CN117247461A - 一种融合蛋白igf2-z及在制备抗体药物增敏剂中的应用 - Google Patents

一种融合蛋白igf2-z及在制备抗体药物增敏剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种融合蛋白IGF2‑Z及在制备抗体药物增敏剂中的应用，所述融合蛋白IGF2‑Z的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明融合蛋白IGF2‑Z易于培养和控制、转化操作简单、表达水平高、成本低、周期短。本发明扩展了抗体药物的作用模式，使其具有了降解相关肿瘤抗原的能力，增强了抗体药物的疗效。本发明融合蛋白IGF2‑Z可以用来潜在治疗肿瘤相关疾病，降解潜在的能够与抗体药物识别的肿瘤相关细胞膜上(外)的靶点。

Description

一种融合蛋白IGF2-Z及在制备抗体药物增敏剂中的应用
(一)技术领域
本发明属于靶向药物技术领域，涉及基于溶酶体靶向嵌合体(LYTACs)技术的类胰岛素生长因子-2(Insulin-like growth factor 2，IGF-2)融合蛋白质A(Protein A)的Z结构域的重组蛋白及其制备方法与在提高抗体药物性能中的应用。
(二)背景技术
抗体药物，主要靶向细胞膜外(上)的靶标，在恶性肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病的治疗上发挥着重要作用。然而，抗体药物的研发仍存在不少问题，包括研发技术缺乏创新、研发成本高、临床研究进展缓慢等，也限制了抗体药物的高速发展。
靶向蛋白质降解(Targeted protein degradation，TPD)技术，在高度选择性靶向致病蛋白的同时，通过泛素蛋白酶体途径、靶向溶酶体途径等方式诱导蛋白降解。比如，2022年诺贝尔奖得主Carolyn R.Bertozzi课题组提出的溶酶体靶向嵌合体(lysosome-targeting chimeras LYTACs)，是一种将溶酶体靶向受体(LTR)、LYTAC、细胞外靶标蛋白三者相互结合形成三元复合物，进而将细胞外或膜相关蛋白利用溶酶体途径降解的技术。在传统的抗体药物通过与靶标进行非共价结合并阻断其相关功能的基础上，该LYTACs技术将靶标蛋白进一步降解，提升抗体药物的性能。然而，现有的LYTACs是将抗体与特异性糖基进行偶联修饰，合成方式困难，且在人体内可能产生较强免疫原性，这些都限制了LYTACs的大规模发展。
Z结构域(Z domain)是金黄色葡萄球菌表面的蛋白Protein A结构域的突变体，能与商用单抗IgG的Fc段进行高亲和力的结合，可作为一通用的万能抗体连接器。目前已有研究将Z domain与细胞穿透肽(CPP)结合，将胞外的抗体带入到细胞内使抗体发挥作用，但这些方式只能使抗体起到自身免疫的作用，并不能同时降低致病蛋白的表达，从而获得更好的治疗效果。
因此，开发一种能够快速且大量获取、减少免疫原性的LYTACs，对于抗体药物的增效具有重要的意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种融合蛋白IGF2-Z及其在制备抗体药物增敏剂中的应用，提高抗体药物性能。将溶酶体靶向受体IGF2R的结合配体类胰岛素生长因子-2(Insulin-likegrowth factor 2，IGF-2)与Z domain融合重组，并在大肠杆菌系统中表达，获得融合蛋白IGF2-Z。该融合蛋白完全由基因编码，不需要任何形式的化学修饰，可大规模生产。且通过Zdomain的连接器的作用，IGF2-Z能够与各种抗体药物相结合。利用IGF2-Z作为一种便捷的抗体药物增敏剂，不仅保留抗体药物对癌细胞靶向作用的能力，同时又能将商用抗体药物所靶向的抗原进行降解，降低抗原的表达水平，最终达到了抗体药物增敏的目的，提高抗体药物抗癌效果、减少耐药性的产生。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种基于溶酶体靶向嵌合体技术的融合蛋白IGF2-Z，所述融合蛋白IGF2-Z的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，分子量为15.3kDa。
所述融合蛋白IGF2-Z主要有两部分构成，用于识别抗体的Z结构域、起到溶酶体靶向作用的类胰岛素样生长因子2(IGF2)。所述的Z结构域来源于葡萄球菌蛋白A，能够以纳摩尔亲和力与IgG的Fc区域结合，同时此结构域能够与大多数在售的抗体药物(Ab)进行结合，起到万能抗体连接器的作用。所述的融合蛋白IGF2-Z能够借助IGF2靶向哺乳动物细胞膜表面的IGF2R受体，形成复合物(IGF2R/IGF2-Z/Ab/POI，其中POI代表靶标蛋白Protein ofinterest)，利用IGF2结合IGF2R后诱导IGF2R转运至溶酶体的性质，将复合物递送至溶酶体，从而对POI进行降解。所述的IGF2R受体为细胞表面跨膜受体又称CI-M6PR受体，是一种溶酶体靶向受体，有10％存在于细胞膜上，可以介导带有甘露糖-6磷酸(M6P)或IGF2修饰的蛋白质转运至溶酶体。而内吞入溶酶体过程中，随着pH的降低，CI-M6PR与结合的蛋白发生解离，CI-M6PR可再度进入循环回到细胞膜上。
本发明还提供一种所述融合蛋白IGF2-Z在制备抗体药物增敏剂中的应用，所述的应用是将融合蛋白IGF2-Z与抗体药物和抗体药物靶向的抗原细胞共同孵育，提高抗体药物对于抗原的降解能力，实现抗体药物靶向的抗原的高效降解。本发明所述的融合蛋白IGF2-Z与商业抗体药物结合后，再与抗体药物所识别的抗原进行结合，促进四级配合物(IGF2R/IGF2-Z/Ab/POI)的形成，使得POI转运至溶酶体被降解，从而增强商业抗体药物的作用。
所述抗原细胞包括人慢性髓原白血病细胞K562、人宫颈癌细胞HeLa、淋巴瘤细胞Raji。所述抗体药物包括西妥昔单抗(Cetuximab，商品名爱必妥(Erbitux))、利妥昔单抗(Rituximab，商品名美罗华)。
本发明融合蛋白IGF2-Z和商用抗体药物与细胞共孵育后，可以靶向细胞膜表面相应抗原并降解，具体的原理为：首先IGF2-Z的Z结构域会与加入的抗体药物的Fc区域以高亲和力的方式连接，随后会在细胞膜上形成IGF2R/IGF2-Z/Ab/POI的四元复合体，最终通过IGF2R-IGF2介导的内化作用将POI转至溶酶体后进行降解。所述细胞为人慢性髓原白血病细胞(K562)。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明提供一种融合蛋白IGF2-Z，使用的Z结构域是能与人类大多数类型的抗体(比如IgG)的Fc段结合的葡萄球菌蛋白A上的最小化的肽段，其亲和力与葡萄球菌蛋白A几乎相同，但大小只有它的六分之一，便于表达与操作。最终通过IGF2R-IGF2介导的内化作用将抗原(比如POI)转运至溶酶体后进行降解。
本发明通过大肠杆菌的表达系统对融合蛋白IGF2-Z进行表达，易于培养和控制、转化操作简单、表达水平高、成本低、周期短。
本发明相比于靶向降解嵌合体(PROteolysis TArgeting Chimeras，PROTACs)降解胞内蛋白，IGF2-Z是在胞外进行结合，靶向膜上或膜外的抗原蛋白质，并能够将靶向的抗原蛋白通过内化的方式进入细胞后降解。现有抗体药物与靶点之间一般都是动态平衡的结合，本发明扩展了抗体药物的作用模式，使其具有了降解相关肿瘤抗原的能力，增强了抗体药物的疗效。本发明融合蛋白IGF2-Z可以用来潜在治疗肿瘤相关疾病，降解潜在的能够与抗体药物识别的肿瘤相关细胞膜上(外)的靶点。
(四)附图说明
图1为实施例1融合蛋白IGF2-Z提取、纯化过程用考马斯亮蓝(CBB)染色的SDS-PAGE图；A中“+”泳道代表含融合蛋白IGF2-Z质粒的重组菌诱导培养液，“-”泳道代表含融合蛋白IGF2-Z质粒的重组菌未诱导培养液；B中泳道Pel代表重组菌诱导培养液离心后的沉淀，泳道FL代表裂解缓冲液洗脱的穿流液；泳道E1、E2、E3、E4代表洗脱缓冲液洗脱的流出液。
图2为实施例1利用AlphaFold2预测的IGF2-Z蛋白折叠结构。
图3为实施例2中CD光谱曲线。
图4为实施例3激光扫描共聚焦显微镜图像(A)、K562细胞中IGF2-Z的剂量-反应曲线(B)。A中IGF2-ZCy5代表Cy5染料标记的融合蛋白IGF2-Z通道；LysoGreen代表溶酶体绿色荧光探针，Merge代表两种通道重叠。
图5为实施例4流式细胞术分析图。
图6为实施例4中激光扫描共聚焦显微镜图像。
图7为SDS-PAGE凝胶分离分析K562细胞中IGF2-Z与不同抗体(A:IgGCy5；B:CetCy5；C:RituCy5)的时间依赖性摄取(3、8、12、24h)和洗脱(12、24h)。
图8为实施例5中利用蛋白质免疫印迹图(A)验证IGF2-Z和Cet的浓度依赖性实验和与溶酶体抑制剂(50μM CQ或50nM Baf)存在下IGF2-Z和Cet诱导HeLa细胞的EGFR降解的蛋白质免疫印迹图(B)。
图9为IGF2-Z与Cet作用下HeLa细胞的pEGFR和pAKT蛋白质免疫印迹图。
图10为药物治疗后肿瘤组织照片及解剖肿瘤的重量比较。
图11为肿瘤组织中EGFR水平的蛋白质免疫印迹图。
图12为IGF2-Z与Ritu作用下诱导Raji细胞中CD20降解的蛋白质免疫印迹图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。本发明所述室温是指25-30℃。
细胞培养基：含体积浓度10％胎牛血清(FBS)+青霉素(100μg/mL)+链霉素(100μg/mL)的DMEM完全培养基。
实施例1、融合蛋白蛋白IGF2-Z的构建、表达纯化
1、质粒的构建
委托南京金斯瑞，人工合成含His标签的融合蛋白IGF2-Z，氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。同时人工合成Z结构域蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.2中80-137位所示)。
将含His标签的融合蛋白IGF2-Z的DNA序列片段插入pET-24a(+)载体中，构建质粒pET-24a/IGF2-Z。
将Z结构域蛋白的DNA序列片段插入pET-24a(+)载体中，构建质粒pET-24a/Z。
IGF2-Z氨基酸序列SEQ ID NO.2
MHHHHHHAYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEEC CFRSCDLALLETYCATPAKSEGGGGSVDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAF IQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK。
2、融合蛋白IGF2-Z粗酶的制备
(1)取1-5μL质粒pET-24a/IGF2-Z(50ng/μL)加入到解冻的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并轻轻混合。将试管放在冰上孵育30min，然后以42℃水浴进行热激处理90秒。后加入到500μL不含抗生素的LB培养基中，在37℃下继续振荡孵育1h。将得到的菌液涂板在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB琼脂板上，然后在37℃下进一步孵育16h。在培养皿上形成的单个菌落，挑出送测，单克隆经DNA序列验证正确后用于后续的实验。
(2)将步骤(1)得到的单菌落挑入25mL含卡那霉素(最终浓度为50μg/mL)的LB液体培养基中，在37℃、200rpm摇床下振荡培养9h以上。之后取5mL菌液到150mL的LB培养基中扩大培养2h，当OD600值达到0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mM诱导细胞，再37℃培养4～5h后，培养液(考马斯亮兰染色，SDS-PAGE凝胶电泳图见图1，其中A“+”为在培养液中添加了IPTG，“-”为在培养液中未添加IPTG)，8000rpm离心10分钟，收集菌液沉淀，再用30mL 1xPBS吹打混匀菌体，离心(4℃，8000rpm，10min)，去上清，收集到的沉淀放置在-80℃冰箱保存，SDS-PAGE凝胶电泳图见图1中B的泳道Pel。
(3)将步骤(2)收集到的沉淀在15mL裂解缓冲液(20mM磷酸钠、8M尿素、300mM氯化钠、3mM二硫苏糖醇(DTT)，溶剂为水，pH 8.0)中重悬，室温静止1小时，然后用细胞超声破碎仪在冰上超声(功率300W、开1s、关3s、10分钟)。将所得到的裂解液在4℃下以12,000rpm离心20min，收集上清。将上清用BCA法测量蛋白含量，后将收集的上清液加入Ni-NTA琼脂糖(Ni-NTA琼脂糖的加入体积根据Ni-NTA的蛋白质负载为50mg/mL计算)，在4℃下用旋转摇床上混匀90min，吸附目的蛋白后，装入亲和层析柱，先用裂解缓冲液洗涤，同时流穿液用Bradford法测定蛋白含量(96孔板每孔100μL Bradford试剂加5μL流穿液)，收集的流穿液的SDS-PAGE凝胶电泳图见图1中B中泳道FL；然后用洗脱缓冲液洗脱(20mM磷酸钠、8M尿素、300mM氯化钠，溶剂为水，用盐酸调节pH至6.0)，洗涤至Bradford不变色，每1mL流出液收集一管，SDS-PAGE凝胶电泳图见图1中B的泳道E1、E2、E3、E4。将全部流出液减压浓缩至干，得到5mg的IGF2-Z粗酶。
3、融合蛋白IGF2-Z纯酶的制备
将步骤2中得到的IGF2-Z的粗酶，用透析法将其复性，取粗酶1.5mg用裂解缓冲液稀释至～0.1mg/mL装入透析袋(截留分子量为10kDa)中，在4℃下使用复性缓冲液(I～IV)透析，每种复性缓冲液1000mL至少透析3小时，然后取截留液转移到下一个复性缓冲液中，最终用1xPBS进行透析，截留液减压浓缩至1mg/mL，得到融合蛋白IGF2-Z纯酶1mg。利用AlphaFold2预测IGF2-Z蛋白折叠结构，见图2所示，结果表明融合蛋白IGF2-Z具有正确折叠。
同样方法，制备Z结构域蛋白纯酶1mg。
复性缓冲液(I～IV)组成：
I：20mM磷酸钠、300mM氯化钠、6M尿素，pH 8.0；
II：20mM磷酸钠、300mM氯化钠、3M尿素，pH 8.0；
III：20mM磷酸钠、300mM氯化钠、1.5M尿素、1mM谷胱甘肽(还原型)GSH、0.2mM谷胱甘肽(氧化型)GSSG，pH 8.0；
IV：20mM磷酸钠、300mM氯化钠、0.5M尿素、1mM GSH、0.2mM GSSG，pH 8.0。
实施例2、融合蛋白IGF2-Z的圆二色性(CD)研究
实施例1步骤3制备的融合蛋白IGF2-Z纯酶用10mM磷酸钾缓冲液(pH值7.2)配制成20μM蛋白溶液，石英样品杯光径0.2cm。在20℃、远紫外CD光谱(260-190nm)下扫描，扫描速度为0.8nm/min，使用JASCO J-815分光偏振仪(JASCO)记录，Peltier系统来控制细胞温度，CD谱图如图3所示，图3表明复性后融合蛋白IGF2-Z的蛋白折叠效果达到预期。
实施例3、细胞K562对Cy5标记融合蛋白IGF2-Z的摄取情况
(1)Cy5标记的融合蛋白IGF2-Z
实验组：实施例1步骤3制备的融合蛋白IGF2-Z用10mM磷酸钾缓冲液(pH 7.2)配制成1mg/mL蛋白溶液，将100μL蛋白溶液加入到400μL Na2CO3缓冲液(500mM，pH＝9.0)中，加入6μL浓度1mM的Cy5-NHS(花菁染料CY5标记活性脂)的DMSO溶液，将反应混合物在4℃下震荡孵育过夜后，加入Tris缓冲液(20mM，pH＝8.0)中，4℃淬灭30min，获得标记蛋白溶液。将标记蛋白溶液加入透析袋(截留分子量10000，使用前先在ddH2O中煮沸10min并冷却至室温)，用1L 1xPBS透析2次去除游离的染料，每次2h，取截留液，即为Cy5标记融合蛋白IGF2-Z，浓度为0.18mg/mL。
对照组：将实验组中蛋白溶液用等体积的Na2CO3缓冲液代替，加入6μLCy5-NHS，将反应混合物在4℃下震荡孵育过夜，用Tris缓冲液淬灭后，作为染料对照样品。
(2)细胞K562对IGF2-Z的摄取检测
人慢性髓原白血病细胞K562接种在细胞培养基中，悬浮、吹打均匀后加入到96孔板，每孔10万细胞，体积200μL，每孔再加入终浓度500nM的Cy5标记的IGF2-Z，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，吸去培养基，用PBS(1x)清洗3次，去除残留的标记蛋白，然后重新加入带有50nM溶酶体红色荧光探针LysoTracker Red的细胞培养基中，37℃继续孵育15min后，采用激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)进行扫描，结果见图4中A，可以看出IGF2-Z能够有效被K562细胞摄取，并递送至溶酶体当中。
(3)细胞K562对不同浓度IGF2-Z的摄取检测
人慢性髓原白血病细胞K562接种在细胞培养基中悬浮、吹打均匀后加入到96孔板，每孔10万细胞，体积200μL，每孔再加入不同终浓度(0、10、50、100、500、750、1000、2000nM)的Cy5标记的IGF2-Z，置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，吸去培养基，用PBS(1x)清洗3次，去除残留的标记蛋白，最后加入1mL PBS(1x)混匀，用流式细胞仪(Navios,Beckman)对细胞中的Cy5信号进行检测，根据平均荧光强度Mean值数据绘制剂量-反应曲线，如图4中B所示，结果表明细胞K562对IGF2-Z的摄取常数Kd为287nM。
实施例4、IGF2-Z对细胞K562摄取抗体的影响
(1)Cy5标记抗体
商业购买的IgGs用PBS稀释至1mg/mL抗体溶液，将100μL抗体溶液加入到400μLNa2CO3缓冲液(500mM，pH＝9.0)中，加入6μL Cy5-NHS(1mM在DMSO中)，将反应混合物在4℃下震荡孵育过夜后，加入Tris缓冲液(20mM，pH＝8.0)，4℃淬灭30min，获得标记抗体溶液。将透析袋(截留分子量3500)在ddH2O中煮沸10min，将标记抗体溶液加入透析袋，用1L 1xPBS透析2次，每次2h，取截留液，即为Cy5标记IgGs抗体，记作IgGCy5，蛋白浓度为0.17mg/mL。
同样的方法，将IgGs替换为Cetuximab(西妥昔单抗，简称Cet)、Rituximab(利妥昔单抗，简称Ritu)抗体，分别获得Cy5标记Cetuximab抗体，记作CetCy5，蛋白浓度为0.18mg/mL；Cy5标记Rituximab抗体，记作RituCy5，蛋白浓度为0.18mg/mL。
(2)细胞K562共培养
人慢性髓原白血病细胞K562接种在细胞培养基中，悬浮、吹打均匀后，加入到96孔板，每孔10万细胞，体积200μL；将培养孔分为单抗组、单抗+Z组和单抗+IGF2-Z组，其中单抗又分为IgGCy5、CetCy5和RituCy5。
在单抗组的培养孔中，分别加入终浓度100nM的IgGCy5、CetCy5和RituCy5。在单抗+Z组的培养孔中，分别加入终浓度100nM的IgGCy5+终浓度100nM的Z结构域纯蛋白、终浓度100nM的CetCy5+终浓度100nM的Z结构域纯蛋白、终浓度100nM的Ritu Cy5+终浓度100nM的Z结构域纯蛋白。单抗+IGF2-Z组的培养孔中，分别加入终浓度100nM的IgGCy5+终浓度100nM的IGF2-Z纯蛋白、终浓度100nM的CetCy5+终浓度100nM的IGF2-Z纯蛋白、终浓度100nM的RituCy5+终浓度100nM的IGF2-Z纯蛋白。
(3)流式细胞仪检测
步骤(2)孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，收集细胞，PBS清洗三次，用流式细胞仪对细胞中Cy5信号进行检测。以Tris缓冲液淬灭的Cy5-NHS作为染料对照，结果见图5所示，在K562中同时加入IGF2-Z与IgG孵育24h，IGF2-Z能够有效得将IgG递送到细胞中，柱状图显示3种IgGs(100nM IgGCy5、CetCy5和RituCy5)的Cy5荧光强度。
(4)激光扫描共聚焦显微镜检测
步骤(2)孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，收集细胞，用PBS(1x)洗2次，然后用Hoechst 33342(100nM)和Lyso-tracker Green(50nM)共染色15min，采用激光扫描共聚焦显微镜进行活细胞共聚焦成像。结果见图6所示，证实了在K562细胞中，在共培养24h后通过IGF2-Z(100nM)摄取了人IgGCy5(100nM)，同时IGF2-Z可以将不同的抗体药物递送到细胞内。
(5)凝胶荧光扫描抗体药物摄取情况
步骤(2)孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24小时，收集细胞，用PBS洗涤三次。然后单抗组转接至新鲜细胞培养基中，37℃，5％CO2孵育24h；单抗+Z组接种至新鲜细胞培养基中，37℃，5％CO2孵育12h和24小时；单抗+IGF2-Z组接种至新鲜细胞培养基中，37℃，5％CO2孵育3、8、12和24h，同时还设置培养基洗脱12、24h，添加500μM氯喹(CQ)孵育24h的对照组。最后，收集细胞，用PBS洗涤，每孔加入100μL含有1mM蛋白酶抑制剂(Beyotime)的RIPA缓冲液，在室温条件下裂解10min，收集裂解液，后用BCA法测定蛋白的浓度，然后将各个裂解液加入到10％的SDS-PAGE凝胶上跑胶分离，最后使用Invitrogen iBright FL1500成像系统成像。上图为荧光成像图，下图为考马斯亮蓝染胶结果图，结果见图7所示。图7表明：不同时间IGF2-Z递送不同抗体药物的差异，且在CQ的存在下递送的抗体药物不会被降解，表面递送的抗体药物是由溶酶体途径进行降解。
实施例5、蛋白质免疫印迹法(Western blotting，WB)分析EGFR降解效果
1、细胞培养
将人宫颈癌细胞HeLa接种在细胞培养基中，悬浮、吹打均匀后接种于12孔板中，37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁占孔板为70～80％(约200000～300000个细胞/孔)。
2、蛋白质免疫印迹法(WB)验证IGF2-Z和Cet的浓度依赖性实验
先将12孔板中的培养液吸出，用1x PBS清洗3次，每孔分别加入不同浓度(0、10、20、50、100、200、1000nM)的IGF2-Z，同时每孔再加入Cet(10nM)，再用细胞培养基补足至500μL。在37℃，5％CO2培养箱中培养孵育24h，吸出含有蛋白的培养基，用PBS(1x)洗2次，每孔加入120μL 0.1％Triton X-100，将细胞刮下分别收集到Ep管中，每孔加入100μL含有1mM蛋白酶抑制剂(Beyotime)的RIPA缓冲液，在室温条件下裂解10min，裂解液用BCA法测定蛋白的浓度。接下来，将各个裂解液等量加入到10％的SDS-PAGE凝胶上进行跑胶，然后4℃转膜到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上。配制5％的无脂牛奶用TBST缓冲液溶解，将PVDF膜在室温下摇晃封闭膜1.5h。用TBST缓冲液洗涤三次每次10min，后用加入100μL稀释后的EGFR抗体(1：1200稀释度，Cell signaling technology，#4267，用含3％BSA的TBST缓冲液稀释)和5mL稀释后的HRP偶联的GAPDH抗体(1：7500稀释度，用含3％BSA的TBST缓冲液稀释，Proteintech，#HRP-60004)，在4℃下孵育过夜。用TBST缓冲液洗涤3次。然后，膜分别加入5mL稀释后的HRP偶联的山羊抗兔IgG(初始浓度0.2mg/mL，Invitrogen，用含3％BSA的TBST缓冲液稀释，1：7500稀释)，在室温下孵育1h，用TBST缓冲液洗涤三次，GAPDH作为内参，最后使用Invitrogen iBright FL1500成像系统成像。成像结果采用ImageJ软件对Western印迹(WB)的条带强度进行定量。结果见图8中A所示，结果表明在10nM Cet与20nM IGF2-Z的存在下，细胞当中的EGFR出现降解，并随IGF2-Z的浓度升高降解效果逐渐增加，达到了近85％的EGFR含量的降低。
3、蛋白质免疫印迹法(WB)验证溶酶体抑制剂(50μM CQ或50nM Baf)存在下减弱了IGF2-Z和Cet诱导HeLa细胞的EGFR降解
将HeLa细胞接种在细胞培养基中，悬浮、吹打均匀后接种于12孔板中，37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁占孔板为70～80％(约200000～300000个细胞/孔)。
先将12孔板中的培养液吸出，用1x PBS清洗3次，每孔加入20nM的IGF2-Z，同时每孔再加入Cet(10nM)，再用细胞培养基补足至500μL，同时设置空白对照组(Blank)，其中以等量的1x PBS代替IGF2-Z和Cet进行孵育。在37℃，5％CO2培养箱中培养孵育24h。
吸出含有蛋白的培养基，用PBS(1x)洗2次，再分别加入500μL含溶酶体抑制剂(50μM CQ或50nM Baf)+细胞培养基，37℃，5％CO2孵育24h，然后吸出含有溶酶体抑制剂的培养基，用PBS(1x)洗2次，每孔加入100μL含有1mM蛋白酶抑制剂(Beyotime)的RIPA缓冲液，在室温条件下裂解10min，裂解液用蛋白质免疫印迹法(WB)检测，结果见图8中B所示，结果表明溶酶体抑制剂的加入会抑制EGFR的降解，表明IGF2-Z起到的降解通路与溶酶体相关。
4、蛋白质免疫印迹法(WB)验证IGF2-Z和Cet诱导HeLa细胞的EGFR与苏氨酸蛋白激酶(Akt)磷酸化水平降低
将HeLa细胞接种在细胞培养基中，悬浮、吹打均匀后接种于12孔板中，37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁占孔板为70～80％(约200000～300000个细胞/孔)。
先将12孔板中的培养液吸出，用1x PBS清洗3次，每孔加入20nM的IGF2-Z，同时每孔再加入Cet(10nM)，再用细胞培养基补足至500μL，分别设置Cet、IGF2-Z、Z、Cet+IGF2-Z组，在37℃，5％CO2培养箱中培养孵育24h。
吸出含有蛋白的培养基，用PBS(1x)洗2次，并进一步用EGF(100ng/mL)在37℃下处理20min。孵育后，每孔加入100μL含有1mM蛋白酶抑制剂(Beyotime)的RIPA缓冲液，在室温条件下裂解10min，裂解液用蛋白质免疫印迹法(WB)检测EGFR、AKT磷酸化水平。接下来，将各个裂解液等量加入到10％的SDS-PAGE凝胶上进行跑胶，然后4℃转膜到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上。配制5％的无脂牛奶用TBST缓冲液溶解，将PVDF膜在室温下摇晃封闭膜1.5h。用TBST缓冲液洗涤三次每次10min，后用加入5mL稀释后的Anit-phospho-EGFR(Y1068)抗体(1：2000稀释度,Cell signaling technology，#2234，用含3％BSA的TBST缓冲液稀释)、5mL稀释后的Anti-phospho-Akt(S473)(1：1000稀释度，用含3％BSA的TBST缓冲液稀释，Huabio，#ET1607-73)、5mL稀释后的HRP偶联的GAPDH(1：7500稀释度，用含3％BSA的TBST缓冲液稀释，BBI)，在4℃下孵育过夜。用TBST缓冲液洗涤3次。然后，膜分别加入5mL稀释后的HRP偶联的山羊抗兔IgG(初始浓度0.2mg/mL，Invitrogen，用含3％BSA的TBST缓冲液稀释，1：7500稀释)，在室温下孵育1h，用TBST缓冲液洗涤三次，GAPDH作为内参，最后使用Invitrogen iBright FL1500成像系统成像。成像结果采用ImageJ软件对Western印迹(WB)的条带强度进行定量。结果见图9所示，结果表明IGF2-Z和Cet的存在下会抑制磷酸化的EGFR、磷酸化Akt的水平，也说明IGF2-Z和Cet能够降低细胞中的EGFR水平，使得下游磷酸化水平也得以降低。
实施例6、IGF2-Z体内降解肿瘤
实验小鼠：4周龄雌性BABL/c裸鼠(～10g)购自上海SLAC实验动物有限公司(中国上海，ICP 05033115)。所有的动物均在温度(23±2℃)、湿度(55±5％)和光照(12h光照/暗循环)的控制条件下饲养。购买来的小鼠正常培养1周后，将100μL悬浮的HeLa细胞(5×106细胞)注射到右背侧皮下荷瘤。
分组：当肿瘤体积达到～100mm3，小鼠随机分为5组(3小鼠/组)，分别设置PBS组、Cet对照组、Cet+IGF2-Z治疗组。
治疗：PBS组注射PBS，注射量与加药组加药量相同；Cet对照组注射西妥昔单抗，注射量5mg/kg的蛋白质；Cet+IGF2-Z治疗组注射西妥昔单抗和IGF2-Z纯蛋白，Cet注射量为5mg/kg，IGF2-Z注射量为5mg/kg。各组每两天注射一次，共7次。
治疗结束后，最终处死所有小鼠并收集肿瘤以获得确切的体重，结果见图10所示。图10表明IGF2-Z和Cet的存在会对肿瘤有抑制效果，肿瘤的重量减小。
从不同处理组获得的肿瘤组织用PBS洗涤，并在含有1mM蛋白酶抑制剂(Beyotime)的RIPA缓冲液中研磨。样品在冰上保存1小时。以12000rpm，4℃离心10min，去除组织或细胞碎片。对等量的上清液进行Western blot(WB)分析，结果见图11所示，结果表明IGF2-Z和Cet的存在下会对肿瘤有抑制效果，对肿瘤的EGFR有降解作用。
实施例7、蛋白质免疫印迹法(Western blotting，WB)分析CD20降解效果
1、细胞培养
Raji细胞接种在细胞培养基中，悬浮、吹打均匀后接种于12孔板中，37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁占孔板为70～80％(约200000～300000个细胞/孔)。
2、蛋白质免疫印迹法(WB)验证IGF2-Z和Ritu对CD20的降解效果
每孔分别加入100nM IGF2-Z，10nM Ritu及100nM IGF2-Z+10nM Ritu，以没有任何试剂的加入做为blank对照组。在37℃，5％CO2培养箱中培养孵育48h，收集细胞，用PBS(1x)洗2次，每个样品中加入100μL含有1mM蛋白酶抑制剂(Beyotime)的RIPA缓冲液，在室温条件下裂解10min，裂解液用BCA法测定蛋白的浓度。接下来，将各个裂解液等量加入到15％的SDS-PAGE凝胶上进行跑胶，然后4℃转膜到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上。配制5％的无脂牛奶用TBST缓冲液溶解，将PVDF膜在室温下摇晃封闭膜1.5h。用TBST缓冲液洗涤三次每次10min，后用加入5mL CD20抗体(1：2000稀释度，Huabio，#ET1065-33，用含3％BSA的TBST缓冲液稀释)和5mL稀释后的HRP偶联的GAPDH抗体(1：7500稀释度，用含3％BSA的TBST缓冲液稀释，Proteintech，#HRP-60004)，在4℃下孵育过夜。用TBST缓冲液洗涤3次。然后，膜分别加入5mL稀释后的HRP偶联的山羊抗兔IgG(初始浓度0.2mg/mL，Invitrogen，用含3％BSA的TBST缓冲液稀释，1：7500稀释)，在室温下孵育1h，用TBST缓冲液洗涤三次，GAPDH作为内参，最后使用Invitrogen iBright FL1500成像系统成像。成像结果采用ImageJ软件对Western印迹(WB)的条带强度进行定量。结果见图12中所示，结果表明仅在10nM Ritu与20nM IGF2-Z的存在下，细胞中的CD20达到了近70％的降低，尤其也表明了IGF2-Z的加入提高了CD20抗体药物Rituximab的药效，为后续开发提供了证明。

Claims (5)

1.一种基于溶酶体靶向嵌合体技术的融合蛋白IGF2-Z，其特征在于，所述融合蛋白IGF2-Z的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述融合蛋白IGF2-Z在制备抗体药物增敏剂中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用是将融合蛋白IGF2-Z与抗体药物和抗体药物靶向的抗原细胞共同孵育，提高抗体药物对于抗原的降解能力，实现抗体药物靶向的抗原的高效降解。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗原细胞包括人慢性髓原白血病细胞K562、人宫颈癌细胞HeLa、淋巴瘤细胞Raji。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗体药物包括西妥昔单抗、利妥昔单抗。
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