CN108245686A - 人grk5基因的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人GRK5基因的用途，即人GRK5基因作为针对癌症细胞的作用靶点应用于制备治疗非小细胞肺癌药物，所述针对癌症细胞的作用靶点为RNA干扰作用靶标；与正常肺支气管上皮细胞相比，GRK5基因在非小细胞肺癌细胞中高表达，针对GRK5基因设计的RNA干扰慢病毒，抑制GRK5表达，能显著抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、使肿瘤细胞分裂阻滞在G2/M期，促进细胞的凋亡、抑制细胞的迁移、抑制裸鼠移植肿瘤的形成，进而能达到治疗非小细胞肺癌的目的，表明人GRK5基因可以作为非小细胞肺癌治疗的靶点，为将来基于GRK5基因的非小细胞肺癌治疗药物的开发提供广阔的前景。

Description

人GRK5基因的用途

技术领域

本发明涉及一种基因的新用途，尤其是人GRK5基因的新用途。

背景技术

非小细胞肺癌是世界上主要的由于癌症导致死亡的恶性肿瘤之一，而所有肺癌病例中非小细胞肺癌最多，大约占80%。非小细胞肺癌主要包括三类：鳞癌、腺癌和大细胞癌。虽然已经开发出许多治疗方法，但非小细胞肺癌患者的平均生存时间不到一年。据报道，表皮生长因子受体-酪氨酸激酶联合抑制剂对一些携带L858或者外显子19缺失EGFR突变的患者更加有效。然而，表皮生长因子受体-酪氨酸激酶联合抑制剂产生先天性和获得性耐受的情况日益严重，因而急需开发新一代表皮生长因子受体-酪氨酸激酶联合抑制剂，或者开发靶向其他靶点的联合治疗。

GRK5基因是G蛋白偶联受体激酶，是丝氨酸/苏氨酸蛋白家族的成员之一，在识别和磷酸化G蛋白偶联受体从而使G蛋白偶联受体介导的级联反应脱敏的过程中发挥重要作用。特别是G蛋白偶联受体激酶对多种G蛋白偶联受体发挥重要的负向调节作用，包括肾上腺素受体、毒蕈硷受体、多巴胺受体和趋化因子受体。目前，G蛋白偶联受体激酶家族有七个成员GRK1-7，这七个成员根据序列相似性分为三类：GRK1和 GRK 7属于视紫质激酶亚家族，GRK2和GRK3属于β-肾上腺素受体激酶亚家族，GRK4、GRK5和GRK6属于GRK4亚家族。GRK1和GRK7在视网膜特异性表达，GRK4只在睾丸表达，然而，GRK2、GRK3、GRK5和GRK6在多种细胞类型中广泛分布。

越来越多的研究显示，G蛋白偶联受体激酶在许多病理条件下的表达和活性异常，尤其是肿瘤。具体来说，GRK5通过抑制细胞周期进程抑制前列腺癌的发生发展。此外，GRK5能够调节p53的磷酸化和降解水平，从而使骨肉瘤细胞及小鼠表现出DNA损伤诱导的凋亡受到抑制。而且，GRK5的缺失通过直接磷酸化细胞骨架-细胞膜黏连蛋白moesin能够降低人前列腺癌的生长、迁移和转移。GRK5磷酸化核仁磷酸蛋白（NPM1），调控乳腺癌细胞对类polo激酶抑制剂诱导的凋亡的敏感性。他佐罗汀诱导基因1（TIG1）通过上调GRK5蛋白显著抑制结直肠癌的生长。然而到目前为止， GRK5在非小细胞肺癌中的功能还不清楚。

RNA干扰现象是细胞内自主产生的生物进化过程中一项保守的防御机制，已成为一种通过抑制目的基因的表达来研究哺乳动物基因产物功能的强大的工具。

发明内容

本发明的目的在于提供人GRK5基因的新用途，即人GRK5基因作为针对非小细胞肺癌细胞的作用靶点应用于制备治疗非小细胞肺癌药物，所述针对非小细胞肺癌细胞的作用靶点为RNA干扰作用靶标。

所述RNA干扰作用靶点选自下述核苷酸序列：

SEQ ID NO:1︰GCACAGTCTGTCCACGAGTAC；

SEQ ID NO:2︰CCGCCAGATCTGAACAGAAAC。

将抑制人GRK5基因表达的shRNA序列克隆入慢病毒载体后获得RNA 干扰慢病毒，用于制备非小细胞肺癌基因治疗药物；表达shRNA 的序列包括两个靶向人GRK5基因编码DNA的反向重复序列，中间由一茎环序列分隔；其中，两个反向重复序列分别为人GRK5基因的shRNA 靶点序列及其互补序列。

所述表达shRNA 的序列的正义链序列如 SEQ ID NO:3 所示，反义链序列如 SEQID NO:4 所示；或者正义链序列如 SEQ ID NO:5所示和反义链序列如SEQ ID NO:6所示。

Forward oligo: GRK5 FO1（SEQ ID NO:3）

CCGGGCACAGTCTGTCCACGAGTACCTCGAGGTACTCGTGGACAGACTGTGCTTTTTG；

Reverse oligo: GRK5 RO1（SEQ ID NO:4）

AATTCAAAAAGCACAGTCTGTCCACGAGTACCTCGAGGTACTCGTGGACAGACTGTGC；

或者

Forward oligo: GRK5 FO2（SEQ ID NO:5）

CCGGCCGCCAGATCTGAACAGAAACCTCGAGGTTTCTGTTCAGATCTGGCGGTTTTTG；

Reverse oligo: GRK5 RO2（SEQ ID NO:6）

AATTCAAAAACCGCCAGATCTGAACAGAAACCTCGAGGTTTCTGTTCAGATCTGGCGG；

GRK5基因参与许多病理过程，是G蛋白偶联受体激酶之一；GRK5除了倾向于结合磷脂表现出膜定位，还能够定位到细胞核。GRK5在肿瘤中的作用依赖于亚细胞定位和细胞本身的背景。我们实验室对其在非小细胞肺癌的发生发展中的作用进行了解析，通过real-timePCR检测，我们发现与对照组正常肺支气管上皮细胞相比，GRK5的RNA水平在非小细胞肺癌细胞系中的表达明显增高，用蛋白免疫印迹（WB）的方法检测发现GRK5的蛋白水平在非小细胞肺癌细胞中较正常肺支气管上皮细胞高。通过对临床组织样本的检测也发现，GRK5在非小细胞肺癌患者中呈高表达趋势，由此推测，GRK5在非小细胞肺癌的发生发展中起着重要作用；因此，我们通过NCBI数据库，找到人的GRK5的序列，人GRK5基因的核苷酸序列见genebank中基因登录号为ID：2869， Chromosome 10第119207685-119455619位所示，mRNA序列见NM_005308.2，CDS区序列为其中第234-2006位所示。

本发明基于GRK5基因在非小细胞肺癌细胞中表达量明显相较正常人肺支气管上皮细胞 (BEAS-2B)高，而且在非小细胞肺癌患者中存在很多 GRK5 突变的发现，通过降低GRK5 的表达能抑制非小细胞肺癌细胞增殖、体外迁移的和体内的异种移植肿瘤形成，表明人GRK5基因可以作为癌症治疗的靶点；针对人GRK5基因设计的RNA干扰慢病毒，在肺癌细胞系内降低了GRK5表达，能明显抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、使细胞阻滞在G2/M期，促进细胞的凋亡、抑制细胞的迁移、抑制异种移植肿瘤的形成，进而能达到治疗非小细胞肺癌的目的，同时为将来基于GRK5基因的非小细胞肺癌治疗药物的开发提供了可能，本发明具有较大的应用价值和前景。

附图说明

图1为GRK5在正常肺支气管上皮细胞和不同的非小细胞肺癌细胞系中mRNA表达结果示意图；

图2为GRK5在正常肺支气管上皮细胞和不同的非小细胞肺癌细胞系中GRK5 蛋白的表达结果示意图；

图3为非小细胞肺癌肿瘤组织芯片 (TMA) 检测539个非小细胞肺癌和99个相邻正常组织中 GRK5 的表达情况结果，其中A图放大倍数40×下GRK5 在正常组织中的阴性染色结果；A’图放大倍数40×下GRK5 在正常组织中的阳性染色结果；B图放大倍数40×下GRK5 在非小细胞肺癌肿瘤组织中阴性染色结果；B’图放大倍数40×下GRK5在非小细胞肺癌肿瘤组织中阳性染色结果；C图IHC量化数据（normal：正常肺组织，tumor：非小细胞肺癌肿瘤组织）；

图4为GRK5高表达与病人预后相关性分析结果示意图；其为在非小细胞肺癌肿瘤组织芯片 (TMA)中GRK5的高低表达与预后关联性分析的结果示意图；GRK5高表达的病人生存时间相对较短，而GRK5低表达的病人生存时间相对较长。

图5为通过实时荧光定量 PCR（A图）和免疫印迹实验（B图）在GRK5表达相对较高的两株非小细胞肺癌细胞系A549和H1299中验证了GRK5shRNA敲低效率，其中-GRK5为GRK5抗体，-GAPDH为GAPDH抗体；*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001,t-test；

图6为抑制GRK5表达抑制细胞增殖实验中生长曲线结果；A图为A549敲降稳转细胞株，B图为H1299敲降稳转细胞株；***p<0.001,t-test；

图7为抑制GRK5表达抑制细胞增殖实验中BrdU掺入实验结果，其中A图为在A549细胞中GRK5敲低后，与对照相比，DNA合成明显减少的结果；B图为在H1299细胞中GRK5敲低后，与对照相比，DNA合成明显减少的结果；C图为A549细胞定量结果；D图为H1299细胞定量结果，**p<0.01, ***p<0.001,t-test；

图8为细胞周期检测实验结果，其中A图为在A549细胞中GRK5敲低后，与对照相比，G2/M期的细胞比例增加；B图为在H1299细胞中GRK5敲低后，与对照相比，G2/M期的细胞比例增加；C图为A549细胞定量结果；D图为H1299细胞定量结果，*p<0.05,t-test；

图9为细胞凋亡检测实验结果，其中A图为在A549细胞中GRK5敲低后，与对照相比，细胞凋亡的比例增加；B图为在H1299细胞中GRK5敲低后，与对照相比，细胞凋亡的比例增加；C图为A549细胞定量结果；D图为H1299细胞定量结果，*p<0.05, ***p<0.001,t-test；

图10为细胞划痕实验结果，其中A图为在A549细胞中GRK5敲低后，与对照相比，迁移受到抑制；B图为在H1299细胞中GRK5敲低后，与对照相比，迁移受到抑制；C图为A549细胞定量结果；D图为H1299细胞定量结果，*p<0.05,t-test；

图11为细胞transwell实验结果，其中A图为在A549细胞中GRK5敲低后，与对照相比，迁移的细胞明显减少；B图为在H1299细胞中GRK5敲低后，与对照相比，迁移的细胞明显减少；C图为A549细胞定量结果；D图为H1299细胞定量结果，*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001，t-test；

图12为细胞粘着斑（vinculin）免疫荧光染色实验结果，其中A图为在A549细胞中GRK5敲低后，与对照相比，细胞周边的点状粘着斑明显增多；B图为在H1299细胞中GRK5敲低后，与对照相比，细胞周边的点状粘着斑明显增多；C图为A549细胞定量结果；D图为H1299细胞定量结果，*p<0.05, **p<0.01,t-test；

图13为体内裸鼠移植瘤实验结果，其中，A图为稳定表达 Ctr 或 GRK5 shRNAs的 A549细胞移植到免疫缺陷裸鼠体内4 周后肿瘤的生长情况；B图为GRK5 敲低显著降低小鼠皮下移植瘤生长结果；C图为GRK5敲低显著抑制异种移植肿瘤的重量结果，*p<0.05, **p<0.01,***p<0.001,t-test；

图14为移植瘤的免疫组化结果，其中A图为HE染色及Ki67染色结果，显示GRK5敲低后肿瘤组织中Ki67的表达明显降低；B图为Ki67染色定量分析结果；*p<0.05, **p<0.01,t-test；

上述图例中Ctr shRNA为 scramble shRNA对照细胞株；GRK5 sh#1为敲低shRNA #1的稳转细胞株；GRK5 sh#2为敲低shRNA #2的稳转细胞株。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，所用试剂如无特殊说明，均为常规时售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1：实时荧光定量PCR 实验检测 GRK5在非小细胞肺癌细胞系中的表达情况

1、细胞总RNA抽提

（1）正常肺支气管上皮细胞和非小细胞肺癌细胞生长状态良好时，去掉上清，PBS洗除血清，加入1mL TRizol，静置5分钟，保证Trizol充分裂解细胞，将细胞从培养皿上吹打下来，液体转移至离心管内，反复吹打直到无明显大块沉淀；室温静置5min；

（2）提前将4℃离心机打开，12,000g离心5min，上清转移至新的1.5mL离心管中；

（3）加入200μL氯仿，漩涡仪振荡，于4℃离心机中以12,000g离心15min，此后液体分为三层；

（4）吸取上层水相（注意不要碰到中间的蛋白质层），转入新的RNAase free的离心管中；

（5）加入等体积的异丙醇，轻柔地上下颠倒5次，室温静置10min；

（6）12,000rpm转速，4℃离心10min，此时出现白色沉淀；

（7）弃上清，加入1mL经DEPC处理的75%乙醇，上下颠倒数次洗涤沉淀；7500g离心5分钟，弃上清保留沉淀；

（8）RNA于室温下干燥10min，然后加入无RNA酶的水溶解；

（9）测量OD值，以确定RNA的浓度和质量，然后置于-80℃保存。

2、反转录反应（Reverse Transcription, RT)

上述提取的RNA取1μg用TAKARA kit 进行反转录，具体如下：去除基因组DNA反应按如下成分于冰上配制反应混合液，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品；轻柔混匀，按照42℃ 2min（或者室温 5min）进行反应；

；

反应后样品置于冰上，按下表配制混合Mix，然后再分装 10μL到每个反应管中；

轻柔混匀后立即进行反转录反应：37℃15 min， 85℃ 5s ，4℃。

3、 qPCR

每个样本设置三个重复孔，按如下组分配制：

，

混匀以上组分，加入到96孔板各孔，封膜后，离心使液体聚集到管底；根据以下条件进行PCR反应，热循环参数如下：50℃，2 min；95℃，2 min；95℃，10 min；95℃，15 s，60℃1min ，40X。

所用引物如下：GRK5_F: CCTCCGAAGGACCATAGACA； GRK5_R:GACTGGGGACTTTGGAGTGA；GAPDH_F: ACCACAGTCCATGCCATCAC；GAPDH_R:TCCACCACCCTGTTGCTGTA其中，GAPDH 作为内参。

结果见图1不同非小细胞肺癌细胞系中GRK5 mRNA的表达量，正常人肺支气管上皮细胞 (BEAS-2B) 和非小细胞肺癌细胞系（非小细胞肺癌GLC-82、SPC-A-1、H520、H358、H838、A549、H1299），BEAS-2B 作为对照；实验结果显示与正常人肺支气管上皮细胞相比，非小细胞肺癌细胞中GRK5 mRNA的表达明显上调。

实施例2：蛋白免疫印迹检测GRK5蛋白表达情况

1、WB（Western Blotting）检测

1.1 细胞总蛋白的提取

按照特定实验处理后的细胞，弃去上清培养基，用PBS洗涤1次；根据细胞沉淀的量加入相应的细胞裂解液，反复冻融裂解2次；4℃、12000 rpm离心10 min，取上清弃沉淀用于后续实验。

1.2蛋白浓度检测与变性处理

蛋白浓度检测试剂盒为碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)，货号：P0010S。方法如下：

将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20 μL，使得标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL；加适当体积样品到96孔板的样品孔中；各孔加入200 μL BCA工作液，37℃放置20min；用酶标仪测定A562波长的吸光度；根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。

取适量的蛋白样品，加入 5×上样缓冲液，置于100℃金属干热仪中煮5 min；取出后冷却，分装，-80℃保存或者直接进行 SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝胶)电泳。

1.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

（1）清洗电泳配制凝胶用玻璃板，烘干，固定在配胶架子上；按照需要，配制8%-12%不同浓度的分离胶，待胶充分凝固后按配方加入浓缩胶，插入样品槽梳子；待胶凝固后，取出胶，拔出梳子，蒸馏水清洗表面胶；把玻璃板和凝胶一同固定在电泳架上，加入的Tris-甘氨酸电泳缓冲液，使电泳缓冲液在短玻璃板上方约 0.5 cm；每孔加入蛋白量 30-50 μg，首先80V电压下电泳跑完浓缩胶，再用120V电压电泳；把转膜架放在转膜液中，黑色塑料板面向下，白色在上，在黑色面上方放一块海绵垫，海绵垫上方放一张滤纸；轻轻把凝胶从电泳玻璃板上取下来后放到滤纸上，把 PVDF 膜放到凝胶上方，再放一张滤纸，滤纸上方放一块海绵垫，把黑白两块塑料板固定牢固，放入已经预冷的转膜缓冲液中；冰浴条件下，83 V电压转膜3 h；把 PVDF膜放入含 5%脱脂奶粉的TBST 中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭 2h；加入用含5%脱脂奶粉的TBST 稀释的一抗，4℃缓慢摇动中孵育过夜；TBST 洗膜 10min×3次；加入 HRP 标记的二抗（抗鼠： 1:20000，抗兔 1:2000 稀释），室温孵育 2h； TBST 洗膜 10min×3次；把 PVDF 膜转移到发光板上，避光条件下加入ECL试剂（用前把 A,B 液进行等量混合），经显影，定影后拍照。

结果见图2在不同的非小细胞肺癌细胞系中GRK5 蛋白的表达；细胞裂解物分别检测GRK5和GAPDH 的表达，GAPDH作为对照；实验结果显示与正常人支气管上皮细胞相比，非小细胞肺癌细胞中GRK5蛋白的表达明显上调。

实施例3：临床实验

1、免疫组化实验

非小细胞肺癌组织免疫组化是与湖南长沙湘雅二医院病理科的范松青主任合作获得，将638个临床样本置于80℃烤片2小时，二甲苯浸泡脱蜡，梯度酒精脱水，浸没在0.3% 的双氧水（甲醇配制）溶液15分钟以去除组织过氧化物酶，用Tris buffer saline (TBS)漂洗,微波炉95℃20分钟抗原修复，室温恢复1小时；然后TBS洗三次，5%的山羊血清孵育30分钟去除非特异性结合，一抗anti-GRK5(Santa Cruz Biotechnology, Cat# sc-565)用封闭液稀释成1:200，4℃孵育两小时，TBS洗三次，HRP标记的二抗 (Santa cruz Biotechnology,USA) 孵育 30 分钟；Diaminobenzidine (DAB) 显色，苏木素进一步染色，然后将切片脱水，二甲苯透明, Dibutylphthalate xylene (DPX)封片；显微镜(Olympus, Tokyo,Japan)拍照并分析；根据染色强度分为：阴性（0）、弱阳性（1）、中度阳性（2）和强阳性（3）四个等级。根据染色阳性细胞比例：<10%（0）、11-25% (1)、26-50% (2)、>50%(3)。根据染色的强度和阳性率，每个标本评分分为0~6级。染色评分0-2分判为阴性，3-6分判为阳性。结果见图3的A、A’、B、B’、C图。病人总的生存曲线通过Kaplan-Meier法分析得出，并通过log-rank检测法进行显著性差异检测，结果见图4，GRK5高表达的病人生存时间相对较短，而GRK5低表达的病人生存时间相对较长。

表1：539个病人的临床和病例特征

患者特征	No. of patients (%)
		NSCLC
Age(years)
		≤50	242(44.9)
＞50	297(55.1)
		Gender
Male	397(73.7)
		Female	142(26.3)
Clinical stages
		Stage Ⅰ	125(23.2)
Stage Ⅱ	148(27.5)
		Stage Ⅲ	239(44.3)
Stage Ⅳ	27(5.0)
		Lymph node status
N0	208(38.6)
		N1/N2/N3	331(61.4)
Histological type
		SCC	248(46.0)
ADC	291(54.0)
		Differentiation
Well	34(6.3)
		Moderate	240(44.5)
Poor	265 (49.2)
		Survival status
Alive	346(64.2)
		Death	193(35.8)
Non-cancerous lung tissues
		Age(years)
≤50	82(78.8)
		＞50	22(21.2)
Gender
		Male	60(57.7)
Female	44(42.3)

实施例4： 质粒构建与稳转细胞系的建立

针对人GRK5设计两条用于独立敲低表达的shRNA靶点，分别为GCACAGTCTGTCCACGAGTAC（shRNA #1）或者CCGCCAGATCTGAACAGAAAC（shRNA #2）；对照shRNA为Scramble shRNA：GCACTACCAGAGCTAACTCA。

合成Oligo序列后，稀释成浓度20μM； Oligo序列如下：

Forward oligo（正义链）: GRK5 FO1

CCGGGCACAGTCTGTCCACGAGTACCTCGAGGTACTCGTGGACAGACTGTGCTTTTTG；

Reverse oligo（反义链）: GRK5 RO1

AATTCAAAAAGCACAGTCTGTCCACGAGTACCTCGAGGTACTCGTGGACAGACTGTGC；

或者

Forward oligo（正义链）: GRK5 FO2

CCGGCCGCCAGATCTGAACAGAAACCTCGAGGTTTCTGTTCAGATCTGGCGGTTTTTG；

Reverse oligo（反义链）: GRK5 RO2

AATTCAAAAACCGCCAGATCTGAACAGAAACCTCGAGGTTTCTGTTCAGATCTGGCGG；

按照下述条件进行反应：Forward oligo 5 μL、Reverse oligo 5μL、10×NEB buffer5μL、ddH₂O 35μL；沸水浴4分钟，缓慢降温至室温；用EcoRⅠ和AgeⅠ酶切pLKO.1，电泳并回收载体片段；取Oligo反应混合液与酶切回收的载体片段在T4连接酶的催化下，16℃连接过夜；取连接产物进行热激转化至Stbl 3感受态中，涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜；挑取单克隆于含有氨苄青霉素液体LB中，37℃振荡培养18 h，抽取质粒进行酶切鉴定（EcoRⅠ和NcoⅠ），对阳性克隆进行测序验证；扩增阳性目的质粒。

通过磷酸钙转染法将目的质粒导入HEK-293T进行病毒制备：配制转染液A液：ddH₂O 420μL、Cacl₂（2 mol/L） 60μL、psPAX2 7.5 μg、pMD2.G 5μg、pLKO.1-shRNA 12.5μg；B液：2×HEPES 500μL；充分混匀后，将A液逐滴加入至B液中，振荡混匀，室温反应30 min，滴加至覆盖率为70%左右的HEK-293T中，5%CO₂ 、37℃培养箱中培养；转染后8 h进行换液，48h和72 h后收病毒，用0.45μM的滤膜过滤得到病毒上清液；将新鲜的病毒液感染目的细胞（A549、H1299），用4μg/mL polybrene促进感染效率；感染72 h后，用相应浓度的嘌呤霉素筛选阳性细胞，直至不再出现死细胞；扩增并鉴定目的基因的敲低效率，得到的稳转细胞株经实时荧光定量PCR鉴定后发现，GRK5的mRNA和蛋白水平成功敲低（见图5中A、B）。

实施例5： 细胞增殖实验

1、为测定细胞增殖能力，取对数期生长的稳定敲降细胞株，消化制成单细胞悬液，进行浓度测定；按照所需细胞数（H1299: 2×10⁴/孔、A549: 2×10⁴/孔），用完全培养基配制相应的细胞悬液种至12孔板中（1.0 mL/孔），37℃、5% CO₂培养6天；每天进行计数：弃上清，400μL胰酶消化进行计数；根据浓度和体积分别算出细胞数，绘制生长曲线。

实验结果表明当GRK5敲低时，非小细胞肺癌细胞的增殖得到抑制（图6A、B）。

2、BrdU插入实验。稳定敲降细胞生长到 80% 覆盖度时，去掉上清，PBS洗除血清，0.25%胰酶1mL消化3分钟，培养基终止，吹打成单细胞悬液，用Countstar细胞计数仪进行计数，A549稳定敲降细胞株和H1299稳定敲降细胞株均按照每孔500 μL 5×10⁴的细胞总量，分别种于8孔板中，置于37℃、5% CO₂二氧化碳培养箱中过夜，24小时后，加入BrdU（终浓度10μM）在培养箱中孵育，20 min后从培养箱中取出，去培养基，PBS漂洗一次；加200μL 4%多聚甲醛（PFA）固定，20分钟后，PBS洗一次，加入200μL 2N HCL-0.5%TrionX-100，室温孵育，30分钟后加入1M NaHCO₃润洗一次，然后弃掉，加入200μL PBS +0.1%tween 20漂洗两次，去除残余液体后加入200μL 10%正常山羊血清（NGS，用 PBS+0.1% tween 20稀释）,室温摇床1小时，将BrdU一抗用PBS+0.1% tween 20 +NGS (终浓度5%)稀释(抗体浓度根据抗体说明书是1:1600)，每孔加入200μL，4℃孵育过夜，每孔加入200μL PBS+0.1% tween 20洗三次，每次10分钟，然后用一抗稀释液稀释二抗CY3-goat anti mouse (种属根据一抗)，按照1:500的比例，及DAPI 按照1:100的比例一起加入，室温摇床2小时，每孔加入200μL PBS+0.1%tween 20洗三次，每次10分钟，置于PBS+NaN₃中，4℃保存，荧光显微镜进行拍照并计数。

稳转的GRK5敲低细胞株中BrdU的掺入明显较对照组减少（见图7A、B、C、D）。

实施例6: 细胞周期检测实验

1、样品准备

稳定敲降细胞生长到80%覆盖度时，去掉培养基上清，PBS清洗一次，0.25%胰酶1mL消化3分钟，然后加入5mL培养基终止，吹打成单细胞悬液，用countstar 进行计数，按照每孔2mL培养基体积，A549稳定敲降细胞株和H1299稳定敲降细胞株细胞总量均为5×10⁵个，种于6孔板中，每个样品设置三个重复孔，轻轻混匀以保证细胞分布均匀，然后置于37℃、5%CO₂二氧化碳培养箱中过夜；24小时后，去除培养基上清，加2mL无血清培养基进行饥饿，置于37℃、5% CO₂二氧化碳培养箱中过夜；去除无血清培养基，加入含血清的完全培养基进行释放6-8小时；去掉培养基上清，PBS清洗一次，0.25%胰酶0.5mL消化3分钟，然后加入2mL培养基终止，轻柔地吹打成单细胞悬液；收集细胞到离心管中，1500rpm离心5分钟。加入5mL PBS洗一次，1500rpm离心5分钟，重复一次；去除PBS液体，用500μL PBS重悬细胞沉淀，注意轻柔；逐滴加入到加有4.5mL预冷的75%乙醇的新的离心管中，标注清楚样品名称；将重悬好的细胞悬液逐滴加入到预冷的75%乙醇中，注意滴入后装有乙醇的管及时摇匀，以保证充分固定，另外样品须一一对应；盖紧离心管盖，上机前于4℃保存。

2、流式检测实验

将样品从4℃取出，1500rpm离心5分钟；去除固定液，加入5mL PBS 清洗，1500rpm离心5分钟，重复一次；每管加入500μL含有RNAase（1:500）的PBS+0.1% Trion X-100 +10μL PI溶液进行染色；15-30分钟后使用流式细胞仪进行检测细胞周期的变化。数据进行整理分析，绘制细胞周期分布图和统计图。

细胞周期试验表明，GRK5敲低的稳转株，与对照组相比，处于G2/M期的细胞比例增多（见图8A、B、C、D）。

实施例7: 细胞凋亡检测

建立的稳转细胞株，按相同的密度接种于6厘米板中培养，细胞用FITC标记的重组人Annexin V来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷酯酰丝氨酸。磷酯酰丝氨酸主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把磷酯酰丝氨酸外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。磷酯酰丝氨酸暴露到细胞表面后会促进凝血和炎症反应。用带有绿色荧光的荧光探针FITC标记的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以用流式细胞仪或荧光显微镜非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。

A549和H1299稳定敲降细胞生长到80%覆盖度时，去掉培养基上清，PBS清洗一次，0.25%胰酶1mL消化3分钟，然后加入5mL培养基终止制成单细胞悬液，用countstar 进行计数，按照每孔2mL培养基体积，细胞总量4×10⁵-6×10⁵个，分别种于6孔板中，每个样品设置三个重复孔，轻轻混匀以保证细胞分布均匀，然后置于37℃，5% CO₂二氧化碳培养箱中过夜。24小时后，收集培养基上清，PBS清洗一次，0.25%胰酶0.5mL消化3分钟，然后加入2mL培养基终止，吹打成单细胞悬液，注意轻柔吹打，防止因机械力带来的细胞损伤凋亡。收集细胞到离心管中，2000rpm离心5分钟，以收集漂浮在上清里的凋亡的细胞。去掉上清液，加入5mL PBS洗一次，2000rpm离心5分钟，重复一次；按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书，先加入1× binding buffer将细胞重悬，取出三个对照所需细胞（阴性对照，FITC单标对照，PI单标对照），然后每管样品加入FITC和PI各5μL到细胞悬液中（对照样品为：不加染料，只加5μL FITC，只加5μL PI），轻柔混匀；37℃避光孵育15-30分钟；利用流式细胞仪检测细胞凋亡比例的变化；数据进行整理分析，绘制细胞凋亡分布图和统计图。

实验结果表明，GRK5敲低的稳转细胞株相比对照细胞株能促进细胞的凋亡（图9A、B、C、D）。

实施例8: 细胞划痕实验

A549和H1299稳定敲降细胞生长状态良好时，消化成单细胞悬液，用countstar 细胞计数仪进行计数。均取1×10⁶细胞量,分别加到6孔板中，将每孔培养基补足到2 mL。24小时后，细胞覆盖度为90-100%，将酒精棉球消过毒的直尺放在孔板上方，取枪头在单细胞层上划线，用PBS润洗掉脱落下来的细胞，然后更换新鲜培养基，每个样品孔随机选取固定宽度的5个以上的视野显微镜拍照，并记录下位置，记为0时刻。12小时后，换新鲜培养基，选取0时刻的同样位置分别进行拍照，记为12小时时刻；得到的结果进行整理分析。

划痕实验结果显示与对照组相比，GRK5敲低能明显的抑制细胞的迁移（图10A、B、C、D）。

实施例9：细胞transwell实验

准备Transwell小室：取一个24孔板中首先加入600μL含血清完全培养基，把Transwell小室(滤膜孔径8.0μm)置于加好含血清培养基的孔中。A549和H1299稳定敲降细胞株生长到80%覆盖度时，去掉培养基，PBS洗除血清，0.25%胰酶1mL消化3分钟，然后加入5mL培养基终止，吹打成单细胞悬液，然后用无血清培养基进行清洗，离心收集细胞沉淀，重复一次，去除无血清培养基；用countstar 细胞计数仪进行计数，取3×10⁵细胞量，定容到1mL无血清培养基重悬，然后取出100μL细胞悬液即3×10⁴总细胞量，加入第一步准备好的Transwell小室中；24小时后，取出Transwell小室，用PBS润湿过的棉签擦去小室上面未发生迁移的细胞，然后置于预先加入了600μL 4%PFA的孔中固定20分钟。固定结束后，将小室置于预先加入600μL含0.5%结晶紫的乙醇溶液，使膜浸没在染色液中，室温染色1-2小时，取出，蒸馏水清洗约5次，并自然风干；随机取5个以上的视野显微镜拍照并计数；拍照完毕，每孔加入500μL 33%的醋酸，摇床摇10min；充分振荡后在570nm处测定光吸收度。

Transwell实验结果显示与对照组相比，GRK5敲低能明显的抑制细胞的迁移（图11A、B、C、D）。

实施例10:细胞粘着斑染色实验，是通过细胞表面的粘着斑的数量来验证细胞的迁移能力

A549和H1299稳定敲降细胞生长到 80% 覆盖度时，去掉上清，PBS洗除血清，0.25%胰酶1 mL消化3分钟，然后加入5 mL培养基终止，吹打成单细胞悬液，用Countstar细胞计数仪进行计数，均按照每孔500 μL 3-4×10⁴的细胞总量，分别种于8孔板中，置于37℃，5% CO₂二氧化碳培养箱中过夜，24小时后，去培养基，PBS漂洗一次，加200μL 4%多聚甲醛（PFA）固定，20分钟后，PBS洗一次，加入200μL 10%FBS+0.1%TrionX-100，室温孵育30分钟后，加入200μLPBS +0.1% tween 20漂洗两次，去除残余液体后加入200μL10%正常山羊血清（NGS，用 PBS+0.1%tween 20稀释）封闭非特异信号,室温摇床1小时，将vinculin一抗用PBS+0.1%tween20 +NGS (终浓度5%)稀释(抗体浓度根据抗体说明书是1:400)，每孔加入200μL，4度孵育过夜，第二天取出，室温恢复10-20分钟，每孔加入200μLPBS+0.1%tween 20洗三次，每次10分钟，然后用一抗稀释液稀释二抗FITC-goat anti mouse (种属根据一抗)，按照1:40的比例，及DAPI 按照1:100的比例一起加入，室温摇床2小时，每孔加入200μLPBS+0.1%tween 20洗三次，每次10分钟，置于PBS+NaN₃溶液中，4度保存，荧光显微镜进行拍照并计数。

稳转的GRK5敲低细胞株中细胞表面的Vinculin的阳性信号明显较对照组增多，表明GRK5敲低能明显的抑制细胞的迁移（图12A、B、C、D）是因为细胞黏着斑数量的增加。

实施例11：裸鼠成瘤实验

4周龄雄性BALB/C裸鼠购买于上海斯莱克实验动物中心（动物许可证号为SYXK(粤)2010-0102）；裸鼠饲养于SPF级环境中，适应2-3天；A549稳定敲降细胞生长到80%覆盖度，弃培养基上清，PBS清洗一次，0.25%胰酶1mL消化3分钟，加入培养基终止，制单细胞悬液，用countstar细胞计数仪进行计数，稀释至5.5×10⁷/ml密度且准备1.1mL细胞悬液，置于冰上；裸鼠随机分为3组，每组5只，编好号；用碘伏消毒裸鼠腹后肢左右腹股沟皮肤后，将胰酶消化好的单细胞悬液GRK5 Ctrl，GRK5 shRNA#1和GRK5 shRNA#2分别接种于各组裸鼠腹股沟皮下，每只接种100μL（含5.0×10⁶个细胞）；接种后一周开始每3天观察裸鼠的一般情况，并用游标卡尺测量肿瘤体积的最大径（L：瘤长）和最小径（W：瘤宽），按公式V=L×W²/2计算肿瘤的近似体积。同时电子天平称量瘤重，绘制裸鼠的移植瘤生长、体重和瘤重曲线；4周时处死裸鼠，解剖并完整取出瘤块，并拍照；取出的移植瘤组织-80℃保存或者置于4% PFA 中4℃过夜，制备石蜡块。

实验结果显示，敲低GRK5的A549细胞能明显抑制裸鼠体内肿瘤的生长（图13A、B、C）。

实施例12：HE染色和ki67免疫组化染色实验

（1）ki67免疫组化染色：4% PFA固定过夜，用流水冲洗已经固定的组织块30min；75%乙醇：1h；80%乙醇：1h；90%乙醇：1h；95%乙醇I：1h；95%乙醇II：1h；100%乙醇I：1h；100%乙醇II：1h；二甲苯I 35min；二甲苯II 35min；浸蜡：石蜡I 1h；石蜡II 1h；将组织包埋进模具中备用；切片前首先将石蜡块-20℃冰冻15min，切片3μm厚度，挑选完整平整的切片在56℃热水中展片，65℃烘片30min。然后进行染色操作：二甲苯3缸，每缸10分钟；无水乙醇2缸，每缸2分钟；95％乙醇，2分钟；85%乙醇，2分钟；75％乙醇，2分钟，流动自来水冲洗2分钟；蒸馏水洗2分钟；样品放入柠檬酸修复液中，用高压灭菌锅进行抗原修复25分钟，拔掉电源10分钟，打开高压锅盖子，将盛有柠檬酸抗原修复液（含样品）的容器取出水浴至常温；将样品用蒸馏水洗1分钟；3%双氧水，孵育20分钟；油性笔将样品画在圈内，PBS+1% tween20+10%正常山羊血清滴在圈内样品表面，封闭半小时；孵育即用型一抗ki67，40分钟；PBS清洗3分钟，重复两次；PBS+1%tween 20，3分钟；孵育二抗1小时，PBS冲洗3分钟，重复两次；PBS+1%tween 20，3分钟；DAB显色5分钟；蒸馏水洗1分钟；苏木素2-3分钟；蒸馏水洗1分钟；1%盐酸酒精分化数秒；蒸馏水蓝化2分钟；75％乙醇，20s；85%乙醇，20s；95％乙醇，30s；无水乙醇2缸，每缸30s；二甲苯2分钟，重复两次；封片。

（2）HE染色：准备好的切片进行二甲苯I处理5min；二甲苯II处理5min；100%乙醇2min；95%乙醇2 min；85%乙醇2 min；75%乙醇2 min；自来水洗2 min；蒸馏水洗2 min；苏木素5-10min；自来水洗1min；1%盐酸酒精分化数秒（眼观淡紫红色为度）；自来水洗1min；温水（50℃）蓝化5min；或用1%氨水蓝化30秒，自来水洗5-10min；蒸馏水1min；95%乙醇1min；伊红数秒。系列梯度酒精脱水和透明：75%乙醇，20s；85%乙醇，20s；95%乙醇，30s；95%乙醇，30s；100%乙醇，30s；100%乙醇，30s。二甲苯，2min；二甲苯，2min；最后二甲苯没干时进行封片。

实验结果显示，敲低GRK5的A549细胞ki67阳性细胞相比对照明显减少（图14A、B）。

序列表

<110> 中国科学院昆明动物研究所

<120> 人GRK5基因的用途

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

gcacagtctg tccacgagta c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

ccgccagatc tgaacagaaa c 21

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ccgggcacag tctgtccacg agtacctcga ggtactcgtg gacagactgt gctttttg 58

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

aattcaaaaa gcacagtctg tccacgagta cctcgaggta ctcgtggaca gactgtgc 58

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

ccggccgcca gatctgaaca gaaacctcga ggtttctgtt cagatctggc ggtttttg 58

<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

aattcaaaaa ccgccagatc tgaacagaaa cctcgaggtt tctgttcaga tctggcgg 58

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

cctccgaagg accatagaca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

gactggggac tttggagtga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

accacagtcc atgccatcac 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims (3)

1.人GRK5基因在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的应用，其特征在于：所述人GRK5基因作为针对非小细胞肺癌细胞的作用靶点应用于制备治疗非小细胞肺癌药物，所述针对非小细胞肺癌细胞的作用靶点为RNA干扰作用靶标。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将抑制人GRK5基因表达的shRNA序列克隆入慢病毒载体后获得RNA 干扰慢病毒，用于制备非小细胞肺癌基因治疗药物；表达shRNA的序列包括两个靶向人GRK5基因编码DNA的反向重复序列，中间由一茎环序列分隔；其中，两个反向重复序列分别为人GRK5基因的shRNA 靶点序列及其互补序列；所述人GRK5基因的shRNA 靶点核苷酸序列选自下述核苷酸序列：

SEQ ID NO:1︰GCACAGTCTGTCCACGAGTAC；

SEQ ID NO:2︰CCGCCAGATCTGAACAGAAAC。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：表达shRNA 的序列的正义链序列如 SEQID NO:3 所示，反义链序列如 SEQ ID NO:4 所示；或者正义链序列如 SEQ ID NO:5所示，反义链序列如SEQ ID NO:6所示。