO2，或所述芳基和杂芳基任选地被稠合以形成杂环烷基；
-R5和R6相同或不同且独立地选自：H和直链或支链(C1-C7)烷基，或
R5和R6连接在一起以与它们所连接的碳原子形成环烷基、芳基或杂芳基，或
R5是H，并且R1和R6连接在一起以与连接到R1的氮原子形成杂环烷基或杂芳基，或
R6是H，并且R1和R5连接在一起以与连接到R1的氮原子形成杂环烷基；
-v选自2至4；
-R7是-(C1-C3)烷基；
-R8是-(C1-C3)烷基NRR’；
-R和R’相同或不同且独立地选自H和直链或支链(C1-C7)烷基。
2.根据权利要求1所述的用于所述用途的至少一种化合物，其中R3是直链或支链(C1-C7)烷基，优选甲基；R1是直链或支链(C1-C7)烷基，优选甲基；R2是C1-C10烷基优选甲基、CHR5CHR6OR4、(CHR5)vOR4；或R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成杂环，具体是吗啉；并且R5和R6是H。
3.根据权利要求1或2所述的用于所述用途的至少一种化合物，其中R5和R6是H，并且R4选自(C2-C7)环烷基、直链或支链-(C1-C7)烷基-杂芳基或苄基；优选苄基；所述(C2-C7)环烷基被一个或多个选自直链或支链(C1-C7)烷基的取代基取代，所述苄基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：任选被一个或多个卤素原子取代的直链或支链(C1-C7)烷基、任选被一个或多个卤素原子取代的直链或支链(C1-C7)烷氧基、卤素。
4.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的至少一种化合物或其药学上可接受的盐或旋光异构体、外消旋体、非对映异构体、对映异构体或互变异构体，其中所述至少一种式(I)的化合物选自：
4-[2-乙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-[2-烯丙氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-[2-苄氧基乙基(甲基)氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-甲基-4-[甲基-[2-(间甲苯基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-[2-[(3,4-二甲基苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-[2-[(4-甲氧基苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-[2-[(3,4-二甲氧基苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-[2-[(3-氯苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-[2-[(3-氟苯基)甲氧基]乙基-甲基-氨基]-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-甲基-4-[甲基-[2-(2-吡啶基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-甲基-4-[甲基-[2-(3-吡啶基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-甲基-4-[甲基-[2-(4-吡啶基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-((4-(苄氧基)丁基)(甲基)氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-((2-羟乙基)(甲基)氨基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-甲基-4-[甲基-[2-(2-萘基甲氧基)乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-甲基-4-[甲基-[2-[(2,6,6-三甲基环己烯-1-基)甲氧基]乙基]氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
2,5,10,11,11-五甲基-6-氧代-7-氧杂-2,5,10-三氮杂十四碳-12-炔-14-硫代酸S-甲酯；
4-甲基-4-[甲基(2-苯氧基环戊基)氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
(S)-4-(2-((苄氧基)甲基)吡咯烷-1-基)-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-[3(苄氧基)-1-吡咯烷基])-4-甲基戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
1-4-二甲氨基-4-甲基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
5-4-甲基-4-吗啉-4-基-戊-2-炔硫代酸S-甲酯；
4-甲基-4-[甲基(辛基)氨基]戊-2-炔硫代酸S-甲酯。
5.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的至少一种化合物，其中所述至少一种式(I)的化合物包含在脂质纳米胶囊中。
6.根据权利要求5所述的用于所述用途的至少一种化合物，其中所述脂质纳米胶囊包含：
-油性核，其包含相对于所述纳米胶囊总重量，按重量计25％-90％，优选60％-80％的中链甘油三酯，和所述至少一种式(I)的化合物；和
-包围所述油性核的壳，其包含相对于所述纳米胶囊的总重量，按重量计3％-25％的至少一种脂质表面活性剂和至少一种亲水性表面活性剂；并且
其中所述中链甘油三酯和所述至少一种式(I)的化合物相对于纳米胶囊总重量的重量比为至少4。
7.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的至少一种化合物，其中所述至少一种式(I)的化合物或所述脂质纳米胶囊包含在药物组合物中。
8.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的至少一种化合物，用于刺激受试者中的免疫应答。
9.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的至少一种化合物，用于治疗和/或预防感染性病症，具体是通过刺激和促进嗜中性粒细胞的成熟和/或活化来治疗和/或预防感染性病症。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的用于所述用途的至少一种化合物，用于治疗和/或预防伤口愈合和/或组织修复；自身免疫病理状况和/或代谢疾病，具体是引起炎症的自身免疫病理状况和/或代谢疾病。
11.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的至少一种化合物，其中所述至少一种式(I)的化合物与免疫检查点抑制剂组合。
12.一种药物组合物，其包含权利要求1至6中任一项所定义的至少一种式(I)的化合物和免疫检查点抑制剂。
13.包含权利要求1至6中任一项所定义的至少一种式(I)的化合物和免疫检查点抑制剂的产品，作为组合制剂用于作为药物同时使用、分开使用或随时间分散开使用。
14.根据权利要求12所述的药物组合物或根据权利要求13所述的产品，其用于预防和/或治疗癌症。
15.根据权利要求14所述的用于所述用途的药物组合物或产品，其中所述癌症选自：黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠癌、急性髓性白血病、肝细胞癌、鳞状细胞头颈癌、肾细胞癌、宫颈癌、梅克尔细胞癌、PMBCL、经典霍奇金淋巴瘤、胃癌和GEJ癌。
16.根据权利要求11所述的用于所述用途的至少一种化合物、根据权利要求12所述的药物组合物、根据权利要求13所述的产品或根据权利要求14或15所述的用于所述用途的药物组合物或产品，其中所述免疫检查点抑制剂选自：PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、TIGIT、TIM-3、LAG-3CD160和2B4化合物，具体是PD1/PDL1化合物。
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