CN117298083B - D-乳酸在制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供D‑乳酸在制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌药物中的用途。本发明提供的D‑乳酸能够靶向食管鳞状细胞癌肿瘤干细胞进行特异性杀伤，从根本上抑制了食管鳞状细胞癌的起始、复发、转移和耐药问题，同时规避了传统的放化疗治疗食管鳞状细胞癌给患者带来的副反应。

Description

D-乳酸在制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌药物中的用途

技术领域

本发明属于医药领域，涉及D-乳酸的治疗用途，具体涉及D-乳酸在制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌药物中的用途。

背景技术

食管癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率为世界第八位，死亡率排世界第六位，参见Cao,W.等人(2020)“Multi-faceted epigenetic dysregulation of gene expressionpromotes esophageal squamous cell carcinoma”Nat Commun 11(1):3675。其中，每年全球一半以上的新发病例发生在中国。根据病理分型，食管癌可分为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)与食管腺癌(esophagealadenocarcinoma,EAC)，在中国，约90％以上的食管癌为食管鳞状细胞癌，参见Xu,W.W.等人(2020)“Direct Targeting of CREB1 with Imperatorin Inhibits TGFbeta2-ERKSignaling to Suppress Esophageal Cancer Metastasis.”Adv Sci 7(16):2000925。目前，晚期食管癌的治疗方法是以铂类为主的联合化疗方案，但由于化疗耐药，肿瘤复发等原因，晚期食管癌的5年生存率不足20％，参见Uhlenhopp,D.J.等人(2020)“Epidemiology ofesophageal cancer:update in global trends,etiology and risk factors”ClinicalJournal of Gastroenterology 13(6):1010-1021。因此，食管鳞状细胞癌的诊疗现状依旧严峻。

近年来，分子靶向治疗成为研究热点，并在部分恶性肿瘤治疗中取得突破性进展。吉非替尼(Irresa)治疗非小细胞肺癌，尤其女性、不吸烟、腺癌患者预后更佳；伊马替尼治疗胃肠道间质瘤,特别是对于有Kit外显子11突变者可获得更好的疗效，参见Nilsson B.等人(2007)“Adjuvant imatinib treatment improves recurrence free survival inpatients with high-risk gastrointestinal stromal tumors(GIST)”Br J Cancer 96:1656-1658。C225联合放疗治疗局部晚期头颈部癌相比于单纯放疗治疗生存率提高近1倍，参见Bonner JA.等人(2006)“Radiotherapy plus cetuximab for squamous-cellcarcinoma of the head and neck”N Engl J Med 354:567-578。

因此，开发更为有效的治疗靶点分子是实现食管鳞状细胞癌精准治疗的先决条件。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供D-乳酸在制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌药物中的用途。

为了实现上述目的，本发明提供D-乳酸在制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌药物中的用途。

更进一步地，所述食管鳞状细胞癌为哺乳动物中的食管鳞状细胞癌。

优选地，所述哺乳动物为人。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的D-乳酸能够靶向食管鳞状细胞癌肿瘤干细胞进行特异性杀伤，从根本上抑制了食管鳞状细胞癌的起始、复发、转移和耐药问题，同时规避了传统的放化疗治疗食管鳞状细胞癌给患者带来的副反应。另一方面，本发明涉及的D-乳酸为小分子代谢物，经济成本较低、治疗效果较好，具有可观的临床应用前景。

附图说明

图1为本发明提供的贴壁生长的KYSE410和KYSE450细胞和悬浮生长的KYSE410和KYSE450细胞球的D-乳酸含量统计图。

图2A为本发明提供的D-乳酸在食管鳞状细胞癌KYSE410细胞中的IC50值。

图2B为本发明提供的D-乳酸在食管鳞状细胞癌KYSE450细胞中的IC50值。

图3A为2mM D-乳酸对食管鳞状细胞癌细胞KYSE410克隆形成的照片。

图3B为图3A的统计图。

图4A为不同浓度D-乳酸对于食管鳞状细胞癌细胞KYSE450侵袭能力的照片。

图4B为图4A的统计图。

图5A为不同浓度D-乳酸对于食管鳞状细胞癌细胞KYSE410迁移能力的照片。

图5B为图5A的统计图。

图6A为不同浓度D-乳酸对于食管鳞状细胞癌细胞KYSE450迁移能力的照片。

图6B为图6A的统计图。

图7为本发明提供的不同浓度D-乳酸对于食管鳞状细胞癌细胞KYSE410和KYSE450中干性相关基因SOX9、ABCG2、NANOG和SOX2表达的Western blot结果图。

图8A为本发明提供的不同浓度D-乳酸对于食管鳞状细胞癌细胞KYSE410和KYSE450体外球体形成能力的照片。

图8B为图8A的统计图。

具体实施方式

下面将对本发明的实施例进行详细、完善的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

肿瘤干细胞(cancer stem cell)是肿瘤里一小群处于休眠状态的细胞，这群细胞对常规的化疗药物高度不敏感，是肿瘤治疗耐药、转移与复发的重要因素，参见VISVADER JE.等人(2012)“Cancer stem cells:current status and evolving complexities”CellStem Cell 10(6):717-28。一些研究表明，肿瘤干细胞来源于人正常的干细胞，其干性的维持主要依赖于促进干性通路的激活以及抑制自我更新通路的失活，参见BAHR C.等人(2018)“A Myc enhancer cluster regulates normal and leukaemic haematopoieticstem cell hierarchies”Nature 553(7689):515-20。因此，寻找靶向肿瘤干细胞杀伤食管鳞癌的潜在靶点成为攻克食管鳞状细胞癌的关键所在。

乳酸的学名为α-羟基丙酸，分子式为C₂H₅OCOOH，属于一种天然存在的有机酸，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。乳酸为自然界最小的手性分子，分子中羧基α位碳原子为不对称碳原子，具有L(+)和D(-)两种构型。L-乳酸为左旋型，D-乳酸为右旋型，L-乳酸和D-乳酸互为手性分子，二者为旋光异构体，L-乳酸和D-乳酸等比例混合即为消旋的DL-型。D-乳酸和L-乳酸除旋光性外，它们的其它理化性质相同，但DL-型的物理性质与它们有所差别，表现在其熔点和熔化热比单一D或L构型的低。

本发明提供的乳酸为D-乳酸。D-乳酸90％为是采用类似于糖的碳水化合物为原料，经生物发酵技术生产的具有高旋光性(手性)乳酸。D-乳酸成品是无色或淡黄色澄清粘性液体、微酸味；有引湿性，水溶液显酸性反应。与水、乙醇或乙醚能任意混合，在氯仿中不溶。其结构式(I)所示：

D-乳酸为甲基乙二醛代谢途径的终产物，在D-乳酸脱氢酶的作用下分解生成丙酮酸，参见de Bari,L.等人(2019)“Synthesis and metabolism of methylglyoxal,S-D-lactoylglutathione and D-lactate in cancer and Alzheimer'sdisease”Ageing ResRev 53:100915。尽管已有研究报道前列腺癌细胞通过D-乳酸脱氢酶代谢线粒体内的D-乳酸，参见Lidia d B.等人(2013)“Prostate cancer cells metabolize d-lactate insidemitochondria via a D-lactate dehydrogenase which is more active and highlyexpressed than in normal cells”FEBS Letters 587467–473，D-乳酸在人类肿瘤发生发展进程中的作用研究极少。

材料：

1.人源食管鳞癌细胞系KYSE410和KYSE450均为商业化细胞系，由日本京都大学的YutakaShimada教授馈赠，也可以到商业网站进行购买。

2.完全培养基购买自北京细工生物科技有限公司，为10％FBS RPMI 1640培养基，其中含10％胎牛血清(FBS)，100U/ml Penicillin(青霉素)，100U/ml Streptomycin(链霉素)，5958mg/ml HEPES,L Glutamine(谷氨酰胺)，NaHCO3,Phenol Red(酚红)。

3.DMEM/F12培养基(Dulbecco’s modifed Eagle’s medium/F12)购买自Gibco，货号：12400024。

4.甲基纤维素购买自Sigma-Aldrich公司，货号：M0512。

5.B-27^TMSupplement(50X)购买自Gibco公司，货号：17504044。

6.表皮生长因子EGF购买自Invitrogen公司，货号：PHG0311。

7.碱性成纤维生长因子bFGF均购买自Proteintech公司，货号：HZ-1285。

8.D-乳酸购买自Sigma-Aldrich公司，货号：L0625。

9.D-乳酸检测试剂盒购买自Biovision公司，货号：K667。

10.BCA蛋白浓度测定试剂盒购买自北京普利莱基因技术有限公司，货号P1511。

11.Super ECL超敏发光液(中)购买自北京普利莱基因技术有限公司，货号：P1030。

12.β-actin抗体(一抗)购买自Abcam公司，货号：ab8226。

13.ABCG2抗体(一抗)购买自Abcam公司，货号：ab108312。

14.SOX2抗体(一抗)购买自Cell Signaling Technology公司，货号：3579S。

15.NANOG抗体(一抗)购买自Cell Signaling Technology公司，货号：4903S。

16.SOX9抗体(一抗)购买自Cell Signaling Technology公司，货号：82630T。

17.Western blot实验所用二抗购买自Promega Corporation公司，anti MouseIgG(H+L),HRP Conjugate，货号：W4021；anti Rabbit IgG(H+L),HRP Conjugate，货号：W401B。

实施例1：贴壁的食管鳞状细胞癌细胞和食管鳞状细胞癌细胞球中D-乳酸的含量

利用细胞体外球体形成实验获得3D培养的KYSE410和KYSE450细胞球。另一方面，利用D-乳酸检测试剂盒检测贴壁生长的KYSE410和KYSE450细胞及其对应3D培养细胞球中D-乳酸的含量。

1.体外球体形成实验

(1)成球培养基配制：将2％甲基纤维素与2×DMEM/F12培养基(已加入B27、20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF)等比例混合均匀，即为1×成球培养基。

(2)消化细胞：弃掉旧培养基，加入5ml无菌1×PBS清洗KYSE410和KYSE450细胞2次，加入2ml胰蛋白酶，37℃消化3-5min，显微镜下观察细胞皱缩变圆，伪足消失，细胞之间分开，部分细胞贴壁能力减弱，脱离皿底。加入2ml RPMI-1640完全培养基重悬细胞，并将细胞悬液稀释10倍，吹打均匀成单细胞悬液后备用。

(3)细胞计数：取10μl稀释后的单细胞悬液与10μl台盼蓝混合均匀，室温静置3min，加入到细胞计数板中，利用细胞自动计数仪，计算出活细胞浓度。

(4)铺板：计算所需活细胞总量，即2000个细胞/孔×6孔＝1.2×10⁴个细胞。计算所需单细胞悬液体积，即1.2×10⁴个细胞/活细胞浓度(个细胞/ml)＝体积(ml)。将所需体积的单细胞悬液加入到2ml成球培养基中，轻轻混匀后加入到低吸附6孔板中继续培养。

(5)37℃、5％ CO₂培养箱中培养约两周后，可在镜下观察到细胞球(直径≥100μm)，收集细胞球备用。

2.D-乳酸含量检测

使用D-乳酸检测试剂盒进行D-乳酸含量检测。具体操作按照说明书进行。

(1)绘制标准曲线：取10μl 100mM D-乳酸标准品加入到990μl D-乳酸实验缓冲液中稀释成1mM。取0、2、4、6、8和10μl稀释后的D-乳酸标准品加入到96孔板中，补加D-乳酸实验缓冲液至50μl/孔，对应的D-乳酸标准品浓度为0、2、4、6、8和10nmol/孔。

(2)样品准备：分别消化、计数2×10⁶个KYSE410和KYSE450细胞及其对应的细胞球，1×PBS清洗两遍后离心、弃上清，分别向细胞沉淀中加入100μlD-乳酸实验缓冲液，冰上孵育10分钟，4℃、13000g离心10分钟后收集上清，即为待测样品。向96孔板中加入10μl检测样品，补加40μl D-乳酸实验缓冲液至50μl/孔。每个样品做3个副孔。

(3)反应混合物准备：每孔加入50μl反应混合物，包含46μl D-乳酸实验缓冲液、2μl D-乳酸底物混合物和2μl D-乳酸酶混合物。

(4)向包含50μl D-乳酸标准品或者检测样品的孔中加入50μl反应混合物，充分混匀。水平摇床上室温避光孵育反应30分钟。

(5)通过酶标仪检测每孔在波长450nm下的吸光度值。

(6)计算：从所有标准品和样品孔读数中减去空白对照孔数值进行背景校正。以D-乳酸浓度/孔作为X轴，以OD450 nm处吸光度值作为纵坐标，绘制出标准曲线。将样本孔OD450nm处吸光度值对应到标准曲线中，计算出检测孔D-乳酸浓度。

3.数据分析

利用t-test进行统计，P<0.05认为具有统计学差异，结果如图1所示。

从图1可以看出，比较贴壁生长的KYSE410和KYSE450细胞(分化的非食管鳞状细胞癌干细胞)以及3D悬浮生长的KYSE410和KYSE450细胞球(食管鳞状细胞癌干细胞)中D-乳酸的含量，悬浮生长的食管鳞状细胞癌KYSE410和KYSE450细胞球中D-乳酸含量显著低于贴壁细胞，说明食管鳞状细胞癌干细胞分解D-乳酸的能力更强，过量的D-乳酸累积不利于食管鳞状细胞癌干细胞的生长。

实施例2：D-乳酸在食管鳞状细胞癌细胞KYSE410和KYSE450中的IC50值

利用0mM、2mM、4mM、8mM、10mM、20mM、50mM和100mM D-乳酸处理食管鳞状细胞癌细胞KYSE410和KYSE450 72小时。利用MTS实验检测不同浓度D-乳酸对食管鳞状细胞癌细胞活力的影响，并计算出IC50值。

MTS实验

1.细胞铺板

(1)在超净台中，消化KYSE410和KYSE450细胞并制成单细胞悬液。

(2)取9μl的单细胞悬液与1μl的台盼蓝染色液混合，取10μl混合液加入细胞计数板中。利用细胞计数仪检测出活细胞浓度。

(3)用RPMI-1640完全培养基将单细胞悬液的浓度调整为50000个/ml。

(4)将单细胞悬液以每孔100μl的体积铺于96孔板中，每个D-乳酸浓度设置3个复孔，再将96孔板放入细胞培养箱中培养。

2.加药处理

(1)设置D-乳酸浓度梯度为0mM、2mM、4mM、8mM、10mM、20mM、50mM和100mM。

(2)待细胞贴壁后，弃去原培养基，将不同浓度的D-乳酸培养基混合液加入到96孔板中，每孔100μl。

(3)将96孔板放入培养箱中培养72h。

3.吸光度测量及结果分析

(1)将MTS试剂与RPMI-1640培养基按1：9的比例混合，现配现用，避光保存。

(2)弃去原培养基，在每个孔中加入100μl MTS混合液，轻轻摇匀，避光操作。放入培养箱中孵育1-4小时。

(3)设置酶标仪参数，选用490nm波长测量吸光度。注意孔内不要有气泡。

(4)用GraphPad软件计算D-乳酸的IC50值，结果如图2A和图2B所示。

从图2A和图2B可以看出，D-乳酸可以显著抑制食管鳞状细胞癌细胞KYSE410和KYSE450的细胞活力。

实施例3：D-乳酸对食管鳞状细胞癌细胞KYSE410克隆形成能力的影响

利用0mM和2mM D-乳酸处理KYSE410细胞，并检测细胞克隆形成能力的改变。

1.平板克隆形成实验

(1)在超净台内消化KYSE410细胞并制成单细胞悬液。

(2)用RPMI-1640培养基将细胞悬液的浓度调整为1250个/ml。取4ml细胞重悬液加入到6cm细胞培养皿中，补加0mM和2mM D-乳酸，轻轻混匀后放入细胞培养箱中培养。

(2)当细胞克隆长到肉眼可见时，停止细胞培养。

(3)弃原培养基，用1×PBS洗涤细胞，弃1×PBS。

(4)加入1ml甲醇溶液固定细胞，室温15min，弃甲醇。

(5)再加入适1ml结晶紫染液，室温染色30min。

(6)回收结晶紫染液，小心洗去多余的染液，室温干燥。

(7)使用Image J软件统计所形成的细胞克隆数，并拍照保存，如图3A所示。

2.数据分析

利用t-test进行统计，P<0.05认为具有统计学差异，结果如图3B所示。

从图3A和图3B可以看出，D-乳酸可以显著抑制KYSE410细胞的克隆形成能力，说明D-乳酸能够有效抑制食管鳞状细胞癌细胞的生长。

实施例4：D-乳酸对食管鳞状细胞癌细胞侵袭能力的影响

利用0mM、4mM、8mM和16mM D-乳酸处理KYSE450细胞，并检测细胞侵袭能力的改变。

1.Transwell细胞侵袭实验

(1)基质胶铺板：提前一晚将基质胶放入4℃过夜融化，用无血清培养基稀释Matrigel基质胶(冰上操作，枪头预冷)，上室加100μl(20-30μg/孔)，放入37℃培养箱中待其凝固，出现“白色层”。

(2)在超净台内消化细胞并用不含血清的培养基将细胞重悬，并调整细胞密度为10000个/ml。

(3)取200μl细胞悬液加入到上室中，下室中加入1ml含20％血清的细胞培养基，放入细胞培养箱中培养24h。

(4)弃去上下室内的培养基，并在下室加入1ml甲醇溶液固定细胞，固定15min，弃甲醇。

(5)在下室内加入1ml结晶紫染液，室温染色30min。

(6)回收结晶紫染液，小心洗去多余的染液，室温干燥。

(7)用Image J软件统计穿过小室的细胞数，并拍照保存，如图4A所示。

2.数据分析

利用t-test进行统计，P<0.05认为具有统计学差异，如图4B所示。

从图4A和图4B可以看出，D-乳酸可以剂量依赖地抑制KYSE450细胞的侵袭能力，随着D-乳酸处理浓度的增加，KYSE450细胞的侵袭能力逐渐减弱。说明D-乳酸处理可以有效抑制食管鳞状细胞癌细胞的转移。

实施例5：D-乳酸对食管鳞状细胞癌细胞KYSE410迁移能力的影响

利用0mM、4mM、8mM和16mM D-乳酸处理KYSE410细胞，并检测细胞迁移能力的改变。

1.细胞划痕实验

(1)培养板划线标记：用marker笔在6孔板背后画横线(用直尺比着)，每孔至少穿过5条线，每条线均匀且平行。

(2)细胞铺板：在孔内接种5-10×10⁵个细胞(可根据细胞的生长快慢调整接种数量)，原则为过夜后细胞能够长满，切记一定要铺匀。

(3)细胞划线：第二天用20ul枪头(灭菌)或牙签，垂直孔板背后的黑线划痕，使划痕与标记线相交。

(4)清洗细胞：划线完成后，使用无菌PBS洗细胞2-3次，去除划下的细胞，使留下的间隙肉眼即清晰可见，然后更换新鲜无血清或低血清(<2％)的培养基继续培养。

(5)细胞培养与观察：将细胞放入37℃，5％CO₂培养箱中培养。然后在0，24，48小时后取出细胞，在显微镜下观察并拍照。

(6)使用Image J软件打开图片后，随机划取6至8条水平线，计算细胞间距离的均值，如图5A所示。

2.数据分析

利用t-test进行统计，P<0.05认为具有统计学差异，如图5B所示。

从图5A和图5B可以看出，D-乳酸可以剂量依赖地抑制KYSE410细胞的迁移能力，随着D-乳酸浓度的增加，KYSE410细胞的划痕恢复能力递减。因此，D-乳酸可用于预防和/或治疗食管鳞状细胞癌患者的复发转移。

实施例6：D-乳酸对食管鳞状细胞癌细胞KYSE450迁移能力的影响

利用0mM、4mM、8mM和16mM D-乳酸处理KYSE450细胞，并检测细胞迁移能力的改变，方法同实施例5，划线结果如图6A所示，统计结果如图6B所示。

从图6A和图6B可以看出，D-乳酸可以剂量依赖地抑制KYSE450细胞的划痕恢复，说明D-乳酸的确可以有效抑制食管鳞状细胞癌细胞的转移。

实施例7：D-乳酸对食管鳞状细胞癌细胞KYSE410和KYSE450干性相关基因表达的影响

利用0mM、4mM、8mM和16mM D-乳酸处理KYSE410和KYSE450细胞72小时，并利用Western blot检测细胞中干性相关基因SOX9、ABCG2、NANOG和SOX2的表达情况。

1.细胞总蛋白提取

(1)取处理后的KYSE410和KYSE450细胞，弃去培养皿中原培养基，加入预冷的1×PBS洗涤细胞，弃PBS。

(2)向培养皿中加1ml预冷的1×PBS，并在冰上用细胞刮板收集细胞至1.5ml EP管中。

(3)离心，780rpm，5分钟，弃上清。

(4)根据收集的细胞沉淀数量加入适量的RIPA裂解液(1ml RIPA/10⁷个细胞)，将细胞吹散并置于冰上，每10分钟震荡一次，共裂解30分钟。

(5)离心，12000rpm，15min，4℃，取上清至新的1.5ml EP管中，冰上放置。

(6)待测量浓度后，加入5×Loading Buffer，混匀。

(7)将蛋白放入100℃金属浴锅中煮10min，加热变性。

(8)将煮好的蛋白放于-20℃冰箱中保存。

2.BCA法测量蛋白浓度

(1)制备BCA标准品：将BCA标准品原液用蒸馏水按比例进行稀释。

(2)制备BCA工作液：将试剂盒中的A液和B液按50∶1的体积比混合成工作液，现配现用。

(3)稀释蛋白样品：吸取10μl的蛋白裂解液与40lL的双蒸水混匀。

(4)将工作液加入到96孔板中，每孔80μl，再将稀释好的蛋白样品加到96孔板中，每孔10μl，每个待测样品应设置3个复孔。

(5)将96孔板放置于37℃孵箱中，孵育30min。

(6)使用酶标仪读取测量样品的OD值，选取波长为579nm。

(7)绘制蛋白标准曲线，计算蛋白样品的浓度。

3.电泳

(1)制胶：按照表1配制10％分离胶，待分离胶凝固后，再加入5％的浓缩胶，并立即在浓缩胶内插入梳子，注意不要产生气泡。

表1

(2)上样：在浓缩胶的小孔中加入相同质量的蛋白样品，并在相邻的孔内加入5μl量程合适的蛋白分子量指示剂。

(3)电泳：先用80V恒压进行电泳，待样品压成一条线后改为120V恒压，继续电泳，直至染料到达分离胶底部。

4.转膜

(1)在1×转膜缓冲液浸泡的环境中，在靠近转膜盒阴极侧的内面铺上纤维垫，将两张滤纸放置其上。

(2)从电泳槽内取出胶板，卸下一侧的玻璃板，切去浓缩胶多余部分，将剩余的分离胶放置在铺好的滤纸上，保持湿润。

(3)将合适大小的PVDF膜放入甲醇中浸泡1min，然后铺在电泳凝胶上。

(4)将两张滤纸放置在PVDF膜上。

(5)在PVDF膜上放纤维垫，注意不要留有气泡，夹紧转膜盒后将其放入转膜槽中。

(6)向转膜槽中注满1×转膜缓冲液，并将转膜槽放置在冰盒内。

(7)打开电源，350mA恒流转膜90min。

5.免疫反应及化学发光

(1)用镊子将PVDF膜从转膜槽中取出并浸泡在5％脱脂奶粉内，置于水平摇床上室温孵育1h。

(2)用封闭液稀释一抗，按分子量大小裁剪PVDF膜，再将PVDF膜浸泡在一抗中孵育过夜，4℃。

(3)用1×PBST洗膜，3次，每次10min。

(4)用封闭液稀释二抗，再将PVDF膜浸泡在二抗中孵育1h，室温。

(5)用1×PBST洗膜，3次，每次10min。

(6)配置显影液，将化学发光试剂盒中的两种试剂等体积混合，现配现用，避光保存。

(7)将PVDF膜周围多余液体吸去并放置于曝光板上，在膜上滴加显影液。

(8)曝光并保存图片，结果如图7所示。

从图7可以看出，D-乳酸可以剂量依赖地抑制KYSE410和KYSE450细胞中干性相关基因SOX9、ABCG2、NANOG和SOX2的表达，随着D-乳酸处理浓度的增加，肿瘤干细胞调控相关基因的表达呈下降趋势，说明D-乳酸可有效抑制食管鳞状细胞癌的发生。

实施例8：D-乳酸对食管鳞状细胞癌细胞KYSE410和KYSE450体外球体形成能力的影响

利用0mM、4mM、8mM和16mM D-乳酸处理KYSE410和KYSE450细胞，并利用细胞体外球体形成实验检测细胞体外成球能力的改变。

1.体外球体形成实验

(1)成球培养基配制：将2％甲基纤维素与2×DMEM/F12培养基(已加入生长因子)等比例混合均匀，即为1×成球培养基。(参见实施例1步骤1)

(2)消化细胞：弃掉旧培养基，加入5ml无菌1×PBS清洗细胞2次，加入2ml胰蛋白酶，37℃消化3～5min。加入2ml RPMI-1640完全培养基重悬细胞，并将细胞悬液稀释10倍，吹打均匀成单细胞悬液后备用。

(3)细胞计数：取10μl稀释后的单细胞悬液与10μl台盼蓝混合均匀，室温静置3min，加入到细胞计数板中，利用细胞自动计数仪，计算出活细胞浓度。

(4)铺板：计算所需活细胞总量(1个细胞/μl成球培养基)。以96孔低吸附细胞培养板为例：100个细胞/100μl成球培养基/孔×(6个副孔+3个损失备用孔)＝900个细胞(活细胞浓度)＝所需单细胞悬液体积(样品)。

(5)37℃、5％ CO₂培养箱中过夜培养，次日显微镜下计数，培养箱中继续培养，7天后补加100μl成球培养基/孔，约两周可在镜下观察到细胞球(直径≥100μm)，如图8A所示。

2.数据分析

利用t-test进行统计，P<0.05认为具有统计学差异，如图8B所示。

从图8A和图8B可以看出，D-乳酸可以剂量依赖地抑制KYSE410和KYSE450细胞的体外成球能力，随着D-乳酸处理浓度的增加，食管鳞状细胞癌细胞体外球体形成效率呈递减趋势。因此，D-乳酸可用于预防和/或治疗食管鳞状细胞癌，从根源上解决食管鳞状细胞癌的起始、转移、复发和耐药问题，改善食管鳞状细胞癌患者的预后和治疗效果。

从上述实施例可以看出，本发明所提供的D-乳酸在制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌药物中的用途。D-乳酸的添加可以抑制食管鳞状细胞癌细胞系的细胞活力、克隆形成、侵袭、迁移、干性基因表达和体外球体形成能力。从而使D-乳酸在食管鳞状细胞癌的临床治疗中发挥关键作用。同时规避了传统的放化疗治疗食管鳞状细胞癌给患者带来的副反应，如营养不良、食管穿孔、放射性食管炎、气道反应和食管梗阻等放疗副反应，及骨髓抑制、胃肠道反应、肝肾功能损害、神经系统毒性和过敏反应等化疗副反应。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.D-乳酸在制备治疗和/或预防食管鳞状细胞癌药物中的用途。

2.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，所述食管鳞状细胞癌为哺乳动物中的食管鳞状细胞癌。

3.如权利要求2中所述的用途，其特征在于，所述哺乳动物为人。