KR101104587B1

KR101104587B1 - 항노화용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101104587B1
Application number: KR1020090081016A
Authority: KR
Inventors: 김혜원; 강찬구; 김지현; 조준철; 한상훈
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2009-08-31
Filing date: 2009-08-31
Publication date: 2012-01-12
Also published as: KR20110023258A

Abstract

본 발명은 항노화용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 올레아놀산(Oleanolic acid), 베타 카로틴(beta-carotene), 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin Gallate) 및 목백일홍 추출물(Lagerstroemia Indica Flower Extract)을 함유하여 피부 주름 개선 효과가 매우 우수한 항노화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

올레아놀산 * 베타카로틴 * 에피갈로카테킨 갈레이트 * 목백일홍 추출물 * 아세틸테트라펩타이드 11 * 항노화 * 피부 주름 개선 * 화장료 조성물

Description

항노화용 화장료 조성물{Anti-aging cosmetic composition}

본 발명은 항노화용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 올레아놀산, 베타 카로틴, 에피갈로카테킨 갈레이트 및 목백일홍 추출물을 함유하여 피부 주름 개선 효과가 매우 우수한 항노화용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 기관들을 온도·습도 변화, 자외선, 공해물질 등 외부환경의 자극으로부터 보호해 주며, 체온조절 등의 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 이렇게 중요한 피부 역시 인체의 다른 장기와 마찬가지로 나이가 들어감에 따라 점차 노화가 진행되게 되고, 그 결과로서 피부 탄력손실, 각질화, 주름 생성, 피부 위축 등의 현상이 나타나게 된다. 이러한 피부 노화 현상은 피부 표면의 주름 발생뿐만 아니라 얼굴의 전체적인 라인의 변화를 가져 오게 된다. 이러한 주름에 직접적으로 영향을 미치는 요소는 콜라겐과 케라틴이며 이들의 중요성과 역할에 대해서는 많은 연구가 지속되어 오고 있다.

피부의 대부분, 피부 전체의 77%, 진피의 90%를 차지하는 콜라겐이 양적으로 풍부하고 질적으로 건강할 때, 피부 또한 주름과 처짐 현상없이 건강하고 아름답게 유지될 수 있는 것이다. 이러한 콜라겐이 당화(glycation)와 같은 변성 과정을 거 치게 되게 되면, 피부 노화를 유발하게 된다. 콜라겐이 당화되면 최종 당화 산물(Advanced Glycation End Products:AGEs)을 생성하게 되는데, 이때 생성되는 AGEs와 AGEs 유발 물질은 섬유아세포와 조직지지체(extracellular matrix:ECM)간의 부착을 방해하고, 이로 인해 콜라겐 생성과 분해 효소간의 균형이 깨어져 콜라겐 생성이 억제되고 분해가 촉진되어 피부 내 콜라겐 양이 급격히 감소하게 된다. 이러한 콜라겐은 진피 내 대다수를 차지하고 있어 피부 깊은 주름으로 나타나게 되며 피부 탄력을 저하시키게 된다.

케라틴은 머리털, 손톱, 피부 등 상피구조의 기본을 형성하는 단백질로, 각질이라고도 한다. 케라틴은 피부 표피층을 형성하는 주요 단백질로, 표피층은 피부 보호 기능뿐만 아니라 피부 노화 방지 기능을 담당하고 있다. 그런데 이런 케라틴 역시 탄화(carbonylation)와 같은 변성이 발생할 수 있으며, 케라틴의 변성은 각질형성세포(keratinocyte)의 분열을 저하시키며 이로 인해 새로운 세포 형성이 더디어지게 된다. 표피층의 케라틴 부족은 피부 장벽 기능을 약화시키고, 피부를 통한 수분 손실을 증가시켜 피부 탄력을 저하시키며 이로 인해 외부 환경 변화에 따른 표피 주름을 유발하게 된다. 따라서 케라틴의 변성은 주름 형성의 초기 단계에 중요한 역할을 한다. 표피층의 케라틴 변성을 억제하고 진피층의 콜라겐 변성을 억제할 수 있다면, 표피 및 진피층에 발생하는 피부 주름을 모두 예방할 수 있다. 이러한 효과를 구현하게 된다면 화장품에 대한 피부 노화에 대한 고객들의 요구를 강하게 충족시키게 되어 피부 노화에 대한 다양한 효능, 특히 항노화 주름 개선 효능 부분에서 큰 인기를 끌게 될 것이다.

이에, 본 발명자들은 진피 내 콜라겐 및 표피 케라틴의 변성 억제에 대한 연구를 매진하던 중, 올레아놀산, 베타 카로틴, 에피갈로카테킨 갈레이트 및 목백일홍 추출물의 복합체가 콜라겐 변성을 억제시키며, 아세틸테트라펩타이드 11을 함께 함유할 경우 케라틴의 변성을 막아 기존의 화장료보다 피부 주름을 크게 개선시킬 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 피부를 채우는 콜라겐과 표피를 구성하는 케라틴의 변성을 억제하여 우수한 피부 주름 개선 효과를 구현하는 항노화용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 올레아놀산, 베타 카로틴, 에피갈로카테킨 갈레이트 및 목백일홍 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 의하여 제공되는 항노화용 화장료 조성물은 피부에 대한 안전성이 높을 뿐만 아니라, 피부를 채우는 콜라겐과 표피를 구성하는 케라틴의 변성을 효과적으로 억제함으로써 표피 및 진피층에서 발생하는 피부 주름을 모두 예방하여 우수한 피부 주름 개선 효과를 나타낸다.

본 발명은 올레아놀산(Oleanolic acid), 베타 카로틴(beta-carotene), 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin Gallate, EGCG) 및 목백일홍 추출물(Lagerstroemia Indica Flower Extract)을 유효성분으로 함유하는 항노화용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 유효성분인 올레아놀산(Oleanolic acid)은 올레아난계 트리테르펜의 일종으로, 쓴풀, 정향, 포도껍질, 올리브잎 등에는 유리(遊離) 상태로, 죽절인삼, 당근, 사탕무 등에는 사포닌으로 존재하는 화합물로서, 피부 노화의 주요 원인인 MMP의 활성을 감소시키고 콜라겐 활성화를 도우며 근원적인 피부 장벽 기능을 강화함으로써 주름을 개선시켜 준다.

본 발명의 유효성분인 베타카로틴(beta-carotene)은 카로티노이드 탄화수소 색소의 하나로 당근과 시금치와 같은 푸른 잎 채소와 해조류에 많이 들어있다. 베타 카로틴의 경우 카로틴 형태로 음식 중에서 섭취하고 체내에 들어와 우리 몸이 필요한 만큼 비타민A(레티놀)로 전환된다. 프리라디칼 제거, 즉 생체 내 항산화 기능에 관해서 저 산소압 조건하 생체 조직 내에서 자유단 산소 제거 능력이 우수하다.

본 발명의 유효성분인 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin Gallate, EGCG)는 녹차에 존재하는 카테킨의 일종으로 항산화 및 항암 효능이 뛰어나 녹차 효능에 대한 대부분의 연구가 이 성분을 중심으로 이루어져 왔다.

또한, 본 발명의 유효성분인 목백일홍(Lagerstroemia Indica)은 부처꽃과에 속하며 다 자라면 나무 높이가 6미터 정도 되며 나무둘레가 40센티미터 정도 된다. 가지가 옆으로 넓게 퍼져서 나무모양이 불균형을 이룬다. 꽃인 백일홍은 꽃이 백일 간다하여 붙여진 이름이며, 목백일홍(배롱나무)의 꽃 또한 7월 하순부터 가을까지 아래서부터 위로 올라가면서 약 백일 간다하여 목백일홍이라 한다. 한 꽃이 백일 가는 것은 아니고 수많은 꽃이 차례차례 백일 동안 핀다.

상기 올레아놀산, 베타카로틴, 에피갈로카테킨 갈레이트 및 목백일홍 추출물은 당업계에 공지된 방법으로 제조될 수 있으며, 보다 구체적으로는 두릅나무, 기름야자수, 녹차 또는 목백일홍 꽃을 추출용매에 넣고 교반하여 유효성분들을 추출하고 여과한 다음, 가압 농축하여 얻을 수 있다. 이때, 추출용매로는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 또는 이들 유기용매와 물의 혼합용매, 보다 바람직하게는 80% 에탄올을 사용할 수 있다.

본 발명의 올레아놀산, 베타 카로틴, 에피갈로카테킨 갈레이트 및 목백일홍 추출물을 혼합하여 주름 개선 복합체(line repairing complex)를 제조하였다. 본 발명에 따른 주름 개선 복합체에 있어, 올레아놀산: 베타카로틴: 에피갈로카테킨 갈레이트: 목백일홍 추출물의 조성비는 0.0001:0.0001:0.0001:1~1:1:1:1의 중량비가 바람직하며, 가장 바람직하게는 0.05:0.1:0.05:1의 중량비로 구성된다. 상기 조성비 범위로 효능 원료들을 사용해야만 효능 원료의 증가율 대비 피부 주름 개선 효과가 크고 제형 안정도도 높다.

본 발명에 의한 화장료 조성물은 상기 주름 개선 복합체를 조성물 총 중량에 대하여 0.001~30중량%의 양으로 함유하며, 보다 바람직하게는 0.01~15중량%의 양으 로 함유한다. 주름 개선 복합체의 양이 0.001중량% 미만이면 주름 개선 복합체에 의한 피부 주름 개선 효과를 얻을 수 있고, 30중량%를 초과하면 함량 증가에 비해 효과의 증가가 크지 않아 비효율적이다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기의 유효성분 이외에 아세틸테트라펩타이드 11을 더 함유할 수 있다. 본 발명의 아세틸테트라펩타이드 11(Acetyl tetrapeptide 11)은 펩타이드 유도체로 N-아세틸-L-프로필-L-프롤릴-L-티로실-L-류신(N-Acetyl-L-Propyl-L-Prolyl-L-Tyrosyl-L-Leucine)의 구조를 갖고 있다. 펩타이드 합성은 당업계에 잘 알려진 방법으로 원하는 단백질의 펩타이드 결합을 통해 원하는 구조를 가지는 펩타이드 성분을 합성하여 사용한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 아세틸테트라펩타이드 11을 조성물 총 중량에 대하여 0.00001~10중량%의 양으로 함유할 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.0001~5중량%의 양으로 함유한다. 상기 아세틸테트라펩타이드 11의 함량이 0.00001중량% 미만이면 상기 성분에 의한 피부 탄력효과를 얻을 수 없고, 10중량%를 초과하면 함량 증가에 비해 효과의 증가가 크지 않아서 오히려 비효율적이다.

본 발명에 의한 항노화용 화장료 조성물은 피부를 채우는 콜라겐과 표피를 구성하는 케라틴의 변성을 효과적으로 억제하여 피부 주름 개선 효과가 매우 뛰어나다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유하여 제형화될 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명에 의한 화장료 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

이하, 시험예 및 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 시험예 및 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

[제조예 1] 올레아놀산, 베타카로틴, 에피갈로카테킨 갈레이트 및 목백일홍 추출물을 함유하는 주름 개선 복합체의 제조

두릅나무, 기름야자수 또는 녹차를 메탄올:에탄올=20:80의 혼합용매에 넣고 실온에서 6시간 동안 교반하여 각각의 유효성분을 추출해낸 후 정제하고 감압농축하여 올레아놀산, 베타카로틴 및 에피갈코카테킨 갈레이트를 제조하였다.

제조한 올레아놀산, 베타카로틴 및 에피갈로카테킨 갈레이트와 상업적으로 시판되는 목백일홍 추출물(CARRUBBA사)을 0.05:0.05:0.02:1의 중량비로 혼합하여 주름 개선 복합체를 제조하였다.

[시험예 1] 피부 세포에 대한 독성 측정

올레아놀산, 베타카로틴, 에피갈로카테킨 갈레이트, 목백일홍 추출물, 아세틸테트라펩타이드 11(cognis사)과 상기 제조예 1을 통하여 제조한 주름 개선 복합체를 증류수로 희석하여 하기 표 1과 같은 농도로 각각 준비한 다음, 인간의 피부 섬유아세포에 처리하고 섬유아세포의 증식 효과를 측정하여 상기 물질들의 피부 세포에 대한 독성을 확인하였다.

구체적으로는 2.5％의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 함유된 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 사람의 섬유아세포를 5,000세포/well이 되도록 넣고, 70~80％ 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 다음, 하기 표 1의 농도로 각각의 물질을 처리하고 3일 후 살아있는 세포수를 측정하여 상기 물질들이 피부 세포에 미치는 독성을 관찰하였다. 이때, 아무런 물질도 처리하지 않은 군을 대조군으로 하고, 대조군의 세포수를 100으로 하여 비교치를 구한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

성분	농도(ppm)	세포수(%)
올레아놀산	100	99
	10	101
	1	100
	대조군	100
베타카로틴	100	101
	10	102
	1	99
	대조군	100
에피갈로카테킨 갈레이트	100	98
	10	101
	1	100
	대조군	100
목백일홍추출물	100	100
	10	101
	1	100
	대조군	100
주름 개선 복합체 (제조예 1)	100	99
	10	102
	1	101
	대조군	100
아세틸테트라펩타이드 11	100	99
	10	100
	1	98
	대조군	100

상기 표 1의 결과를 통하여, 올레아놀산, 베타카로틴, 에피갈로카테킨 갈레이트, 목백일홍 추출물, 주름 개선 복합체 및 아세틸테트라펩타이드 11은 모두 피부 세포에 독성을 주지 않는 안전한 성분임을 확인할 수 있었다.

[시험예 2] 인간 피부세포에 대한 콜라겐 생합성 효능 측정

인간 섬유아세포를 24공 평판배양기에서 배양한 다음, 하기 표 2에 기재된 농도를 갖는 각각의 물질을 포함하는 배지로 교체하여 3일간 배양하고 10％의 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지를 각 웰당 0.5㎖씩 첨가한 후 L[2, 3,4, 5-3H]-프롤린 10μCi를 첨가하였다. 24시간 경과 후, 각 웰에 들어있는 배지와 세포들을 긁어 모아 5％ 트리클로로아세트산(TCA; Trichloroacetic acid) 용액에 넣어 수세한 후, 각각 2개의 시험관에 분주하고 1개의 시험관에는 타입 I 콜라게나제(type I collagenase) 1unit/㎕를 넣고 37℃에서 90분간 배양하였으며 다른 시험관은 4℃에서 보관하였다. 그 후, 모든 시험관에 50％ 트리클로로아세트산을 0.05㎖씩 첨가하고 4℃에서 20분간 방치한 다음, 각각 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 각각의 상등액과 침전물을 액체 신틸레이션 계수기(LSC; Liquid Scintillation Counter)로 씨피엠(CPM; counts per minute) 값을 얻어, 하기 수학식 1에 의거하여 대조군과 실험군에 대해 콜라겐 생합성 값(RCB; Relative Collagen Biosynthesis)을 구하였다. 대조군을 100으로 하여 비교치를 구한 다음 하기 표 2에 나타내었다.

시험물질	농도(ppm)	콜라겐 생합성 비율(RCB)(%)
올레아놀산	10	126
올레아놀산	1	109
베타카로틴	10	120
베타카로틴	1	114
에피갈로카테킨 갈레이트	10	129
에피갈로카테킨 갈레이트	1	117
목백일홍 추출물	10	107
목백일홍 추출물	1	102
주름 개선 복합체 (제조예 1)	10	143
주름 개선 복합체 (제조예 1)	1	129
대조군	-	100

상기 표 2에서 나타낸 바와 같이, 올레아놀산, 베타카로틴, 에피갈로카테킨 갈레이트, 목백일홍 추출물 및 주름 개선 복합체는 콜라겐 생합성을 농도 의존적으로 증가시킴을 알 수 있었다. 또한, 본 발명에 따른 주름 개선 복합체의 콜라겐 생합성 효능이 다른 물질과 비교하여 가장 우수함을 알 수 있었다. 이는 각 성분들의 단순 혼합에서 기대할 수 있는 평균값 이상으로서, 본 발명의 주름 개선 복합체는 콜라겐의 생합성을 효과적으로 촉진하여 피부 주름과 처짐 현상을 예방할 수 있다.

[시험예 3] 콜라겐 젤 수축 시험

콜라겐(collagen, Sigma)을 0.1% 아세트산 수용액에 최종 농도가 3mg/㎖ 되게 녹여서 콜라겐 수용액을 준비하였다. 배양 접시에서 자라고 있는 정상 인간 섬유아세포에 트립신 이디티에이(Trypsin-EDTA) 수용액을 처리해서 배양접시에서 떼어낸 후, 원심분리해서 세포와 배양액을 분리하였다. 분리된 세포에 적당량의 배양 배지(DMEM, 10% FBS, 1% penicilin-streptomycin)를 넣어주고 피펫팅해서 세포 서스펜젼(cell suspension)을 만들었다. 이때 세포수는 1.5x10⁵cells/㎖로 조절하였다. 준비된 세포 서스펜젼(cell suspension)을 에피 튜브(epi-tube)로 옮기고 콜라겐 수용액을 넣어서 거품이 생기지 않게 피펫팅으로 잘 섞어주었다. 세포와 콜라겐이 잘 혼합되면 24웰 플레이트(24well plate)로 옮기고, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 20분간 굳혔다. 콜라겐 젤이 굳은 것을 확인한 후, 500㎕의 배양배지를 넣어주고 200㎕ 피펫 팁의 끝으로 웰(well)의 외곽을 돌려서 젤과 플레이트를 분리하였다. 젤이 플레이트에서 완전히 분리된 것을 확인한 후, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 대조군 및 실험군 1~6을 각각의 배양 배지에 처리하고 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 디지털 카메라를 이용해서 젤을 촬영하고, 이미지 J(Image J) 프로그램(NIH)을 이용해서 젤의 표면적을 계산해서 수축의 정도를 정량화하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1의 Y축은 시료를 처리하기 전 후 젤 표면적 변화량(%)으로, 이 값이 작을수록 젤이 수축된 것을 나타낸다. 수축이 더 많이 진행될수록 젊고 건강한 세포로 콜라겐이 활발히 생성된 것을 의미한다.

시료명	성분 함량
대조군	무처리 - 늙은 섬유아세포
실험군 1	올레아놀산 500ppm
실험군 2	베타카로틴 500ppm
실험군 3	에피갈로카테킨 갈레이트 200ppm
실험군 4	목백일홍 추출물 1.0%
실험군 5	올레아놀산 100ppm+ 베타카로틴 100ppm+ 에피갈로카테킨 갈레이트 40ppm+ 목백일홍 추출물 0.2%
실험군 6	올레아놀산 500ppm+ 베타카로틴 500ppm+ 에피갈로카테킨 갈레이트 200ppm+ 목백일홍 추출물 1.0%

도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 올레아놀산(실험군 1), 베타카로틴(실험군 2), 에피갈로카테킨 갈레이트(실험군 3) 및 목백일홍 추출물(실험군 4)은 무처리 대조군과 비교하여 콜라겐 활성 강화를 통해 세포 수축력을 유의하게 증가시켰으며, 이를 혼합하여 사용하였을 경우(실험군 5 및 6)에는 유효 성분들간의 시너지 작용으로 인하여 시험물질을 적은 양만 처리하더라도 세포 수축력을 탁월하게 증가시킴을 알 수 있었다.

콜라겐 섬유는 피부의 인장강도를 결정하는 중요한 구성 성분으로 콜라겐 섬유가 정상적으로 활성을 나타내는 섬유아세포의 경우는 우수한 수축력을 발휘하여 피부의 탄력을 유지시켜 준다. 그러나 섬유아세포가 건강하지 못하거나, 콜라겐의 양과 질이 떨어지고, 둘 사이의 부착 포인트가 단단하지 못할 경우에는 수축력이 현저하게 떨어지고 피부 탄력을 잡아주는 힘이 떨어지게 되어 피부 노화가 진행되게 된다. 본 발명에 따라 올레아놀산, 베타카로틴, 에피갈로카테킨 갈레이트 및 목백일홍 추출물을 혼합한 주름 개선 복합체를 사용하면 세포 수축력이 빠르게 증가되어 우수한 피부 주름 개선 효과를 나타낼 수 있었다.

[시험예 4] 콜라겐 면역형광 염색을 통한 변성 확인 시험

정상 인간 각질형성세포는 KBM^®배지(Clonetics)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기(incubator)에서 배양하였고, 정상 인간 섬유아세포는 10% FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicilin-streptomycin)이 첨가된 DMEM배지를 사용하여 동일 조건에서 배양하였다. 정상 인간 각질형성세포는 배양접시에 부착을 위해서 콜라겐이 코팅된 배양 접시를 사용하였다.

면역형광 염색용 슬라이드 글래스에 세포를 도포하고, 48시간 동안 물질을 처리한 후에 면역형광 염색을 진행하였다. 자세한 면역형광 염색의 방법은 다음과 같다. 세포를 디피비에스(DPBS)로 두 번 세척하고 3.5% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 10분간 처리해서 고정시켰다. 고정된 세포를 디피비에스로 10분씩 3번 세척하고 0.1% 트리톤 X-100(Triton X-100)을 5분간 처리해서 세포에 침투시켰다. 피비에스(PBS)로 10분간 세척하고 5% 염소 혈청(Goat serum)으로 30분간 블로킹 하였다. 블로킹이 끝난 세포에 일차 항체가 첨가된 5% 염소 혈청(Goat serum)을 처리하고 상온에서 1시간 동안 반응시켜서 일차 항체가 대항 항체에 결합하게 하였다. 디피비에스로 10분씩 3번 세척해서 여분의 일차 항체를 제거하고, 이차 항체를 상온에서 30분간 처리하였다. 피비에스로 10분씩 3번 세척해서 여분의 2차 항체를 완전히 제거하였다. 슬라이드 글래스 위에 마운팅 용액(mounting solution)을 한 방울 떨어뜨리고 커버 슬립으로 덮었다. 커버 슬립 밖으로 나온 여분의 마운팅 용액(mounting solution)을 제거하고 커버 슬립을 실링하였다. UV를 조사하기 전에 무처리 대조군의 콜라겐 발현 정도를 확인한 후, UV를 조사하여 콜라겐의 변성을 확인하였다. 이어서 올레아놀산 500ppm, 베타카로틴 500ppm, 에피갈로카테킨 갈레이트 200ppm 및 목백일홍 추출물 1.0%을 혼합한 주름 개선 복합체를 처리하고, 형광 차이를 관찰하여 콜라겐의 발현 변화를 확인하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 올레아놀산, 베타카로틴, 에피갈로카테킨 갈레이트 및 목백일홍 추출물을 혼합한 주름 개선 복합체는 콜라겐의 변성을 억제하는 효과를 가지고 있으며, UV에 의해 변성된 콜라겐의 활성을 다시 강화시킬 수 있음을 알 수 있었다.

[시험예 5] 각질형성세포의 손상 방어 및 재생능력 시험

아세틸테트라펩타이드 11의 UV에 의한 각질형성세포(표피)의 손상 방어 및 재생 능력을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험 방법을 따라 각질형성세포의 손상 정도를 관찰하였다. 그 결과는 하기 도 3에 나타내었다.

<실험 방법>

1. 6 well plate에 4x10⁵의 HaCaT 세포를 넣고, 배지는 DMEM(10% FBS 첨가)을 사용한다. 37℃ CO₂ 배양기에서 24시간 배양한다.

2. 무처리군 및 UV처리군, UV처리+아세틸테트라펩타이드 11군으로 나누고 아세틸테트라펩타이드 11 처리군에 아세틸테트라펩타이드 11을 100ppm으로 6시간 동안 처리한다.

3. White tip의 끝을 이용해서, 광학현미경(50x 배율)을 이용하여 사진을 촬영한다.

4. 외부 스트레스로 UV를 처리하고 48시간 후 사진을 촬영하여 세포 손상 정도를 비교한다.

도 3에서 볼 수 있듯이, 표피 구성 세포인 각질형성세포(keratinocyte)에 UV를 조사하여 외부 환경에 의한 케라틴 변성을 관찰한 결과, UV 조사시 피부 외각층의 케라틴이 검고 어둡게 되어 케라틴의 변성이 심화되는 것을 확인할 수 있었지만, 아세틸테트라펩타이드 11을 처리한 경우는 케라틴의 변성이 억제되는 것을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명의 아세틸테트라펩타이드 11은 UV와 같은 외부 자극에 의한 케라틴 손상을 억제함으로써 피부 주름을 개선하고 노화를 방지함을 알 수 있었다.

[실시예 1~2 및 비교예 1~6]

하기 표 4와 같은 조성으로 유액 형태의 로션 제형인 실시예 1~2 및 비교예 1~6을 제조하였다.

배합성분	함량(중량%)
배합성분	실시예1	실시예2	비교예1	비교예2	비교예3	비교예4	비교예5	비교예6
올레아놀산	-	-	0.05	-	-	-	-	-
베타카로틴	-	-	-	0.05	-	-	-	-
에피갈로카테킨 갈레이트	-	-	-	-	0.02	-	-	-
목백일홍 추출물	-	-	-	-	-	1.0	-	-
주름 개선 복합체 (제조예 1)	1.12	1.12	-	-	-	-	-	-
아세틸테트라펩타이드 11	-	0.01	-	-	-	-	0.01	-
EDTA-2Na	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02
글리세린	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00
부틸렌 글리콜	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00
글리세릴 스테아레이트	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
세테아릴 알코올	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
아라키딜알코올 &아라키딜글루코사이드	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
세틸아릴 알코올 & 세테아릴 글루코사이드	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00	1.00
식물성 스쿠알란	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
세틸에틸헥사노에이트	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00	5.00
카보머	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
트리에탄올아민	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
방부제, 향, 색소	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량
정제수	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량	잔량

<실시예 1~2 및 비교예 1~6의 제조방법>

1. 정제수에 EDTA-2Na, 글리세린 및 부틸렌 글리콜을 넣고 70℃까지 가온한다.

2. 글리세릴 스테아레이트, 세테아릴 알코올, 아라키딜 알코올&아라키딜글루코사이드, 세틸아릴 알코올&세테아릴 글루코사이드, 식물성 스쿠알란, 세틸에틸헥사노에이트의 오일 및 왁스를 80℃까지 가온 용해한다.

3. 상기 2를 상기 1의 물파트에 천천히 투입하면서 유화시킨다.

4. 상기 3에 카보머를 넣고 점증하여 준 후 50℃까지 냉각한다.

5. 상기 4에 올레아놀산, 베타카로틴, 에피갈로카테킨 갈레이트, 목백일홍 추출물, 아세틸테트라펩타이드 11, 주름개선복합체, 방부제, 향, 색소를 투입하고 균일하게 혼합한다.

[시험예 6] 주름 개선 효과

상기 실시예 1~2 및 비교예 1~6의 주름개선효과를 알아보기 위하여 다음과 같이 실험을 실시하였다. 20~40대 여성 160명을 각각 20명씩 8조로 나누어 아침 저녁 매일 2회씩 8주간 지정된 눈가 부위에 실시예 1~2 및 비교예 1~6의 로션을 각각 도포하게 한 후, 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오미터(visiometer: SV60, Courage+Khazaka electronic GmbH, Germany)로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었으며, 이 결과는 8주 후의 각각의 파라미터(parameter) 값에서 8주 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 이 값이 음수가 나올수록 주름 개선 효과가 높다는 것을 의미한다.

구분	R1	R2	R3	R4	R5
실시예 1	-0.20	-0.15	-0.07	-0.07	-0.04
실시예 2	-0.25	-0.19	-0.1	-0.09	-0.07
비교예 1	-0.15	-0.12	-0.03	-0.05	-0.04
비교예 2	-0.15	-0.13	-0.06	-0.05	-0.04
비교예 3	-0.16	-0.18	-0.04	-0.05	-0.06
비교예 4	-0.13	-0.07	-0.04	-0.03	-0.03
비교예 5	-0.10	-0.07	-0.04	-0.05	-0.03
비교예 6	0.06	0.05	0.02	-0.01	0.00

R1: 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값

R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값들의 평균

R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치

R4: 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각 각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값

R5: 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤곽을 뺀 값의 평균값

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 올레아놀산, 베타 카로틴, 에피갈로카테킨 갈레이트 및 목백일홍 추출물을 혼합한 주름 개선 복합체를 함유하는 실시예 1은 올레아놀산, 베타 카로틴, 에피갈로카테킨 갈레이트, 목백일홍 추출물 또는 아세틸테트라펩타이드 11을 1종씩 함유한 비교예 1~5, 및 유효성분을 모두 함유하지 않는 비교예 6보다 피부 주름을 개선하는 효과가 탁월함을 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 주름 개선 복합체와 함께 아세틸테트라펩타이드 11을 함유하는 실시예 2는 주름 개선 복합체를 단독으로 함유하는 실시예 1보다 더욱 우수한 주름 개선 효과를 나타내었다.

그러므로 본 발명의 올레놀산, 베타 카로틴, 에피칼로카테킨 갈레이트 및 목백일홍 추출물을 혼합한 주름 개선 복합체와 함께 아세틸테트라펩타이드 11을 함유하는 조성물은 표피층의 케라틴 변성을 억제하고, 진피층의 콜라겐 변성을 억제함으로써 표피 및 진피층에 발생하는 피부 주름을 모두 예방할 수 있다.

또한, 실시예 1~2 및 비교예 1~6에 대해 별도로 실시한 피부 안전성 평가에서 본 발명의 화장료 조성물은 피부에 대한 안전성 역시 우수한 것으로 나타났다.

도 1은 본 발명에 따른 주름 개선 복합체를 처리하였을 때 콜라겐 젤 수축 정도를 정량화하여 나타낸 그래프이다.

도 2는 UV에 노출시킨 후 본 발명에 따른 주름 개선 복합체를 처리하였을 때 콜라겐의 발현 변화를 나타낸 것이다.

도 3은 손상된 각질형성세포에 아세틸테트라펩타이드 11을 처리하였을 때 세포 재생력 결과를 나타낸 것이다.

Claims

올레아놀산(Oleanolic acid), 베타 카로틴(beta-carotene), 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin Gallate) 및 목백일홍 추출물(Lagerstroemia Indica Flower Extract)을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 올레아놀산, 베타 카로틴, 에피갈로카테킨 갈레이트 및 목백일홍 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.001~30중량%의 양으로 함유하는 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 조성물에 아세틸테트라펩타이드 11을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 아세틸테트라펩타이드 11을 조성물 총 중량에 대하여 0.00001~10중량%의 양으로 함유하는 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.