CN117286206A - 枸杞糖基化多肽的酶酵耦合制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了枸杞糖基化多肽的酶酵耦合制备方法，属于枸杞精深加工技术领域。该制备方法包括以下步骤：前处理‑巴杀水提‑复合酶解（木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、果胶酶、酸性纤维素酶和中温α‑淀粉酶）‑粗过滤‑滤渣复提‑复合益生菌发酵（植物乳杆菌LHP710、戊糖乳杆菌P307、枯草芽孢杆菌M252、热带假丝酵母CICC31854和发酵毕赤酵母CICC33372）‑糖基化修饰‑分离过滤‑超滤膜分离‑喷雾干燥。本发明的有益之处在于：工艺简便易操作，不使用任何有机试剂，纯绿色无污染，制备成本较低；反应条件温和；可以显著提升枸杞糖基化多肽的提取率和纯度。

Description

枸杞糖基化多肽的酶酵耦合制备方法
技术领域
本发明涉及一种多肽的制备方法，具体涉及枸杞糖基化多肽的酶酵耦合制备方法，属于枸杞精深加工技术领域。
背景技术
枸杞属茄科，其味甘、性平，具有补肝肾、益精血和明目的功能。枸杞中含有枸杞多糖、蛋白质、类胡萝卜素、氨基酸、黄酮等多种成分，营养丰富。
枸杞中多糖约占46.5％，枸杞多糖由木糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖和阿拉伯糖组成，是枸杞主要的活性成分，具有抗菌、抗肿瘤、抗衰老、保肝护肝的功效；枸杞中蛋白约占14.7％，枸杞蛋白含18种氨基酸，其中8种为人体必需氨基酸，是良好的活性肽来源。枸杞多肽与枸杞蛋白相比，分子质量相对较小，更易于人体消化吸收，且不存在枸杞蛋白中的抗营养因子（植酸、单宁），具有促进肠道有益菌生长、抑制血管紧张素转化酶活力、抗氧化、降血压、抗炎等功效。
糖基化是蛋白质最重要的修饰手段之一，反应温和，不产生有害物质，通过美拉德反应实现糖与蛋白质共价连接，生成蛋白质-多糖结合物，从而改变蛋白构象、功能及稳定性和溶解度等状态。
目前关于糖基化蛋白大分子物质的研究有很多，但关于糖基化多肽小分子物质的研究却不多见。枸杞糖基化多肽是枸杞精深加工产物中降血糖、降血压、降脂、抗炎等的活性物质。现有的制备枸杞糖基化多肽的方法主要包括：
（1）向枸杞反应液中加入葡萄糖、半乳糖或木糖，引入大量羟基基团，使羟基充分发生交联。该方法会使接枝物结构复杂，难以精确控制；
（2）将枸杞蛋白与多糖混合成水分散体，随后冷冻干燥孵育5～7天。该方法反应时间较长，效率较低，冷冻干燥及反应条件不好控制；
（3）将枸杞蛋白与糖溶液在水或油溶液中高温加热，使枸杞蛋白与糖充分偶联，不需要冷冻干燥。该方法的工艺过程较难控制，且得到的接枝物结构比较复杂。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种无外源添加、反应温和、可以制备得到接枝度高且特性好的枸杞糖基化多肽的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
枸杞糖基化多肽的酶酵耦合制备方法，包括以下步骤：
（1）前处理：干枸杞浸泡，加水进入胶体磨研磨，得匀浆液；
（2）巴杀水提：将匀浆液转移至反应釜，加水，升温至85℃，间断性搅拌保持50min，得水提液；
（3）复合酶解：将反应釜中的水提液控温在50～60℃，按重量比1～3‰加入复配比例为1～2:1～2:1～3:1～2:1～2的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、果胶酶、酸性纤维素酶和中温α-淀粉酶，连续搅拌酶解2～4h，得酶解液；
（4）粗过滤：将酶解液过滤，得滤液、滤渣；
（5）滤渣复提：将步骤（4）所得滤渣转移至反应釜加水复提，得复提液；
（6）复合益生菌发酵：将步骤（4）所得滤液与步骤（5）所得复提液一起转移至发酵罐中合并混合，调节温度至25～35℃，按1～5‰接菌量接入复配比例为2:2:2:1:1的植物乳杆菌LHP710、戊糖乳杆菌P307、枯草芽孢杆菌M252、热带假丝酵母CICC31854和发酵毕赤酵母CICC33372连续发酵48～72h，得发酵液；
（7）糖基化修饰：将步骤（6）所得发酵液迅速加热升温至60～70℃，并连续搅拌2～4h进行反应，随后冷却至室温，得反应液；
（8）分离过滤：将步骤（7）所得反应液离心并过滤，得滤液；
（9）超滤膜分离：将步骤（8）所得滤液采用超滤膜分离，截流分子量为1～10kDa的纳滤陶瓷膜透过液；
（10）喷雾干燥：将步骤（9）所得透过液浓缩，添加麦芽糊精，喷雾干燥，即得枸杞糖基化多肽。
优选的，在步骤（1）中，使用温水浸泡枸杞；使用纯净水研磨枸杞。
优选的，在步骤（4）中，使用50目滤网过滤酶解液。
优选的，在步骤（5）中，复提水体温度为80～100℃，复提时间为1～3h，复提后用40～60目滤网过滤。
优选的，在步骤（6）中，复合益生菌发酵剂以5%无菌蔗糖水37℃活化培养30min后接种至发酵罐；在发酵过程中，每12h搅拌15～30min。
优选的，在步骤（7）中，使用流动水冷却。
优选的，在步骤（8）中，离心速率为4000r/min；使用80目滤网过滤。
优选的，在步骤（10）中，将透过液浓缩至可溶固形物含量为30～40%；按固液比30～50%添加麦芽糊精；喷雾塔进风温度为150～190℃，出风温度为85～100℃。
本发明的有益之处在于：
（1）本发明提供的制备方法工艺简便易操作，不使用任何有机试剂，纯绿色无污染，制备成本较低；
（2）本发明提供的制备方法利用了酶酵耦合，反应条件温和，制备得到的枸杞糖基化多肽既保留了枸杞中固有的活性功能（例如：枸杞多糖、枸杞多肽/蛋白、类胡萝卜素等），又增加了新的活性物质（例如：有机酸、胞外多糖、脂肪酸、黄酮等），同时还消除了枸杞致敏源（例如：单宁、植酸等），扩大了适用人群；
（3）本发明通过复合生物酶辅助湿热法，改变了枸杞蛋白的结构，使枸杞蛋白的糖基化位点暴露率提高，这样可以增加糖基化效率，从而显著提升了枸杞糖基化多肽的提取率（78%以上，最高可达到85%）和纯度（80%以上）；
（4）本发明通过复合益生菌发酵的方法，将枸杞提取液中大分子蛋白多糖等通过益生菌代谢进一步降解成小分子物质，易于人体吸收利用，并对单宁、植酸等致敏源进行降解，显著提升了枸杞糖基化多肽的营养价值、功能活性；
（5）采用本发明提供的方法制备得到的枸杞糖基化多肽呈黄棕色粉末状，复水时间短（30s左右），感官符合大众感官喜好（达到了“喜欢和接受”），水溶性好（水溶液澄清透明），作为抗氧化、降血压、降血糖的保健食品、特医食品及药品研发的潜在来源具有广泛应用前景。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、制备枸杞糖基化多肽
干枸杞为从市面上购买而来的宁夏红枸杞。
木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、果胶酶、酸性纤维素酶和中温α-淀粉酶均从市面上购买而来。
热带假丝酵母CICC31854、发酵毕赤酵母CICC33372和鼠李糖乳杆菌CICC6134均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
副干酪乳杆菌Bio-03644购于中国微生物菌种保藏中心。
植物乳杆菌LHP710取自中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M 2021675。
戊糖乳杆菌P307取自中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M 20221055。
枯草芽孢杆菌M252取自中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M 2020057。
实施例1
一种枸杞糖基化多肽的制备方法，采用酶酵耦合，包括以下步骤：
（1）前处理：干枸杞去杂质，温水浸泡，添加纯净水进入胶体磨研磨，得匀浆液；
（2）巴杀水提：将步骤（1）所得匀浆液转移至反应釜，加水调至35%（w/v）浓度，升温至85℃，间断性搅拌保持50min，进行巴氏杀菌与水提反应，得水提液；
（3）复合酶解：将反应釜中的水提液控温在55℃，按重量比2‰加入复配比例为2:1:3:1:1的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、果胶酶、酸性纤维素酶和中温α-淀粉酶，连续搅拌酶解3h，进行深度酶解，得酶解液；
（4）粗过滤：将步骤（3）所得酶解液用50目滤网过滤，得滤液、滤渣；
（5）滤渣复提：将步骤（4）所得滤渣转移至反应釜加水复提，复提水体温度为90℃，复提时间为2h，随后用50目滤网过滤，得复提液；
（6）复合益生菌发酵：将步骤（4）所得滤液与步骤（5）所得复提液一起转移至发酵罐中合并混合，调节温度至30℃，按3‰接菌量接入复配比例（菌体重量比例）为2:2:2:1:1的植物乳杆菌LHP710、戊糖乳杆菌P307、枯草芽孢杆菌M252、热带假丝酵母CICC31854和发酵毕赤酵母CICC33372，以5%无菌蔗糖水37℃活化培养30min接种至发酵罐，每12h搅拌20min，连续发酵60h，得发酵液；
（7）糖基化修饰：将步骤（6）所得发酵液迅速加热升温至60℃，并连续搅拌3h进行反应，随后使用流动水立即冷却至室温，完成枸杞多糖对枸杞多肽的糖基化修饰反应，同时终止发酵和灭酶活，得反应液；
（8）分离过滤：将步骤（7）所得反应液4000r/min离心10min，用80目滤网过滤，得滤液；
（9）超滤膜分离：将步骤（8）所得滤液采用超滤膜分离，截流分子量为1～10kDa的纳滤陶瓷膜透过液；
（10）喷雾干燥：将步骤（9）所得透过液浓缩至可溶固形物含量为35%，然后按固液比40%添加麦芽糊精，喷雾塔进风温度为170℃，出风温度为95℃，喷雾干燥，最终得到枸杞提取物——枸杞糖基化多肽，呈黄棕色粉末状。
本发明通过酶酵耦合来制备枸杞糖基化多肽，其中，复合生物酶制剂由木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、果胶酶、酸性纤维素酶和中温α-淀粉酶组成，复合益生菌发酵剂由植物乳杆菌LHP710、戊糖乳杆菌P307、枯草芽孢杆菌M252、热带假丝酵母CICC31854和发酵毕赤酵母CICC33372组成，该复合生物酶制剂和该复合益生菌发酵剂产生内在联动酶酵耦合反应，这种特定的协同配合联动反应能高效专一分解枸杞多糖与枸杞蛋白，使其小分子化，介于1～10kDa的枸杞糖基化多肽比例能够达到93.5%以上，更易于人体吸收利用，并且经益生菌发酵后转化释放产生更多活性成分（例如：有机酸、胞外多糖、脂肪酸、黄酮等）。此外，枸杞多肽被枸杞自身多糖进行糖基化修饰，提升了枸杞糖基化多肽综合营养功能。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于复合酶解方法不同，具体的：
将反应釜中的水提液控温在50℃，按重量比1‰加入复配比例为2:1:2:1:1的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、果胶酶、酸性纤维素酶和中温α-淀粉酶，连续搅拌酶解2h，进行深度酶解。
实施例3
本实施例与实施例1的区别仅在于复合酶解方法不同，具体的：
将反应釜中的水提液控温在60℃，按重量比3‰加入复配比例为1:2:1:2:2的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、果胶酶、酸性纤维素酶和中温α-淀粉酶，连续搅拌酶解4h，进行深度酶解。
实施例4
本实施例与实施例1的区别仅在于滤渣复提方法不同，具体的：
将步骤（4）所得滤渣转移至反应釜加水复提，复提水体温度为80℃，复提时间为1h，随后用40目滤网过滤，得复提液。
实施例5
本实施例与实施例1的区别仅在于滤渣复提方法不同，具体的：
将步骤（4）所得滤渣转移至反应釜加水复提，复提水体温度为100℃，复提时间为3h，随后用60目滤网过滤，得复提液。
实施例6
本实施例与实施例1的区别仅在于复合益生菌发酵方法不同，具体的：
将步骤（4）所得滤液与步骤（5）所得复提液一起转移至发酵罐中合并混合，调节温度至25℃，按1‰接菌量接入复配比例为2:2:2:1:1的植物乳杆菌LHP710、戊糖乳杆菌P307、枯草芽孢杆菌M252、热带假丝酵母CICC31854和发酵毕赤酵母CICC33372，以5%无菌蔗糖水37℃活化培养30min接种至发酵罐，每12h搅拌15min，连续发酵48h，得发酵液。
实施例7
本实施例与实施例1的区别仅在于复合益生菌发酵方法不同，具体的：
将步骤（4）所得滤液与步骤（5）所得复提液一起转移至发酵罐中合并混合，调节温度至35℃，按5‰接菌量接入复配比例为2:2:2:1:1的植物乳杆菌LHP710、戊糖乳杆菌P307、枯草芽孢杆菌M252、热带假丝酵母CICC31854和发酵毕赤酵母CICC33372，以5%无菌蔗糖水37℃活化培养30min接种至发酵罐，每12h搅拌30min，连续发酵72h，得发酵液。
实施例8
本实施例与实施例1的区别仅在于糖基化修饰方法不同，具体的：
将步骤（6）所得发酵液迅速加热升温至65℃，并连续搅拌2h进行反应，随后使用流动水立即冷却至室温，得反应液。
实施例9
本实施例与实施例1的区别仅在于糖基化修饰方法不同，具体的：
将步骤（6）所得发酵液迅速加热升温至70℃，并连续搅拌4h进行反应，随后使用流动水立即冷却至室温，得反应液。
实施例10
本实施例与实施例1的区别仅在于喷雾干燥方法不同，具体的：
将步骤（9）所得透过液浓缩至可溶固形物含量为30%，然后按固液比30%添加麦芽糊精，喷雾塔进风温度为150℃，出风温度为85℃，喷雾干燥最终得到枸杞糖基化多肽。
实施例11
本实施例与实施例1的区别仅在于喷雾干燥方法不同，具体的：
将步骤（9）所得透过液浓缩至可溶固形物含量为40%，然后按固液比50%添加麦芽糊精，喷雾塔进风温度为190℃，出风温度为100℃，喷雾干燥最终得到枸杞糖基化多肽。
对比例1
本对比例与实施例1的区别仅在于不进行复合酶解步骤，即将步骤（2）所得水提液直接转移至发酵罐中进行复合益生菌发酵。
对比例2
本对比例与实施例1的区别仅在于不进行复合益生菌发酵步骤，即将步骤（4）所得滤液与步骤（5）所得复提液一起转移至发酵罐中合并混合后直接进行糖基化修饰。
对比例3
本对比例与实施例1的区别仅在于不进行糖基化修饰步骤，即将步骤（6）所得发酵液直接进行分离过滤。
对比例4
本对比例与实施例1的区别仅在于不进行复合酶解步骤、不进行复合益生菌发酵步骤、不进行糖基化修饰步骤，即将步骤（2）所得水提液直接进行分离过滤。
对比例5
本对比例与实施例1的区别仅在于用酸性蛋白酶代替由木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、果胶酶、酸性纤维素酶和中温α-淀粉酶组成的复合酶进行生物酶解。
对比例6
本对比例与实施例1的区别仅在于用由鼠李糖乳杆菌CICC6134和副干酪乳杆菌Bio-03644组成的复合益生菌（鼠李糖乳杆菌CICC6134和副干酪乳杆菌Bio-03644的复配比例为1：1）代替由植物乳杆菌LHP710、戊糖乳杆菌P307、枯草芽孢杆菌M252、热带假丝酵母CICC31854和发酵毕赤酵母CICC33372组成的复合益生菌进行微生物发酵。
二、检测枸杞糖基化多肽的接枝度和纯度、计算枸杞糖基化多肽的提取率和得率
将各实施例和各对比例制备得到的枸杞糖基化多肽（粉末）分别溶解于纯净水中（经观察，复水时间大概在30s左右），得到浓度为50g/L的枸杞糖基化多肽溶液，溶液澄清透明，静置15min，取上清液用于检测。
1、接枝度
向邻苯二甲醛（OPA）中加入枸杞糖基化多肽上清液，35℃水浴锅中反应2min，于340nm处测定吸光度，以去离子水作空白对照计算接枝度，计算公式如下：
式中，DG为接枝度，A0为接枝前的吸光度，A1为接枝后的吸光度。
2、纯度
枸杞糖基化多肽的纯度以枸杞糖基化多肽中的多糖的纯度计，枸杞糖基化多肽中的多糖的纯度按照硫酸苯酚法进行检测。
3、提取率
枸杞糖基化多肽的提取率（以下简称提取率）按如下公式计算：
提取率＝（枸杞糖基化多肽中的多糖的纯度×枸杞糖基化多肽的质量）/（干枸杞中的多糖的纯度×干枸杞的质量）×100%
枸杞糖基化多肽中的多糖的纯度和干枸杞中的多糖的纯度均按照硫酸苯酚法进行检测。
4、得率
枸杞糖基化多肽的得率（以下简称得率）按如下公式计算：
得率=枸杞糖基化多肽的质量/干枸杞的质量×100%
枸杞糖基化多肽的接枝度、纯度、提取率及得率的检测结果见表1:
表1 枸杞糖基化多肽的接枝度、纯度、提取率及得率的检测结果
通过接枝度数据发现，各实施例的接枝度均保持在25%以上，这在多糖与蛋白或多肽共价连接中是较好的表现，表明多糖与蛋白或多肽发生共价连接效率较高，本发明制备得到的枸杞糖基化多肽不仅大大提高了枸杞多肽与枸杞多糖的可利用率，同时改善了枸杞多肽的功能性质。
通过提取率数据和纯度数据发现，采用酶酵耦合法制备得到的枸杞糖基化多肽（实施例1至实施例11）与未进行复合酶解和/或复合益生菌发酵制备得到的枸杞糖基化多肽（对比例1、对比例2、对比例4）相比，二者纯度接近，但前者的提取率显著高于后者，并且前者的提取率（78.4～85.7%）与纯度（78.2～82.4%）均保持在较高且稳定范围之内，由此可见，本发明提供的酶酵耦合制备方法在保证枸杞糖基化多肽提取率高的前提下，还能保证枸杞糖基化多肽纯度高。
通过得率数据发现，采用酶酵耦合法制备得到的枸杞糖基化多肽（实施例1至实施例11）的得率在60%以上，该得率属于较高水平（植物提取物得率一般为30%～50%），由此可见，本发明提供的酶酵耦合制备方法在保证枸杞糖基化多肽提取率高和纯度高的前提下，还能保证枸杞糖基化多肽的得率。
三、检测枸杞糖基化多肽的DPPH自由基清除率和ACE抑制率、对枸杞糖基化多肽进行感官评估
1、DPPH自由基清除率
1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）的醇溶液呈紫红色，加入具有不同抗氧化能力的溶液后，DPPH 的醇溶液的颜色会发生变化，可根据不同的吸光值来反映样品的抗氧化能力。
将枸杞糖基化多肽上清液加入到DPPH的甲醇溶液（0.025g/L）中，对照组使用蒸馏水，常温下于黑暗中震荡30min，在波长515nm处读取吸光值，测量前用0.025g/L DPPH甲醇溶液调零。
DPPH自由基清除率的计算公式如下：
DPPH 自由基清除率（%）=（Ac-As）/Ac×100%
式中，Ac为对照组吸光值，As为样品组吸光值。
2、ACE抑制率
N-[3-（2-呋喃酰基）丙烯酰]-苯氨酰-谷氨酰-谷氨酸（FAPGG）可以被丙酮（ACE）酶解成苯丙氨酸（FAP）和双甘氨肽（GG），可作为ACE模拟底物。
1mM FAPGG完全转化成FAP和GG的吸光值为0.758，可根据340nm吸光度的变化值计算ACE抑制率。具体的：在离心管内加入50μL ACE溶液和100μL 枸杞糖基化多肽液，37℃恒温水浴锅中反应1h，随后迅速加入200μL 1mol/L 盐酸溶液终止反应，以超纯水作为空白对照组，在340nm吸光度计算ACE抑制率。
3、感官评估
由11名成员组成评定小组对枸杞糖基化多肽进行感官评估，根据枸杞糖基化多肽及其水溶液颜色、气味、口味、质地和总体可接受性参数，对枸杞糖基化多肽做出依据感官嗜好的可接受性评价：“1”分表示极度不喜欢，完全不能接受；“5”分为临界值，表示既不喜欢也不讨厌；“9”分表示极度喜欢，完全能够接受。每组取感官评价平均分。
表2 DPPH自由基清除率、ACE抑制率及感官评价数据
由上表可知，采用酶酵耦合法制备得到的枸杞糖基化多肽（实施例1至实施例11）对DPPH自由基的清除率保持在80%以上，最高可达86.7%，表明本发明制备得到的枸杞糖基化多肽具有显著的清除DPPH自由基的能力。另外，采用酶酵耦合法制备得到的枸杞糖基化多肽（实施例1至实施例11）的ACE抑制率也普遍较高，基本保持在60%以上。与未进行糖基化修饰或未进行复合酶解和/或复合益生菌发酵制备得到的枸杞糖基化多肽（对比例1、对比例2、对比例3、对比例4）比较发现，各对比例的DPPH自由基清除率和ACE抑制率均显著低于各实施例，表明本发明制备得到的枸杞糖基化多肽具有较为显著的抗氧化和降血压作用。枸杞糖基化多肽及其水溶液的感官评价显示，各实施例和各对比例的感官平均分相差不大，对比例略低于实施例，各实施例感官均达到“喜欢和接受”，表明通过本发明酶酵耦合法制备得到的枸杞糖基化多肽其感官指标基本符合大众感官喜好，其接受度较高。
综上，采用本发明提供的酶酵耦合法制备得到的枸杞糖基化多肽具有显著的清除DPPH自由基的能力和显著的抑制ACE的能力，表明其具有较为显著的抗氧化作用和降血压作用，可以作为功能性产品使用。
需要说明的是，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明技术方案所引申出的显而易见变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.枸杞糖基化多肽的酶酵耦合制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）前处理：干枸杞浸泡，加水进入胶体磨研磨，得匀浆液；
（2）巴杀水提：将匀浆液转移至反应釜，加水，升温至85℃，间断性搅拌保持50min，得水提液；
（3）复合酶解：将反应釜中的水提液控温在50～60℃，按重量比1～3‰加入复配比例为1～2:1～2:1～3:1～2:1～2的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、果胶酶、酸性纤维素酶和中温α-淀粉酶，连续搅拌酶解2～4h，得酶解液；
（4）粗过滤：将酶解液过滤，得滤液、滤渣；
（5）滤渣复提：将步骤（4）所得滤渣转移至反应釜加水复提，得复提液；
（6）复合益生菌发酵：将步骤（4）所得滤液与步骤（5）所得复提液一起转移至发酵罐中合并混合，调节温度至25～35℃，按1～5‰接菌量接入复配比例为2:2:2:1:1的植物乳杆菌LHP710、戊糖乳杆菌P307、枯草芽孢杆菌M252、热带假丝酵母CICC31854和发酵毕赤酵母CICC33372，连续发酵48～72h，得发酵液；
（7）糖基化修饰：将步骤（6）所得发酵液迅速加热升温至60～70℃，并连续搅拌2～4h进行反应，随后冷却至室温，得反应液；
（8）分离过滤：将步骤（7）所得反应液离心并过滤，得滤液；
（9）超滤膜分离：将步骤（8）所得滤液采用超滤膜分离，截流分子量为1～10kDa的纳滤陶瓷膜透过液；
（10）喷雾干燥：将步骤（9）所得透过液浓缩，添加麦芽糊精，喷雾干燥，即得枸杞糖基化多肽。
2.根据权利要求1所述的枸杞糖基化多肽的酶酵耦合制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，使用温水浸泡枸杞；使用纯净水研磨枸杞。
3.根据权利要求1所述的枸杞糖基化多肽的酶酵耦合制备方法，其特征在于，在步骤（4）中，使用50目滤网过滤酶解液。
4.根据权利要求1所述的枸杞糖基化多肽的酶酵耦合制备方法，其特征在于，在步骤（5）中，复提水体温度为80～100℃，复提时间为1～3h，复提后用40～60目滤网过滤。
5.根据权利要求1所述的枸杞糖基化多肽的酶酵耦合制备方法，其特征在于，在步骤（6）中，复合益生菌发酵剂以5%无菌蔗糖水37℃活化培养30min后接种至发酵罐；在发酵过程中，每12h搅拌15～30min。
6.根据权利要求1所述的枸杞糖基化多肽的酶酵耦合制备方法，其特征在于，在步骤（7）中，使用流动水冷却。
7.根据权利要求1所述的枸杞糖基化多肽的酶酵耦合制备方法，其特征在于，在步骤（8）中，离心速率为4000r/min；使用80目滤网过滤。
8.根据权利要求1所述的枸杞糖基化多肽的酶酵耦合制备方法，其特征在于，在步骤（10）中，将透过液浓缩至可溶固形物含量为30～40%；按固液比30～50%添加麦芽糊精。
9.根据权利要求1所述的枸杞糖基化多肽的酶酵耦合制备方法，其特征在于，在步骤（10）中，喷雾塔进风温度为150～190℃，出风温度为85～100℃。
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