CN117264053A - 白介素-9的抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了特异性结合IL‑9的抗体，以及编码所述抗体的核酸、包含所述核酸的载体和包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。还公开了包含抗体的药物组合物，以及所述抗体和药物组合物的用途。

Description

白介素-9的抗体及其用途
发明领域
本公开涉及特异性结合IL-9抗体，以及这些抗体的用途，特别是它们在呼吸系统疾病、自身免疫病和血液系统癌症中的用途。
技术背景
白介素-9(IL-9)是一种28-30kDa的单体糖基化多肽，由激活的T细胞和肥大细胞表达，在许多抗原诱导的反应中起关键作用。IL-9通过白介素-9受体(IL-9R)发挥作用，可以刺激细胞增殖并防止细胞凋亡。IL-9R被激活后，通过不同的信号转导，激活不同的通路，如Janus激酶(JAK)信号通路及STAT蛋白(包括STAT1、STAT3和STAT5)，从而将IL-9与各种生物过程联系起来。IL-9可以影响许多效应细胞，如效应T细胞、B细胞、固有淋巴细胞、肥大细胞、多形核细胞、上皮细胞和平滑肌细胞，在炎症免疫调节中发挥重要作用。
IL-9在促进细胞和体液免疫应答中的关键作用，使其成为潜在的治疗干预的靶点。根据先前的报道，IL-9在呼吸系统疾病、自身免疫病和血液系统癌症的发生和发展中起到了重要作用，其机制可能与IL-9和其分泌细胞Th9的功能相关。
呼吸系统疾病可由多种病毒或细菌等病原体感染，及过敏等变态反应所致，自身免疫性疾病则是机体对自身抗体发生免疫反应而导致自身组织损害所引起，前者主要表现为肺部等呼吸道组织炎症，后者可出现全身关节、滑膜、软组织、结缔组织等多器官组织的非感染性炎症改变。该两类疾病在病原、发病机制和病理变化等多个环节存在着许多类同，在治疗途径和药物作用靶点等方面也具有相同之处。
自身免疫性疾病治疗亦非常困难，且需接受长期治疗。目前用于炎性病症的疗法包括症状药物治疗和免疫抑制剂。其中改善症状的治疗中具有止痛和抗炎作用的药物有非甾体类抗炎药(NSAID)。但是，NSAID不能改变疾病进展，且其常导致胃肠道副作用，影响下消化道，导致穿孔或加重炎性肠病并会产生肾毒性。皮质类固醇是另一类常用于控制炎症症状的药物。皮质类固醇与NSAID一样，不改变疾病的自然进展。因此，当停用药物时，活动性疾病的临床表现通常再现。而长期接受皮质类固醇治疗，患者会出现严重的不良反应，极大地限制了它的长期使用。免疫抑制剂也是常用的一种治疗选择。同样，长期使用免疫抑制剂会损害患者的免疫系统，进而使患者对感染无抵抗力。因此，需要寻找用于自身免疫性病症的可以长期应用的新疗法。
此外，在血液系统癌症例如霍奇金淋巴瘤中，IL-9被认为以旁分泌方式起作用，通过刺激和激活淋巴瘤中浸润的TH2型淋巴细胞，并与构成肿瘤的其他细胞如肥大细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞相互作用，促进了肿瘤的发展。
发明概述
本公开提供了特异性结合IL-9的抗体，以及编码所述抗体的核酸、包含所述核酸的载体和包含所述核酸或所述载体的宿主细胞。还公开了包含抗体的药物组合物，以及所述抗体和药物组合物的用途，特别是抗体用于预防或治疗呼吸系统疾病、自身免疫病和血液系统癌症中的用途。
相应地，在一个方面，本公开提供了特异性结合白介素-9(IL-9)的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中
(i)VH包含分别具有如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且VL包含分别具有如SEQ ID NO:5、氨基酸SAS和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
(ii)VH包含分别具有如SEQ ID NO:8-10所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且VL包含分别具有如SEQ ID NO:12、氨基酸AAT和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
(iii)VH包含分别具有如SEQ ID NO:15-17所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且VL包含分别具有如SEQ ID NO:19、氨基酸YAS和SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
(iv)VH包含分别具有如SEQ ID NO:22-24所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且VL包含分别具有如SEQ ID NO:12、氨基酸AAT和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，
(i)VH包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或
(ii)VH包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或
(iii)VH包含与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或
(iv)VH包含与SEQ ID NO:25具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，
(i)VH包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，并且VL包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；或
(ii)VH包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，并且VL包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；或
(iii)VH包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，并且VL包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；或
(iv)VH包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，并且VL包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，VH包含与选自SEQ ID NO:26-29中任一项所示氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且VL包含与选自SEQ ID NO:30-33中任一项所示氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，VH包含如SEQ ID NO:26-29中任一项所示的氨基酸序列，并且VL包含如SEQ ID NO:30-33中任一项所示的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，
(i)VH包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，且VL包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；或
(ii)VH包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，且VL包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；或
(iii)VH包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，且VL包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；或
(iv)VH包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，且所述VL包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，抗体可以选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。
在一些实施方案中，抗体可以选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体。
在一些实施方案中，抗原结合片段可以选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv和ds-scFv。
在一些实施方案中，抗体可以为双特异性抗体或多特异性抗体。
在另一方面，本公开提供了核酸，其包含编码本公开的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
在又一方面，本公开提供了载体，其包含编码本公开的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
在又一方面，本公开提供了宿主细胞，其包含本公开的核酸或本公开的载体。
在又一方面，本公开提供了药物组合物，其包含本公开的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，药物组合物进一步包含第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂可以选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂可以选自抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗血管发生剂、TNF-α拮抗剂、免疫调节剂、抗癌剂、肥大细胞调节剂、抗炎剂、抗组胺剂、以及常见中药活性成分及提取物，及其组合。
在另一方面，本公开提供了预防或治疗受试者中与IL-9异常表达相关的疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本公开的抗体或其抗原结合片段或本公开的药物组合物。
在又一方面，本公开提供了本公开的抗体或其抗原结合片段或本公开的药物组合物，其用于预防或治疗受试者中与IL-9异常表达相关的疾病。
在又一方面，本公开提供了本公开的抗体或其抗原结合片段或本公开的药物组合物在制备用于预防或治疗受试者中与IL-9异常表达相关的疾病的药物中的用途。
在本公开的上述方面的一些实施方案中，与IL-9异常表达相关的疾病可以为呼吸系统疾病。在一些实施方案中，呼吸系统疾病可以选自急性感染性肺炎、过敏性肺炎、支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病和肺组织纤维化。
在一些实施方案中，与IL-9异常表达相关的疾病可以为自身免疫病。在一些实施方案中，自身免疫病可以选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、混合性结缔组织病、过敏性鼻炎、变应性结膜炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、干燥综合征、银屑病关节炎、多发性硬化、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎和自身免疫性肾上腺功能不全。
在一些实施方案中，与IL-9异常表达相关的疾病可以为血液系统癌症，例如白血病、浆细胞恶性肿瘤或淋巴瘤。在一些实施方案中，血液系统癌症可以选自慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、意义未明的单克隆免疫球蛋白病(MGUS)、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
在本公开的上述方面的一些实施方案中，方法进一步包括向受试者施用第二治疗剂。在一些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段，或本公开的药物组合物用于与第二治疗剂组合施用。
在一些实施方案中，第二治疗剂可以选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。在一些实施方案中，第二治疗剂可以选自抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗血管发生剂、TNF-α拮抗剂、免疫调节剂、抗癌剂、肥大细胞调节剂、抗炎剂、抗组胺剂、以及常见中药活性成分及提取物，及其组合。
附图说明
可通过参考描述了利用本发明原理的示例性实施方案的以下详细描述和附图来获得对本发明的特征和优点的理解，在附图中：
图1显示了Fc-IL-9和IL-9-His重组蛋白的SDS-PAGE检测结果。其中泳道M为蛋白marker，泳道9为Fc-IL-9重组蛋白，泳道1为IL-9-His重组蛋白。
图2显示了制备CHO-S-IL-9膜型表达细胞株的FACS结果。NC(阴性对照)为PBS，对照细胞为CHO-S。
图3显示了纯化抗体的阻断活性流式检测结果。阳性对照为IL-9阳性抗体7F3com(参见专利CN1809383A)。
图4显示了pcDNA3.4-IgG1和pcDNA3.4-IgKc表达载体的结构示意图。
图5显示了嵌合抗体的阻断活性流式检测结果和EC50值。阳性对照为7F3com。
图6A-6B显示了人源化抗体的ELISA检测结果(图6A)和阻断活性流式检测结果(图6B)。ELISA检测中，对照为38-D8-C7-G9嵌合抗体(CA1)和7F3com；流式细胞术中，对照为38-D8-C7-G9嵌合抗体(CA1)。
图7A-7C显示了通过ForteBio(BLI)检测人源化抗体的亲和力的结果。图7A为38-D8-C7-G9嵌合抗体(CA1)，图7B为人源化VH1-VL2抗体，图7C为人源化VH1-VL4抗体。
图8A-8B显示了博莱霉素小鼠模型组和二氧化硅小鼠模型组的体重随时间的变化。
图9A-9B显示了博莱霉素小鼠模型组的HE染色和炎性评分结果(**＝P<0.01；***＝P<0.001)。
图10A-10B显示了博莱霉素小鼠模型组的Masson染色和纤维化评分结果(ns：不显著；*＝P<0.05；***＝P<0.001)。
图11A-11B显示了二氧化硅小鼠模型组的HE染色和炎性评分结果(*＝P<0.05；**＝P<0.01；***＝P<0.001)。
图12A-12B显示了二氧化硅小鼠模型组的Masson染色和纤维化评分结果(*＝P<0.05；***＝P<0.001)。
发明详述
本公开提供了具有IL-9高亲和力的抗体或其抗原结合片段，可以用于治疗患有与IL-9表达和/或活性相关的呼吸系统疾病(如急性感染性肺炎、过敏性肺炎、支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病，以及多种原因所致的肺组织纤维化、特发性肺纤维化等)、自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、混合性结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、干燥综合征、银屑病关节炎、多发性硬化、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎、自身免疫性肾上腺功能不全等)和血液系统癌症(如白血病(例如慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病)、浆细胞恶性肿瘤(例如多发性骨髓瘤、意义未明的单克隆免疫球蛋白病(MGUS))或淋巴瘤(例如非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤))。
本文描述的任何方面或实施方案可以与本文公开的任何其他方面或实施方案组合。虽然已经结合本公开的详细描述描述了本公开，但是前面的描述旨在说明而不是限制本公开的范围，本公开的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。本文提及的专利和科学文献建立了本领域技术人员可获得的知识。本文引用的所有中国专利和公开或未公开的中国专利申请通过引用并入本文。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请在此通过引用并入本文。本文引用的所有其他公开的参考文献、词典、文件、手稿和科学文献在此通过引用并入本文。从包括实施方案和权利要求的以下详细描述中，本公开的其他特征和优点将是显而易见的。
为了更容易理解本公开，首先在下面定义某些术语。在整个说明书中阐述了对以下术语和其他术语的附加定义。
除非另有限定，否则本文所使用的全部技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同。
应当注意，如本文中及所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。因此，术语“一个”、“一种”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”可以互换使用。类似地，术语“包含”、“包括”、“含有”和“具有”可以互换使用。
在本文中及所附权利要求书中使用术语“包含”、“包括”、“含有”和“具有”时，其不排除其他元素。为了本发明的目的，术语“由……组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。
本公开提供了特异性结合白介素-9(IL-9)的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中
(i)VH包含分别具有如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且VL包含分别具有如SEQ ID NO:5、氨基酸SAS和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
(ii)VH包含分别具有如SEQ ID NO:8-10所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且VL包含分别具有如SEQ ID NO:12、氨基酸AAT和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
(iii)VH包含分别具有如SEQ ID NO:15-17所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且VL包含分别具有如SEQ ID NO:19、氨基酸YAS和SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
(iv)VH包含分别具有如SEQ ID NO:22-24所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且VL包含分别具有如SEQ ID NO:12、氨基酸AAT和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
如本公开所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其具有特异性结合特定抗原的能力。抗体通常在每条重链和轻链中包含可变区和恒定区。抗体重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(如效应细胞)和补体系统的组分。因此，大多数抗体具有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，它们共同形成与抗原结合的抗体部分。
“重链可变区”(VH)或“轻链可变区”(VL)由间插三个“互补决定区”或“CDR”的“框架”(FR)区组成。框架区用于调整CDR，以用于特异性结合抗原表位。CDR包含抗体中主要负责抗原结合的氨基酸残基。从氨基末端到羧基末端，VH和VL结构域都包含以下FR区和CDR区：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。VH结构域的CDR 1、2和3在本文中也分别称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；VL结构域的CDR 1、2和3在本文中也分别称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
每个VH和VL结构域的氨基酸分配按照CDR的任何常规定义。常规定义包括Kabat定义(Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutesof Health,Bethesda,MD,1987和1991))；Chothia定义(Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917,1987；Chothia等人,Nature 342：878-883,1989)；Chothia和Kabat CDR的复合；Oxford Molecular的抗体建模软件所使用的AbM定义；以及Martin等人的CONTACT定义(www.bioinfo.org.uk/abs)。Kabat提供了广泛使用的编号惯例(Kabat编号系统)，其中不同重链之间或不同轻链之间的对应残基被赋予相同的编号。本公开可以使用根据这些编号系统中的任一种定义的CDR。在一些实施方案中，使用Kabat定义的CDR。在一些实施方案中，使用Chothia定义的CDR。在一些实施方案中，使用Chothia定义的CDR。在一些实施方案中，使用Chothia和Kabat复合定义的CDR。在一些实施方案中，使用AbM定义的CDR。在一些实施方案中，使用CONTACT定义的CDR。
如本公开所用，术语“结合”或“特异性结合”是指两种分子之间的非随机结合反应，例如在抗体和其靶抗原之间的非随机结合反应。抗体的结合特异性可以基于亲和力和/或亲合力来确定。亲和力通常由抗原与抗体解离的平衡常数(KD)表示，是抗原决定簇和抗体的抗原结合位点之间的结合强度的量度：KD值越小，抗原决定簇和抗体之间的结合强度越强。或者，亲和力也可以表示为亲和力常数(KA)，其为1/KD。KD可以从Koff/Kon的商数计算得到，KA可以从Kon/Koff的商数计算得到。Kon指例如抗体与抗原的结合速率常数，而Koff指例如抗体与抗原的解离速率常数。Kon和Koff可以通过本领域的普通技术人员已知的技术(诸如或KinExA)测定。
通常，抗体将以10-5至10-12M或更小的解离常数(KD)结合，优选以10-7至10-12M或更小，更优选以10-8至10-12M的解离常数(KD)结合，和/或以至少107M-1，优选至少108M-1，更优选至少109M-1，例如至少1012M-1的结合亲和力结合。通常认为任何大于10-4M的KD值代表非特异性结合。抗体与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以通过本身已知的任何合适的方式测定，包括例如斯卡查德分析和/或竞争性结合测定，如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和三明治竞争测定和本领域中本身已知的不同变型。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，
(i)VH包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或
(ii)VH包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或
(iii)VH包含与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或
(iv)VH包含与SEQ ID NO:25具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且VL包含与SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在本公开的抗体或其抗原结合片段的一些实施方案中，VH包含与选自SEQ ID NO:26-29中任一项所示氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且VL包含与选自SEQ ID NO:30-33中任一项所示氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，
(i)VH包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，且VL包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；
(ii)VH包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，且VL包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；或
(iii)VH包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，且VL包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；或
(iv)VH包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，且VL包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
如本文所用，“序列同一性”是指任何给定的查询序列和主题序列之间的同一性程度。本领域的技术人员将容易理解如何确定两个多肽(例如未经修饰的肽和肽变体)的同一性。例如，可以在对齐两条序列使它们的同一性达到最高水平之后再计算同一性，例如可以引入空位。计算同一性的另一个方法可以通过公开的算法实施。此类数学算法的非限制性实例包括Myers和Miller(1988)CABIOS 4:11-17的算法、Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的同源性比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的用于搜索同源性的方法和Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264的算法的修改形式，记载于Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877的算法。通过使用基于此类数学算法的程序，可以实施用于测定序列同一性的序列比较(即比对)。程序可以由计算机适当执行。此类程序的实例包括但不限于PC/Gene程序的CLUSTAL、ALIGN程序(2.0版本)和Wisconsin遗传学软件包的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。可以例如通过使用初始参数实施使用这些程序的比对。
此外，在确定两条氨基酸序列之间的序列同一性的程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守性”氨基酸取代，其通常可以描述为氨基酸残基被替换为具有类似化学结构的另一种氨基酸残基的氨基酸取代，其对多肽的功能、活性或其他生物学性质几乎没有影响或基本上没有影响。这种保守性氨基酸取代在本领域中是众所周知的。
这种保守性取代优选地是以下组(a)到(e)中的一个氨基酸被同组中的另一个氨基酸残基取代的取代：(a)小的脂肪族、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性、带负电的残基及其(不带电的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性、带正电的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、He、Val和Cys；以及(e)芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。
特别优选的保守性取代如下：Ala到Gly或到Ser；Arg到Lys；Asn到Gln或到His；Asp到Glu；Cys到Ser；Gln到Asn；Glu到Asp；Gly到Ala或到Pro；His到Asn或到Gln；Ile到Leu或到Val；Leu到Ile或到Val；Lys到Arg、到Gln或到Glu；Met到Leu、到Tyr或到Ile；Phe到Met、到Leu或到Tyr；Ser到Thr；Thr到Ser；Trp到Tyr；Tyr到Trp；和/或Phe到Val、到Ile或到Leu。
在一些实施方案中，本公开的抗体及其抗原结合片段包括变体，变体可以包含一种或多种氨基酸修饰。在单个变体中可以包含取代、缺失、插入、添加或其任何组合，只要变体可以特异性结合抗原。制备变体的方法和技术是本领域技术人员公知的。
在一些实施方案中，抗体可以选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。在一些实施方案中，抗体可以选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体。在一些实施方案中，抗原结合片段可以选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv和ds-scFv。在一些实施方案中，抗体可以为双特异性抗体或多特异性抗体。
本公开所用的术语“抗体”应以其最广泛的意义来理解，并且包括单克隆抗体(包含全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体片段和包含至少两个抗原结合区的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)。抗体可含有另外的修饰，例如非天然存在的氨基酸、Fc区中的突变、以及糖基化位点的突变。抗体还包括翻译后修饰的抗体、含有抗体的抗原决定簇的融合蛋白以及含有对抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要这些抗体表现出预期的生物活性即可。
在一些实施方案中，抗体包括嵌合抗体，如鼠源性抗体的人源化形式。此类人源化抗体可以通过已知技术制备，并且在将抗体施用于人时提供降低免疫原性的优点。在一个实施方案中，人源化抗体包含鼠源性抗体的可变区(或仅其抗原结合位点)和衍生自人抗体的恒定区。替代地，人源化抗体片段可以包含鼠源性抗体的抗原结合位点和衍生自人抗体的可变区片段(缺乏抗原结合位点)。用于产生嵌合抗体和进一步经工程化改造的抗体的程序包括描述在以下中的那些程序：Riechmann等人，(Nature 332:323,1988)；Liu等人，(PNAS 84:3439,1987)；Larrick等人，(Bio/Technology 7:934,1989)；以及Winter和Harris(TIPS 14:139,May,1993)。用于转基因生成抗体的程序可以见于GB 2,272,440、美国专利号5,569,825和5,545,806。
可以使用通过基因工程方法产生的抗体(如嵌合和人源化抗体)，其包含人和非人部分二者，可以使用标准重组DNA技术来制造。可以使用本领域已知的标准DNA技术，通过基因工程来产生此类嵌合和人源化抗体。
如本公开所用，术语抗体的“抗原结合片段”是指保持特异性结合抗原(例如IL-9)能力的一种或多种抗体片段。已经表明，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。抗原结合片段的实例包括(i)Fab片段，其为由VH、VL、CH1和CL结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其为二价片段，包含通过铰链区二硫键连接的两个Fab片段；(iii)Fab'片段，其基本上是Fab，但具有部分铰链区(参见，FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY(Paul ed.,3.sup.rd ed.1993))；(iv)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(v)Fd'片段，其具有VH和CH1结构域以及位于CH1结构域的C端的一个或多个半胱氨酸残基；(vi)Fv片段，其由抗体单臂的VH和VL结构域组成；(vii)dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341：544-546)，其由VH结构域组成；(viii)单独的互补决定区(CDR)；和(ix)纳米抗体，其为包含单个可变域和两个恒定域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域VH和VL通过独立的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头连接，该合成接头能够使它们形成单个蛋白质链，在该蛋白质链中，VH和VL区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人(1988)Science242,423-426；以及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,5879-5883)。此类单链抗体也意在包含在术语抗体的“抗原结合片段”内。此外，该术语还包括含有一对串联Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，其与互补的轻链多肽以及保留抗原结合活性的任何前述片段的修饰版本共同形成抗原结合区。
这些抗原结合片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式筛选片段的效用。
在一方面，本公开提供了核酸，其包含编码本公开的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
术语“核酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”可互换使用，是指基本上由核苷酸(如脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸)组成的任何长度的寡聚物和聚合物。核酸可以包含嘌呤和/或嘧啶碱基和/或其他天然(例如黄嘌呤、肌苷、次黄嘌呤)，化学或生物化学修饰(例如甲基化)，非天然或衍生的核苷酸碱基。核酸的骨架可以包含通常存在于RNA或DNA中的糖和磷酸基团，和/或一种或多种经修饰或取代的糖和/或一种或多种经修饰或取代的磷酸基团。可以引入磷酸基团或糖的修饰以改善稳定性、对酶促降解的抗性，或一些其他有用的特性。“核酸”可以是例如双链的，部分双链的或单链的。当是单链时，核酸可以是有义链或反义链。“核酸”可以是环形或线形的。如本文所用，术语“核酸”涵盖DNA和RNA，包括基因组、pre-mRNA、mRNA、cDNA、包含载体的重组或合成核酸。出于本文所述用途的目的，应理解，可以通过本领域可用的任何方法修饰多核苷酸。
本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。另外，应当理解，技术人员可以使用常规技术进行不影响本文所述多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代，以反映要在其中表达多肽的任何具体宿主生物体的密码子使用。
在又一方面，本公开提供了包含本公开的核酸的载体。
本文所用“载体”是指可以将核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。而当载体能使插入的核苷酸编码的蛋白获得表达时，该载体称为表达载体。载体可以通过转化、转导或者转染等方法导入宿主细胞，继而使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内获得表达。载体是本领域技术人员公认的、包括但不限于：(1)质粒；(2)噬菌粒；(3)柯斯质粒；(4)人工染色体，如酵母人工染色体、细菌人工染色体或P1来源的人工染色体；(5)噬菌体，如λ噬菌体或M13噬菌体；及(6)动物病毒，如逆转录酶病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、孢疹病毒、痘病毒、杆状病毒。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不局限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因；此外，载体还可以含有复制起始位点。
重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体。合适的载体包括被设计用于繁殖和扩增或用于表达或两者的载体，例如质粒和病毒。例如，载体可以选自pUC系列(Fermentas Life Sciences,Glen Burnie,Md.)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,CA)、pET系列(Novagen,Madison,Wis.)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)和pEX系列(Clontech，Palo Alto，Calif.)。也可以使用噬菌体载体，例如λGT10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。可用于本公开的植物表达载体的实例包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。可用于本公开的动物表达载体的实例包括pcDNA、pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。
在另一方面，本公开提供了包含本公开的核酸或本公开的载体的宿主细胞。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指已引入表达载体的细胞。任何细胞都可以用作本公开的核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，细胞可以是原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞如哺乳动物细胞。合适的原核细胞包括但不限于真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobactehaceae)，例如埃希氏杆菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E.coli)；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)；和志贺氏菌属(Shigella)；芽孢杆菌属(Bacilli)，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；假单胞菌(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；和链霉菌(Streptomyces)。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，宿主细胞包括例如CHO细胞，例如CHO-S细胞和CHO-K1细胞，或HEK293细胞，例如HEK293A、HEK293T和HEK293FS。
在又一方面，本公开提供了药物组合物，其包含本公开的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
术语“药学上可接受”是指载体或佐剂与组合物的其他成分相容并且对其接受者没有大量毒害，和/或这些载体或佐剂被批准或可用于包含在对人类肠胃外给药的药物组合物中。
在一些实施方案中，与本公开的组合物一起使用的载体或赋形剂包括但不限于马来酸、酒石酸、乳酸、柠檬酸、乙酸、碳酸氢钠、磷酸钠、组氨酸、甘氨酸、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化锌、水、右旋糖、N-甲基吡咯烷酮、二甲亚砜、N,N-二甲基乙酰胺、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、二甘醇单乙醚和表面活性剂聚氧乙烯-脱水山梨糖醇单油酸酯。
在本公开的药物组合物的一些实施方案中，药物组合物进一步包含第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂可以选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。
在一些实施方案中，第二治疗剂可以选自抗病毒剂(如奇多夫定、阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、疱疹净、三氟尿苷和病毒唑、磷卡萘替、金刚烷胺、金刚乙胺、噻奎努氟、茚地那韦(indinavir)、利托那韦(ritonavir)、α干扰素等)、抗细菌剂(如青霉素、头孢菌素、亚胺培南、axtreonam、万古霉素、环丝氨酸、杆菌肽、氯霉素、红霉素、氯林可霉素、四环素、链霉素、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素、壮观霉素、甲氧苄啶、诺氟沙星、利福平、多粘菌素、两性霉素B、制霉菌素、酮康唑、异烟肼、灭滴灵和戊烷脒)、抗真菌剂(如吡咯类药物、咪唑、三唑类、依他康唑、多烯、两性霉素B类、氟康唑、氟胞嘧啶、酮康唑、醋酸卡泊芬净(caspofungin acetate)、伏立康唑(voriconazole)等)、抗血管发生剂、TNF-α拮抗剂、免疫调节剂(如甲氨蝶呤、来氟米特、环磷酰胺、环磷氮芥、Immuran、环孢菌素A、二甲胺四环素、硫唑嘌呤等)、抗癌剂(不限于肽、多肽、融合蛋白、核酸分子、小分子、模拟剂、合成药物、无机分子和有机分子)、肥大细胞调节剂、和抗炎剂(如肾上腺皮质激素、皮质类固醇(如倍氟米松、布地缩松、9-去氟肤轻松、氟地松、去炎松、甲基强的松龙、强的松龙、强的松、氢化可的松)、糖皮质激素、甾体类、非甾体类抗炎药(如阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸钠、COX-2抑制剂)、和白三烯拮抗剂(如孟鲁斯特、甲基黄嘌呤、扎鲁斯特和zyleuton)、β2激动剂(如舒喘灵、biterol、酚丙喘宁、isoetharie、异丙喘宁、吡布特罗、沙丁胺醇、特布他林福莫特罗、沙美特罗和沙丁胺醇特布他林))、Vitaxin,siplizumab,抗组胺剂(如苯海拉明、氯苯苄咯、去敏灵、溴苯吡胺、氯苯吡胺、吡咯吡胺、异丙嗪、羟嗪、阿斯咪唑、阿扎他定、西替立嗪、赛庚啶、氯雷他定、非索非那定(fexofenadine))、抗EphA2抗体、以及常见中药活性成分及提取物(如抗炎、抗癌活性小分子、多糖类提取物(如人参多糖、石斛多糖、茯苓多糖、灵芝多糖、虫草多糖、枸杞多糖、银耳多糖等))及其任意组合。
在另一方面，本公开提供了预防或治疗受试者的疾病，例如与IL-9异常表达相关的疾病的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本公开的抗体或其抗原结合片段或本公开的药物组合物。在又一方面，本公开提供了本公开的抗体或其抗原结合片段或本公开的药物组合物在制备用于预防或治疗受试者的疾病，例如与IL-9异常表达相关的疾病的药物中的用途。
如本文所用，“预防”意指将治疗有效量的本公开的抗体或其抗原结合片段、药物组合物施用于受试者以便保护受试者免于发生与IL-9异常表达相关的疾病。当本文使用的术语“预防”与对给定病况的给定治疗有关(例如预防与IL-9异常表达相关的疾病)时，意在表达治疗的受试者根本不发展临床上可观察的病况水平，或与不存在治疗的受试者相比发展更缓慢和/或至较轻的程度。这些术语不仅限于其中受试者不经历任何病况方面的情况。例如，如果在患者暴露于预期产生给定病况表现的刺激期间给予治疗，并且该治疗导致受试者与不给予时的预期相比经历较少和/或更温和的病况症状，那么可以认为治疗已预防病况。
如本文所用，“治疗”是指获得有益或期望的结果(包括临床结果)的方法。出于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下的一项或多项：减轻由疾病引起的一种或多种症状、降低疾病的程度、稳定疾病(例如，防止或延迟疾病的恶化)、防止或延迟疾病的传播、防止或延迟疾病的复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、提供疾病的缓解(部分或完全)、减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延缓疾病的进展、提高或改善生活质量、体重增加和/或延长生存期。本发明的方法设想了治疗的这些方面中的任一个或多个方面。
在某些实施方案中，治疗可以在已经出现一种或多种症状之后给予。在其他实施方案中，治疗可以在没有症状的情况下给予。例如，治疗可以在症状发作之前给予易感个体，或者可以用另一种损伤剂进行治疗(例如，根据症状史，根据遗传或其他易感因素、疾病疗法或它们的任何组合)。还可以在症状已经消退之后继续治疗，例如，以预防或延迟它们的复发。
如本文所用，“施用”是指将抗体或组合物引入到受试者中，并且包括并行或顺序引入抗体或组合物。“施用”可以指例如治疗、药代动力学、诊断、研究、安慰剂和实验方法。“施用”还涵盖体外和离体治疗。通过任何合适的途径将组合物或药剂引入到受试者中，用于施用本公开的抗体或组合物的合适方法的实例包括口服、皮内、皮下、肌肉内、骨内、腹膜内和静脉内注射，以及全身施用或局部施用至靶位点附近，但不限于此。施用包括自我施用和他人施用。可以通过任何合适的途径进行施用。合适的施用途径允许组合物或药剂进行其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内，则通过将抗体或组合物引入到受试者的静脉中来施用组合物。
在本公开的某些实施方案中，本公开的抗体或组合物与用于施用的装置包装在一起或储存在用于施用的装置中。用于可注射制剂的装置包括但不限于注射口，自动注射器，注射泵和注射笔。用于雾化或粉末制剂的装置包括但不限于吸入器，吹入器，抽吸器等。因此，本公开包括包含本公开的抗体或组合物的施用装置，用于治疗或预防本文所述的一种或多种病症。
预期所施用的“受试者”包括但不限于人(即任何年龄组的男性或女性，例如儿童受试者(例如婴儿、少儿、青少年)或成人受试者(例如青年、中年人、或老年人))和/或其他非人动物，例如哺乳动物(例如灵长类)。
在本公开的方法或用途的一些实施方案中，疾病可以为呼吸系统疾病、自身免疫病或血液系统癌症(例如白血病、浆细胞恶性肿瘤或淋巴瘤)。在一些实施方案中，疾病可以选自急性感染性肺炎、过敏性肺炎、支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺组织纤维化(例如多种原因所致的肺组织纤维化、特发性肺纤维化)、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、混合性结缔组织病、过敏性鼻炎、变应性结膜炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、干燥综合征、银屑病关节炎、多发性硬化、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎、自身免疫性肾上腺功能不全、慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、意义未明的单克隆免疫球蛋白病(MGUS)、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
在本公开的方法或用途的一些实施方案中，预防或治疗受试者的疾病进一步包括向受试者施用第二治疗剂。
在一些实施方案中，第二治疗剂可以选自抗病毒剂(如奇多夫定、阿昔洛韦、更昔洛韦、阿糖腺苷、疱疹净、三氟尿苷和病毒唑、磷卡萘替、金刚烷胺、金刚乙胺、噻奎努氟、茚地那韦(indinavir)、利托那韦(ritonavir)、α干扰素等)、抗细菌剂(如青霉素、头孢菌素、亚胺培南、axtreonam、万古霉素、环丝氨酸、杆菌肽、氯霉素、红霉素、氯林可霉素、四环素、链霉素、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、卡那霉素、新霉素、壮观霉素、甲氧苄啶、诺氟沙星、利福平、多粘菌素、两性霉素B、制霉菌素、酮康唑、异烟肼、灭滴灵和戊烷脒)、抗真菌剂(如吡咯类药物、咪唑、三唑类、依他康唑、多烯、两性霉素B类、氟康唑、氟胞嘧啶、酮康唑、醋酸卡泊芬净(caspofungin acetate)、伏立康唑(voriconazole)等)、抗血管发生剂、TNF-α拮抗剂、免疫调节剂(如甲氨蝶呤、来氟米特、环磷酰胺、环磷氮芥、Immuran、环孢菌素A、二甲胺四环素、硫唑嘌呤等)、抗癌剂(不限于肽、多肽、融合蛋白、核酸分子、小分子、模拟剂、合成药物、无机分子和有机分子)、肥大细胞调节剂、和抗炎剂(如肾上腺皮质激素、皮质类固醇(如倍氟米松、布地缩松、9-去氟肤轻松、氟地松、去炎松、甲基强的松龙、强的松龙、强的松、氢化可的松)、糖皮质激素、甾体类、非甾体类抗炎药(如阿司匹林、布洛芬、双氯芬酸钠、COX-2抑制剂)、和白三烯拮抗剂(如孟鲁斯特、甲基黄嘌呤、扎鲁斯特和zyleuton)、β2激动剂(如舒喘灵、biterol、酚丙喘宁、isoetharie、异丙喘宁、吡布特罗、沙丁胺醇、特布他林福莫特罗、沙美特罗和沙丁胺醇特布他林))、Vitaxin,siplizumab,抗组胺剂(如苯海拉明、氯苯苄咯、去敏灵、溴苯吡胺、氯苯吡胺、吡咯吡胺、异丙嗪、羟嗪、阿斯咪唑、阿扎他定、西替立嗪、赛庚啶、氯雷他定、非索非那定(fexofenadine))、抗EphA2抗体、以及常见中药活性成分及提取物(如抗炎、抗癌活性小分子、多糖类提取物(如人参多糖、石斛多糖、茯苓多糖、灵芝多糖、虫草多糖、枸杞多糖、银耳多糖等))及其任意组合。
实施例
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
实施例1：纯化抗体的制备及检测
1.Fc-IL-9和IL-9-His重组蛋白制备
合成IL-9片段(Glu19-Ile144)的编码序列，分别在N端和/或C端添加Fc和His标签，将其亚克隆至真核表达载体pcDNA3.4-His和pLVX-puro中，构建抗原表达载体。得到的载体分别命名为pcDNA3.4-IL9(19-144)-His(P15248)和pLVX-Fc2-IL9(19-144)-Puro。通过瞬时转染293F细胞获得用于免疫和抗体筛选的重组蛋白。
对经纯化的Fc-IL-9和IL-9-His重组蛋白进行SDS-PAGE检测。SDS-PAGE检测结果(图1)显示，Fc-IL-9重组蛋白大小约为40kD，IL-9-His重组蛋白大小约为30kD，Fc-IL-9和IL-9-His重组蛋白的纯度大于80％，可以用于免疫和效价的检测。
2.CHO-S-IL-9膜型表达细胞株制备
将经密码子优化的IL-9序列基因合成后亚克隆至慢病毒表达载体Lenti-CMV-puro以制备目的基因过表达慢病毒载体。使用构建的过表达慢病毒载体制备慢病毒，感染CHO-S细胞并筛选稳定细胞株。将CHO-S细胞株与IL-9阳性对照抗体7F3com(参见专利CN1809383A)孵育，采用流式细胞荧光分选术(FACS)检测目的基因的表达。7F3com抗体具有以下VH和VL序列：
7F3com-VH(SEQ ID NO:34)
7F3com-VL(SEQ ID NO:35)
如图2所示，结果表明，已成功筛选出可以用于免疫效价检测和抗体结合的CHO-S-IL-9膜型表达细胞株。
3.小鼠免疫及检测
使用1mg/ml表达的Fc-IL-9重组蛋白，按照100μg/只小鼠的用量，对10只6-8周龄雌性小鼠(SPF级，Balb/C和CD-1品系各5只，标记为61-70号)皮下多点注射进行免疫。其中分别于第0、15和30天通过皮下注射进行3次免疫。免疫后，对小鼠进行眼眶采血10μL，离心获得血清，将血清进行梯度稀释后进行酶联免疫吸附测定(ELISA)检测，同时将血清按照1:1000稀释，进行FACS检测。综合ELISA和FACS检测结果，挑选免疫效价检测较好的66和70号小鼠通过腹腔注射进行冲击免疫和杂交瘤融合。
4.杂交瘤融合及筛选
对小鼠进行冲击免疫3天后，处死小鼠，并在无菌条件下获得小鼠脾脏以制备B细胞单细胞悬液。将B细胞单细胞悬液与非分泌性SP2/0骨髓瘤细胞(中国科学院上海细胞库，目录号：TCM42)混合，使用BTX细胞电融合仪进行细胞融合。将融合后的细胞在完全培养基中培养约10天，随后将培养基更换为HT培养基。继续培养2天后，取上清进行特异性抗体的检测。
具体来说，将取出的培养基上清通过ELISA检测与IL-9-His的结合，并利用CHO-S-IL-9膜型表达细胞和CHO-S细胞通过FACS检测融合克隆效价，筛选结合强的克隆进行亚克隆。亚克隆结束后通过ELISA和FACS进行鉴定，重复多轮直至单克隆形成。检测中使用的阴性对照(NC)为PBS，阳性对照(PC)为1:1000稀释的免疫血清。最终根据检测结果选择荧光值高以及生长较好的克隆表达纯化抗体。
5.纯化抗体检测
5.1纯化抗体的ELISA检测和EC50统计
按照标准方案进行ELISA检测以确定纯化抗体与IL-9-His重组蛋白的亲和力。简而言之，使用无菌PBS稀释IL-9-His重组蛋白，以100μL/孔加入96孔板于4℃包被过夜后，用封闭缓冲液进行封闭。加入100μl梯度稀释的纯化IL-9抗体，在室温下孵育1小时，对照孔为PBS。使用PBST洗涤板3次，并加入100μL HRP抗小鼠IgG H&L(博奥龙，CAT#BF03001)，在室温下孵育1小时。使用PBST洗涤板3次，并在室温下用TMB显色液进行显色。使用酶标仪读取孔内的O.D.值。采用PRISM GraphPad对数据进行处理，绘制曲线图，并计算每个候选抗体的EC50值。表1显示了44个纯化的抗体与IL-9-His重组蛋白的亲和力的EC50统计结果。
5.2纯化抗体阻断活性的检测
将IL-9受体(IL-9R)的编码序列构建到真核表达载体pLVX-Hygro中。使用构建的载体感染293F细胞并筛选293-IL-9R细胞株用于抗体阻断活性检测。将IL-9重组蛋白与IL-9R一起孵育，流式细胞术检测结果显示IL-9重组蛋白可以特异性结合IL-9R。
按照标准方案，通过流式细胞术检测纯化抗体对生物素偶联的IL-9-Fc(Biotin-IL-9-Fc)与293-IL-9R重组细胞株结合能力的影响，检测其阻断活性。简而言之，将对数生长期的293-IL-9R细胞重悬于PBS并调整细胞密度为3×106个/mL，以100μL/孔加入96孔U型板中，加入20μg/mL待测的纯化IL-9抗体和20μg/mL的Biotin-IL-9-Fc，于4℃孵育1h。用PBS洗涤一次后以100μL/孔加入二抗(APC-Streptavidin，Biolegend,CAT#405207)，于4℃孵育45min。用PBS洗涤后重悬于PBS进行流式细胞术检测。PC为IL-9阳性抗体7F3com。
根据ELISA检测结果和阻断实验流式细胞术检测结果(图3)，选择38-D8-C7-G9、31-D6-B8-B8、29-B9-F5-B6、22-F2-E9-C8和43-C3-A10-F12(将其分别重新编号为A1-A5)五个纯化抗体进一步进行杂交瘤测序。
6.杂交瘤测序
按照标准方案提取杂交瘤细胞的总RNA并逆转录为cDNA样品。使用杂交瘤测序引物采用PCR法对抗体的重链和轻链可变区进行扩增，然后进行TA克隆，将PCR获得的片段亚克隆至T载体中，挑取克隆进行测序。杂交瘤测序结果如下表2中所示，其中A4与A5序列相同。
表2.A1-A5抗体的CDR序列、VH序列和VL序列
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实施例2：嵌合抗体的制备和检测
1.嵌合抗体表达载体构建和验证
将根据杂交瘤测序获得的抗体重链可变区亚克隆至pcDNA3.4-IgG1表达载体，轻链可变区亚克隆至pcDNA3.4-IgKc表达载体(图4)。将构建好的重链和轻链表达载体瞬时共转染293F细胞(无血清培养)，收集上清进行ELISA检测。ELISA方法如实施例1中的5.1中所述。检测结果如下表3所示。
表3.嵌合抗体的表达检测结果
结果显示，4个嵌合抗体(CA1-CA4)均能够特异性结合IL-9。对嵌合抗体进行进一步的表达纯化和阻断活性检测。
2.嵌合抗体的表达纯化和阻断活性检测
将2mL/孔PBS加入至6孔板，然后分别加入pcDNA3.4-IgG1和pcDNA3.4-IgKc表达载体，用移液枪上下吹打充分混匀后，加入LVTransm转染试剂，在室温下静置10分钟。将DNA/LVTransm复合物加入到293F细胞中充分混匀。将细胞置于37℃、5％ CO2培养箱继续培养。离心收集培养基上清，过滤，将滤液转至无菌离心管中，使用Protein A亲和柱纯化嵌合抗体。
将嵌合抗体梯度稀释，通过流式细胞术检测其对Biotin-IL-9-Fc与293-IL-9R重组细胞株结合能力的影响，检测其阻断活性。PC为IL-9阳性抗体7F3com。根据流式细胞术的检测结果(图5)，CA1-CA4四株嵌合抗体均具有高阻断活性。在以下实施例中，以38-D8-C7-G9嵌合抗体(CA1抗体)为例进行抗体人源化设计。
实施例3：人源化抗体构建及检测
1.抗体人源化设计
根据获得的鼠源抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列信息进行人源化设计，保留原始抗体的CDR区序列不变，根据种系比对(germline alignment)的结果以及抗体结构模拟的结果，针对重链和轻链分别选择不同的人源抗体模版，并在人源化之后的框架区进行回复突变，设计候选的人源化抗体序列(表4)。
表4.人源化抗体序列
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2.人源化抗体基因合成及表达载体构建
将上述设计的人源化抗体的重链和轻链分别进行基因合成，将重链亚克隆至pcDNA3.4-IgG1表达载体，并将轻链亚克隆至pcDNA3.4-IgKc表达载体(载体示意图如图4所示)。载体经测序验证无误后，制备去内毒素质粒。
3.人源化抗体的表达及检测
将包含经设计的重链或轻链序列的人源化抗体表达载体两两组合，瞬时转染293F细胞，然后收集培养基上清，按照标准方案(参考实施例1中5.1部分)，以原始鼠源抗体VH和VL构建的人鼠嵌合抗体CA1作为对照，通过ELISA检测人源化抗体与靶抗原的结合情况。ELISA方法如实施例1中的5.1中所述。结果表明，检测的VH1+VL1、VH1+VL2、VH1+VL3、VH1+VL4、VH2+VL1、VH2+VL3、VH2+VL4、VH3+VL1、VH3+VL3、VH3+VL4、VH4+VL1、VH4+VL3组合均能够与IL-9以高亲和力结合，其结合与嵌合抗体基本一致。在后续实验中，以VH1-VL2，VH1-VL4，VH2-VL4和VH3-VL4四种组合(hu.CA1-hu.CA4)为例对抗体进行纯化以及功能检测。
4.人源化抗体的纯化及功能检测
将选择的抗体重链/轻链组合对应的pcDNA3.4-IgG1和pcDNA3.4-IgKc表达载体利用LVTransm转染试剂转染至293F细胞中。培养细胞后进行离心以收集培养基上清，使用Protein A亲和柱纯化抗体。按照标准方案，通过ELISA(对照为38-D8-C7-G9(CA1)嵌合抗体和IL-9阳性抗体7F3com)和流式细胞术(对照为38-D8-C7-G9(CA1))检测纯化人源化抗体的亲和力和阻断活性。
结果显示(图6A和6B)，人源化抗体和嵌合抗体以及阳性对照抗体亲和力一致。在后续实验中，以VH1-VL4(hu.CA2)和VH1-VL2(hu.CA1)两种组合为例进行亲和力的检测。
5.人源化抗体亲和力检测
通过ForteBio(BLI)检测人源化抗体的亲和力。使用Protein A传感器(Sartorius，Cat#18-5010)分别固化嵌合(作为对照)和人源化抗体，固化高度为1nm左右。缓冲液为PBS，抗原蛋白样品经梯度稀释至125、62.5、31.25、15.625，7.81和0nM。亲和力检测程序为平衡60s，结合180s，解离180s。
纯化人源化抗体亲和力的检测结果如图7A-7C和下表5中所示。结果显示信号呈浓度依赖性。
表5.亲和力检测结果
实施例4：IL-9抗体治疗小鼠肺纤维化疾病模型
材料和方法
将6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠(购自广东斯嘉景达生物科技有限公司，许可证号：SCXK(粤)2020-0052)根据下表6和7所示的方案进行分组、造模和给药。其中使用博莱霉素(日本化药株式会社公司，15mg粉剂，使用剂量1.5mg/kg)和二氧化硅(SiO2，美国sigma公司，S5631-500g，使用剂量2.5mg/只)造模的时间为第0天(D0)，从第1天(D1)开始给药，使用生理盐水作为抗体溶剂。阳性对照组中使用阳性药物吡非尼酮(北京康蒂尼药业有限公司，100mg胶囊)，IL-9抗体组中使用本申请的人源化抗体hu.CA1(VH1-VL2)。
表6.博莱霉素模型组
表7.二氧化硅模型组
a：因灌胃操作失误于D8死亡1只，实验终点时该组动物数量为10只。
每天称量小鼠体重。博莱霉素模型组开始给药21天后以及二氧化硅模型组开始给药30天后，处死小鼠以获得肺组织。对肺组织进行染色以检测肺组织的病理学改变，具体地，使用HE染色(HE染色试剂盒购自上海碧云天生物公司，C0105M)检测肺泡炎症程度，并使用Masson染色(Masson染色试剂盒购自南京建成生物公司，D026-1-2)检测肺纤维化程度。HE染色和Masson染色的评分标准分别如下表8和9所示(分别参照参考文献：Matute-BelloG,Downey G,Moore BB,et al.An official American Thoracic Society workshopreport:features and measurements of experimental acute lung injury inanimals.Am J Respir Cell Mol Biol.2011；44(5):725-738.doi:10.1165/rcmb.2009-0210ST和Lee Hyun Ju,Goo Jin Mo,Kim Na Ra et al.Semiquantitative measurementof murine bleomycin-induced lung fibrosis in in vivo and postmortemconditions using microcomputed tomography:correlation with pathologicscores--initial results.[J].Invest Radiol,2008,43:453-60)。
表8.HE染色炎性评分标准
Score＝[(20*A)+(14*B)+(7*C)+(7*D)+(2*E)]/(视野数*100)
表9.Masson染色纤维化评分标准
结果
博莱霉素小鼠模型组的体重如图8A所示。结果显示，除空白对照组外，造模后小鼠体重均出现降低，直至给药第10天(D10)出现体重回升。给药过程中阴性对照组、阳性对照组和IL-9抗体组体重变化趋势一致。二氧化硅小鼠模型组的体重如图8B所示。结果显示，除空白对照组外，造模后小鼠体重均出现降低，直至给药第3天(D3)出现体重回升，给药第12天(D12)体重回升至造模前体重。给药过程中阴性对照组、阳性对照组和IL-9抗体组体重变化趋势一致。上述结果说明IL-9抗体具有良好的安全性。
博莱霉素小鼠模型组的HE染色和炎性评分结果分别如图9A和9B所示。结果显示，阴性对照组小鼠肺组织结构破坏严重，出血点较多，出现炎症细胞浸润的情况。阳性对照组和IL-9抗体组经给药治疗后肺组织结构均有所改善，出血点减少。炎性评分结果显示IL-9抗体和吡非尼酮均可以显著降低炎性评分，且IL-9抗体组炎性评分略更低，说明IL-9抗体对肺纤维化具有显著的治疗效果。
博莱霉素小鼠模型组的Masson染色和纤维化评分结果分别如图10A和10B所示。结果显示，与空白对照组相比，阴性对照组小鼠肺组织蓝色胶原纤维明显增多。阳性对照组和IL-9抗体组经给药治疗后肺组织胶原纤维及纤维化区域均明显减小。纤维化评分结果显示IL-9抗体和阳性药物吡非尼酮均显著降低纤维化评分，说明IL-9抗体对肺纤维化具有显著的治疗效果。
二氧化硅小鼠模型组的HE染色和炎性评分结果分别如图11A和11B所示。结果显示，阴性对照组小鼠肺组织炎症细胞浸润较多，肺组织结构破坏严重，出血点较多。阳性对照组和IL-9抗体组经给药治疗后肺组织结构均有所改善，浸润面积减少。炎性评分结果显示IL-9抗体和阳性药物吡非尼酮均可以显著降低炎性评分，说明IL-9抗体对肺纤维化具有显著的治疗效果。
二氧化硅小鼠模型组的Masson染色和纤维化评分结果分别如图12A和12B所示。结果显示，与空白对照组相比，阴性对照组小鼠肺组织蓝色胶原纤维明显增多，肺组织出血点较多。阳性对照组和IL-9抗体组经给药治疗后肺组织胶原纤维及纤维化区域均明显减小。纤维化评分结果显示IL-9抗体和阳性药物吡非尼酮均可以降低纤维化评分，说明IL-9抗体对肺纤维化具有显著的治疗效果。

Claims (24)

1.特异性结合白介素-9(IL-9)的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中
(i)所述VH包含分别具有如SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL包含分别具有如SEQ ID NO:5、氨基酸SAS和SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
(ii)所述VH包含分别具有如SEQ ID NO:8-10所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL包含分别具有如SEQ ID NO:12、氨基酸AAT和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
(iii)所述VH包含分别具有如SEQ ID NO:15-17所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL包含分别具有如SEQ ID NO:19、氨基酸YAS和SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；或
(iv)所述VH包含分别具有如SEQ ID NO:22-24所示的氨基酸序列的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，并且所述VL包含分别具有如SEQ ID NO:12、氨基酸AAT和SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中
(i)所述VH包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:7具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或
(ii)所述VH包含与SEQ ID NO:11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或
(iii)所述VH包含与SEQ ID NO:18具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:21具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列；或
(iv)所述VH包含与SEQ ID NO:25具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与SEQ ID NO:14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
3.权利要求2的抗体或其抗原结合片段，其中
(i)所述VH包含如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，并且所述VL包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；或
(ii)所述VH包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，并且所述VL包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列；或
(iii)所述VH包含如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，并且所述VL包含如SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；或
(iv)所述VH包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，并且所述VL包含如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
4.权利要求1的抗体或其抗原结合片段，其中
所述VH包含与选自SEQ ID NO:26-29中任一项所示氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列，并且所述VL包含与选自SEQ ID NO:30-33中任一项所示氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
5.权利要求4的抗体或其抗原结合片段，其中
所述VH包含如SEQ ID NO:26-29中任一项所示的氨基酸序列，并且所述VL包含如SEQID NO:30-33中任一项所示的氨基酸序列。
6.权利要求4的抗体或其抗原结合片段，其中：
(i)所述VH包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，且所述VL包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；或
(ii)所述VH包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，且所述VL包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；或
(iii)所述VH包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，且所述VL包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列；或
(iv)所述VH包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，且所述VL包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
7.权利要求1至6中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型。
8.权利要求1至7中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体。
9.权利要求1至8中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv和ds-scFv。
10.权利要求1至9中任一项的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为双特异性抗体或多特异性抗体。
11.核酸，其包含编码权利要求1至10中任一项的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
12.载体，其包含编码权利要求1至10中任一项的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。
13.宿主细胞，其包含权利要求11的核酸或权利要求12的载体。
14.药物组合物，其包含权利要求1至10中任一项的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
15.权利要求14的药物组合物，其进一步包含第二治疗剂。
16.权利要求15的药物组合物，其中所述第二治疗剂选自抗体、化学治疗剂和小分子药物。
17.权利要求15或16的药物组合物，其中所述第二治疗剂选自抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗血管发生剂、TNF-α拮抗剂、免疫调节剂、抗癌剂、肥大细胞调节剂、抗炎剂、抗组胺剂、以及常见中药活性成分及提取物，及其组合。
18.预防或治疗受试者中与IL-9异常表达相关的疾病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1至10中任一项的抗体或其抗原结合片段或权利要求14至17中任一项的药物组合物。
19.权利要求18的方法，其中所述疾病为呼吸系统疾病，例如所述呼吸系统疾病选自急性感染性肺炎、过敏性肺炎、支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病和肺组织纤维化。
20.权利要求18的方法，其中所述疾病为自身免疫病，例如所述自身免疫病选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、混合性结缔组织病、过敏性鼻炎、变应性结膜炎、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫病、溃疡性结肠炎、干燥综合征、银屑病关节炎、多发性硬化、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎和自身免疫性肾上腺功能不全。
21.权利要求18的方法，其中所述疾病为血液系统癌症，例如白血病、浆细胞恶性肿瘤或淋巴瘤。
22.权利要求21的方法，其中所述血液系统癌症选自慢性粒细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、意义未明的单克隆免疫球蛋白病(MGUS)、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。
23.权利要求18至22中任一项的方法，其进一步包括向所述受试者施用第二治疗剂。
24.权利要求23的方法，其中所述第二治疗剂选自抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗血管发生剂、TNF-α拮抗剂、免疫调节剂、抗癌剂、肥大细胞调节剂、抗炎剂、抗组胺剂、以及常见中药活性成分及提取物，及其组合。
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