CN117304261A - 一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽及其制备方法和应用，具体讲是以黄姑鱼鱼鳔为原料，通过脱脂、中性蛋白酶和碱性蛋白酶复合酶解，超滤膜分级和色谱制备得到二肽基肽酶Ⅳ抑制寡肽Tyr‑Pro‑Val‑Glu‑Ser‑Pro‑Tyr，质谱测定其分子量为853.9Da。本发明制备的黄姑鱼鱼鳔寡肽可显著地抑制二肽基肽酶Ⅳ(DPP‑Ⅳ)活力，降低模型小鼠的餐后血糖水平，提高小鼠口服葡萄糖糖耐量和麦芽糖糖耐量，降低模型小鼠的甘油三酯(TG)和胆固醇(TC)的水平。因此，本发明的黄姑鱼鱼鳔寡肽可应用于制备治疗或者辅助治疗糖尿病的药物和功能产品。

Description

一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病是由于体内的胰岛素绝对或者相对分泌不足和(或)胰岛素利用障碍引起的碳水化合物、蛋白质、脂肪代谢紊乱性疾病，以高血糖为主要标志。长期存在高血糖，将引起糖尿病眼病、肾病、神经损伤、心脏病变、血管病变等多个组织器官的慢性进行性损伤，严重的甚至可以出现器官功能衰竭。在急性情况下可以引起严重的代谢紊乱，如糖尿病酮症酸中毒、糖尿病高渗。全球有5.37亿成年人(20～79岁)患有糖尿病，预计到2030年，糖尿病患病人数将上升至6.43亿；2045年，将上升至7.84亿。研发高效的降血糖药物对糖尿病的治疗至关重要。
胰高糖素样肽-1(GLP-1)是一种主要由肠道L细胞所产生的激素，属于肠促胰素(incretin)。GLP-1可以通过刺激胰岛素、抑制升糖素、抑制胃排空和促进胰岛细胞重生的方式来降低血糖。然而，人体自身产生的GLP-1极易被体内的二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解，其血浆半衰期不足2分钟，必须持续静脉滴注才能产生疗效，极大限制了GLP-1的临床应用。因此，寻找DPP-IV抑制剂，降低GLP-1的降解速率，使得GLP-1在体内维持高水平，就可以有效抑制胰高血糖素的分泌，从而降低血糖。因此，该方法也成为开发治疗糖尿病药物的主攻方向之一。
黄姑鱼是鲈形目石首鱼科黄姑鱼属鱼类，常栖息于泥沙底质海域中，主要分布于西北太平洋，在中国沿海也均有分布。黄姑鱼的鱼鳔富含胶原蛋白等多种营养物质，可以提高机体免疫力，而且还具有活血、补血、止血、御寒祛湿等功效。此外，鱼鳔对治疗食道癌、胃癌也显示出一定作用。
基于此，申请人以黄姑鱼鱼鳔为原料，利用蛋白酶酶解和色谱技术制备具有抑制二肽基肽酶IV(DPP-IV)活性的寡肽，该寡肽可以通过抑制DPP-IV活性降低血糖水平，从而可用于制备治疗糖尿病的药物和功能产品。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽及其制备方法和应用的技术方案。该寡肽通过抑制二肽基肽酶IV(DPP-IV)活性而实现降血糖效果，可应用于制备治疗或者辅助治疗糖尿病的药物和功能产品。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽，该寡肽的氨基酸序列为Tyr-Pro-Val-Glu-Ser-Pro-Tyr，如SEQ ID NO.1所示。
进一步，该寡肽的氨基酸ESI/MS检测分子量为853.9Da。
本发明第二方面提供了上述一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽作为二肽基肽酶IV抑制剂的应用。
本发明第三方面提供了上述一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽在制备降血糖药物中的应用。
本发明第四方面提供了上述一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽的制备方法，其包括以下步骤：
1)黄姑鱼鱼鳔的预处理：黄姑鱼鱼鳔解冻、去杂质，组织捣碎机捣碎，按料液比1g:10～15mL加入乙醇溶液，40KHZ、200～250W超声35～40min脱脂，重复三次，于室温9000g离心15～20min，固体沉淀干燥、研磨、过200目筛，得脱脂黄姑鱼鱼鳔粉末；
2)黄姑鱼脱脂鱼鳔粉末的酶解：将上述脱脂黄姑鱼鱼鳔粉末按照料液比1g:13～15mL加入到0.2mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，搅匀，溶液调温至50～55℃，调节pH值至6.5～7.5，加入鱼鳔粉末重量2.5～3.0％的中性蛋白酶，酶解3.5～4.0h后，溶液于95～100℃水浴中灭酶活；10～15min后，溶液调节温度至55～60℃，调节pH值至8.5～9.5，加入鱼鳔粉末重量0.5～1.0％的碱性蛋白酶，酶解1.5～3.0h后，溶液于95～100℃水浴中保温灭酶活，10～15min后于9000rmp离心10～12min，收集上清液，即得黄姑鱼鱼鳔蛋白酶解液；
3)黄姑鱼鱼鳔寡肽的制备：将上述黄姑鱼鱼鳔蛋白酶解液经截留分子量为1kDa、5kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集4个分级组分MW<1kDa、1kDa<MW<5kDa、5kDa<MW<10kDa和MW>10kDa，测定各超滤组分对二肽基肽酶IV的抑制活性，选择活性最好的组分，即黄姑鱼鱼鳔超滤酶解物；
4)黄姑鱼鱼鳔超滤酶解物的纯化：该超滤酶解物依次经大孔吸附树脂、凝胶色谱和反相高效液相色谱RP-HPLC纯化，得到黄姑鱼鱼鳔二肽基肽酶IV抑制寡肽。
进一步，所述步骤4)中大孔吸附树脂、凝胶色谱和RP-HPLC纯化的具体过程为：
大孔吸附树脂纯化：将黄姑鱼鱼鳔超滤酶解物溶解于超纯水配成浓度为25～30mg/mL的溶液，加入到HP20SS型大孔吸附树脂柱，静置吸附1.5～2.0h，然后用4～5倍柱体积的超纯水洗脱除去未吸附杂质，再用4-5被柱体积的75～85％乙醇溶液洗脱，流速1.0～1.5mL/min，收集80％乙醇的洗脱溶液，即为大孔吸附树脂层析酶解物；
凝胶色谱纯化：将上述大孔吸附树脂层析酶解物配成浓度为10～15mg/mL的溶液，经过Sephadex G-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速0.6～0.9mL/min，根据214nm下色谱图收集各色谱峰，测定各个色谱峰的DPP-IV抑制活性，活性最高色谱峰样品即为凝胶层析酶解物；
RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成15～20μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据制备寡肽的活性得1个高DPP-IV抑制活性的寡肽Tyr-Pro-Val-Glu-Ser-Pro-Tyr，ESI-MS测定其分子量为853.9Da。
进一步，所述RP-HPLC条件为：进样量8～10μL；色谱柱Kromasil C18规格为250mm×4.6mm，5μm；流动相：45％乙腈；洗脱速度0.9～1.1mL/min；紫外检测波长214nm。
通过本发明制备得到的黄姑鱼鱼鳔寡肽可显著抑制二肽基肽酶IV(DPP-IV)活力，对DPP-IV的IC50为0.297mg/mL；Tyr-Pro-Val-Glu-Ser-Pro-Tyr(YPVESPY)显著降低糖尿病小鼠餐后血糖水平，改善小鼠口服麦芽糖糖耐量和葡萄糖糖耐量，降低总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量。
本发明制备得到的黄姑鱼鱼鳔寡肽具有安全无毒副作用、降血糖功效显著等优点，可应用于制备治疗或者辅助治疗糖尿病的药物和功能产品。
附图说明
图1是本发明的黄姑鱼鱼鳔蛋白酶解液(HG-H)及其超滤组分(HG-H1～HG-H4)对二肽基肽酶IV(DPP-IV)的抑制活性(IC50,mg/mL)。
图2是本发明的黄姑鱼鱼鳔蛋白酶解液超滤组分HGYH1的Sephadex G-25柱层析色谱图。
图3是本发明的黄姑鱼鱼鳔蛋白酶解液超滤组分HGYH1经Sephadex G-15柱层析分离所得组分(H1a-1～H1a-3)对二肽基肽酶IV(DPP-IV)的抑制活性(IC50,mg/mL)。
图4是本发明的Sephadex G-21柱层析分离组分H1a-2的RP-HPLC色谱图。
图5是本发明的Sephadex G-21柱层析分离组分H1a-2经RP-HPLC纯化所得组分(HG-P1～HG-P8)对二肽基肽酶IV(DPP-IV)的抑制活性(IC50,mg/mL)。
图6是本发明的黄姑鱼鱼鳔寡肽Tyr-Pro-Val-Glu-Ser-Pro-Tyr(YPVESPY)的质谱图。
图7是本发明的黄姑鱼鱼鳔寡肽Tyr-Pro-Val-Glu-Ser-Pro-Tyr(YPVESPY)的结构。
图8是本发明的黄姑鱼鱼鳔寡肽Tyr-Pro-Val-Glu-Ser-Pro-Tyr(YPVESPY)对糖尿病小鼠餐后血糖曲线下面积的影响。
图9是本发明的黄姑鱼鱼鳔寡肽Tyr-Pro-Val-Glu-Ser-Pro-Tyr(YPVESPY)对糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量曲线下面积的影响。
图10是本发明的黄姑鱼鱼鳔寡肽Tyr-Pro-Val-Glu-Ser-Pro-Tyr(YPVESPY)对糖尿病小鼠口服麦芽糖耐量曲线下面积的影响。
图11是本发明的黄姑鱼鱼鳔寡肽YPVESPY对糖尿病小鼠甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量的影响。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例：
一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽，制备工艺流程如下：黄姑鱼鱼鳔→脱脂→复合酶解→超滤膜分级→色谱制备→DPP-IV抑制寡肽→降血糖功能评价。
具体步骤为：
1)黄姑鱼鱼鳔的预处理：黄姑鱼鱼鳔解冻、去杂质，组织捣碎机捣碎，按料液比1g:13mL加入乙醇溶液，40KHZ、230W超声38min脱脂，重复三次，于室温9000g离心16min，固体沉淀干燥、研磨、过200目筛，得脱脂黄姑鱼鱼鳔粉末；
2)黄姑鱼脱脂鱼鳔粉末的酶解：将上述脱脂黄姑鱼鱼鳔粉末按照料液比1g:14mL加入到Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(0.2mol/L)中，搅匀，溶液调温至53℃，调节pH值至7.2，加入鱼鳔粉末重量2.6％的中性蛋白酶，酶解3.5h后，溶液于98℃水浴中灭酶活；13min后，溶液调节温度至56℃，调节pH值至9.2，加入鱼鳔粉末重量0.8％的碱性蛋白酶，酶解1.8h后，溶液于98℃水浴中保温灭酶活，12min后于9000rmp离心12min，收集上清液，即得黄姑鱼鱼鳔蛋白酶解液(HG-H)。
3)黄姑鱼鱼鳔寡肽的制备：将上述黄姑鱼鱼鳔蛋白酶解液(HG-H)经截留分子量为1kDa、5kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集4个分级组分HG-H1(MW<1kDa)、HG-H 2(1kDa<MW<5kDa)、HG-H 3(5kDa<MW<10kDa)和HG-H 4(MW>10kDa)，测定4个组分对二肽基肽酶IV(DPP-IV)的抑制活性(IC50)(见图1)，选择活性最好的组分，即黄姑鱼鱼鳔超滤酶解物(HG-H1)，依次经凝大孔吸附树脂、凝胶色谱和和RP-HPLC纯化，得到黄姑鱼鱼鳔二肽基肽酶IV(DPP-IV)抑制寡肽。利用质谱测定其分子量，氨基酸序列分析仪测定其氨基酸序列。
①大孔吸附树脂纯化：将黄姑鱼鱼鳔超滤酶解物(HG-H1)溶于超纯水配成浓度为25mg/mL的溶液，加入到HP20SS型大孔吸附树脂柱，静置吸附2.0h，然后用4倍柱体积的超纯水洗脱除去未吸附杂质，再用5被柱体积的80％乙醇溶液洗脱，流速1.0～1.5mL/min，收集80％乙醇的洗脱溶液，即为大孔吸附树脂层析酶解物(H1a)，测定其对二肽基肽酶IV(DPP-IV)的抑制活性，IC50为2.036mg/mL。
②凝胶柱层析：将上述大孔吸附树脂层析酶解物(H1a)配成浓度为10～15mg/mL的溶液，经过Sephadex G-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速0.7mL/min，根据214nm下色谱图收集各色谱峰(H1a-1、H1a-2和H1a-3)(见图2)，测定H1a-1、H1a-2和H1a-3色谱峰的DPP-IV抑制活性(见图3)，H1a-2显示出最强DPP-IV抑制活性，即为凝胶层析酶解物(H1a-2)。
③RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成15～20μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化(RP-HPLC条件为：进样量8～10μL；色谱柱Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：45％乙腈；洗脱速度0.9～1.1mL/min；紫外检测波长214nm)，得214nm下色谱图(见图4)，制备10个寡肽组分(HGP1～HGP8)；测定各个色谱峰的DPP-IV抑制活性(见图5)，其中HGP5对DPP-IV的IC50为0.297mg/mL，显著低于其他寡肽，故选择HGP5进行结构分析和功能评价。
④结构检测：收集活性最高的HGP5，利用ESI-MS测定分子量为853.9Da(见图6)蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Tyr-Pro-Val-Glu-Ser-Pro-Tyr(YPVESPY)(见图7)。
⑤功能评价：参照文献[陈明珠。杭白菊中黄酮成分的抗糖尿病活性及其机制研究[D].天津科技大学，2019]实验方法，采用小鼠体内实验评估黄姑鱼鱼鳔寡肽YPVESPY的体内治疗糖尿病功能。
实验方法具体为：
1.1实验小鼠
选择体重为18-22g的昆明雄性SPF小鼠，饲养条件是室温25℃，湿度50％，光暗循环，实验小鼠可以自由饮水、摄食。
1.2糖尿病小鼠模型的制备
小鼠适应环境1周后，我们将小鼠随机分为两个组，分别是高脂饲料组和空白组，分别用高脂的饲料和普通的饲料喂养，饮水自由，每周定时称量小鼠的体重并记录小鼠的摄食量和饮水量。在高脂饲料饲养了4周后，禁食不禁水6h，先称量小鼠的体重，采用尾尖取血测量两组小鼠的血糖值，然后以100mg/kg的剂量对高脂饲料组的小鼠的腹腔注射链脲佐菌素(STZ)，然后继续给高脂饲料。1周后再一次称量小鼠体重并测量血糖值，空腹血糖值大于11.0mM视为造模成功。对于造模不成功的小鼠再次注射腹腔STZ(62mg/kg)，诱导期间记录小鼠的摄食和饮水量。
1.3.实验动物分组及给药
在造模成功之后，根据各小鼠的体重和血糖值，随机分为模型组、样品组，普通饲料喂养和STZ诱导没有成功的小鼠当做正常组。样品组分别给Tyr-Pro-Val-Glu-Ser-Pro-Tyr(YPVESPY)(55mg/kg)，正常组和模型组给予相同的生理盐水，连续28天灌胃给药，每日1次。模型组和样品组的小鼠还是继续高脂饲料喂养，正常组还是普通饲料喂养，各组小鼠自由的饮水。
1.4.检测小鼠体重、摄食量和饮水量
在给药的过程中，每天要记录小鼠体重。每周都要记录小鼠的摄食量和它们的饮水量，来进行比较。
1.5.检测小鼠餐后血糖和口服糖耐量
在连续4周的给药治疗结束后，给药前禁食不禁水3h，给完药后再给饲料，2h后取血于尾静脉，血糖仪用来检测各组小鼠的餐后血糖浓度，再统计其血糖变化曲线下面积(AUC)。
分别在小鼠给药第3周和第4周，测小鼠口服葡萄糖耐量和口服麦芽糖耐量。记录各组小鼠空腹血糖值和体重，给药1h后，给予各组小鼠2.5g/kg的葡萄糖和2.0g/kg的麦芽糖的剂量，之后分别在30、60、90和120min尾静脉采血测量血糖值，并釆用梯形面积法计算曲线下面积(AUC)。
1.6.甘油三酯和胆固醇的检测
在给药结束后，禁食不禁水过夜，小鼠的眼球取血，在Ep管中加入肝素钠溶液储存于其中，5000rpm离心10min，取上清。按照试剂盒里的测量方法检测甘油三酯(TG)和胆固醇(TC)的含量。
实验结果表明：YPVESPY能显著降低模型小鼠餐后血糖水平(见图8)，改善小鼠口服葡萄糖糖耐量(见图9)和麦芽糖糖耐量(见图10)，降低甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)的含量(见图11)。
与现有技术相比，本发明所提供的黄姑鱼鱼鳔寡肽Tyr-Pro-Val-Glu-Ser-Pro-Tyr(YPVESPY)可显著抑制二肽基肽酶IV(DPP-IV)活力，显著降低糖尿病小鼠餐后血糖水平，改善小鼠口服麦芽糖糖耐量和葡萄糖糖耐量，降低总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量。YPVESPY具有安全无毒副作用、降血糖功效显著等优点，可应用于制备治疗或者辅助治疗糖尿病的药物和功能产品。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽，其特征在于该寡肽的氨基酸序列为Tyr-Pro-Val-Glu-Ser-Pro-Tyr。
2.如权利要求1所述的一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽，其特征在于该寡肽的氨基酸ESI/MS检测分子量为853.9Da。
3.如权利要求1或2所述的一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽作为二肽基肽酶Ⅳ抑制剂的应用。
4.如权利要求1或2所述的一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽在制备降血糖药物中的应用。
5.如权利要求1或2所述的一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)黄姑鱼鱼鳔的预处理：黄姑鱼鱼鳔解冻、去杂质，组织捣碎机捣碎，按料液比1g:10～15mL加入乙醇溶液，40KHZ、200～250W超声35～40min脱脂，重复三次，于室温9000g离心15～20min，固体沉淀干燥、研磨、过200目筛，得脱脂黄姑鱼鱼鳔粉末；
2)黄姑鱼脱脂鱼鳔粉末的酶解：将上述脱脂黄姑鱼鱼鳔粉末按照料液比1g:13～15mL加入到0.2mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，搅匀，溶液调温至50～55℃，调节pH值至6.5～7.5，加入鱼鳔粉末重量2.5～3.0％的中性蛋白酶，酶解3.5～4.0h后，溶液于95～100℃水浴中灭酶活；10～15min后，溶液调节温度至55～60℃，调节pH值至8.5～9.5，加入鱼鳔粉末重量0.5～1.0％的碱性蛋白酶，酶解1.5～3.0h后，溶液于95～100℃水浴中保温灭酶活，10～15min后于9000rmp离心10～12min，收集上清液，即得黄姑鱼鱼鳔蛋白酶解液；
3)黄姑鱼鱼鳔寡肽的制备：将上述黄姑鱼鱼鳔蛋白酶解液经截留分子量为1kDa、5kDa和10kDa的超滤膜进行分级，收集4个分级组分MW<1kDa、1kDa<MW<5kDa、5kDa<MW<10kDa和MW>10kDa，测定各超滤组分对二肽基肽酶Ⅳ的抑制活性，选择活性最好的组分，即黄姑鱼鱼鳔超滤酶解物；
4)黄姑鱼鱼鳔超滤酶解物的纯化：该超滤酶解物依次经大孔吸附树脂、凝胶色谱和反相高效液相色谱RP-HPLC纯化，得到黄姑鱼鱼鳔二肽基肽酶Ⅳ抑制寡肽。
6.如权利要求5所述的一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽的制备方法，其特征在于所述步骤4)中大孔吸附树脂、凝胶色谱和RP-HPLC纯化的具体过程为：
大孔吸附树脂纯化：将黄姑鱼鱼鳔超滤酶解物溶解于超纯水配成浓度为25～30mg/mL的溶液，加入到HP20SS型大孔吸附树脂柱，静置吸附1.5～2.0h，然后用4～5倍柱体积的超纯水洗脱除去未吸附杂质，再用4-5被柱体积的75～85％乙醇溶液洗脱，流速1.0～1.5mL/min，收集80％乙醇的洗脱溶液，即为大孔吸附树脂层析酶解物；
凝胶色谱纯化：将上述大孔吸附树脂层析酶解物配成浓度为10～15mg/mL的溶液，经过Sephadex G-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速0.6～0.9mL/min，根据214nm下色谱图收集各色谱峰，测定各个色谱峰的DPP-Ⅳ抑制活性，活性最高色谱峰样品即为凝胶层析酶解物；
RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成15～20μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据制备寡肽的活性得1个高DPP-Ⅳ抑制活性的寡肽Tyr-Pro-Val-Glu-Ser-Pro-Tyr，ESI-MS测定其分子量为853.9Da。
7.如权利要求6所述的一种具有降血糖作用的黄姑鱼鱼鳔寡肽的制备方法，其特征在于所述RP-HPLC条件为：进样量8～10μL；色谱柱Kromasil C18规格为250mm×4.6mm，5μm；流动相：45％乙腈；洗脱速度0.9～1.1mL/min；紫外检测波长214nm。
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