CN117229916A - 一种多类器官共培养微流控芯片及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于类器官芯片领域，具体公开了一种多类器官共培养微流控芯片，包括类器官微流控芯片单体，所述类器官微流控芯片单体分为键合成型的上下两层，其中，上层依次设置有类器官培养基灌注通道、第一通道屏障、类器官培养小室、第二通道屏障和血管内皮培养通道，下层设置微灌注网络通道。本发明保证了各类器官特异的营养和微环境，有助于维持其特异表型。同时能够模拟体内的血液流动，进行类器官间信号沟通和交互，充分模拟多器官疾病的体内环境和相互作用。

Description

一种多类器官共培养微流控芯片及其使用方法

技术领域

本发明属于类器官芯片领域，具体涉及一种多类器官共培养微流控芯片及其使用方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

类器官（organoids），是由多能干细胞（pluipotent stem cell, PSC）和成体干细胞（adult stem cell, ASC）在体外培养时形成的能够进行自我组装的微观三维结构。类器官可以在结构和功能上模拟人体器官，在再生医学、基因编辑、精准医疗、器官发育、疾病建模等方面有良好的应用潜力。被《自然》杂志的子刊《Nature Methods》评为“2017年度生物技术”，类器官技术的发展在2019年被《新英格兰医学杂志》详细介绍，并登上了《科学》杂志的封面。

微流控芯片，又被称为芯片实验室（Lab-on-chip），是在微米尺度上操控流体的技术，2017年被科技部定位为“颠覆性技术”。而以微流控芯片和细胞培养相结合的器官芯片技术，可以模拟人类器官单位功能，更被世界经济论坛评为2016年世界十大新型技术之一。

将器官芯片技术与类器官相整合而形成的“类器官芯片”技术因可以在类器官发育中对信号通路进行实时可控的调节，并能充分模拟体内微环境和机械作用力而独具优势。

单类器官芯片对探究单个器官功能具有重要优势，但单类器官芯片技术无法模拟器官对损伤、疾病和治疗反应的全身性相互作用。这使得涉及多器官和血管流动的疾病（如癌症、代谢、纤维化、炎症和感染等）难以在体外实验中进行模拟研究。

目前针对多器官芯片相关疾病模型的研究，大致分为三类，第一类，过去研究多以多器官来源的单层细胞系共培养为主，此类芯片可以实现对不同类型细胞彼此间影响及串扰的研究，但无法充分发挥类器官技术在器官模拟中独特作用，而且无法避免在共培养过程中培养基之间的互相混合，从而使得各细胞无法维持自身生长的微环境和独特表型。第二类，以2022年秦建华团队发表在advanced science的微阵列小室类器官共培养芯片为代表（IF = 17.521），该研究借助类器官自组装特性，在芯片微阵列小室内实现类器官的共培养，此类研究很好地实现了类器官在芯片中的培养成长和交互作用，但仍无法避免培养基之间的互相混合影响，无法保证类器官成长独特的体内微环境。第三类，以美国哥伦比亚大学工程系和医学中心2022年发表在《Nature Biomedical Engineering》（IF=25.671）可插拔多器官芯片共培养芯片为代表，首次同时实现了（1）各器官维持各自特异微环境，（2）通过血管内皮通道流动实现不同器官间的交互沟通，（3）通过选择性渗透屏障将血管通道和器官培养腔室分离。但该器官芯片在较大尺寸下进行培养，无法实现在微米层面的微流控液体灌注和类器官生长。

上述缺陷未能解决主要挑战有三：第一，以多器官来源的单层细胞系共培养芯片和微阵列小室类器官共培养芯片虽相对成熟，但目前方案均未添加内皮屏障，从而无法彻底解决共培养期间培养基的混合和干扰难题。因此无法在培养过程中保证类器官独特的营养和微环境。第二，目前以胶滴法为代表的类器官培养芯片因普遍存在灌胶难度大，失败率高，类器官灌注不足的难题，未能成为类器官芯片培养的主流方案。第三，目前类器官微流控芯片制作难度大，制作和使用成本高，难以在微米尺度上满足多类器官共培养微流控芯片的设计要求。

发明内容

基于上述研究背景，一种多类器官共培养微流控芯片，保证了各类器官特异的营养和微环境，有助于维持其特异表型。同时能够模拟体内的血液流动，进行类器官间信号沟通和交互，充分模拟多器官疾病的体内环境和相互作用。

本发明第一方面，提供一种多类器官共培养微流控芯片，包括类器官微流控芯片单体，所述类器官微流控芯片单体分为键合成型的上下两层，其中，上层依次设置有类器官培养基灌注通道、第一通道屏障、类器官培养小室、第二通道屏障和血管内皮培养通道，下层设置微灌注网络通道，所述类器官培养基灌注通道和所述微灌注网络通道连通，所述第一通道屏障和所述第二通道屏障分别设置有隔孔，不同的类器官共培养微流控芯片单体之间血管内皮培养通道连通。

进一步的，所述类器官培养基灌注通道、第一通道屏障、类器官培养小室、第二通道屏障和血管内皮培养通道在上层芯片的下表面依次设置，并且向上设置，所述微灌注网络通道在下层芯片的上表面向下设置。

进一步的，类器官培养小室中灌注含有类器官悬液的基质胶。

进一步的，血管内皮培养通道灌注含有血管内皮细胞的血管内皮培养基。

进一步的，所述类器官微流控芯片单体数量为2、3或4。

第一通道屏障和第二通道屏障采用隔孔设计，灌胶时利用胶体分子表面张力（phaseguide）保证灌胶的成功率。

血管内皮培养通道设计有血管内皮细胞形成的选择性渗透屏障，同时保障类器官的独立生长和类器官间的信号交互。

芯片下层设计有微灌注网络通道，最大限度提高了类器官的灌注效率，保障营养供给以及代谢废物的排出。

进一步的，所述类器官培养基灌注通道、所述类器官培养小室和所述血管内皮培养通道端部分别设置灌注孔。所述类器官培养基灌注通道和所述血管内皮培养通道分别灌注类器官培养基和血管内皮培养基，类器官培养小室灌注孔灌注含有类器官悬液的基质胶。灌注孔的设计有助于芯片的灌胶或者灌注培养基，有助于在共培养芯片微流控体系中外接管道。

进一步的，所述隔孔的内侧宽度小于等于外侧宽度，更进一步的，隔孔内侧宽度为60μm，隔孔外侧宽度为100μm。

芯片上下两层键合成型后，形成类器官培养小室，类器官培养小室可以分为多个观测空间，例如4个长为1200μm，宽度为800μm，深度为600μm（上层和下层各300μm）的类器官培养观测空间，在培养小室中，种子细胞可在基质胶中通过自组装生长成为类器官。

进一步的，芯片下层在所述观测空间位置设置有凹陷。

本发明另一方面，提供一种多类器官共培养微流控芯片的使用方法，其步骤为：

1）将芯片倒置，自下方类器官培养小室灌注孔自下向上灌注混有类器官悬液的基质胶；

2）静置，基质胶凝固后，将芯片正置，基质胶进一步凝固；

3）类器官培养基灌注通道灌注类器官培养基，血管内皮培养通道灌注含有血管内皮细胞的血管内皮培养基，静置，使内皮细胞粘附在血管内皮培养通道表面；

4）类器官培养基灌注通道和血管内皮培养通道分别外接蠕动泵，循环提供培养基，类器官在类器官培养小室内自组装，逐渐生长成为成熟的类器官。

本发明另一方面，提供一种多类器官共培养微流控芯片的循环灌注体系，所述类器官培养基灌注通道、所述血管内皮培养通道两端的灌注孔分别通过管道连接蠕动泵和培养基，蠕动泵和培养基通过管道连接。以蠕动泵为动力，建立类器官营养通道及血管通道的循环灌注体系，便于灌注液的收集和检测。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本多类器官共培养微流控芯片可在微米尺度上同时满足2-4种不同类器官的共培养和自由组合，可广泛用于模拟涉及两种及以上类器官的多器官的系统性疾病（如癌症，代谢，炎症感染等）以及多器官药物作用和毒性评估等难以在体外实验模拟的研究，填补了业内空白，具有广泛的应用价值。

微灌注通道的加入，极大地增加了类器官灌注的效率，提升营养和代谢产物的交换效率，可满足类器官长期培养的需要。

通道屏障的加入，保证了各类器官特异的营养和微环境，有助于维持其特异表型。同时各类器官可通过选择性渗透屏障借助循环通道，模拟体内的血液流动，进行类器官间信号沟通和交互，充分模拟多器官疾病的体内环境和相互作用。

本芯片可适应于常规微流控芯片的检测手段和实时动态观察。同时储液管的存在和培养基的循环流动，方便随时更换培养基，并可对循环培养基的PH、营养成分、代谢废物、化合物浓度、信号分子、外泌体等十种以上成分进行检测评估，极大丰富了检测手段。

本多类器官微流控类器官共培养芯片最大限度发挥软光刻工艺优势，采用制造精度高的硅片作为光刻模具，以PDMS为基质进行加工，可规模化量产，且单芯片制作成本低，良品率高，具有很好地商用潜力。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：多类器官共培养微流控芯片结构示意图；

图2：上层结构示意图；

图3：下层微灌注网络通道示意图；

图4：隔孔结构示意图；

图5：血管内皮细胞粘附示意图；

图6：双类器官微流控共培养芯片示意图；

图7：双类器官微流控共培养芯片实物图；

图8：芯片使用方法示意图；

图9：芯片的循环灌注体系示意图；

其中：1为类器官培养基灌注通道，2为第一通道屏障，3为类器官培养小室，4为第二通道屏障，5为血管内皮培养通道，6为微灌注网络通道，7为隔孔，8为观测空间，9为灌注孔。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。

实施例：

如图1-7所示，一种多类器官共培养微流控芯片，包括类器官微流控芯片单体，所述类器官微流控芯片单体分为键合成型的上下两层，其中，上层依次设置有类器官培养基灌注通道1、第一通道屏障2、类器官培养小室3、第二通道屏障4和血管内皮培养通道5，下层设置微灌注网络通道6，所述类器官培养基灌注通道1和所述灌注网络通道6连通，所述第一通道屏障2和所述第二通道屏障4分别设置有隔孔7，不同的类器官微流控芯片单体之间血管内皮培养通道5连通。

类器官培养小室3中灌注含有类器官悬液的基质胶。

血管内皮培养通道5灌注含有血管内皮细胞的血管内皮培养基。

进一步的，所述类器官微流控芯片单体数量为2、3或4。

第一通道屏障2和第二通道屏障4采用隔孔7设计，灌胶时利用胶体分子表面张力（phaseguide）保证灌胶的成功率。所述隔孔7宽度为内侧小于等于外侧，更进一步的，隔孔7内侧宽度为60μm，隔孔7外侧宽度为100μm。

血管内皮培养通道5设计有血管内皮细胞形成的选择性渗透屏障，同时保障类器官的独立生长和类器官间的信号交互。

芯片下层设计有微灌注网络通道6，最大限度提高了类器官的灌注效率，保障营养供给以及代谢废物的排出。

进一步的，所述类器官培养基灌注通道1、所述类器官培养小室3和所述血管内皮培养通道5端部分别设置灌注孔9。所述类器官培养基灌注通道1和所述血管内皮培养通道5分别灌注类器官培养基和血管内皮培养基，类器官培养小室3灌注孔灌注含有类器官悬液的基质胶。灌注孔9的设计有助于芯片的灌胶或者灌注培养基，有助于在共培养芯片微流控体系中外接管道。

芯片上下两层键合成型后，形成类器官培养小室3，类器官培养小室3可以分为多个观测空间8，例如4个长为1200μm，宽度为800μm，深度为600μm（上层和下层各300μm）的类器官培养观测空间8，在培养小室中，种子细胞可在基质胶中通过自组装生长成为类器官。

芯片下层在所述观测空间8位置设置有凹陷。

如图8，一种多类器官共培养微流控芯片的使用方法，其步骤为：

1）将芯片倒置，自下方类器官培养小室3灌注孔自下向上灌注混有类器官悬液的基质胶；图8中图8A为芯片正置示意图，图中数字为具体部位尺寸单位为μm。图8B为芯片倒置灌注基质胶示意图，基质胶灌注到类器官培养小室3中。

2）静置，基质胶凝固后，将芯片正置，基质胶进一步凝固；

3）类器官培养基灌注通道1灌注类器官培养基，血管内皮培养通道5灌注含有血管内皮细胞的血管内皮培养基，静置，使内皮细胞粘附在血管内皮培养通道表面；图8C为芯片灌注类器官培养基（红色阴影）和血管内皮培养基（蓝色阴影）示意图，图8D为芯片血管内皮细胞粘附（蓝色阴影部位外圈实现蓝色线条）示意图。血管内皮细胞粘附在血管内皮培养通道5内壁和隔孔7内，如图5，形成选择性渗透屏障。

4）类器官培养基灌注通道1和血管内皮培养通道5分别外接蠕动泵，循环提供培养基，类器官在类器官培养小室3内自组装，逐渐生长成为成熟的类器官。

如图9，一种多类器官共培养微流控芯片的循环灌注体系，所述类器官培养基灌注通道3、所述血管内皮培养通道5两端的灌注孔9分别通过管道连接蠕动泵和培养基，蠕动泵和培养基通过管道连接。以蠕动泵为动力，建立类器官营养通道及血管通道的循环灌注体系，便于灌注液的收集和检测。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种多类器官共培养微流控芯片，其特征是，包括类器官微流控芯片单体，所述类器官微流控芯片单体分为键合成型的上下两层，其中，上层依次设置有类器官培养基灌注通道、第一通道屏障、类器官培养小室、第二通道屏障和血管内皮培养通道，下层设置微灌注网络通道，所述类器官培养基灌注通道和所述微灌注网络通道连通，所述第一通道屏障和所述第二通道屏障分别设置有隔孔，不同的类器官共培养微流控芯片单体之间血管内皮培养通道连通。

2.如权利要求1所述的多类器官共培养微流控芯片，其特征是，所述类器官培养基灌注通道、第一通道屏障、类器官培养小室、第二通道屏障和血管内皮培养通道在上层芯片的下表面依次设置，并且向上设置，所述微灌注网络通道在下层芯片的上表面向下设置。

3.如权利要求1所述的多类器官共培养微流控芯片，其特征是，类器官培养小室中灌注含有类器官悬液的基质胶；管内皮培养通道灌注含有血管内皮细胞的血管内皮培养基。

4.如权利要求1所述的多类器官共培养微流控芯片，其特征是，所述类器官微流控芯片单体数量为2、3或4。

5.如权利要求1所述的多类器官共培养微流控芯片，其特征是，所述血管内皮培养通道设计有血管内皮细胞形成的选择性渗透屏障。

6.如权利要求1所述的多类器官共培养微流控芯片，其特征是，所述隔孔的内侧宽度小于等于外侧宽度。

7.如权利要求1所述的多类器官共培养微流控芯片，其特征是，隔孔内侧宽度为60μm，隔孔外侧宽度为100μm。

8.如权利要求1所述的多类器官共培养微流控芯片，其特征是，芯片上下两层键合成型后，形成类器官培养小室，类器官培养小室可以分为多个观测空间

一种多类器官共培养微流控芯片的使用方法，其特征是，步骤为：

1）将芯片倒置，自下方类器官培养小室灌注孔自下向上灌注混有类器官悬液的基质胶；

2）静置，基质胶凝固后，将芯片正置，基质胶进一步凝固；

3）类器官培养基灌注通道灌注类器官培养基，血管内皮培养通道灌注含有血管内皮细胞的血管内皮培养基，静置，使内皮细胞粘附在血管内皮培养通道表面；

4）类器官培养基灌注通道和血管内皮培养通道分别外接蠕动泵，循环提供培养基，类器官在类器官培养小室内自组装，逐渐生长成为成熟的类器官。

9.一种多类器官共培养微流控芯片的循环灌注体系，其特征是，所述类器官培养基灌注通道、所述血管内皮培养通道两端的灌注孔分别通过管道连接蠕动泵和培养基，蠕动泵和培养基通过管道连接。

10.以蠕动泵为动力，建立类器官营养通道及血管通道的循环灌注体系，便于灌注液的收集和检测。