CN117243335A - 一种富含多酚的发酵全豆豆浆及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于发酵食品技术领域，公开了一种富含多酚的发酵豆浆制备方法。将德氏乳杆菌MT772183接种于全豆豆浆中发酵，得到富含多酚的发酵豆浆。本发明利用具有β‑葡萄糖苷酶活力的德氏乳杆菌MT772183发酵全豆豆浆，豆渣的存在有效激发了德氏乳杆菌MT772183产β‑葡萄糖苷酶的能力。全豆发酵过程中豆渣中不溶的多酚大量溶出，其中的游离酚、结合酚、总酚、游离黄酮、结合黄酮、总黄酮和大豆异黄酮苷元含量显著高于除渣豆浆和半除渣豆浆。同时，全豆发酵增加了发酵豆浆的稠厚程度(粘度)；提供了丰富的口感；发酵后的产品中含有膳食纤维、低聚糖和多酚等益生元，长期服用可调节肠道菌群，进而提高多酚的生物吸收率和生物利用率。

Description

一种富含多酚的发酵全豆豆浆及其制备方法
技术领域
本发明属于发酵食品技术领域，更具体的，涉及一种富含多酚的发酵全豆豆浆及其制备方法。
背景技术
长久以来，豆浆深受亚洲人喜爱，它是普通消费者或素食者的良好蛋白质来源，也是乳糖不耐症人群的牛奶替代品。豆浆中含有多种生物活性物质，包括异黄酮、多酚、植酸盐、皂苷、卵磷脂、植物类固醇和生育酚等。其中，多酚和异黄酮多以不易被人体吸收的结合形式存在于天然大豆中，其生物利用率有限，若将结合型多酚转化为游离形式，可进一步提高大豆多酚的生物利用率。目前，研究者已从磨浆工艺、发酵工艺、酶水解等角度优化除渣豆浆中游离型多酚的占比，已将除渣豆浆中游离酚的含量提高到较好的水平，突破的空间有限。
值得注意的是，豆制品加工企业大多采用去皮去渣的工艺制备除渣豆浆，使得大量的豆渣被遗弃或低价值处理。豆渣的营养物质丰富，其膳食纤维约占大豆干物质的55％，大豆异黄酮约占大豆干物质的12～30％。豆渣膳食纤维中含有大量的酚类物质，它们往往通过共价/非共价的方式结合在一起，当环境条件发生改变或者发酵时，多酚可能从基质的膳食纤维中释放出来。若能将豆渣中不溶的酚类物质释放出来，可提高豆浆中酚类物质的含量。
发酵豆浆指的是将乳酸菌接种于豆浆并于适宜温度下培养一段时间而制得的发酵蛋白饮料。豆浆是乳酸菌的良好培养基，富含的低聚糖能促进乳酸菌生长。乳酸菌发酵使得发酵豆浆中含有微生物水解酶(如α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、阿魏酸酯酶和蛋白酶等)，进而起到增加豆浆营养价值、改善豆浆口感并优化豆浆理化特性的作用。研究表明，乳酸菌产生的α-半乳糖苷酶可以减少肠道胀气，β-葡萄糖苷酶能将大豆异黄酮糖苷转化为更具生物活性的苷元形式。因此，乳酸菌发酵是改善豆浆营养价值和感官特性的有效方法。
全豆豆浆是大豆打浆后不进行除渣工艺而制得的豆浆，它几乎保留了大豆所有的营养，多酚、大豆异黄酮和膳食纤维等“益生元”的含量高于除渣豆浆。随着全豆豆浆和发酵豆浆优势的凸显，已有一些学者将二者结合并探究发酵全豆豆浆的营养和感官特性。然而，目前有关发酵全豆豆浆的研究大多集中于感官、质构和功能活性方面，关于生物活性物质(如多酚、多糖、生物活性肽等)的报道较少。
多酚是一种羟基酚类化合物，其具有抗氧化、抗癌、抗击心血管疾病等多种生物活性。多酚具有多种结构，包括类黄酮、酚酸、木脂素、香豆素和其他低分子量成分。根据多酚在有机溶剂中的溶解度，多酚可分为不可提取多酚和可提取多酚，不可提取酚也叫结合酚(Boundphenolic compounds，BPC)，可提取多酚依据其在乙酸乙酯-水或乙醚-水体系中的分配情况可被分为游离酚(Free phenolic compounds，FPC)和共轭酚(Conjugatedphenolic compounds，CPC)。大豆异黄酮是大豆中最主要的酚类化合物，具有12种异构体，可分为结合型糖苷和游离型苷元两类。游离型苷元包括染料木素、大豆苷元和黄豆黄素。结合型糖苷包括染料木苷、大豆苷、黄豆黄苷及其对应的乙酰基和丙二酰基衍生物。
大豆中含有大量的多酚化合物，但多以不易被人体吸收的结合形式存在，若提高食物中游离酚的含量，可以提高大豆多酚的生物利用率。研究表明，乳酸菌被广泛应用于发酵豆制品的生产中，产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌可以将糖苷型多酚转化为游离形式。全豆豆浆中富含多酚、膳食纤维和低聚糖等“益生元”，但豆渣中含有大量不溶的酚类物质，利用产β-葡萄糖苷酶乳酸菌发酵全豆豆浆，可能促进豆渣多酚的溶出，进而实现高多酚豆浆的转化与利用。中国专利CN112574905B公开了一株具有β-葡萄糖苷酶活力且能转化大豆异黄酮糖苷的德氏乳杆菌MT772183。其分类学命名为Lactobacillus delbrueckii，德氏乳杆菌MT772183保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020332，保藏日期为2020年07月20日。将德氏乳杆菌MT772183用于豆浆发酵，能去除豆乳的豆腥味，增加产品中的大豆异黄酮苷元含量，提高豆乳产品的抗氧化能力。
综上所述，采用产β-葡萄糖苷酶的德氏乳杆菌MT772183发酵豆浆，有望获得一款富含多酚的发酵豆浆。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供德氏乳杆菌MT772183的新应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
德氏乳杆菌MT772183在促进豆浆豆渣中不溶性多酚溶出及共轭酚释放游离酚中的应用，其特征在于，所述不溶性多酚为结合酚和结合黄酮，共轭酚包括共轭多酚、共轭黄酮及大豆异黄酮糖苷。
本发明首先在考虑对豆渣综合利用的前提下，发现全豆豆浆的酚类物质含量均显著高于半除渣豆浆和除渣豆浆，且与全豆豆浆相比，半除渣豆浆和除渣豆浆的总大豆异黄酮回收率都出现显著下降，并随除渣程度的增加而降低。
产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌将异黄酮糖苷转化为异黄酮苷元的研究已有报道，但是否可释放结合多酚和结合黄酮则没有系统研究，其对大豆结合酚的释放能力也未有报道。
由此，申请人考虑进行全豆豆浆发酵的可行性，如何将豆渣中一定含量的不溶性多酚转化为可溶性且可供人类吸收利用的多酚则成为了新的难题，申请人在前期研究中发现了一种能够产β-葡萄糖苷酶的德氏乳杆菌MT772183，其可以用于发酵除渣豆浆，能去除豆乳的豆腥味，增加产品中的大豆异黄酮苷元含量，提高豆乳产品的抗氧化能力，但是用于含有豆渣的全豆豆浆的发酵性能还没有系统性研究。
本发明基于豆渣中仍含有大量多酚和异黄酮，特别是结合多酚的事实，提出利用产β-葡萄糖苷酶的乳酸菌发酵全豆豆浆以释放豆渣中结合多酚并获得高多酚含量豆浆的假设。研究证明了上述假设，并意外发现豆渣的存在可以激活乳酸菌的β-葡萄糖苷酶产生能力，以及提高所产β-葡萄糖苷酶在发酵豆浆中的耐受性。
因此，优选的，本发明上述保护的应用中，是利用德氏乳杆菌MT772183发酵全豆豆浆。
更优选的，发酵过程包括以下步骤：
S1、以豆水比为1：6～12进行打浆，经灭菌、冷却后接种，接种量2～8％v/v；
S2、37～42℃发酵至pH＝4.5，发酵完成后均质即得。
本发明还提供一种发酵全豆豆浆产品的制作方法，利用德氏乳杆菌MT772183接种全豆豆浆进行发酵，所述豆浆产品包括发酵全豆豆浆饮品和发酵豆粉。
优选的，当所述发酵全豆豆浆产品为发酵全豆豆浆饮品时，所述方法包括以下步骤：
S1、以豆水比为1：6～12进行打浆，经灭菌、冷却后备用；
S2、挑取德氏乳杆菌MT772183单菌落进行培养活化，调节菌落密度为109CFU/mL；
S3、37～42℃发酵至pH＝4.5，发酵完成后均质即得兼具可溶性多酚含量和稠厚程度的发酵全豆豆浆饮品。
全豆发酵能增加发酵豆浆稠厚程度(粘度)。研究显示发酵结束后，全豆豆浆的粘度增长率为402.40±0.49mPa·s，而半除渣豆浆和除渣豆浆的粘度增长率仅为310.28±1.94mPa·s和235±1.68mPa·s。
优选的，当所述发酵全豆豆浆产品为发酵豆粉时，所述方法包括以下步骤：
S1、以豆水比为1：6～12进行打浆，经灭菌、冷却后备用；
S2、挑取德氏乳杆菌MT772183单菌落进行培养活化，调节菌落密度为109CFU/mL；
S3、37～42℃发酵至pH＝4.5，发酵完成后均质即得兼具可溶性多酚含量和稠厚程度的发酵全豆豆浆饮品；
S4、在全豆豆浆饮品的基础上进行干燥得到发酵豆粉。
更优选的，上述方法中，所述干燥选自鼓风干燥、微波干燥、真空冷冻干燥、喷雾干燥中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种富含多酚的发酵豆浆制备方法。将大豆浸泡、打浆后，不进行过滤工艺制得全豆豆浆，把德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)MT772183接种于全豆豆浆中发酵，得到富含多酚的发酵豆浆。本发明利用具有β-葡萄糖苷酶活性的德氏乳杆菌MT772183发酵全豆豆浆，豆渣的存在有效激发了德氏乳杆菌MT772183产β-葡萄糖苷酶的能力。全豆发酵过程中豆渣中不溶的多酚大量溶出，其中的游离酚、结合酚、总酚、游离黄酮(Bound flavonoid compounds，BFC)、结合黄酮(Bound flavonoid compounds，BFC)、总黄酮(Total flavonoid compounds，TFC)和大豆异黄酮苷元含量显著高于除渣豆浆和半除渣豆浆。同时，全豆发酵增加了发酵豆浆的稠厚程度(粘度)；提供了丰富的口感；发酵后的产品中含有膳食纤维、低聚糖和多酚等益生元，长期服用可调节肠道菌群，进而提高多酚的生物吸收率和生物利用率。
附图说明
图1为乳酸菌的豆浆发酵特性，其中WSM-LA未检测到微生物，WSM-b5、WSM-LA未检测到β-葡萄糖苷酶活力；
图2为乳酸菌发酵不同豆渣含量豆浆的多酚转化情况。
图3为乳酸菌发酵不同豆渣含量豆浆的黄酮转化情况。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例中所采用的德氏乳杆菌MT772183保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020332，保藏日期为2020年07月20日。
实施例1除渣工艺对于豆浆多酚含量的影响
1、样品制备工艺
大豆→浸泡12h→清洗→打浆(豆水比为1:8)→过滤或不过滤。
其中，不进行过滤工艺直接制得全豆豆浆(WSM)，过40目筛制得半除渣豆浆(MSM)，过300目筛制得除渣豆浆(LSM)。
2、多酚的提取与测定
游离酚的提取：精确称取0.500g冻干样品，加入20mL 70％丙酮溶液(丙酮：水：冰醋酸＝70：29.5：0.5，v/v/v)，在4℃下孵育2h，期间不断震荡。在4℃下以4,000r/min离心15min，收集上清液。将残余物重复萃取两次，合并三次萃取上清液，于35℃下真空蒸干有机溶剂。剩余水溶液与乙酸乙酯1:1(v/v)混合，收集乙酸乙酯相，重复萃取3次，合并乙酸乙酯萃取相，35℃下真空旋干有机试剂，收集残余液并用50％的甲醇定容至5mL，为游离酚提取液。将其避光储存于-20℃，待测。
共轭酚的提取：向游离酚萃余相中加入等体积NaOH(2M)溶液，氮封后于室温下水解6h，用6mol/L HCl溶液调节pH＝6，与乙酸乙酯1:1(v/v)混合，重复萃取3次，合并乙酸乙酯相，在35℃下旋干乙酸乙酯，收集残余液并用50％的甲醇定容至5mL，为共轭酚提取液。将其避光储存于-20℃，待测。
结合酚的提取：加入10mL NaOH(4M)至游离酚提取后的残渣中，于35℃下氮气吹扫20min，并在4℃下储存2h，期间不断震荡。用HCl(6M)将碱液中和至pH＝2，并在4℃储存2h。加入20mL 70％丙酮溶液，在4℃下储存2h，期间不断震荡。离心(4,000r/min，15min，4℃)，收集上清液。再将残余物重复萃取两次，合并三次萃取上清液，在35℃下旋干有机试剂，收集残余液并用50％的甲醇定容至50mL，为结合酚提取液。将其避光储存于-20℃，待测。
多酚的测定：多酚提取液分析前过0.45μm有机滤膜，取400μL提取液，加入2mL10％福林酚试剂，摇匀，3-8min内加入1.6mL质量分数为7.5％的Na2CO3溶液，室温下避光反应60min，在765nm处测定吸光度。以没食子酸为标准品绘制标准曲线，结果以每100mL样品中所含没食子酸当量的毫克数表示(mg/100mL)。
用总酚回收率表示WSM、MSM和LSM中的酚类物质与大豆多酚之间的关系。回收率的计算方式见式1：
用不可提取多酚与可提取多酚的比值(N/E)表示样品中不同类型酚类物质的分布情况。N/E的计算方式见式2：
用增长率表示乳酸菌发酵过程中豆浆多酚含量的变化情况。增长率的计算方式见式3：
表1大豆粉及豆浆的酚类物质含量
注：①大豆粉的酚类物质含量的单位为：mg/100g；②豆浆的酚类物质含量(的单位为：mg/100mL。
使用丙酮法和乙酸乙酯法相结合，分离了大豆粉及豆浆中的可提取多酚(游离酚和共轭酚)和不可提取多酚(结合酚)。结果显示(表1)，大豆粉的多酚以不可提取多酚为主(853.35±14.56mg/100g)，其与可提取多酚(游离酚和共轭酚的总和，即74.82±3.27mg/100g)的比值大于10。全豆豆浆、半除渣豆浆和除渣豆浆也以结合酚为主，其与可提取多酚的比值相似(10.60±0.31、10.32±0.28、10.49±0.32)。并且，全豆豆浆的酚类物质含量均显著高于半除渣豆浆和除渣豆浆(p<0.05)。
3、大豆异黄酮的测定
大豆异黄酮的定量方法参考国家标准GBT26625-2011。精确称取0.500g冻干样品，加入近25mL的80％甲醇溶液溶解。室温下超声20min后，用80％甲醇定容至25mL后离心(8,000r/min，15min，4℃)，收集上清液，使用0.45μm有机滤膜过滤后通过高效液相检测器测定。流动相由0.1％乙酸水溶液和0.1％乙酸乙腈溶液组成，使用C18色谱柱对样品进行梯度洗脱。0.1％乙酸乙腈溶液的含量变化为：0-12.5min，10％～30％；12.5-17.5min，30％～40％；17.5～18.5min，40％～100％；18.5～21min，100％；21～22.5min，100％～10％；22.5～26min，10％。测定过程中柱温保持40℃，流速为1.0mL/min，进样量为20μL，检测波长为260nm。以大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素标准品分别绘制标准曲线。结果以每100mL样品中所含标品的毫克数表示(mg/100mL)。
用糖苷与总大豆异黄酮的比值(G/T)表示样品中不同类型酚类物质的分布情况。G/T的计算方式见式4：
用增长率表示乳酸菌发酵豆浆过程中大豆异黄酮含量的变化情况。增长率的计算方式见
式5：
表2大豆粉及豆浆的大豆异黄酮含量
注：①大豆粉的大豆异黄酮含量的单位为：mg/100g；②豆浆的大豆异黄酮含量的单位为：mg/100mL。
已知大豆异黄酮由糖苷和苷元两种形式组成，大豆粉的异黄酮以糖苷为主(表2)。虽然热处理可导致大豆异黄酮出现不同形式的转换，异黄酮糖苷占总大豆异黄酮的比例有所降低，但3种豆浆的异黄酮仍以糖苷为主。随着豆渣含量的增加，豆浆中的糖苷占比越小且越偏离大豆粉的原有组成结构。与全豆豆浆相比，半除渣豆浆和除渣豆浆的总大豆异黄酮的回收率都出现显著下降(p<0.05)，并随除渣程度的增加而降低。
由此可见，使用全豆豆浆进行发酵，能够最大程度的保留豆浆中的营养素，从而提供更多可供人体吸收利用的营养物质。
实施例2豆浆的发酵特性
1、样品的制备
工艺流程：大豆→浸泡12h→清洗→打浆(豆水比为1:8)→过滤或不过滤→灭菌(121℃、20min)→冷却→接种(4％，v/v)→发酵(37℃，24h)→均质→测定。其中，不进行过滤工艺直接制得全豆豆浆(WSM)，过40目筛制得半除渣豆浆(MSM)，过300目筛制得除渣豆浆(LSM)。
菌株活化：将菌株充分活化后，挑取单个菌落接种于MRS液体培养基中，于37℃厌氧培养6～8h，离心(8,000r/min，4℃，5min)，用无菌水洗涤2次后重悬于无菌水中，调节OD600≈0.9(菌落密度约为109CFU/mL)。
接种：将德氏乳杆菌MT772183接种于WSM、MSM、LSM中得到WSM-b8、MSM-b8、LSM-b8，置于37℃连续发酵24h，每隔3h取样测定。
2、pH、酸度、乳酸菌活菌数的测定
用pH计测量样品的pH值。用氢氧化钠滴定法测定样品的酸度，其值以乳酸(°T)表示。每个样品(1mL)溶解于9mL无菌水中，稀释后的悬液涂布于MRS固体培养基上，于37℃下厌氧培养48h后，进行菌落计数。
3、β-葡萄糖苷酶活力的测定
向10mL发酵豆浆中加入10mL 0.5M磷酸钠缓冲液(0.5M，pH 6.5)，室温下振荡(200r/min，30min)，离心(8000g，10min，4℃)，沉淀用磷酸钠缓冲液(0.5M，pH 6.5)洗涤2次后，重悬于等体积磷酸钠缓冲液(0.5M，pH 6.5)中，与1mL溶菌酶(3mg/mL，20000U/mg)混合后于37℃水浴孵育30min，期间不断震荡(200r/min)。然后在细胞破碎仪中低温超声破碎(超声2s，间歇3s，45W，15min)，得到破碎液。离心(8,000g，4℃，10min)，得到的上清液即为粗酶液，用于进一步测定。
向100μL无细胞提取物中加入900μL磷酸钠缓冲液(0.5M，pH 6.5)，在37℃水浴锅中预热10min，加入1mL 5mM p-NPG(已预热)，置于37℃精确反应30min后，立即加入1mL 1M碳酸钠(4℃)终止反应，室温放置5min，在400nm处测定吸光度。以在100℃灭活30min的粗酶液、磷酸钠缓冲液作对照。以p-NP为标准品绘制标准曲线。结果以1mL发酵豆浆在37℃，pH6.5反应条件下每分钟酶解p-NPG产生1μmol p-NP的能力表示(U/mL)。
由图1可知，同样采用德氏乳杆菌MT772183发酵，WSM-b8、MSM-b8和LSM-b8的pH值变化无显著差异(图1A)。但在高酸度下WSM-b8比MSM-b8、LSM-b8的活菌数下降得慢，其中LSM-b8的活菌数下降得最快。这可能与豆浆的纤维含量、体系粘度和流变性有关，而WSM拥有更高的豆渣纤维和更高的粘度，可为德氏乳杆菌MT772183提供良好的生存环境。
在WSM-b8发酵过程中，β-葡萄糖苷酶活力呈现先增加后减少的趋势，这与德氏乳杆菌MT772183的活菌数变化趋势有关。值得注意的是，在发酵6h后，WSM-b8的β-葡萄糖苷酶活力(59.07±1.48U/mL)是MSM-b8(49.95±1.90U/mL)的1.18倍，是LSM-b8(36.43±1.38U/mL)的1.62倍。并且，WSM-b8的β-葡萄糖苷酶活力保留时间最长，在发酵18h才出现下降趋势，MSM-b8次之，LSM-b8最短。因此，豆渣的存在更利于β-葡萄糖苷酶活力的产生与保持。
实施例3产β-葡萄糖苷酶乳酸菌发酵不同豆渣含量豆浆的酚类物质转化情况分析
1、样品的制备
工艺流程：大豆→浸泡12h→清洗→打浆(豆水比为1:8)→过滤或不过滤→灭菌(121℃、20min)→冷却→接种(4％，v/v)→发酵(37℃，24h)→均质→测定。其中，不进行过滤工艺直接制得全豆豆浆(WSM)，过40目筛制得半除渣豆浆(MSM)，过300目筛制得除渣豆浆(LSM)。
菌株活化：将菌株充分活化后，挑取单个菌落接种于MRS液体培养基中，于37℃厌氧培养6～8h，离心(8,000r/min，4℃，5min)，用无菌水洗涤2次后重悬于无菌水中，调节OD600≈0.9(菌落密度约为109CFU/mL)。
接种：将德氏乳杆菌MT772183接种于WSM、MSM、LSM中得到WSM-b8、MSM-b8、LSM-b8，置于37℃连续发酵24h，每隔3h取样测定。
2、多酚的提取与测定
游离酚的提取：精确称取0.500g冻干样品，加入20mL 70％丙酮溶液(丙酮：水：冰醋酸＝70：29.5：0.5，v/v/v)，在4℃下孵育2h，期间不断震荡。在4℃下以4,000r/min离心15min，收集上清液。将残余物重复萃取两次，合并三次萃取上清液，于35℃下真空蒸干有机溶剂。剩余水溶液与乙酸乙酯1:1(v/v)混合，收集乙酸乙酯相，重复萃取3次，合并乙酸乙酯萃取相，35℃下真空旋干有机试剂，收集残余液并用50％的甲醇定容至5mL，为游离酚提取液。将其避光储存于-20℃，待测。
共轭酚的提取：向游离酚萃余相中加入等体积NaOH(2M)溶液，氮封后于室温下水解6h，用6mol/L HCl溶液调节pH＝6，与乙酸乙酯1:1(v/v)混合，重复萃取3次，合并乙酸乙酯相，在35℃下旋干乙酸乙酯，收集残余液并用50％的甲醇定容至5mL，为共轭酚提取液。将其避光储存于-20℃，待测。
结合酚的提取：加入10mL NaOH(4M)至游离酚提取后的残渣中，于35℃下氮气吹扫20min，并在4℃下储存2h，期间不断震荡。用HCl(6M)将碱液中和至pH＝2，并在4℃储存2h。加入20mL 70％丙酮溶液，在4℃下储存2h，期间不断震荡。离心(4,000r/min，15min，4℃)，收集上清液。再将残余物重复萃取两次，合并三次萃取上清液，在35℃下旋干有机试剂，收集残余液并用50％的甲醇定容至50mL，为结合酚提取液。将其避光储存于-20℃，待测。
多酚的测定：多酚提取液分析前过0.45μm有机滤膜，取400μL提取液，加入2mL10％福林酚试剂，摇匀，3～8min内加入1.6mL质量分数为7.5％的Na2CO3溶液，室温下避光反应60min，在765nm处测定吸光度。以没食子酸为标准品绘制标准曲线，结果以每100mL样品中所含没食子酸当量的毫克数表示(mg/100mL)。
将1mL多酚提取液与0.30mL的5％(w/v)NaNO2溶液混合，反应5min后添加0.50mL的2％(w/v)AlCl3·6H2O溶液。室温下反应6分钟后，向试管中加入0.50mL的1mol/L氢氧化钠溶液，再于室温下反应10分钟。510nm处测吸光度。以芦丁为标准品绘制标准曲线，结果以每100mL豆浆中含有芦丁当量的毫克数表示(mg/100mL)。
用增长率表示乳酸菌发酵过程中豆浆多酚或黄酮含量的变化情况。增长率的计算方式见式3。
由图2A可知，豆浆的游离酚含量从发酵6h左右开始出现显著差异(p<0.05)，WSM-b8的FPC增长率显著高于其他两组，而LSM-b8最低，该趋势一直维持至游离酚增长的高峰期。对应地，CPC(图2B)出现了同样的下降趋势，结合酚(图2C)也出现了对应的上升趋势。同样的，WSM-b8的黄酮增长率出现了类似的趋势(图3)。因此，产β-葡萄糖苷酶乳酸菌发酵高豆渣含量的豆浆，更有利于大豆多酚的转化与积累。
由图1C可知，豆渣的存在能提高德氏乳杆菌MT772183产β-葡萄糖苷酶的能力，并延长β-葡萄糖苷酶活性的保留时间。β-葡萄糖苷酶活力与大豆多酚变化情况显著相关。由此可见，豆渣含量越高，β-葡萄糖苷酶活力越高，越有利于大豆多酚的转化与积累。
3、大豆异黄酮的测定
大豆异黄酮的定量方法参考国家标准GBT26625-2011。精确称取0.500g冻干样品，加入近25mL的80％甲醇溶液溶解。室温下超声20min后，用80％甲醇定容至25mL后离心(8,000r/min，15min，4℃)，收集上清液，使用0.45μm有机滤膜过滤后通过高效液相检测器测定。流动相由0.1％乙酸水溶液和0.1％乙酸乙腈溶液组成，使用C18色谱柱对样品进行梯度洗脱。0.1％乙酸乙腈溶液的含量变化为：0-12.5min，10％～30％；12.5-17.5min，30％～40％；17.5～18.5min，40％～100％；18.5～21min，100％；21～22.5min，100％～10％；22.5～26min，10％。测定过程中柱温保持40℃，流速为1.0mL/min，进样量为20μL，检测波长为260nm。以大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素、染料木素标准品分别绘制标准曲线。结果以每100mL样品中所含标品的毫克数表示(mg/100mL)。用增长率表示乳酸菌发酵豆浆过程中大豆异黄酮含量的变化情况。增长率的计算方式见式5。
表3乳酸菌发酵不同豆渣含量豆浆的大豆异黄酮增长率(％)
注：每个发酵组同一列的不同上标字母代表显著性差异(p<0.05)。
三个发酵组的异黄酮糖苷转化情况类似，均能在发酵18h后实现异黄酮糖苷的全部水解(表3)。德氏乳杆菌MT772183发酵导致体系中苷元含量的上升和总大豆异黄酮含量的下降。此外，随着发酵的进行，各发酵组总大豆异黄酮的下降趋势为全豆<半除渣<除渣。如前所述，苷元的疏水作用、异黄酮与植物细胞壁的键合作用，使得豆渣中存在大量不可提取大豆异黄酮，而乳酸菌发酵可以促进大豆中不可提取酚向可提取酚转变。图1A显示在发酵过程中pH值变化无显著差异(p>0.05)，且β-葡萄糖苷酶活力呈全豆>半除渣>除渣的趋势，这说明在酶的作用下豆渣中的不可提取异黄酮不断被水解，使得苷元上升。综上所述，产β-葡萄糖苷酶的德氏乳杆菌MT772183可以释放豆渣纤维中不可提取的异黄酮，全豆发酵可带来更多的苷元型大豆异黄酮。
实施例4发酵豆浆的粘度
1、发酵豆浆的制备
工艺流程：大豆→浸泡12h→清洗→打浆(豆水比为1:8)→过滤或不过滤→灭菌(121℃、20min)→冷却→接种(4％，v/v)→发酵至pH＝4.5→均质→测定。其中，不进行过滤工艺直接制得全豆豆浆(WSM)，过40目筛制得半除渣豆浆(MSM)，过300目筛制得除渣豆浆(LSM)。
菌株活化：将菌株充分活化后，挑取单个菌落接种于MRS液体培养基中，于37℃厌氧培养6～8h，离心(8,000r/min，4℃，5min)，用无菌水洗涤2次后重悬于无菌水中，调节OD600≈0.9(菌落密度约为109CFU/mL)。
接种：将德氏乳杆菌MT772183接种于WSM、MSM、LSM中得到WSM-b8、MSM-b8、LSM-b8，置于35～42℃连续发酵10～15h。
2、粘度
从均匀的样品中取一份试样，保证完全没有空气泡。将试样置于圆形容器内，再把SP-3号同轴测量圆筒放入测量容器内，调节转速为100rpm/min，测定粘度值(mPa·s)。粘度增长率用发酵前后豆浆粘度的差值表示。
粘度能够反映菌株的产黏情况，发酵全豆豆浆的粘度增长率(402.40±0.49mPa·s)显著优于除渣豆浆(310.28±1.94mPa·s)和半除渣豆浆(235±1.68mPa·s)，这可能与菌株在全豆豆浆生长状态较好有关。
实施例5一种富含多酚的发酵豆粉制备方法
包括以下步骤：
(1)工艺流程：大豆→浸泡12h→清洗→打浆(豆水比为1:8)→灭菌(121℃、20min)→冷却→接种(4％，v/v)→发酵(37～42℃，10～15h)→均质→真空冷冻干燥(冷冻仓温度40℃，真空压力70Pa，加热板温度55℃，冻干48h)→富含多酚的发酵豆粉。
(2)菌株活化：将德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)MT772183充分活化后，挑取单个菌落接种于MRS液体培养基中，于37℃厌氧培养6～8h，离心(8,000r/min，4℃，5min)，用无菌水洗涤2次后重悬于无菌水中，调节OD600≈0.9(菌落密度约为109CFU/mL)。
所得发酵豆粉的游离酚、结合酚、共轭酚、总酚、总苷元和总大豆异黄酮含量分别为1.61±0.05、14.82±0.26、0.22±0.01、16.65±0.17、96.08±3.82和34.87±2.60mg/100g。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.德氏乳杆菌MT772183在促进豆浆豆渣中不溶性多酚溶出及共轭酚释放游离酚中的应用，其特征在于，所述不溶性多酚为结合酚和结合黄酮，共轭酚包括共轭多酚、共轭黄酮及大豆异黄酮糖苷。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用德氏乳杆菌MT772183发酵全豆豆浆。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵过程包括以下步骤：
S1、以豆水比为1：6～12进行打浆，经灭菌、冷却后接种，接种量为2～8％v/v；
S2、37～42℃发酵至pH＝4.5，发酵完成后均质即得。
4.一种发酵全豆豆浆产品的制作方法，其特征在于，利用德氏乳杆菌MT772183接种全豆豆浆进行发酵，所述豆浆产品包括发酵全豆豆浆饮品和发酵豆粉。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，当所述发酵全豆豆浆产品为发酵全豆豆浆饮品时，所述方法包括以下步骤：
S1、以豆水比为1：6～12进行打浆，经灭菌、冷却后备用；
S2、挑取德氏乳杆菌MT772183单菌落进行培养活化，调节菌落密度为109CFU/mL；
S3、37～42℃发酵至pH＝4.5，发酵完成后均质即得兼具可溶性多酚含量和稠厚程度的发酵全豆豆浆饮品。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，当所述发酵全豆豆浆产品为发酵豆粉时，是在权利要求5所述S3得到的全豆豆浆饮品的基础上进行干燥得到发酵豆粉。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述干燥选自鼓风干燥、微波干燥、真空冷冻干燥、喷雾干燥中的一种或几种。
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