CN117298029B - 一种具有外用综合控油作用的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有外用综合控油作用的组合物及其制备方法和应用，属于皮肤控油技术领域。本发明组合物，经试验发现，其作用于皮脂腺细胞多靶点，一方面抑制调控因子SREBP‑1、SCD1、FASN的表达和促进AMPK的表达，通过上述多靶点的调控来抑制油脂的产生，另一方面通过促进ABCA1的表达，促进已经生成的油脂的快速排出，从而达到综合控油的效果。并且，本发明组合物适用于各种肤质，具有选择性，针对不同皮肤状态均有良好的控油效果，适用性更广。本发明还提供了组合物的制备方法，具有提取效率高，产物纯度高，稳定性强的特点。本发明组合物可在皮肤化学用品中应用，制得的皮肤化学用品具有良好的平衡油脂效果。

Description

一种具有外用综合控油作用的组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于皮肤控油技术领域，具体地，涉及一种具有外用综合控油作用的组合物及其制备方法和应用。

背景技术

控油功效是2021年药监局发布的第50号公告附件《化妆品功效宣称评价规范》中化妆品允许使用的主要宣称之一。是整个行业功效研究的热点，亦是人们日益丰富的护肤需求中的热点问题之一。

目前化妆品领域，其控油功效主要通过抑制5α还原酶从而抑制油脂分泌来实现，如专利文献CN107126379A涉及一种控油祛痘组合物，其成分辛酰基甘氨酸、肌氨酸、锡兰桂树皮提取物和吡咯烷酮强酸锌通过抑制5α还原酶来抑制油脂分泌。然而5α还原酶只是人体油脂产生的众多调控因子中的一个，仅作用于5α还原酶，故还是时常出现控油效果不佳的情况。并且现有产品在单一配比下，或因功效作用太弱而无法实现有效的控油效果，或因功效作用太强而引起皮肤干燥、屏障功能受损等诸多皮肤问题，难以适用于多种肤质的皮肤，使用范围有限。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有外用综合控油作用的组合物，通过该组合物可以在多靶点产生调控作用，通过多靶点的调控达到综合控油的效果；并且本发明的组合物具有良好的选择性，对高出油肤质具有更强的控油效果，可适用于不同肤质的皮肤，使用范围更广。

本发明的第二个目的在于提供上述组合物的制备方法。

本发明的第三个目的在于提供上述组合物在日化产品中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种具有外用综合控油作用的组合物，由以下质量比的原料制成：

槐米：葛根：知母=1:1~6:1~6。

作为本发明的一种优选方案，所述组合物由以下质量比的原料制成：

槐米：葛根：知母=1:1~3:1~3或1:3~6:3~6。

上述组合物的制备方法，包括以下操作：

水油两相除杂：用水油两相萃取剂对所述组合物的所述原料进行浸提，弃浸提液留药渣；

提取离心分离：对药渣，用多元醇溶液进行提取，然后离心分离，弃上层油层和底部固体，取中间层离心液；

微滤交联吸附：对中间层离心液依次进行微滤、进行循环浓缩、进行微滤、加入壳聚糖和氧化镁、进行微滤，制得混合液；冷热交替老化：对混合液进行冷热交替处理2~4个循环，其中，冷处理为-20~-15℃/10~15h，热处理为50~60℃/10~15h，冷热交替处理结束后微滤得滤液；

超滤处理：对滤液进行超滤，取透过液制得具有外用综合控油作用的组合物。

作为本发明的一种优选方案，水油两相除杂操作中，所述水油两相萃取剂为质量比为4:6~6:4的水：辛酸癸酸甘油三酯。

作为本发明的一种优选方案，提取离心分离中所述多元醇溶液为1,3-丁二醇或者1,3-丙二醇的水溶液，质量浓度为50~70%。

作为本发明的一种优选方案，微滤交联吸附中所述壳聚糖和氧化镁的添加量分别为占加入后总体系质量浓度0.6~0.8‰和3~5%。

作为本发明的一种优选方案，微滤交联吸附中所述循环浓缩具体通过50nm陶瓷膜来操作。

上述组合物作为控油成分在制造皮肤化学用品中的应用。

作为本发明的一种优选方案所述皮肤化学用品剂型选自化妆水、精华液、膏霜或乳液。

作为本发明的一种优选方案，所述组合物在皮肤化学用品中的添加量为0.1~10wt%。

本发明的有益效果：

1.本发明所提供的组合物，经试验发现，其作用于皮脂腺细胞多靶点，一方面抑制调控因子SREBP-1、SCD1、FASN的表达和促进AMPK的表达，通过上述多靶点的调控来抑制油脂的产生，另一方面通过促进ABCA1的表达，促进已经生成的油脂的快速排出，从而达到综合控油的效果。并且，本发明组合物适用于各种肤质，具有选择性，具体表现在：施用于不同出油量的皮肤时，本发明组合物选择性地对高出油肤质有更强的抑制油脂分泌的效果，进而实现对高油脂分泌的皮肤更强的控油效果，而对于普通控油需求的皮肤则不会表现出更强的控油效果，即针对不同皮肤状态均有良好的控油效果，适用性更广。

2.本发明所提供的制备方法，具有提取效率高，产物纯度高，稳定性强的特点，详述如下：

本发明在除杂步骤中创造性地采用水油两相萃取剂，有效去除了和控油无关的多种杂质成分，如水溶性成分多酚、生物碱、氨基酸、蛋白、多糖、粘液质、有机酸、色素等，油溶性成分精油、脂肪酸类、色素、香豆素等，其中有机酸作为刺激性成分的降低，扩展了所得组合物的皮肤适用范围，并且水油两相萃取剂还改善了产品外观颜色，本发明制备方法下所制得的组合物是浅棕色，颜色比传统工艺制得的棕黑色浅，较适于加入产品外观要求高的产品中。

本发明在微滤交联吸附步骤中，对中间层离心液依次进行微滤、循环浓缩、微滤，第一次微滤操作去除了离心操作未除尽的固体，循环浓缩操作实现了有效物质析出和小分子溶剂分离，第二次微滤操作使溶剂减少从而进一步析出溶解性差的物质；微滤交联吸附步骤还加入了壳聚糖和氧化镁，壳聚糖和氧化镁协同作用，有效了去除重金属离子和带电荷的色素成分，具体原理如下：壳聚糖通过交联组作用形成絮凝，主要除去如大分子糖和蛋白的大分子杂质，氧化镁通过多孔结构主要除去重金属离子和小分子色素等杂质，并且二者在体系中均带有正电荷，不会相互干扰，二者协同实现了除去带负电荷为主的多酚杂质的效果。

本发明在冷热交替老化步骤中，冷热交替循环处理不断破坏可逆平衡，使得杂质析出更多，有效去除了易聚合成分。

综上所述，本发明提供的制备方法中通过多步骤处理，达到精制除杂，提高提取效率，降低产品颜色，增加安全性和稳定性的效果。

3.本发明所给出的组合物可在皮肤化学用品中应用，制造所得皮肤化学用品具有良好的平衡油脂效果。

进一步地，在长期使用过程中还发现本发明组合物控油效果会呈先下降后稳定的状态，不会持续过度抑制油脂量，呈现出长期稳定的皮脂腺控油效果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

执行下述操作制备具有外用综合控油作用的组合物：

水油两相除杂：称取100g质量比为1:1:1的槐米、葛根、知母干药材饮片为原料，不进行粉碎，加入外循环提取罐中，再加入干药材质量6倍的水油两相萃取剂进行外循环提取除杂，所述水油两相萃取剂为质量比为4:6的水：辛酸癸酸甘油三酯；所述水油两相萃取剂中的水相用酸调节pH为4；设置外循环提取罐温度为90℃，循环速度为5倍罐体积/h，萃取时间为2h；弃去萃取液，留药渣a；

提取离心分离：往药渣a中加入质量浓度为50%的多元醇溶液，于90℃，循环速度为8倍罐体积/h进行循环提取3h；提取结束，用离心机于1000r/min离心20min，除去药渣留滤液b；将滤液b用离心机于15000r/min离心20min,弃上层油层和底部固体，取中间层离心液；所述多元醇溶液为1,3-丁二醇的水溶液，质量为干药材的6倍；

微滤交联吸附：对中间层离心液，用0.45微米膜进行过滤，再用50nm陶瓷膜循环浓缩至生药量200%，过程压力控制1bar；再用0.45微米膜过滤得滤液c；将加入后质量浓度为0.6‰的壳聚糖和5%的氧化镁加入滤液c中，60℃搅拌30min，转速50rpm，结束后静置2h，用0.45微米膜过滤得滤液d；继续补入相同质量浓度的多元醇溶液至100%生药浓度得混合液；

冷热交替老化：让混合液在-20~-15℃/12h和50~60℃/12h交替，例如在-20℃/12h和50℃/12h，进行3组循环，用0.45微米膜过滤得滤液e；

超滤处理：用5000 Dal滤膜对滤液e进行超滤，至透过液超过总量的80%时，补总量20~30%的相同质量浓度的多元醇溶液，继续超滤至透过液体积与滤液e体积相同，控制所述超滤及继续超滤的压力为2bar，取透过液即得具有外用综合控油作用的组合物。

实施例2

执行下述操作制备具有外用综合控油作用的组合物：

水油两相除杂：称取100g质量比为1:6:6的槐米、葛根、知母干药材饮片为原料，不进行粉碎，加入外循环提取罐中，再加入干药材质量4倍的水油两相萃取剂进行外循环提取除杂，所述水油两相萃取剂为质量比为6:4的水：辛酸癸酸甘油三酯；所述水油两相萃取剂中的水相用酸调节pH为5；设置外循环提取罐温度为70℃，循环速度为10倍罐体积/h，萃取时间为3h；弃去萃取液，留药渣a；

提取离心分离：往药渣a中加入质量浓度为70%的多元醇溶液，于70℃，循环速度为6倍罐体积/h进行循环提取2h；提取结束，用离心机于2000r/min离心10min，除去药渣留滤液b；将滤液b用离心机于18000r/min离心15min,弃上层油层和底部固体，取中间层离心液；所述多元醇溶液为1,3-丙二醇的水溶液，质量为干药材的8倍；

微滤交联吸附：对中间层离心液，用0.45微米膜进行过滤，再用50nm陶瓷膜循环浓缩至生药量200%，过程压力控制3bar；再用0.45微米膜过滤得滤液c；将加入后质量浓度为0.8‰的壳聚糖和3%的氧化镁加入滤液c中，50℃搅拌40min，转速100rpm，结束后静置2h，用0.45微米膜过滤得滤液d；继续补入相同质量浓度的多元醇溶液至100%生药浓度得混合液；

冷热交替老化：让混合液在-20~-15℃/12h和50~60℃/12h交替，例如在-15℃/12h和60℃/12h，进行3组循环，用0.45微米膜过滤得滤液e；

超滤处理：用10000 Dal滤膜对滤液e进行超滤，至透过液超过总量的80%时，补总量20~30%的相同质量浓度的多元醇溶液，继续超滤至透过液体积与滤液e体积相同，控制所述超滤及继续超滤的压力为3bar，取透过液即得具有外用综合控油作用的组合物。

实施例3

执行下述操作制备具有外用综合控油作用的组合物：

水油两相除杂：称取100g质量比为1:3:3的槐米、葛根、知母干药材饮片为原料，不进行粉碎，加入外循环提取罐中，再加入干药材质量5倍的水油两相萃取剂进行外循环提取除杂，所述水油两相萃取剂为质量比为1:1的水：辛酸癸酸甘油三酯；所述水油两相萃取剂中的水相用酸调节pH为4.5；设置外循环提取罐温度为80℃，循环速度为7倍罐体积/h，萃取时间为2.5h；弃去萃取液，留药渣a；

提取离心分离：往药渣a中加入质量浓度为60%的多元醇溶液，于80℃，循环速度为7倍罐体积/h进行循环提取2.5h；提取结束，用离心机于2000r/min离心10min，除去药渣留滤液b；将滤液b用离心机于18000r/min离心15min,弃上层油层和底部固体，取中间层离心液；所述多元醇溶液为1,3-丁二醇的水溶液，质量为干药材的7倍；

微滤交联吸附：对中间层离心液，用0.45微米膜进行过滤，再用50nm陶瓷膜循环浓缩至生药量200%，过程压力控制2bar；再用0.45微米膜过滤得滤液c；将加入后质量浓度为0.7‰的壳聚糖和4%的氧化镁加入滤液c中，55℃搅拌35min，转速80rpm，结束后静置2h，用0.45微米膜过滤得滤液d；继续补入相同质量浓度的多元醇溶液至100%生药浓度得混合液；

冷热交替老化：让混合液在-20~-15℃/12h和50~60℃/12h交替，例如在-18℃/12h和55℃/12h，进行3组循环，用0.45微米膜过滤得滤液e；

超滤处理：用10000 Dal滤膜对滤液e进行超滤，至透过液超过总量的80%时，补总量20~30%的相同质量浓度的多元醇溶液，继续超滤至透过液体积与滤液e体积相同，控制所述超滤及继续超滤的压力为2bar，取透过液即得具有外用综合控油作用的组合物。

对比例1

与实施例1差异在于所述组合物原料在控制总质量相同的前提下由以下质量比的原料制成：

槐米：葛根：知母=1:7:0.5。

对比例2

与实施例1差异在于所述组合物原料在控制总质量相同的前提下由以下质量比的原料制成：

槐米：葛根=1:2。

对比例3

与实施例1差异在于所述组合物原料在控制总质量相同的前提下由以下质量比的原料制成：

葛根：知母=1:2。

对比例4

与实施例1差异在于所述组合物原料在控制总质量相同的前提下由以下质量比的原料制成：

槐米：知母=1:2。

对比例5

与实施例1差异在于所述组合物原料为与实施例1组合物原料等质量的知母。

对比例6

与实施例1差异在于所述组合物原料为与实施例1组合物原料等质量的葛根。

对比例7

与实施例1差异在于所述组合物原料为与实施例1组合物原料等质量的槐米。

对比例8

与实施例1差异在于所述组合物通过以下常规工艺制得：

将质量比为1:1:1的槐米、葛根、知母干药材粉碎至粗粉采用回流提取法进行提取，提取溶剂为体积比70%的乙醇溶液，料液比（g：ml）为1:40,提取时间2h，温度为90℃，提取液用0.45μm膜过滤至澄清，滤液在65~70℃减压浓缩至生药浓度200%，补加1,3丁二醇至100%生药浓度，混匀，0.45μm膜过滤至澄清，即得具有外用综合控油作用的组合物。

试验例1 理化性质测试

对实施例1-3和对比例8进行如下测试：

一、稳定性测试

将待测样品置于4℃、48℃、常温光照各条件下，记录在三个温度条件下均能保持无严重变色、无肉眼可见析出、总皂苷含量减少≤10%的最长时间，所得结果见表1。

二、活性物含量测定

活性物含量=总皂苷含量+总黄酮含量，为此，以下分别测试总皂苷含量和总黄酮含量；

1.总皂苷检测方法：

检测仪器：752G紫外分光光度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)

样品处理：取定量样品用甲醇定容稀释至显色后吸光度数值在0.1~1；对照品溶液配制：精密称取知母皂苷A3对照品5.0mg，置10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。标准品精密量取知母皂苷A3对照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、待测样品1mL分别置于10mL具塞比色管中，水浴蒸干，加质量浓度0.5%茴香醛硫酸溶液0.5mL，混匀，放置冰水浴中冷却5min后取出，精密量取一定纯甲醇加入至10mL，摇匀，以相应试剂为空白，于430nm测定其吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，知母皂苷A3对照品含量(mg)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=aX+b，根据标准曲线得的线性方程式Y=aX+b，按下列公式（1）计算结果

总皂苷含量（%）=×100

其中，Y——样品吸光度值；

a、b——线性方程式系数；

C₀——加入知母皂苷A3的浓度，mg/mL；

P₀——加入知母皂苷A3的纯度，%；

N——供试品稀释倍数；

V——加入待测样的体积，mL，此处为1mL；

1000——mg向g单位转换。

2.总黄酮检测方法

检测仪器：752G紫外分光光度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)

芦丁标准液：准确称量干燥至恒重的芦丁标准品5.0mg，质量浓度60%乙醇定容至25mL容量瓶。

待测样品：取定量样品用质量浓度70%乙醇定容稀释至显色后吸光度数值在0.1~1。

标准品精密量取芦丁对照品溶液0、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL、待测样品1ml分别置于25mL容量瓶中，依次加入质量浓度60%乙醇10ml和质量浓度5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6min，再加入质量浓度10%硝酸铝1ml，摇匀，放置6min，加1.0mol/L氢氧化钠溶液5ml，用质量浓度60%乙醇定容，摇匀，放置10min后，以相应试剂为空白，于504nm测定其吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，芦丁对照品含量(mg)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=aX+b，根据标准曲线得的线性方程式Y=aX+b，按下列公式（1）计算结果：

总黄酮含量（%）=×100

其中，Y——样品吸光度值；

a、b——线性方程式系数；

C₀——加入芦丁的浓度，mg/mL；

P₀——加入芦丁的纯度，%；

N——供试品稀释倍数；

V——加入待测样的体积，mL，此处为1mL；

1000——mg向g单位转换，

所得结果见表1。

三、刺激性测试

通过鸡胚试验测试试样的刺激性：参照SNT2329-2009-化妆品眼刺激性-腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验测试，IS＜1为无刺激；1≤IS＜5为轻度刺激；5≤IS＜9为中度刺激，所得结果见表1。

四、电导率测试

电导率用雷磁DDS-11A电导率仪直接测试，所得结果见表1。

表1 理化指标汇总

	颜色	电导率μs/cm	活性物含量%	稳定性	5%浓度下鸡胚试验IS值
						实施例1	浅棕色	165	4.4	＞3个月	0.2
实施例2	浅棕色	134	4.9	＞3个月	0.3
						实施例3	浅棕色	129	5.2	＞3个月	0.2
对比例8	棕黑色	463	3.3	9天	2.3

由表1可得，本发明实施例1-3所得组合物颜色为浅棕色，活性物含量均>4，稳定性均在3个月以上，电导率为100-200μs/cm，并且鸡胚试验IS值均低于0.5，无刺激性。而对比例8制备所得产物颜色为棕黑色，外观品质相较于实施例的浅棕色明显下降，活性物含量为3.3，相较于本发明实施例1-3所得组合物活性物含量有所下降；该产物稳定性为9天，相较于实施例1-3均在3个月以上有明显下降，即该产物稳定性变差；该产物在5%浓度下鸡胚试验IS值为2.3，表现出轻度刺激；该产物电导率大幅度上升，安全性降低。综上可见实施例所得组合物相较于传统制备工艺制得的对比例8，所制得的组合物颜色浅、稳定性安全性大幅提高，活性物含量提高，说明本发明所提供的组合物的制备方法同时具有提取效率高，产物纯度高安全性高，稳定性强的特点。

试验例2 控油效果测试

五、对实施例1，实施例3和对比例1-8所得植物组合物通过金黄地鼠皮脂腺斑组织测定实验检测组合物的控油效果

试验方法：适应性喂养1周后将金黄地鼠随机分组，空白组、阳性药物组及测试组10组（分别施用实施例1，实施例3和对比例1-8所得植物组合物），共计12组，每组6只。实验开始前、实验最后一天测量各组小鼠背部皮脂腺面积。空白组不予特殊干预；阳性药组予罗格列酮片4mg/(kg·d)（溶于2mL蒸馏水）灌胃，每日1次，每次0.1mL/只，测试组皮外涂布相应浓度的样品1mL，均为每日2次，局部外用于金黄地鼠背部皮脂腺斑处。连续干预4周后腹腔注射质量浓度10%水合氯醛麻醉，切取双侧背部约1cm×1cm大小皮脂腺斑处皮肤组织，置于质量浓度4%甲醛溶液中进行固定，做好标记待检，并将取材后的金黄地鼠脱颈处死后置于规定位置。HE染色观察各组金黄地鼠皮脂腺斑组织病理学表现，免疫组化检测皮脂腺斑中油脂调控因子的综合表达，并采用图像分析系统(Aipathwell)分析计算，干预前后各组金黄地鼠皮脂腺斑面积见表2。

表2 干预前后各组金黄地鼠皮脂腺斑面积（±s/mm²）

组别	干预前	干预后
			空白	31.179±2.122	52.895±6.561
实施例1	29.964±5.298	38.064±2.747**
			实施例3	29.659±3.014	40.217±2.706**
对比例1	27.117±5.156	46.724±1.910
			对比例2	32.116±6.045	45.851±3.978
对比例3	30.762±1.972	46.416±7.799
			对比例4	28.938±6.578	45.929±3.841
对比例5	28.825±6.578	46.160±3.412
			对比例6	30.128±2.689	46.050±5.777
对比例7	29.569±4.885	47.391±6.100
			对比例8	30.198±2.259	43.420±6.385*
阳性对照（罗格列酮）	30.614±3.337	41.817±3.857**

用t-test方法进行统计分析，与空白组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01表示为**；n=6；

由表2可得，实验干预前后空白组皮肤组织皮脂腺面积大幅增加；实施例和阳性对照组这两者皮脂腺面积轻度增加，而与空白组相比有显著性差异，且实施例效果优于阳性对照。与实施例1相比，对比例1调整了原料间的质量配比，对比例2-4用等量一种原料代替第三种原料，对比例5-7只用等量一种原料代替所有原料，对比例1-7与空白组比较没有明显差异，说明本发明中质量比为1:1~6:1~6的槐米、葛根和知母的配方组成是影响功效的主要因素，各成分间协同作用，不可随意替换成分和质量配比；对比例8和实施例1的配方组成是一样的但工艺不同，结果显示对比例8也有一定的控油效果，但效果比实施例1差，说明本发明的特殊工艺对功效也有贡献。

六、对各组金黄地鼠皮脂腺斑组织中各调控因子蛋白的平均光密度测定，所述测试方法如下：

显微镜：尼康仪器有限公司E100

（一）石蜡切片制作

1、固定取材：剖取新鲜组织立即投入组织固定液内或者组织对应的特殊固定液内固定24h以上，常温保存运输。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于包埋框内。

2、脱水浸蜡：将脱水盒放进脱水机内依次梯度酒精进行脱水。质量浓度75%酒精4h，质量浓度85%酒精2h，质量浓度90%酒精2h，质量浓度95%酒精1h，无水乙醇I 30min，无水乙醇II 30min，醇苯5-10min，二甲苯I 5-10min，二甲苯II 5-10min，65°融化石蜡I 1h，65°融化石蜡II 1h，65°融化石蜡III 1h。

3、石蜡包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。

4、石蜡切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片，厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片。水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。

（二）染色步骤

1.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入环保型脱蜡液Ⅰ20min—环保型脱蜡液Ⅱ20min—无水乙醇Ⅰ5min—无水乙醇Ⅱ5min—质量浓度75%酒精5min，自来水洗。

冰冻切片复温固定：将冰冻切片从-20°冰箱取出恢复至室温，用组织固定液固定15min后，流水冲洗。

2.苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。

3.伊红染色：切片依次入质量浓度85%、95%的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。

4.脱水封片：切片依次放入无水乙醇I 5min -无水乙醇II 5min-无水乙醇Ⅲ5min-二甲Ⅰ5min- 二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片。

5.显微镜镜检，图像采集分析。

（三）免疫组化实验步骤

1.石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入环保型脱蜡液Ⅰ10min-环保型脱蜡液Ⅱ10min-环保型脱蜡液Ⅲ10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ5min-蒸馏水洗。

2.抗原修复：此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织来确定）

3.阻断内源性过氧化物酶：切片放入质量浓度3%双氧水溶液，室温避光孵育25min，将玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4.血清封闭:在组化圈内滴加质量浓度3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭30min。（一抗是山羊来源的用兔血清封闭，其他来源的用BSA封闭）

5.加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。

6.加二抗：玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50min。

7.DAB显色：玻片置于PBS（pH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。

8.复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。

9.脱水封片：将切片依次放入质量浓度75%酒精5min—质量浓度85%酒精5min --无水乙醇Ⅰ5min --无水乙醇Ⅱ5min--正丁醇5min--二甲苯Ⅰ5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，封片胶封片。

10.镜检：置于白光显微镜下进行结果判读。

所得结果见表3。

表3 各组金黄地鼠皮脂腺斑组织中各调控因子蛋白的平均光密度

用 t-test 方法进行统计分析，与空白组相比，显著性以*表示，P-value＜0.05表示为*，P-value＜0.01 表示为**；n=6。

由表3可得，相比空白组，实施例1和实施例3能显著降低SREBP-1、SCD1、FASN蛋白的表达量，显著升高AMPK蛋白表达量，能减少油脂的生成并能间接促进已经生成的油脂进入线粒体氧化分解，起到多靶点同时抑制油脂生成的作用，并且实施例1和实施例3能显著升高ABCA1蛋白的表达量，能加速油脂从细胞内转运，从而减少皮脂腺内油脂的累积，起到促进已生成的油脂排出体外的作用；而对比例1-7不能完全实现5个靶点同步调控，无法实现5个靶点均具有显著性，结合表2干预前后各组金黄地鼠皮脂腺斑面积，皮脂腺增加与空白组没有显著性差异，即综合控油效果不显著。因此只有在本发明所提供的组合物及质量配比下，才能同时调控5个靶点，实现良好的控油效果。

试验例3 人体测试

测试仪器：SebumScale皮脂测量仪，Delfin；

样本量：每组受试者30~35名，共10组，受试者为20-60岁健康女性或男性，无皮肤病及皮肤过敏史，测试前1周不能使用同类产品。

测试周期：8周；

受试品：添加1%活性物的啫喱，阴性对照为空白啫喱；所述啫喱由以下表4原料及制备方法制成；

表4

采用随机测试法，分别对10组受试者适用啫喱，啫喱分别由添加1%质量浓度的实施例1、实施例3和对比例1-8的组合物所制得，测试方法为半脸盲测，具体为半脸涂用组合物的啫喱，半脸涂覆空白啫喱设置阴性对照；

测试方法：对受试者进行头面部基础数据采集，采集结束后进行受试品和对照品使用，每日2次，测试记录鼻颊相同部位在使用后7d，14d，28d，42d，56d的油脂分泌量和分泌情况，在末次使用样品后的12h以上进行测试，期间禁止洗脸、擦拭；整个测试期间禁止熬夜、吃辛辣食物、酗酒、暴晒；将受试人群分为左右脸平均出油量＜50μg，记作A组（低出油组），左右脸平均出油量≥50μg，记作B组（高出油组），进行分别统计和合并统计分析，测试组油脂分泌统计结果见表5，阴性组油脂分泌统计结果见表6。

表5：测试组油脂分泌统计表

表6 阴性组油脂分泌统计表

由表6可得，阴性对照组的56天趋势以及和测试组0天的数据比较变化较小，因此可得出本次实验受试人群在测试期间皮肤的出油状态是稳定的。

由表5可得，针对A组（低出油组）28天以后控油率可达到20%以上；针对B组（高出油组）28天以后控油率可达到38%以上；对比例1组适用调整了原料间的质量配比后的啫喱，28天以后控油率分别为11.97%和13.25%，并且A组和B组差异性显著降低，说明原料间的配比对控油效果有显著性影响，并且对高出油组不具有选择性；对比例2-4组用等量一种原料代替第三种原料制成的啫喱，28天以后控油率在7-14%，并且A组和B组差异性显著降低，甚至B组控油率低于A组，说明原料成分组成对控油效果有显著性影响，替换原料会影响本发明技术效果，并且对比例2-4对高出油组不具有选择性；对比例5-7只用等量一种原料代替所有原料，28天以后控油率在9-15%，并且A组和B组差异性显著降低，甚至B组控油率低于A组，说明原料成分组成对控油效果有显著性影响，无法用单一物质替代实现本发明中同样的技术效果，并且单一物质对高出油组不具有选择性；对比例8和实施例1具有相同的原料成分，A组和B组28天以后控油率分别为12.61%和19.75%，控油效果相较于实施例1有所下降，说明本发明提供的制备方法对控油效果亦有贡献，但是A组和B组仍然具有显著性差异，说明本原料构成及配比下依旧具有良好的选择性，说明本发明组合物原料即配比对高出油组具有良好的选择性。

进一步地，本发明实施例1和实施例3组的皮肤油脂变化率在28d达到基本平衡，继续使用本品，不会使得油脂持续线性下降，而会基本维持出油率不变，说明本发明所得组合物具有长效稳定控油的作用，达到平衡后不会过度降低油脂量，有利于皮肤长期的油脂平衡；而对比例1-7组皮肤油脂变化率或出现持续线性增长或逐渐减弱的情况，说明调整了原料成分和配比的组合物不具有长效稳定作用。

如上所述仅为本发明创造的实施方式，不以此限定专利保护范围。本领域技术人员在本发明创造的基础上作出非实质性的变化或替换，仍落入专利保护范围。

Claims (8)

1.一种具有外用综合控油作用的组合物，其特征在于，由以下质量比的原料制成：

槐米：葛根：知母=1:1~6:1~6；

所述组合物的制备方法包括以下操作：

水油两相除杂：用水油两相萃取剂对所述组合物的所述原料进行浸提，弃浸提液留药渣；所述水油两相萃取剂为质量比为4:6~6:4的水：辛酸癸酸甘油三酯；

提取离心分离：对药渣，用多元醇溶液进行提取，然后离心分离，弃上层油层和底部固体，取中间层离心液；

微滤交联吸附：对中间层离心液依次进行微滤、进行循环浓缩、进行微滤、加入壳聚糖和氧化镁、进行微滤，制得混合液；

冷热交替老化：对混合液进行冷热交替处理2~4个循环，其中，冷处理为-20~-15℃/10~15h，热处理为50~60℃/10~15h，冷热交替处理结束后微滤得滤液；

超滤处理：对滤液进行超滤，取透过液制得具有外用综合控油作用的组合物。

2.根据权利要求1所述的一种具有外用综合控油作用的组合物，其特征在于，由以下质量比的原料制成：

槐米：葛根：知母=1:1~3:1~3或1:3~6:3~6。

3.根据权利要求1-2任一项所述的组合物，其特征在于，提取离心分离中所述多元醇溶液为1,3-丁二醇或者1,3-丙二醇的水溶液，质量浓度为50~70%。

4.根据权利要求1-2任一项所述的组合物，其特征在于，微滤交联吸附中所述壳聚糖和氧化镁的添加量分别为占加入后总体系质量浓度0.6~0.8‰和3~5%。

5.根据权利要求1-2任一项所述的组合物，其特征在于，微滤交联吸附中所述循环浓缩具体通过50nm陶瓷膜来操作。

6.一种如权利要求1-2任一项所述的组合物作为控油成分在制造皮肤化学用品中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述皮肤化学用品剂型选自化妆水、精华液、膏霜或乳液。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述组合物在皮肤化学用品中的添加量为0.1~10wt%。