CN117288942A - 鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫学检测领域，涉及一种鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒及制备方法，包括用于检测包含Omicron突变株在内的所有新型冠状病毒毒株的第一试剂条以及用于检测包含新型冠状病毒原始株及α，β，δ等突变株在内的所有非Omicron突变株的第二试剂条。本发明提供了一种鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒及制备方法，试剂盒灵敏度高、对突变体漏检率低、快捷、简便，十分有助于新型冠状病毒的科学防治。

Description

鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒及制备 方法
技术领域
本发明属于免疫学检测领域，涉及一种病毒检测试剂盒及制备方法，尤其涉及一种鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒及制备方法。
背景技术
冠状病毒隶属于冠状病毒科、冠状病毒属，是一类单链正义RNA病毒。自1937年发现首个病毒至今，共鉴定多种冠状病毒，分属于α、β、γ和δ属，其中有7种冠状病毒能感染人，分别为α属的HCoV-229E、HCoV-NL63和β属的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV及2019年底鉴定的新型冠状病毒SARS-CoV-2。冠状病毒基因组依次编码棘突蛋白(Spikeprotein)、包膜蛋白(Envelopeprotein)、膜蛋白(Membrane protein)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid)。其中，核衣壳蛋白(Nucleocapsid)是冠状病毒中含量最丰富的蛋白。在病毒体组装过程中，N蛋白与病毒RNA结合并导致螺旋核衣壳的形成。新型冠状病毒突变体较多，但是核衣壳蛋白在多次突变中并未产生较大改变，根据文献报道，一个冠状病毒粒子仅含有1条RNA，而N蛋白的平均含量则为3000多分子。以此计算，当N抗原检测的灵敏度(最低检出限)达到40-200pg/mL时，其对成熟冠状病毒的检测灵敏度即可等于核酸检测(200-1000拷贝/mL，即3-15pg/mL)。除此之外，由于病毒复制早期会释放大量不含核酸的游离抗原，感染极早期与活动期的核酸阴性样本，也可能显示为抗原阳性。所以N蛋白被普遍选为检测靶标。现有研究表明，在Omicron突变株中N-Pr突变位点较多，对蛋白空间结构造成一定影响，造成现有抗体识别的效率下降明显。由于新型冠状病毒Omicron突变株感染性与毒性等生物学特性的改变，鉴别Omicron突变株的感染对新型冠状病毒的科学防治意义重大。
目前市场上已有多个相关针对病毒N或S蛋白的胶体金免疫检测试剂盒，但其均不能对Omicron突变株进行鉴别，其中部分试剂盒由于Omicron突变株抗原结构的重大改变而造成检测灵敏度明显下降，与核酸检测法相比具有较大差距从而极大限制了其应用。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒及制备方法，试剂盒灵敏度高、对突变体漏检率低、快捷、简便，十分有助于新型冠状病毒的科学防治。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒及其制备方法，该检测试剂盒由两张检测试剂条所组成，其中一张检测试剂条可检测包含Omicron突变株在内的所有新型冠状病毒毒株，另一张则可以检测除Omicron突变株之外的(包含新型冠状病毒原始株及α，β，δ等突变株在内的所有非Omicron突变株)所有新型冠状病毒。两张试剂条同时使用，即可鉴别新型冠状病毒Omicron突变体。
其中一张能检测包含Omicron突变株在内的所有新型冠状病毒毒株的试剂条(第一试剂条)，由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜检测层、吸水垫以及硬质聚氯乙烯背底板组成；其制备方法包括硝酸纤维素膜检测层的制备、结合垫的制备以及吸水垫的制备；硝酸纤维素膜检测层靠近结合垫的一端包被有能识别所有毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体；硝酸纤维素膜检测层靠近吸水垫的一端包被有羊抗兔IgG抗体；结合垫上喷点有胶体金标记的能识别所有毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。
另外一张能检测除Omicron突变株之外的所有新型冠状病毒毒株的试剂条(第二试剂条)，亦由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜检测层、吸水垫以及硬质聚氯乙烯背底板组成；其制备方法亦包括硝酸纤维素膜检测层的制备、结合垫的制备以及吸水垫的制备；硝酸纤维素膜检测层靠近结合垫的一端包被有能识别所有毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体；硝酸纤维素膜检测层靠近吸水垫的一端包被有羊抗鼠IgG抗体；结合垫上喷点有胶体金标记的能识别除Omicron突变株之外的所有新型冠状病毒毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。
本发明所提供的能鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒用于检测2019-nCoV(于2020年2月11日-12日正式更名为COVID-19)病毒，本申请文件中的“新型冠状病毒”均指此病毒。
作为优选，本发明第一试剂条所采用的硝酸纤维素膜检测层的制备方法是：将能识别所有毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体使用划膜仪包被至膜表面，形成检测线T，同时使用划膜仪将羊抗兔IgG包被至膜表面形成质控C线。
作为优选，本发明所述第一试剂条硝酸纤维素膜检测层上包被的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，为南京拂晓生物科技有限公司产品，货号为：Mo11503M-MY21M1609。
作为优选，本发明第一试剂条硝酸纤维素膜检测层上所采用的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的使用浓度均是0.1-3.0mg/ml，划线包被量均为0.2-2.0ul/cm。
作为优选，本发明第一试剂条所硝酸纤维素膜检测层上包被的羊抗兔IgG的浓度是0.1-3.0mg/ml，划线包被量是0.2-2.0ul/cm。
作为优选，本发明第一试剂条所采用的结合垫的具体制备方法是：通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，基于得到的胶体金溶液制备胶体金标记的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，将制备得到的胶体金标记的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体通过生物划膜喷金仪喷点至经预处理的玻璃纤维垫表面，形成结合垫；
作为优选，本发明所述第一试剂条结合垫上使用的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，为南京拂晓生物科技有限公司产品，货号为：Mo11504M-MY21M1509。
作为优选，本发明第一试剂条玻璃纤维垫的具体预处理方式是：
1.1)配置结合垫处理液：所述结合垫处理液的含量及组分是0.01M Tris，1％BSA，1％Tween-20，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮；所述结合垫处理液的pH＝8.7；
1.2)浸泡处理：将玻璃纤维垫浸泡于结合垫处理液中，浸泡时间1-2h后在干燥间晾干12-16h；
1.3)收集晾干后的玻璃纤维垫，切割后在干燥密封环境中保存备用。
作为优选，本发明第一试剂条的制备方法还包括样品垫的制备，所述样品垫的具体制备方式是：
a)配置样品垫处理液：所述样品垫处理液的组分及含量是0.01M Tris，1％BSA，1％Tween-20，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮，所述样品垫处理液的pH＝8.7；
b)浸泡处理：将单张样品垫浸泡于结合垫处理液中，浸泡时间1-2h后在干燥间晾干12-16h；
c)收集晾干后的样品垫，切割后在干燥密封环境中保存备用。
作为优选，本发明第一试剂条所采用的结合垫材质是玻璃纤维；所述样品垫材质为玻璃纤维或者聚酯。
作为优选，本发明第一试剂条所采用的吸水垫是将普通吸水纸裁剪后即获得；
作为优选，本发明第一试剂条所采用的底板材质为PVC，其经裁剪后即为试剂条底板；
将上述硝酸纤维素膜检测层、结合垫、样品垫、吸水垫以及底板根据现有技术进行组装，即得到本发明“一种鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒”中的第一试剂条。
作为优选，本发明中的第二试剂条所采用的硝酸纤维素膜检测层的制备方法是：将能识别所有毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体使用划膜仪包被至膜表面，形成检测线T，同时使用划膜仪将羊抗鼠IgG包被至膜表面形成质控C线。
作为优选，本发明所述第二试剂条硝酸纤维素膜检测层上包被的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，为南京拂晓生物科技有限公司产品，货号为：Mo11503M-MY21M1609。
作为优选，本发明第二试剂条硝酸纤维素膜检测层上所采用的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的使用浓度均是0.1-3.0mg/ml，划线包被量均为0.2-2.0ul/cm。
作为优选，本发明第二试剂条所硝酸纤维素膜检测层上包被的羊抗鼠IgG的浓度是0.1-3.0mg/ml，划线包被量是0.2-2.0ul/cm。
作为优选，本发明第二试剂条所采用的结合垫的具体制备方法是：通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，基于制备得到的胶体金溶液制备胶体金标记的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，将制备得到的胶体金标记的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体通过生物划膜喷金仪喷点至经过预处理的玻璃纤维垫表面，形成结合垫；
作为优选，本发明所述第二试剂条结合垫上使用的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，其特征在于，其包含三个重链互补决定区(CDR-VH1、CDR-VH2和CDR-VH3)和三个轻链互补决定区(CDR-VL1、CDR-VL2和CDR-VL3)，其中，CDR-VH1的氨基酸序列为GYTFTDYS，CDR-VH2的氨基酸序列为INTETGEA，CDR-VH3的氨基酸序列为TRSTATDD，CDR-VL1的氨基酸序列为QSVDYDGDSY，CDR-VL2的氨基酸序列为TAS，CDR-VL3的氨基酸序列为QQSNEDPLT。
作为优选，本发明第二试剂条玻璃纤维垫的具体预处理方式是：
1.1)配置结合垫处理液：所述结合垫处理液的含量及组分是0.01M Tris，1％BSA，1％Tween-20，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮；所述结合垫处理液的pH＝8.7；
1.2)浸泡处理：将玻璃纤维垫浸泡于结合垫处理液中，浸泡时间1-2h后在干燥间晾干12-16h；
1.3)收集晾干后的玻璃纤维垫，切割后在干燥密封环境中保存备用。
作为优选，本发明中的第二试剂条的制备方法还包括样品垫的制备，所述样品垫的具体制备方式是：
a)配置样品垫处理液：所述样品垫处理液的组分及含量是0.01M Tris，1％BSA，1％Tween-20，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮，所述样品垫处理液的pH＝8.7；
b)浸泡处理：将单张样品垫浸泡于样品垫处理液中，浸泡时间1-2h后在干燥间晾干12-16h；
c)收集晾干后的样品垫，切割后在干燥密封环境中保存备用。
作为优选，本发明第二试剂条所采用的结合垫材质是玻璃纤维；所述样品垫材质为玻璃纤维或者聚酯。
作为优选，本发明第二试剂条所采用的吸水垫是将普通吸水纸裁剪后即获得；
作为优选，本发明第二试剂条所采用的底板材质为PVC，其经裁剪后即为试剂条底板；
将上述硝酸纤维素膜检测层、结合垫、样品垫、吸水垫以及底板根据现有技术进行组装，即得到本发明“一种鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒”中的第二试剂条。
将上述第一试剂条与第二试剂条同时装入试剂盒的卡盒内，辅以配套的鼻咽拭子及新型冠状病毒裂解液即形成新型冠状病毒能鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试盒。检测时，如果第一试剂条与第二试剂条同时显示为阳性，则表明该样品为非Omicron突变株的新型冠状病毒感染；如果第一试剂条为阳性，第二试剂条为阴性，则表明该样品为新型冠状病毒Omicron突变株感染；如果第一试剂条为阴性，第二试剂条为阴性，则表明未检测出新型冠状病毒；如果第一试剂条为阴性，第二试剂条为阳性，则表示结果可疑，需进一步检测分析。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
首先，本发明采用两对单克隆抗体，制备两个检测试剂条，能有效区分Omicron突变株与非Omicron突变株的感染，对于新型冠状病毒的的治疗方案的制定有着十分重要的指导意义。
其次，本发明试剂盒所采用的单克隆抗体对Omicron突变株的识别力强，试剂盒检测灵敏度高，对各种常见突变株均无漏检率，能够检出CT值(荧光定量PCR法)高至32的临床样品，基本可以代替核酸检测，可实现对病毒低载量的无症状携带者进行快速检测，克服市面试剂盒对Omicron突变株检测阳性率低的缺陷。
最后，本发明的单克隆抗体具有高度的特异性，与包括SARS在内的其他呼吸道常见病原体无交叉反应。本发明的试剂盒具有良好的特异性和稳定性，与明显高于微生物传统检测方法，并且具有快速、高效等优点。
本发明属于免疫学检测领域，涉及一种鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒及其制备方法。该检测试剂盒由两张检测试剂条所组成，其中一张检测试剂条可检测包含Omicron突变株在内的所有新型冠状病毒毒株，另一张则可以检测除Omicron突变株之外的(包含新型冠状病毒原始株及α，β，δ等突变株在内的所有非Omicron突变株)所有新型冠状病毒。两张试剂条同时使用，即可鉴别新型冠状病毒Omicron突变体。本发明所提供的鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒，是一种应用双抗体夹心法原理，结合免疫层析和胶体金表面抗体定向标记技术实现对样本中新型冠状病毒N抗原的定性检测，克服现有技术中对于新型冠状病毒检测试剂盒灵敏度相对较差，存在不少漏诊和假阳问题的缺陷，使用两对单克隆抗体，解决目前检测试剂盒不能对感染进行分型检测，对部分重要突变体漏检严重的缺陷，其具有快捷、简便、灵敏度高、特异性强优点，在新型冠状病毒的科学防治中应用价值巨大。
附图说明
图1是本发明所提供的试剂盒中2个试剂条的共同结构示意图；
图2是本发明所提供的试剂盒的结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1能识别除Omicron突变株之外的所有新型冠状病毒毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备
1.1)动物的免疫
以武汉普健生物科技有限公司货号ATEP02448COV的新型冠状病毒(SARS-CoV-2(2019-nCoV))N蛋白重组蛋白为抗原，经1：5000的β-丙內酯灭活后免疫8周龄的BALB/c小鼠5只，设2只不作免疫小鼠做阴性对照。初次免疫抗原加等量弗氏完全佐剂充分乳化后，背部皮下多点注射免疫小鼠，100μg/小鼠。之后间隔三周用相同剂量抗原与弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射进行第二次免疫，以后间隔2周用相同剂量抗原与弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔注射进行第三次免疫。第三次免疫15天后尾静脉采血，检测抗血清效价。
1.2)抗血清效价检测
抗血清效价采用间接ELISA方法：用PBS(8.5g/L NaCl，1.4g/L Na2HPO4，0.2g/LNaH2PO4，pH＝7.4)稀释抗原浓度至3μg/mL，加入96孔板，100μL/孔，37℃孵育2h或者4℃过夜。用PBST(8.5g/L NaCl，1.4g/L Na2HPO4，0.2g/L NaH2PO4，0.5％(v/v)Tween-20，pH＝7.4)洗板3次之后拍板。1％的牛血清白蛋白溶于PBS溶液中，250μL/孔，37℃封闭2h或者4℃过夜。用PBST洗板3次之后拍板。4只免疫鼠血清用PBS梯度稀释加入对应孔中，100μL/孔，空白对照为PBS溶液，阴性对照为免疫前小鼠血清37℃包被1h后洗板。HRP标记的羊抗鼠IgG以1：5000倍数稀释加入，100μL/孔，37℃包被1h后洗板。每孔加新鲜配制的TMB显色底物溶液100μL，37℃作用10min后每孔加入1M盐酸100μL终止反应，用酶联检测仪测定OD450nm值，读数并观察结果。选择效价最高(效价51200)，第三次免疫间隔一个月后加强免疫，5天后取小鼠脾细胞进行细胞融合。
1.3)SP2/0骨髓瘤细胞的复苏和培养
提前对冻存的骨髓瘤细胞(SP2/0)进行复苏，将液氮冻存的骨髓瘤细胞快速取出后，置于37℃水浴中轻微晃动使其迅速融化，注意冻存管口不能碰到水，以免污染，然后将细胞转移到含2ml RPMI-1640完全培养基(含20％胎牛血清的RPMI-1640培养基，胎牛血清购自山西润生大业生物材料有限公司)的24孔板中，放入37℃，5％CO2培养箱中培养半个小时，待细胞全部贴壁生长时，及时换液，以后每隔3天传代一次，并调整细胞使其处于最适生长密度，当细胞达到一定活性，计数，准备进行融合。细胞融合前2天对细胞进行1比4传代，用新鲜培养基调整每瓶细胞浓度为1×105/ml。
1.4)饲养细胞的制备
1.4.1)将BALB/c小鼠眼球取血之后拉颈处死，完全浸泡于75％酒精中5min，移入超净工作台的平皿中，使其腹部朝上。
1.4.2)用镊子提起小鼠胸腹部皮肤，用剪刀剪开一小口，用两把镊子将皮肤撕开一较大的口，提起小鼠腹膜，剪开，找到小鼠的脾脏，用镊子，小剪刀小心将脾脏取出，放在一次性平皿中，细心剥去脾脏上附带的脂肪、结缔组织等，加入RPMI-1640培养基(购自Hyclone，货号SH30809.01)5ml，用吸有5ml RPMI-1640培养基的注射器的针头穿刺脾脏，小心的洗出脾细胞，然后过筛，将脾脏细胞悬液加入10ml离心管中，1100rpm离心5min，弃上清，用RPMI-1640培养基离心洗涤两次。
1.4.3)用5ml HAT培养液轻轻将细胞重悬并混和均匀，计数，补加HAT培养液至细胞浓度为1×105/ml。
1.4.4)将细胞悬液滴入96孔细胞培养板内，130μl/孔，放入37℃、5％ CO2培养箱中培养。
1.5)免疫脾细胞悬液的制备
1.5.1)加强免疫5天后，选血清效价最高的BALB/c小鼠，摘除眼球，放血，收集并分离血清作为抗体检测的阳性对照。
1.5.2)小鼠断颈处死后浸泡于75％酒精中5min，取出小鼠放在无菌超净工作台的平皿中，使其腹部朝上。
1.5.3)用镊子提起小鼠胸腹部皮肤，用剪刀剪开一小口，再用两把镊子将皮肤撕开一较大的口，然后重新换用新的镊子提起小鼠腹膜，剪开，找到小鼠的脾脏，小心将脾脏取出，放在一次性平皿中，细心去除脂肪和结缔组织。
1.5.4)用RPMI-1640洗液冲洗后，加入新的RPMI-1640洗液，用吸有5ml RPMI-1640培养基的注射器的针头穿刺脾脏小心的洗出脾细胞，然后过筛，使脾细胞尽可能都通过网孔挤压到溶液中，将脾细胞悬液移入离心管中，1100rpm离心5min，弃上清，离心洗涤两次。
1.5.5)用RPMI-1640培养液轻轻将脾细胞重悬，计数，备用。
1.6)SP2/0骨髓瘤细胞悬液的制备
1.6.1)取2瓶T75培养瓶培养好的骨髓瘤细胞(融合前一天换液，融合时细胞应处于对数生长期)，收集于50ml离心管中。
1.6.2)1000rpm离心5分钟，弃上清。
1.6.3)沉淀中加入30ml RPMI-1640洗液，轻轻重悬，混匀，同法再离心洗涤一次。
1.6.4)用10ml RPMI-1640培养液轻轻将脾细胞重悬并混和均匀，计数，备用。
1.7)细胞融合
1.7.1)将含1×108个脾细胞的悬液和含1×107个SP2/0骨髓瘤细胞的悬液混合于一支50ml的离心管内，补加培养基至40ml，充分混匀。
1.7.2)1200rpm离心5分钟，弃去上清，尽量去上清。
1.7.3)用手轻轻弹离心管底，使细胞团块松散均匀呈糊状。
1.7.4)从4℃冰箱中拿出已配好的50％PEG(MW1450)、RPMI-1640洗液，放在37℃水浴中，预温备用。
1.7.5)用1ml吸管吸取50％的PEG(MW1450)0.8ml，缓慢加入离心管边加边搅拌，时间控制在60秒。
1.7.6)然后再用60秒的时间逐渐加入40ml预热好的RPMI-1640洗液，使PEG稀释而失去促融作用。
1.7.7)1000rpm离心5min，弃上清。
1.7.8)加入400mL HAT培养液(购自Sigma，货号H0262)，轻轻吹吸、重悬沉淀细胞。
1.7.9)将融合细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔培养板内，50μl/孔，共铺20块培养板，然后将培养板置37℃、5％ CO2的培养箱中培养。
1.8)阳性克隆的筛选和克隆化培养
融合后第3天开始，每天观察各孔细胞生长情况，若有污染，立即用叠氮钠处理。融合后第7d用HT培养液全换液(HT，50×，购自Sigma，货号H0137)。换液后第二天，吸取出现克隆的孔上清用于特异性检测。以新型冠状病毒δ毒株为包被抗原，采用间接ELISA法检测。用酶联检测仪测定OD450，满足P/N值＞2.1为阳性。将阳性孔再次用HT培养基全换液，第二天再次ELISA检测阳性，选取连续阳性的克隆孔进行2-3次亚克隆，筛选出单克隆杂交瘤细胞。亚克隆具体步骤：①吹散并混匀阳性融合孔杂交瘤细胞，测定细胞浓度；②提前制备饲养细胞，并悬于HT培养基中，130ul/孔，铺到96孔板中，然后将培养板置37℃、5％CO2的培养箱中备用；③取阳性融合孔杂交瘤细胞，平均分散到步骤②的96孔板中；④将培养板置37℃、5％CO2的培养箱中培养7d；⑤用ELISA筛选阳性单集落孔，再次亚克隆；⑥连续亚克隆2—3次之后，可使亚克隆细胞集落孔均为阳性，且数值相近，即获得单克隆杂交瘤细胞；对单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，获取含单克隆抗体的细胞培养液上清。以新型冠状病毒Omicron毒株、人肺炎支原体(ATCC15531，1×106个菌体/孔)、铜绿假单胞菌(ATCC27853，1×108个菌体/孔)、卡他莫拉菌(ATCC25240，1×106个菌体/孔)、鲍曼不动杆菌(ATCC19606，1×106个菌体/孔)、副流感嗜血杆菌(ATCC7901，1×106个菌体/孔)、嗜肺军团菌(ATCC33152，1×106个菌体/孔)、化脓性链球菌(BNCC 185918，1×106个菌体/孔)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923，1×106个菌体/孔)、人流感嗜血杆菌(ATCC49247，1×106个菌体/孔)、肺炎克雷伯菌(ATCC700603，1×106个菌体/孔)、阴沟肠杆菌(ATCC13047，1×106个菌体/孔)、大肠埃希菌(ATCC25922，1×106个菌体/孔)、假丝酵母菌(BNCC 186382，1×106个菌体/孔)、甲型流感病毒(ATCC VR-1743)等呼吸道病原菌分别包被酶标板，对所筛抗体的特异性进行ELISA检测，淘汰与这些病原体有阳性反应的单克隆抗体。此步共筛选出1株合格的细胞株，命名为H5。
1.9)腹水制备与细胞保藏
对最后筛选出的阳性单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养。常规腹水体内诱生方法制备单抗腹水。
(1)mAb的Western blot检测：采用常规Western blot实验方法，测定腹水在1：2000稀释度下的特异性，结果显示该抗体只与新型冠状病毒δ毒株的N蛋白结合。
(2)抗体纯化及效价测定：腹水用Protein A亲和层析法进行纯化，步骤如下：
用GE-HiTrap Protein A HP预装柱，按说明书纯化抗体，具体操作如下：
a.取5mL杂交瘤上清，加入0.5mL 1M Tris(pH＝8.0)调节到pH＝8.0，20000g离心20min除去沉淀。
b.上柱后用10倍柱体积buffer A(100mM Tris-Cl，pH＝8.0)洗涤后，再用10倍柱体积buffer B(10mM Tris-Cl，pH＝8.0)洗涤。
c.用大约三倍柱体积的IgG洗脱缓冲液(100mM glycine，pH＝3.0)洗脱IgG。(收集管内先预装0.1mL IgG-中和缓冲液(1M Tris-Cl，pH＝8.0)，每管装0.9mL洗脱液)
d.用50倍体积PBS(8.5g/L NaCl，1.4g/L Na2HPO4，0.2g/L NaH2PO4，pH＝7.4)进行透析。
e.超滤浓缩后，以PBS调整浓度为1mg/ml，-70℃保存备用。
纯化后的4种抗体经倍比稀释后用间接ELISA法测定效价。抗体经SDS-PAGE分析纯度均在95％以上，ELISA效价均在1：1000000以上。纯化的抗体调整浓度为1mg/ml后，-70℃保存备用。根据筛选时的实验编号，将此单克隆抗体命名为H5。
1.10)抗体可变区的序列分析
按常规方法对上述杂交瘤细胞进行基因测序与分析，确定了H5单克隆抗体的基因序列，其包含三个重链互补决定区(CDR-VH1、CDR-VH2和CDR-VH3)和三个轻链互补决定区(CDR-VL1、CDR-VL2和CDR-VL3)，其中，CDR-VH1的氨基酸序列为GYTFTDYS，CDR-VH2的氨基酸序列为INTETGEA，CDR-VH3的氨基酸序列为TRSTATDD，CDR-VL1的氨基酸序列为QSVDYDGDSY，CDR-VL2的氨基酸序列为TAS，CDR-VL3的氨基酸序列为QQSNEDPLT。
实施例2能检测包含Omicron突变株在内的所有新型冠状病毒毒株的试剂条(第一试剂条)的制备
2.1硝酸纤维素膜包被抗体
a)配置包被缓冲液：在80ml超纯水中依次加入0.15g磷酸氢二钠、0.04g磷酸二氢钠、0.8g氯化钠、0.02g氯化钾、5g蔗糖，搅拌均匀后调节pH至7.5，并定容至100ml。
b)包被抗体稀释：使用上述包被缓冲液分别稀释南京拂晓生物科技有限公司货号为Mo11503M-MY21M1609的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和羊抗兔IgG抗体(武汉飞羿科技有限公司产品)至2.0mg/ml和1.0mg/ml。
c)划线包被：将金标生物划膜喷金仪HM3035划膜管路依次使用清洗液、纯水各清洗20次；将上述两种稀释后的包被抗体(货号Mo11503M-MY21M1609的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和羊抗兔IgG抗体)液分别吸入独立的两个划线管路，并排空管路中的空气；调整各划线笔位置使N抗原检测线与质控线两线间隔5mm，并且N抗原检测线距离NC膜下端4mm；在硝酸纤维素膜CN140表面划线包被上述两种抗体溶液，划线参数均为1ul/cm、100mm/s。
4)干燥处理：划线后的硝酸纤维素膜在30％相对湿度的房间干燥12小时；收集干燥后的硝酸纤维素膜在密闭铝箔袋中，并在袋中加入袋状干燥剂；
2.2样品垫和结合垫处理
a)配置处理溶液：样品垫处理液(pH＝8.7)0.01M Tris，1％BSA，1％Tween-20，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮；结合垫处理液(pH＝8.7)组分为0.01M Tris，1％BSA，1％Tween-20，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮，按照上述配方各配置1L处理液。
b)浸泡处理：将处理液倒入敞口容器内，放入2张玻璃纤维垫，稍微按压使溶液完全浸没垫子，每张浸泡约1-2h后取出放置到网架上在干燥间晾干12-16小时。按照上述方法分别进行样品垫和结合垫处理。
c)收集晾干后的样品垫和结合垫，在斩切机上分别将其切割为1.5cm、0.6cm宽的细条。
d)收集上步骤切割后的样品垫和结合垫至干燥密封袋中保存。
2.3胶体金标记与喷垫
a)胶体金溶液的制备：
该产品使用的胶体金是通过柠檬酸三钠还原法制备的，具体方法如下：
1)往250ml的圆底烧瓶中倒入99ml超纯水，再加入1ml浓度为1％的氯金酸(终浓度为0.01％)。圆底烧瓶放于油浴锅中，设置温度120℃，加热到完全沸腾。
2)迅速加入1.2ml浓度为1％的柠檬酸三钠后继续加热10min，观察溶液颜色由黄色变蓝再变红，最后变成稳定的红色后，停止加热，水浴搅拌冷却。
3)将冷却后的胶体金溶液使用紫外分光光度计进行400-600nm紫外扫描，确定最大吸收峰波长，观察最大吸收峰的峰型和峰宽。该胶体金在520～530nm处有单一吸收峰。
b)胶体金标记抗新型冠状病毒N蛋白抗体的制备、纯化及浓缩：
1)取10ml胶体金溶液放入已加入搅拌子的50ml圆底烧瓶中，加入0.2M浓度的碳酸钾溶液20ul后放置在磁力搅拌器开始搅拌5分钟(转速以不产生气泡为准)，按终浓度5ug/ml的量缓慢滴加南京拂晓生物科技有限公司货号为Mo11504M-MY21M1509的抗新型冠状病毒N蛋白抗体(滴速以1毫克蛋白5分钟滴完为准)后，低速搅拌45分钟。
3)匀速加入BSA(40mM Tris配制的10％浓度的BSA)1000ul，继续搅拌15分钟后，4℃保存备用。
4)取标记好的胶体金液分装到2ml离心管中。以12000g离心10分钟，弃上清，以金液原体积1/5的量的洗涤液重悬沉淀，12000g离心10分钟，弃上清，以金液原体积1/10的量的洗涤液重悬沉淀。再以4℃保存备用。(洗涤液配方：0.01M Tris，1％BSA，1％Tween-20，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮，pH＝8.7)。
c)金标抗体的负载
将胶体金标记的抗新型冠状病毒N蛋白抗体使用上海金标生物划膜喷金仪HM3035按照8ul/cm用量、100mm/s速度喷点至结合垫表面，形成结合垫，转移结合垫至相对湿度低于30％的房间，放置1-2小时后收集结合垫。
2.4组装和切割
1)在底板上进行大板的组装，依次粘贴上样品垫、抗体划线包被后的硝酸纤维素膜，结合垫和吸水垫，其中，样品垫和结合垫重叠区域宽度为1.2mm，结合垫和硝酸纤维素膜重叠区域宽度为1.2mm，吸水垫和硝酸纤维素膜重叠区域宽度为2mm。
2)将组装后的大板在高速斩切机上切割为3mm宽的长条，即得到能检测包含Omicron突变株在内的所有新型冠状病毒毒株的试剂条(第一试剂条)(具体结构详见图1)。
实施例3能检测除Omicron突变株之外的所有新型冠状病毒毒株的试剂条(第二试剂条)的制备
3.1硝酸纤维素膜包被抗体
a)配置包被缓冲液：在80ml超纯水中依次加入0.15g磷酸氢二钠、0.04g磷酸二氢钠、0.8g氯化钠、0.02g氯化钾、5g蔗糖，搅拌均匀后调节pH＝7.5，并定容至100ml。
b)包被抗体稀释：使用上述包被缓冲液分别稀释南京拂晓生物科技有限公司货号为Mo11503M-MY21M1609的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体(武汉飞羿科技有限公司产品)至2.0mg/ml和1.0mg/ml。
c)划线包被：将金标生物划膜喷金仪HM3035划膜管路依次使用清洗液、纯水各清洗20次；将上述两种稀释后的包被抗体(货号Mo11503M-MY21M1609的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体)液分别吸入独立的两个划线管路，并排空管路中的空气；调整各划线笔位置使N抗原检测线与质控线两线间隔5mm，并且N抗原检测线距离NC膜下端4mm；在硝酸纤维素膜CN140表面划线包被上述两种抗体溶液，划线参数均为1ul/cm、100mm/s。
4)干燥处理：划线后的硝酸纤维素膜在30％相对湿度的房间干燥12小时；收集干燥后的硝酸纤维素膜在密闭铝箔袋中，并在袋中加入袋状干燥剂；
3.2样品垫和结合垫处理
a)配置处理溶液：样品垫处理液(pH＝8.7)0.01M Tris，1％BSA，1％Tween-20，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮；结合垫处理液(pH＝8.7)组分为0.01M Tris，1％BSA，1％Tween-20，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮，按照上述配方各配置1L处理液。
b)浸泡处理：将处理液倒入敞口容器内，放入2张玻璃纤维垫，稍微按压使溶液完全浸没垫子，每张浸泡约1-2h后取出放置到网架上在干燥间晾干12-16小时。按照上述方法分别进行样品垫和结合垫处理。
c)收集晾干后的样品垫和结合垫，在斩切机上分别将其切割为1.5cm、0.6cm宽的细条。
d)收集上步骤切割后的样品垫和结合垫至干燥密封袋中保存。
3.3胶体金标记与喷垫
a)胶体金溶液的制备：
该产品使用的胶体金是通过柠檬酸三钠还原法制备的，具体方法如下：
1)往250ml的圆底烧瓶中倒入99ml超纯水，再加入1ml浓度为1％的氯金酸(终浓度为0.01％)。圆底烧瓶放于油浴锅中，设置温度120℃，加热到完全沸腾。
2)迅速加入1.2ml浓度为1％的柠檬酸三钠后继续加热10min，观察溶液颜色由黄色变蓝再变红，最后变成稳定的红色后，停止加热，水浴搅拌冷却。
3)将冷却后的胶体金溶液使用紫外分光光度计进行400-600nm紫外扫描，确定最大吸收峰波长，观察最大吸收峰的峰型和峰宽。该胶体金在520～530nm处有单一吸收峰。
b)胶体金标记抗新型冠状病毒N蛋白抗体的制备、纯化及浓缩：
1)取10ml胶体金溶液放入已加入搅拌子的50ml圆底烧瓶中，加入0.2M浓度的碳酸钾溶液20ul后放置在磁力搅拌器开始搅拌5分钟(转速以不产生气泡为准)，按终浓度5ug/ml的量缓慢滴加H5单克隆抗体(滴速以1毫克蛋白5分钟滴完为准)后，低速搅拌45分钟。
3)匀速加入BSA(40mM Tris配制的10％浓度的BSA)1000ul，继续搅拌15分钟后，4℃保存备用。
4)取标记好的胶体金液分装到2ml离心管中。以12000g离心10分钟，弃上清，以金液原体积1/5的量的洗涤液重悬沉淀，12000g离心10分钟，弃上清，以金液原体积1/10的量的洗涤液重悬沉淀。再以4℃保存备用。(洗涤液配方：0.01M Tris，1％BSA，1％Tween-20，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮，pH＝8.7)。
c)金标抗体的负载
将胶体金标记的抗新型冠状病毒N蛋白抗体使用上海金标生物划膜喷金仪HM3035按照8ul/cm用量、100mm/s速度喷点至结合垫表面，形成结合垫，转移结合垫至相对湿度低于30％的房间，放置1-2小时后收集结合垫。
3.4组装和切割
1)在底板上进行大板的组装，依次粘贴上样品垫、抗体划线包被后的硝酸纤维素膜，结合垫和吸水垫，其中，样品垫和结合垫重叠区域宽度为1.2mm，结合垫和硝酸纤维素膜重叠区域宽度为1.2mm，吸水垫和硝酸纤维素膜重叠区域宽度为2mm。
2)将组装后的大板在高速斩切机上切割为3mm宽的长条，即得到能检测除Omicron突变株之外的所有新型冠状病毒毒株的试剂条(第二试剂条)，具体结构详见图1，其中，该试剂条包括样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜检测层3、质控线4、N抗原检测线、吸水垫6以及硬质聚氯乙烯背底板7。
实施例4：能鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒的组装
将实施例2与实施例3制备的两种试剂条同时装入卡盒内，即形成能鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒，其具体结果详细见图2，其中，1和2分别代表第一试剂条以及第二试剂条；T代表检测线；C代表质控线；O代表样品加样孔(对应试剂条的样品垫)。第一试剂条可检测所有种类的新型冠状病毒；第二试剂条可检测除Omicron突变株的新型冠状病毒。
实施例5：试剂盒的性能测试
1)对灭活新型冠状病毒培养物检测结果(灵敏度测试)
将灭活的多种新型冠状病毒培养物(新型冠状病毒原始毒株，编号B.1.1.7的阿尔法毒株，编号B.1.351的贝塔毒株，编号B.1.617.2的德尔塔毒株及编号B.1.1.529的奥密克戎毒株)用β-丙內酯灭活后，先稀释2000倍后再2倍梯度稀释，稀释后的样品当做常规标本进行检测，结果表明在上述五种新型冠状病毒浓度均为为2×103CFU/ml，本试剂盒内的第一试剂条仍可对其检出。第二试剂条则仅对编号B.1.1.529的奥密克戎毒株呈现阴性反应，而对其他新型冠状病毒毒株的灵敏度与第一试剂条一致。
2)特异性测试
为了验证本发明的鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒的特异性，将实施例4所述的试纸条对相关呼吸道常见病原体进行了检测，见表1。结果表明，本发明试剂盒内的两个试剂条对18株呼吸道常见病原微生物以及9种烈性病毒的检测结果均为阴性。该试剂盒显示出良好的特异性。
表1
菌株名称 检测结果 菌株名称 检测结果
人肺炎支原体ATCC 15531 阴性 化脓性链球菌BNCC 185918 阴性
铜绿假单胞菌ATCC 27853 阴性 金黄色葡萄球菌ATCC 25923 阴性
卡他莫拉菌ATCC 25240 阴性 人流感嗜血杆菌ATCC 49247 阴性
鲍曼不动杆菌ATCC 19606 阴性 肺炎克雷伯菌ATCC 700603 阴性
副流感嗜血杆菌ATCC 790 阴性 阴沟肠杆菌ATCC 13047 阴性
腺病毒ATCC VR-3 阴性 大肠埃希菌ATCC 25922 阴性
甲型流感病毒ATCC VR-1743 阴性 假丝酵母菌BNCC 186382 阴性
乙型流感病毒ATCC VR-790 阴性 呼吸道合胞病毒ATCC VR26 阴性
SARS-Cov病毒灭活抗原 阴性 MERS-Cov病毒抗原 阴性
流感H1N1 阴性 流感H3N3 阴性
流感BV 阴性 流感BY 阴性
脊髓灰质炎Ⅰ型 阴性 脊髓灰质炎Ⅱ型 阴性
脊髓灰质炎Ⅲ型 阴性 流行性乙型脑炎 阴性
EV71 阴性
实施例6：本实施例利用实施例4中的试剂条对分泌液样本进行检测以验证性能
1)样本采集
因新型冠状病毒具有较强的传染性，样本采集应由专业技术人员配备相应等级的防护装备条件下进行，采集过程可参考下列方法。
鼻咽拭子：拭子贴鼻孔进入后沿下鼻道底部缓缓深入，拭子到达鼻咽腔后壁时轻轻旋转一周后缓慢取出拭子
口咽拭子：被采集人员头部微扬，张开嘴巴，并发出“啊”音，暴露出两侧咽扁桃体，将拭子在两侧咽扁桃体反复擦拭3次以上，然后在咽后壁上下擦拭3次以上。
将采集的拭子放入到含有1ml样本提取液(配方：50mMTris，1％Triton-100，0.02Proclin300，PH＝8.2)的离心管中，拭子紧靠管壁反复旋转挤压10次左右，使标本最大程度释放。分别取混合有样本的提取液150ul加入到水平放置的试剂盒的两个加样孔中，样本通过样品垫后浸润结合垫上的胶体金标记物，并使其逐步释放，胶体金随着液态在毛细作用下在硝酸纤维素膜上层析，如果样本中存在新型冠状病毒，胶体金表面的相应抗体将识别并结合病毒表面蛋白，并在硝酸纤维素检测区被捕获抗体结合，在N蛋白检测线上出现胶体金条带。加样层析20min后进行检测结果判读：如果第一试剂条与第二试剂条同时显示为阳性，则表明该样品为非Omicron突变株的新型冠状病毒感染；如果第一试剂条为阳性，第二试剂条为阴性，则表明该样品为新型冠状病毒Omicron突变株感染；如果第一试剂条为阴性，第二试剂条为阴性，则表明未检测出新型冠状病毒；如果第一试剂条为阴性，第二试剂条为阳性，则表示结果可疑，需进一步检测分析。
2)和新型冠状病毒核酸检测结果对比
本发明试剂盒和国内华大基因新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)在130例阳性临床标本(其中δ株35例，Omicron突变株95例)上进行了对比，分析验证本试剂盒对新型冠状病毒的检测情况。结果表明，本试剂盒在Omicron突变株和非Omicron突变株的检测结果上对比核酸法灵敏度均为100％，特异性均为100％，说明本试剂盒性能满足新型冠状病毒分型快速筛选的需求。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (21)

1.一种鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒，其特征在于：所述鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒包括用于检测包含Omicron突变株在内的所有新型冠状病毒毒株的第一试剂条以及用于检测包含新型冠状病毒原始株及α，β，δ等突变株在内的所有非Omicron突变株的第二试剂条。
2.根据权利要求1所述的鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒，其特征在于：所述第一试剂条包括样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜检测层(3)、吸水垫(6)以及硬质聚氯乙烯背底板(7)；所述硝酸纤维素膜检测层(3)铺设在硬质聚氯乙烯背底板(7)上表面；所述硝酸纤维素膜检测层(3)靠近结合垫(2)的一端包被有能识别所有毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜检测层(3)靠近吸水垫(6)的一端包被有羊抗兔IgG抗体；所述结合垫(2)上喷点有胶体金标记的能识别所有毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体；所述样品垫(1)以及结合垫(2)自前而后依次相连并共同设置在硝酸纤维素膜检测层(3)的一端；所述吸水垫(6)设置在硝酸纤维素膜检测层(3)的另一端。
3.根据权利要求1所述的鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒，其特征在于：所述第二试剂条包括包括样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜检测层(3)、吸水垫(6)以及硬质聚氯乙烯背底板(7)；所述硝酸纤维素膜检测层(3)铺设在硬质聚氯乙烯背底板(7)上表面；所述硝酸纤维素膜检测层(3)靠近结合垫(2)的一端包被有能识别所有毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体；所述硝酸纤维素膜检测层(3)靠近吸水垫(6)的一端包被有羊抗鼠IgG抗体；所述结合垫(2)上喷点有胶体金标记的能识别除Omicron突变株之外的所有新型冠状病毒毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体；所述样品垫(1)以及结合垫(2)自前而后依次相连并共同设置在硝酸纤维素膜检测层(3)的一端；所述吸水垫(6)设置在硝酸纤维素膜检测层(3)的另一端。
4.一种用于制备如权利要求1-3任一项所述的鉴别新型冠状病毒Omicron突变株的抗原检测试剂盒的方法，其特征在于：所述方法包括第一试剂条的制备以及第二试剂条的制备。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述第一试剂条的制备具体实现方式是：硝酸纤维素膜检测层的制备、结合垫的制备以及吸水垫的制备；硝酸纤维素膜检测层靠近结合垫的一端包被有能识别所有毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体；硝酸纤维素膜检测层靠近吸水垫的一端包被有羊抗兔IgG抗体；结合垫上喷点有胶体金标记的能识别所有毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述第一试剂条的制备时，所述硝酸纤维素膜检测层的制备方法是：将能识别所有毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体使用划膜仪包被至膜表面，形成检测线T，同时使用划膜仪将羊抗兔IgG包被至膜表面形成质控C线。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述硝酸纤维素膜检测层上包被的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体；所述抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的使用浓度是0.1-3.0mg/ml，划线包被量为0.2-2.0ul/cm。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述硝酸纤维素膜检测层上包被的羊抗兔IgG的浓度是0.1-3.0mg/ml，划线包被量是0.2-2.0ul/cm。
9.根据权利要求4-8任一项所述的方法，其特征在于：所述结合垫的具体制备方法是：通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，基于得到的胶体金溶液制备胶体金标记的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，将制备得到的胶体金标记的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体通过生物划膜喷金仪喷点至经预处理的玻璃纤维垫表面，形成结合垫。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述玻璃纤维垫的预处理方式是：
1.1)配置结合垫处理液：所述结合垫处理液的含量及组分是0.01M Tris，1％BSA，1％Tween-20，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮；所述结合垫处理液的pH＝8.7；
1.2)浸泡处理：将玻璃纤维垫浸泡于结合垫处理液中，浸泡时间1-2h后在干燥间晾干12-16h；
1.3)收集晾干后的玻璃纤维垫，切割后在干燥密封环境中保存备用。
11.根据权利要10所述的方法，其特征在于：所述第一试剂条的制备还包括样品垫的制备，所述样品垫的具体制备方式是：
a)配置样品垫处理液：所述样品垫处理液的组分及含量是0.01M Tris，1％BSA，1％Tween-20，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮，所述样品垫处理液的pH＝8.7；
b)浸泡处理：将单张样品垫浸泡于结合垫处理液中，浸泡时间1-2h后在干燥间晾干12-16h；
c)收集晾干后的样品垫，切割后在干燥密封环境中保存备用。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述结合垫(2)的材质是玻璃纤维；所述样品垫的材质为玻璃纤维或者聚酯；所述吸水垫(6)是将普通吸水纸裁剪后即获得；所述硬质聚氯乙烯背底板(7)的材质为PVC。
13.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述第二试剂条的制备具体实现方式是：包括硝酸纤维素膜检测层的制备、结合垫的制备以及吸水垫的制备；硝酸纤维素膜检测层靠近结合垫的一端包被有能识别所有毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体；硝酸纤维素膜检测层靠近吸水垫的一端包被有羊抗鼠IgG抗体；结合垫上喷点有胶体金标记的能识别除Omicron突变株之外的所有新型冠状病毒毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述第二试剂条的制备时，所述硝酸纤维素膜检测层的制备方法是：将能识别所有毒株N蛋白的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体使用划膜仪包被至膜表面，形成检测线T，同时使用划膜仪将羊抗鼠IgG包被至膜表面形成质控C线。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于：所述硝酸纤维素膜检测层上包被的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体；所述抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的使用浓度是0.1-3.0mg/ml，划线包被量为0.2-2.0ul/cm。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：所述硝酸纤维素膜检测层上包被的羊抗鼠IgG的浓度是0.1-3.0mg/ml，划线包被量是0.2-2.0ul/cm。
17.根据权利要求13-16任一项所述的方法，其特征在于：所述结合垫的具体制备方法是：通过柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，基于制备得到的胶体金溶液制备胶体金标记的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，将制备得到的胶体金标记的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体通过生物划膜喷金仪喷点至经过预处理的玻璃纤维垫表面，形成结合垫。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于：所述抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体包含三个重链互补决定区和三个轻链互补决定区，所述三个重链互补决定区是CDR-VH1、CDR-VH2和CDR-VH3；所述三个轻链互补决定区是CDR-VL1、CDR-VL2和CDR-VL3；其中，CDR-VH1的氨基酸序列为GYTFTDYS；CDR-VH2的氨基酸序列为INTETGEA；CDR-VH3的氨基酸序列为TRSTATDD；CDR-VL1的氨基酸序列为QSVDYDGDSY；CDR-VL2的氨基酸序列为TAS；CDR-VL3的氨基酸序列为QQSNEDPLT。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于：所述玻璃纤维垫的预处理方式是：
1.1)配置结合垫处理液：所述结合垫处理液的含量及组分是0.01M Tris，1％BSA，1％Tween-20，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮；所述结合垫处理液的pH＝8.7；
1.2)浸泡处理：将玻璃纤维垫浸泡于结合垫处理液中，浸泡时间1-2h后在干燥间晾干12-16h；
1.3)收集晾干后的玻璃纤维垫，切割后在干燥密封环境中保存备用。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于：所述第二试剂条的制备还包括样品垫的制备，所述样品垫的具体制备方式是：
a)配置样品垫处理液：所述样品垫处理液的组分及含量是0.01M Tris，1％BSA，1％Tween-20，5％蔗糖，0.3％聚乙烯吡咯烷酮，所述样品垫处理液的pH＝8.7；
b)浸泡处理：将单张样品垫浸泡于样品垫处理液中，浸泡时间1-2h后在干燥间晾干12-16h；
c)收集晾干后的样品垫，切割后在干燥密封环境中保存备用。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于：所述结合垫(2)的材质是玻璃纤维；所述样品垫的材质为玻璃纤维或者聚酯；所述吸水垫(6)是将普通吸水纸裁剪后即获得；所述硬质聚氯乙烯背底板(7)材质为PVC。
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