KR20210005606A - 멀티레인 혈관구조용 시스템 및 방법 - Google Patents
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Abstract
시험관내 모델에서 멀티레인 관구조 및 다기관 혈관성-관 유체 계면을 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 상기 방법은 적어도 하나의 조직을 3D 구조 내로 매립하는 단계, 상기 조직 또는 조직들 내로 영양분 관류를 위한 관 계면을 형성하는 단계, 관 속성을 변형시켜 자연적인 생물학적 표적 조직 또는 표적 환경의 특성을 갖도록 상기 관 계면 또는 계면들을 함께 또는 별도로 조율하는 단계, 및 생리학적으로 재현하는 방식으로 성장 유체를 제공하기 위해 유체 계면 채널을 라이닝하는 단계를 포함한다. 상기 3D 구조는 관신생 또는 관형성을 위한 관형성 요소를 포함한다.
Description
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 그 전체가 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 2018년 3월 26일자 출원된 미국 가출원 일련 번호 제62/648,209호에 대한 우선권을 주장한다.
연방 기금 연구와 관련된 설명
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 지급된 승인 번호 1UG3TR002198-01 하의 정부 지원에 의해 수행되었다. 정부는 본 발명에 대한 일정한 권리를 갖는다.
어떤 칩-상-기관(organ-on-chip) 장치는 그 내부에 인간 생리학의 조직- 및 기관-레벨 요소가 재현(recaptulation)될 수 있는 미세 가공된 생물학적 세포-배양 구획을 포함할 수 있다. 상기 미세 가공된 생물학적 세포-배양 구획은 해당 기관 시스템(예컨대, 췌장을 모방하기 위한 인슐린-분비 섬(islet) 단위, 폐에서의 산소 운반을 모방하기 위한 공기-액체 계면(interface))의 기능적 생물학적 단위의 생물학적 시험관내 모델링을 허용할 수 있다. 이러한 모델은 살아있는 인간 개체의 필요 없이 살아있는 인간 조직에 대한 테스트를 수행할 수 있다.
그러나, 어떤 칩-상-기관은 기능적 및/또는 실제적 다기관 네트워크를 생성하는데 실패하며, 전신 레벨에서 복잡한 생리학적 반응 및 다기관 상호작용을 재현할 수 없다. 2D 모델에서, 페트리 접시 상에 자란 단층의 내피 세포는 관의 내강을 나타내지만, 이러한 접근법은 관의 거동에 전형적으로 수반되는 다른 세포(예컨대, 혈관주위세포(pericyte) 및 평활근 세포)의 부재로 인해 제한될 수 있다. 어떤 기관-칩 시스템은 불충분한 관류 효율로 인해 히드로겔(hydrogel) 또는 다른 스캐폴드(scaffold) 내에 자란 3D 조직의 크기를 제한하는 확산 제약을 갖는다. 더 큰 조직은 조직의 발생, 생존, 조절, 및 항상성을 위해 보다 효율적인 관류를 필요로 한다. 어떤 조직은 생체내에서 생리학적 상태로 분화하기 위해, 또는 생물학적 기능을 수행하기 위해 혈관 조직 또는 관구조로부터의 미세환경 신호를 필요로 한다.
따라서, 치료적 적용 및 약물 스크리닝을 위한 칩-상-기관 장치를 위해서는 개선된 관류 효율을 갖는 다기관 네트워크 및 여기에 대한 계면을 생성할 필요성이 존재한다.
본 개시된 주제는 단일 또는 다중 시험관내 조직으로, 이로부터, 또는 이들 사이의, 또는 인간 또는 동물 생존 조직 내에서 다중 생체내 조직으로, 이로부터, 또는 이들 사이의 멀티레인 관구조, 또는 관류가능한 관 유체 계면을 생성하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다.
소정 구현예에서, 미세생리학적 장치 또는 칩-상-기관 장치를 이용한 조직의 배양 방법은 적어도 2개의 조직을 3D 구조 내로 매립(embedding)하는 단계를 포함하며, 여기서 3D 구조는 관형성 요소(vasculogenic element)를 포함한다. 영양분 관류를 위한 관 계면이 상기 적어도 2개의 조직 내에 형성되며, 적어도 하나의 관 속성을 변형시킴으로써 자연적인 생물학적 표적 조직 또는 표적 환경의 특성을 갖도록 조율된다. 혈관 생산을 촉진하기 위하여 유체 계면 채널이 3D 구조에 라이닝 및 커플링되어서 여기에 성장 유체를 제공할 수 있다. 해당 시스템은 본 명세서에 유사하게 개시된다.
소정 구현예에서, 미세생리학적 장치 또는 칩-상-기관 장치를 이용한 조직 배양 방법은 1가지 타입의 조직을 3D 구조 및 하나 이상의 관형성 요소 내로 매립하는 단계를 포함한다. 영양분 관류를 위한 관 계면은 상기 조직 내로, 또는 상기 조직으로부터, 또는 상기 조직 내로 및 이로부터 형성되며, 적어도 하나의 관 속성을 변형시킴으로써 자연적인 생물학적 표적 조직 또는 표적 환경의 특성을 갖도록 조율된다. 혈관 생산을 촉진하기 위하여 유체 계면 채널이 3D 구조에 라이닝 및 커플링되어서 여기에 성장 유체를 제공할 수 있다. 해당 시스템은 본 명세서에 유사하게 개시된다.
소정 구현예에서, 상기 방법은 관 계면을 생성하기 위하여 적어도 2개의 조직 사이에 관형성 조직의 절편(section), 요소, 또는 층을 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 관형성 요소 및 상기 관형성 조직의 층은 저산소증 유도 인자(HIF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 및/또는 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 복수의 관 계면을 연결하여 멀티-레인 관구조 배양 시스템을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.
소정 구현예에서, 상기 방법은 혈관성 관 구조를 통해 조직으로 유체 통신을 가능하게 하기 위해 하나 이상의 관 계면을 생성하기 위하여 한 조직의 상류, 또는 하류, 또는 상류 및 하류에 관형성 조직의 절편, 요소, 또는 층을 도입하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 관형성 요소 및 관형성 조직의 층은 저산소증 유도 인자(HIF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 및/또는 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 멀티-레인 관구조 배양 시스템을 형성하기 위하여 복수의 관 계면을 연결하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
소정 구현예에서, 상기 관구조의 관 속성은 다음 중 하나 이상을 변형함으로써 자연적인 생물학적 표적 조직의 특성을 갖도록 조율될 수 있다: 관 밀도, 관 직경, 관 장벽 기능, 관 질환 증상, 또는 이들 변형의 하나 또는 조합을 (예컨대, 관 세포 또는 관 조직에 대한 기계자극감지 피드백(mechanosensory feedback)을 통해) 직접적으로 달성하는 (강성도, 구멍 크기, 또는 노출된 화학적 모이어티(moiety) 또는 화학적 기를 포함하는) 물질 특성.
본 개시의 추가적인 특징 및 이점은 본 개시의 예시적 구현예를 보여주는 부속 도면과 함께 다음의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다.
도 1은 3D 미세 생리학적 조직 배양 장치에서 3D 피브린 히드로겔 내의 예시적인 조작된 관구조를 도시한다. 기준자(Scalebar) 200 ㎛.
도 2는 미세 생리학적 장치 내의 조작된 관구조(RFP-발현 혈관 내피 세포)의 비어있는 내강을 통한 1 ㎛ 형광 비드(바닥으로부터의 점)의 예시적인 관류를 도시한다.
도 3은 미세 생리학적 장치 내의 3D ECM 히드로겔에서 외식된(explanted) 인간 섬 조직에 대한 조작된 관 계면의 예시적 다이어그램을 도시한다.
도 4는 마우스로부터 단리된 GFP-발현 췌장 섬을 갖는 내피-라인 관의 예시적인 조작된 3D 관 계면을 도시한다.
도 5는 인간 골수 조직이 3D 관 계면을 통해 유체적으로 접근가능하고, 이는 다시 유체 채널의 모든 면이 혈관 내피 세포로 코팅됨으로써 정의된 크기의 혈관성 관을 형성하도록 형성된 큰 관 유체 계면에 계면화된 골수 모델의 예시적인 개략적 다이어그램을 도시한다.
도 6은 그 내부에 형성된 관의 내강 직경에 의해 통제되는 유체 흐름 및 크기-기반 선택성에 의해 구동될 때 조작된 3D 관 유체 계면을 통한 중앙 골수 조직 구획으로부터의 백혈구의 예시적 관류를 도시한다.
도 7은 유체 현탁액(가운데) 내에 포획된 백혈구의 유입(inflow) 및 유출(outflow) 측 상의 예시적 3D 관 계면(내피)을 도시한다.
도 8은 본 개시된 문제에 따른 2개의 3D 관 계면을 갖는 예시적 시스템을 도시한다.
도 9는 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다.
도 10은 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 조직은 인접하는 유동 채널 사이에 연속적이고 관류가능한 관 연결을 형성한다.
도 11은 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 다수의 분리된 조직은 상기 분리된 조직 사이에 배치된 다수의 관 계면 물질을 통해 유체 통신한다.
도 12는 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 다수의 인접한 조직 타입은 순환 시스템에 대한 생물학적 계면을 시뮬레이션하기 위하여 관 계면 물질에 의해 미세유체 채널의 미세 챔버에 계면화된다.
도 13은 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 다수의 분리된 조직은 관 계면 물질을 다수 위치시킴으로써 인트라(intra)-관화된다. 상기 공정은 혈액 순환에서 생물학적 접속을 시뮬레이션하는 관류가능한 다수-조직 네트워크의 형성을 촉진한다.
도 14는 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 다수의 인접한 조직은 관 계면 물질에 의해 인트라-관화되어 관류가능한 다수-조직 물질을 형성한다.
도 15는 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 별개의 조직이 채널 내로 흐른 후 관화된다.
도 16은 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 별개의 조직이 프리-겔(pre-gel) 관 물질에 현탁되고 챔버 내에 위치된다. 관 계면 물질은 캡슐화된 조직과 계면을 형성한다.
도 17은 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 관 계면의 면적 증가는 단층의 세포를 갖는 미세채널 또는 유체 챔버를 라이닝함으로써 생성된다.
도 18은 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 별개의 조직이 챔버 내로 흐른 후 관화된다. 단층을 형성할 수 있는 조직은 유동 채널 내로 매립된다.
도면 전체에서, 동일한 참조 번호 및 문자는, 달리 나타내지 않는 한, 도시된 구현예의 동일한 특징, 요소, 성분 또는 그의 일부를 나타내기 위해 사용된다. 또한, 이제 본 개시는 도면을 참조하여 상세히 설명될 것이지만, 이는 예시적인 구현예와 연관되어 행해진 것이다.
도 1은 3D 미세 생리학적 조직 배양 장치에서 3D 피브린 히드로겔 내의 예시적인 조작된 관구조를 도시한다. 기준자(Scalebar) 200 ㎛.
도 2는 미세 생리학적 장치 내의 조작된 관구조(RFP-발현 혈관 내피 세포)의 비어있는 내강을 통한 1 ㎛ 형광 비드(바닥으로부터의 점)의 예시적인 관류를 도시한다.
도 3은 미세 생리학적 장치 내의 3D ECM 히드로겔에서 외식된(explanted) 인간 섬 조직에 대한 조작된 관 계면의 예시적 다이어그램을 도시한다.
도 4는 마우스로부터 단리된 GFP-발현 췌장 섬을 갖는 내피-라인 관의 예시적인 조작된 3D 관 계면을 도시한다.
도 5는 인간 골수 조직이 3D 관 계면을 통해 유체적으로 접근가능하고, 이는 다시 유체 채널의 모든 면이 혈관 내피 세포로 코팅됨으로써 정의된 크기의 혈관성 관을 형성하도록 형성된 큰 관 유체 계면에 계면화된 골수 모델의 예시적인 개략적 다이어그램을 도시한다.
도 6은 그 내부에 형성된 관의 내강 직경에 의해 통제되는 유체 흐름 및 크기-기반 선택성에 의해 구동될 때 조작된 3D 관 유체 계면을 통한 중앙 골수 조직 구획으로부터의 백혈구의 예시적 관류를 도시한다.
도 7은 유체 현탁액(가운데) 내에 포획된 백혈구의 유입(inflow) 및 유출(outflow) 측 상의 예시적 3D 관 계면(내피)을 도시한다.
도 8은 본 개시된 문제에 따른 2개의 3D 관 계면을 갖는 예시적 시스템을 도시한다.
도 9는 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다.
도 10은 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 조직은 인접하는 유동 채널 사이에 연속적이고 관류가능한 관 연결을 형성한다.
도 11은 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 다수의 분리된 조직은 상기 분리된 조직 사이에 배치된 다수의 관 계면 물질을 통해 유체 통신한다.
도 12는 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 다수의 인접한 조직 타입은 순환 시스템에 대한 생물학적 계면을 시뮬레이션하기 위하여 관 계면 물질에 의해 미세유체 채널의 미세 챔버에 계면화된다.
도 13은 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 다수의 분리된 조직은 관 계면 물질을 다수 위치시킴으로써 인트라(intra)-관화된다. 상기 공정은 혈액 순환에서 생물학적 접속을 시뮬레이션하는 관류가능한 다수-조직 네트워크의 형성을 촉진한다.
도 14는 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 다수의 인접한 조직은 관 계면 물질에 의해 인트라-관화되어 관류가능한 다수-조직 물질을 형성한다.
도 15는 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 별개의 조직이 채널 내로 흐른 후 관화된다.
도 16은 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 별개의 조직이 프리-겔(pre-gel) 관 물질에 현탁되고 챔버 내에 위치된다. 관 계면 물질은 캡슐화된 조직과 계면을 형성한다.
도 17은 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 관 계면의 면적 증가는 단층의 세포를 갖는 미세채널 또는 유체 챔버를 라이닝함으로써 생성된다.
도 18은 본 개시된 문제에 따른 방법에서의 예시적 단계를 도시하는 다이어그램이다: 별개의 조직이 챔버 내로 흐른 후 관화된다. 단층을 형성할 수 있는 조직은 유동 채널 내로 매립된다.
도면 전체에서, 동일한 참조 번호 및 문자는, 달리 나타내지 않는 한, 도시된 구현예의 동일한 특징, 요소, 성분 또는 그의 일부를 나타내기 위해 사용된다. 또한, 이제 본 개시는 도면을 참조하여 상세히 설명될 것이지만, 이는 예시적인 구현예와 연관되어 행해진 것이다.
복수의 미세유체 장치를 이용한 칩-상-기관 상의 생체 기관 또는 시스템을 제조하기 위한 기술이 본 명세서에 개시된다. 본 개시된 주제는 상기 칩-상-기관에서 한 기능적 단위를 다른 단위와 계면화하여 피드-포워드(feed-forward) 및 피드백 효과를 모델링함으로써 전문화된 개인에 대한 필요 없이 상기 칩-상-기관을 이용한 완전히 또는 부분적으로 자동화된 기관 배양을 수행할 수 있다.
소정 구현예에서, 본 개시된 주제는 미세 생리학적 조직 배양 시스템을 제공한다. 상기 미세 생리학적 조직 배양 시스템은 조작된 관 네트워크를 포함할 수 있다. 예를 들면, 혈관 내피 세포, 섬유아세포, 혈관주위세포, 중간엽(mesenchymal) 줄기 세포, 및/또는 평활근 세포는 VEGF, FGF, 및 내피 성장 호르몬을 포함하는 관형성 인자를 함유하는 내피 세포 배지로 보충된 3D ECM 스캐폴드 또는 히드로겔 내로 함께 접종될 수 있다. 도 1에 나타낸 것과 같이, 3D 피브린 히드로겔, 또는 콜라겐 히드로겔, 또는 생체적합성 히드로겔, 또는 이들의 조합은 관구조 조작을 위해 사용될 수 있다. 상기 성장 인자의 존재 시, 상기 세포는 관형성, 관신생(angiogenesis), 또는 관형성 또는 관신생의 조합의 공정을 통해 비어있고 관류가능한 내강을 갖는 패턴화된 관 구조를 형성할 수 있다.
소정 구현예에서, 상기 미세 생리학적 조직 배양 시스템은 관 겔의 벽 상의 내피 세포의 층을 갖는 라인을 포함할 수 있다. 예를 들면, 단층 라인의 내피 세포는 히드로겔로 관신생 스프라우팅(sprouting)을 추진할 수 있다. 상기 단층을 갖는 미세 생리학적 조직 배양 시스템은 상기 3D 겔 매트릭스 내에서 겔의 내피 라이닝의 외부 내강으로 관 형성을 문합시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 2-7일의 성장 후, 상기 3D 미세 생리학적 조직 배양 시스템은 주위의 기질(stroma) 내에서 혈관주위세포 또는 섬유아세포 또는 이들의 조합에 의해 둘러싸인 비어있는 내피 세포-라이닝 내강을 포함하는 관의 관류가능한 관 네트워크를 가질 수 있다(도 2 및 도 10).
소정 구현예에서, 상기 미세 생리학적 조직 배양 시스템은 다수의 조작된 또는 자연적인 조직 타입 사이에 관 계면을 가질 수 있다. 상기 미세 생리학적 조직 배양 시스템은 상기 관 계면에서 생산된 관 조직을 포함하는 2 이상의 조직 타입을 연결함으로써 신체-규모 또는 기관-규모 조직 역학을 재현하는 3D 세포 배양 모델일 수 있다. 현미경, 용출액 샘플링, 통합된 바이오센싱(biosensing), 또는 물리적/구조적 측정에 의해 모아진 데이터를 사용하여 3D 미세 생리학적 조직 배양 시스템 또는 3D 세포 배양 시스템을 생성할 수 있다. 본 개시된 배양 시스템은 치료 적용분야, 인간 조직 생검(biopsy) (예컨대, 암 생검, 샘플링된 미생물 배양 및/또는 감염)의 배양, 또는 약물의 스크리닝을 위해 사용될 수 있다.
소정 구현예에서, 상기 3D 미세 생리학적 미세유체 시스템은 조직 내에서 혈관을 촉진함으로써 조직의 발생, 생존, 조절, 및 항상성을 위한 관류를 제공할 수 있다. 혈액은 영양분, 산소, 신호전달 호르몬, 적혈구, 혈소판, 백혈구, 및 줄기 세포를 포함하는 다양한 세포 타입뿐만 아니라 대사성 폐기물 및 이산화탄소를 운반할 수 있다. 인간 조직을 관류시키기 위하여, 상기 3D 미세 생리학적 미세유체 시스템은 심장을 떠나는 대동맥(예컨대, 20-30 ㎜ 직경)으로부터 동맥(예컨대, 0.1-10 ㎜ 직경), 소동맥(예컨대, 0.01-0.1 ㎜ 직경), 및 말초혈관(예컨대, 0.005-0.01 ㎜ 직경)을 통해 분지될 수 있는 인체와 유사한 관 시스템을 가질 수 있고, 이 점에서 주위 조직 내로 및 조직으로부터 혈액매개(bloodborne) 요소의 확산 및 운반이 일어날 수 있다. 모세관 네트워크로부터, 혈액은 소정맥(0.008-0.1 ㎜ 직경) 및 정맥(0.1-15 ㎜ 직경)을 통해 다시 순환될 수 있다. 혈관은 내피 세포로부터 형성된 내부 내피를 포함할 수 있고, 이것은 결합 조직에서 신경분포(innervated) 평활근 세포, 관성 혈관주위세포, 및 섬유아세포에 의해 둘러싸여 있다.
소정 구현예에서, 상기 3D 미세 생리학적 미세유체 시스템은 생물학적 조직과 이를 관류시키는 관 사이에 일어날 수 있는 상호 신호전달을 제공할 수 있다. 인간 조직에서 국소 저산소증 또는 영양분 결핍은 저산소증 유도 인자(HIF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 및 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF)를 포함하는 신호전달 분자의 분비를 초래할 수 있다. 신호전달 분자의 분비는 관형성, 전구체 세포로부터 혈관의 형성, 및 관신생, 기존의 내피 조직으로부터 관의 스프라우팅을 촉진할 수 있다. 예를 들면, 관형성 내피 세포에 의해 형성된 발생기 관은 배아 발생 동안의 조직 탈라인화(delineation) 및 유도성 신호전달, 및 항상성을 관장하는 인슐린 및 다른 호르몬이 분비되는 조밀하게 관을 이룬 섬과 연관될 수 있다. 상기 섬은 천공된 모세관과 밀접하게 접촉해 존재하고, 그 내부 혈액의 포도당 농도를 샘플링하여서, 그 반응으로 인슐린을 방출한다: 그 관 환경을 포함하지 않는 췌장 섬의 시험관내 모델을 생성하는 것은 근시안적인 것이다. 부가적으로, 내피 세포 및 평활근 세포는 약물-유도성 관 상처로 인한 손상의 표적일 수 있지만, 생성된 병소는 특정 구조, 예컨대 관상 동맥에서의 분지점으로 국부화될 수 있다.
소정 구현예에서, 상기 3D 미세 생리학적 미세유체 시스템은 상이한 관구조의 구조를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 관구조의 구조는 서로 단단히 접합을 형성하여 인간 뇌에서 뇌 내로의 분자 통과의 허용을 조절할 수 있는(즉, 혈액-뇌 장벽) 뇌에서의 내피 세포 라이닝 혈관을 포함할 수 있다. 부가적으로, 상기 3D 미세 생리학적 미세유체 시스템은 그 벽이 평활근 세포, 결합 조직, 및 폐에서 폐포 가스 교환을 담당하는 얇은 미세 관을 함유하는 관구조의 구조를 포함할 수 있다.
소정 구현예에서, 본 개시된 미세 생리학적 미세유체 시스템은 적어도 하나의 챔버를 포함할 수 있다. 상기 챔버의 형태는 목적에 기초하여 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 챔버는 스트레이트 레인일 수 있다. 예를 들면, 상기 챔버는 전체적으로 또는 부분적으로 다른 챔버를 캡슐화할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 챔버는 수직으로 패턴화될 수 있다. 상기 챔버는 서로 인접하게 위치할 수 있다. 또한, 상기 패턴을 통한 흐름은 조정가능한 방식으로 네트워크화 될 수 있다. 상기 챔버는 혈류에서 물질의 분배 모델링(partition modeling)을 생성하도록 제조될 수 있다. 예를 들면, 튜브는 장치의 조직의 상이한 면적에 접근하여 방향성 접속을 생성하는 임의의 2 이상의 포트 사이에 위치할 수 있다. 임의의 상기 포트를 통해 바깥으로 흐르는 유체 용출액이 수집될 수 있다. 예를 들면, 상기 조직 중 하나는 5-레인 구현예의 중심에 위치할 수 있고, 약물 후보물질을 갖는 흐름은 좌측의 제1 관 계면 및 우측의 제2 관 계면을 통해 조직을 통과해 왼쪽에서 오른쪽으로 흐를 수 있다. 상기 조직 전후의 관 포트 내의 유출물은 약물의 대사를 측정하기 위해 수집될 수 있다. 도 13에 나타낸 것과 같이, 오른쪽 표적 기관을 갖는 왼쪽 조직은 관구조에 계면화되어서 왼쪽 조직 전, 왼쪽 조직 후이지만 표적 기관 전, 및 표적 기관 후에 용출액을 샘플링할 수 있다: 표적 기관의 분비 생성물에 대한 약물의 대사 및 그 효과가 측정될 수 있다. 본 개시된 장치는 관 상호연결을 갖는 22 이상 기관으로 확장될 수 있다.
소정 구현예에서, 본 개시된 주제는 3D 관 계면을 생성하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 적어도 2개의 실질성(parenchymal) 3D 조직을 계면화하는 것을 포함할 수 있다. 상기 실질성 조직은 관 또는 비-관(avascular) 조직을 가질 수 있다. 상기 조직은 부가적인 절편, 요소, 또는 이들 사이의 3D 관형성 조직의 층을 도입하여 관을 형성함으로써 계면화될 수 있다. 예를 들면, 도 9에 나타낸 것과 같이, 관 계면은 미세유체 장치 내에 배치된 조직에 생성될 수 있다. 상기 계면화된 조직은 관형성 또는 관신생을 할 수 있는 관류가능한 관 구조를 형성할 수 있다. 상기 계면화된 조직은 관형성 및/또는 관신생을 통해 자가-관형성하고, 실질성 조직 내에서 기존의 관 또는 관구조에 문합 또는 접속되며, 이로 인해 대향하는 본래의 조직 사이에 관류가능한 유체 접속의 계면을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 계면화된 조직은 관신생성 스프라우팅을 통해 기존의 조직에 새로운 관을 관형성 또는 형성할 수 있고, 이로 인해 기존의 실질성 조직을 유체적으로 연결하는 관류가능한 관 계면을 형성한다(도 10). 비-제한적 구현예에서, 상기 계면화된 조직은 소정의 자연적인 관 조직 또는 혈관성 관으로 문합시킬 수 있다.
소정 구현예에서, 상기 관형성 조직은 인접한 표적 모델화 3D 조직의 부가 이전에 주사될 수 있다. 예를 들면, 도 18에 나타낸 것과 같이, 관형성 조직은 (관 계면이 형성되는) 스캐폴드, 매트릭스, 또는 겔 내에 계면화되어서, 이후에 조직 배양 장치 내로 주사되거나 접종되는 적절한 조직 성분을 안정화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 계면화된 관형성 조직은 주사된 조직 또는 느슨하거나 자유롭게 흐르는 요소를 갖는 조직의 유체 현탁물을 (예컨대, 주사 포트가 플러그된 후에) 제자리에 고정하기 위한 구조적 강직도를 가질 수 있다. 따라서, 계면화된 관형성 조직을 갖는 스캐폴드, 매트릭스, 또는 겔은 관구조 또는 관의 직경에 의해 관장되는 구멍 크기를 갖는 필터로서 거동함으로써 느슨한 요소가 벌크 용액 내로 탈출하는 것을 방지할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 계면화된 관형성 조직은 그 자체의 히드로겔, 스캐폴드, 또는 세포외 매트릭스가 세팅, 경화, 및/또는 가교될 때까지 주사된 조직을 고정하기 위하여 겔의 구조적 강직도를 개선할 수 있다. 예를 들면, 3D 콜라겐 겔 내에 주사하는 지방세포는 2개의 관형성 히드로겔 세포외 매트릭스(ECM) 스캐폴드 사이에 "칩-상-지방(fat-on-a-chip)" 조직 모델을 생성할 수 있다. 인접한 관형성 조직은 지방 모델 내로 관신생적으로 스프라우팅되어 관 계면을 생성할 수 있다. 비-제한적 구현예에서, 상기 관형성 조직은 그 표면 커버리지가 상기 관형성 조직 경계에 의해 에워싸인 부피를 대면하는 표면으로 제한되는 단층의 세포를 접종 또는 이식하기 위하여 상기 경화, 세팅, 또는 가교된 3D 관형성 스캐폴드, 매트릭스, 또는 겔의 구조적 표면을 추가로 개선할 수 있다. 예를 들면, 단층의 내피 세포는 겔 챔버 내로 접종되어 동맥과 같이 훨씬 더 큰 혈관을 모방할 수 있고, 모세관 베드를 나타내는 3D 관형성 조직과 계면화된다. 본 개시된 시스템은 약물-유도성 관 상처에 효과를 나타내는 관 규모를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
소정 구현예에서, 상기 방법은 관형성 조직을 함유하는 스캐폴드, 매트릭스, 또는 겔 내에 조직을 매립하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 조작된 조직(예컨대, 올가노이드(organoid) 또는 스페로이드(spheroid)), 자연적인 조직(예컨대, 췌장 베타 섬, 또는 생검된 암), 또는 이들의 조합은 스캐폴드, 매트릭스, 또는 겔 내에 매립될 수 있다. 상기 조직이 매립된 시스템은 상기 함유된 조직에서 기존의 관 또는 관구조를 문합 또는 연결하는 관류가능한 관을 형성할 수 있는 관형성 요소를 가질 수 있다. 도 16에 나타낸 것과 같이, 별개의 조직(예컨대, 스페로이드, 올가노이드, 생검된 조직, 생검된 종양, 캡슐화된 조직, 세포 응집체, 또는 조직 스캐폴드)은 프리-겔 관 물질 내에 현탁되어 챔버 내로 위치할 수 있다. 상기 관 계면 물질은 캡슐화된 조직과 계면을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 스캐폴드, 매트릭스, 또는 겔 내의 관형성 요소는 상기 함유된 조직 내로 관신생적으로 스프라우팅되고 이로 인해 관 계면을 형성하는 관류가능한 관을 형성한다. 비-제한적 구현예에서, 상기 스캐폴드, 매트릭스, 또는 겔 내의 조작된 관은 매립된 조직을 자연적인 기존의 관에 문합시킬 수 있고, 또한 그 관성(vascularity)을 증가시키기 위하여 상기 조직 내로 부가적인 관을 관신생적으로 스프라우팅할 수 있다.
소정 구현예에서, 상기 관형성 조직 계면의 스캐폴드, 매트릭스, 또는 겔은 상기 계면화된 조직을 공간적으로 저지하면서 여전히 영양분의 관류를 위해 유체의 접근을 허용할 수 있다. 예를 들면, 상기 관형성 조직 계면의 스캐폴드, 매트릭스, 또는 겔은 2개의 췌장 섬, 또는 2개의 신장 올가노이드, 또는 다수의 암 스페로이드와 같은 다수의 별개의 조직의 합병을 방지할 수 있다. 상기 관형성 조직 계면의 스캐폴드, 매트릭스, 또는 겔은 상기 조직 요소(예컨대, 스페로이드 또는 올가노이드)가 다수의 부분으로 해리 또는 느슨해지거나 단일 2D 표면에 대한 부착에 대한 반응으로 평탄해지는 것을 추가로 방지할 수 있다.
소정 구현예에서, 상기 방법은 조작된 관구조 계면이 자연적인 생물학적 표적 조직에 관한 특성을 갖도록 조율하는 것을 포함할 수 있다. 상기 조율은 조작된 관 네트워크의 밀도, 조작된 관의 직경, 조작된 관의 장벽 기능(예컨대, 단단한 내피 접합 또는 천공된 접합 또는 시누소이드 내피), (예컨대, 시험관내 질환 모델 또는 관 상처 모델에 사용하기 위한) 조작된 관의 건강, (예컨대, 외식된 조직에 대한 영양분 관류의 유체 접근을 신속하게 제공하기 위한) 관구조의 관류성에 대한 시간, 및/또는 이들의 조합을 포함하는 관 속성을 변형시킴으로써 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조율된 관 계면은 생물학적 조사, 치료적 테스트 및/또는 스크리닝의 목적을 위하여 상기 계면화된 조직이 생리학적 상태로 분화되게 하거나, 생리학적으로 적절한 방식으로 거동하도록 할 수 있다. 또한, 상기 조율된 관 계면은 2 이상의 인접한 조직 내로 유체 흐름의 분배 계수를 결정하거나 이에 영향을 미치도록 사용될 수 있다. 예를 들면, 더 좁은 관을 갖는 조직 계면은 더 크거나 조밀한 관을 갖는 계면보다 흐름에 대해 증가된 저항성을 나타낼 수 있고, 이로 인해 더 좁고 제한적인 관을 갖는 계면에 비해 더 큰 관을 갖는 계면 내로 유체 흐름이 증가된다.
소정 구현예에서, 환경적, 기계적 및/또는 생물학적 조건은 조율될 수 있다. 예를 들면, 상기 환경적 조건은 관 직경을 포함하는 측면들을 조정할 수 있는 관 밀도 및 관형성 조직 내의 상이한 세포 또는 세포 타입의 비를 포함하는 측면들을 조정할 수 있는 상기 관형성 조직 내에 위치된 관형성 세포의 밀도를 포함할 수 있다. 상기 생물학적 조건은 성장 배지에 의해 일관되게 또는 역학적으로 세포에 공급되는 생화학적 프로필을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 생물학적 조건은 관형성을 가속 또는 중단하기 위한 VEGF, 관신생을 촉진하기 위한 Ang1, 단단한 접함 형성을 촉진하기 위한 코르티코스테로이드, 및/또는 관 투과성을 증가시키기 위한 TNF-알파를 포함하는 인자의 농도를 변형함으로써 조율될 수 있다. 상기 기계적 조건은 유체 환경 및 구조적 환경을 포함할 수 있다. 예를 들면, 유체 환경은 연속적 유체 관류에 조직을 노출하여 더 단단한 내피 접합 및 불필요한 분지화가 적은 효율적인 관 네트워크를 생성하도록 변형될 수 있다. 상기 구조적 환경은 확대된 관, 관 동맥류(aneurysm) 또는 파열을 모방하기 위하여 더 강한 관 또는 더 부응하거나 부드러운 스캐폴드 또는 겔의 형성을 추진하기 위해 더 뻣뻣한 ECM 스캐폴드 또는 겔 내에 관형성 조직 계면을 생성하도록 변형될 수 있다.
소정 구현예에서, 상기 방법은 조직에 커플링된 유체 계면 채널을 라이닝하는 것을 포함할 수 있다. 상기 유체 계면 채널은 평행하게, 나란히, 수직으로 쌓이거나, 또는 상류/하류 공간적 지향 또는 형상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 도 17 및 도 18에 나타낸 것과 같이, 증가된 면적의 관 계면은 미세채널 또는 유체 챔버를 단층의 세포(예컨대, 내피 세포)로 라이닝함으로써 생성될 수 있다. 관 내피 세포를 갖는 상기 미세 생리학적 조직 배양 시스템은 관의 내강을 모방하여 조직간(inter-tissue) 관 계면을 생성할 수 있다. 상기 조직간 관 계면은 유체 채널의 기하학에 의해 구체적으로 정의될 수 있는 관의 직경 또는 단면 면적을 가질 수 있다. 상기 조직간 관 계면은 패턴화된 관을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 관 벽은 관 협색(constriction) 또는 확장(dilation)을 시뮬레이션하기 위해 기계적으로 작동될 수 있다. 예를 들면, 캡슐성 협색은 관이 신경분포 평활근 세포가 될 필요 없이 시뮬레이션될 수 있다.
소정 구현예에서, 상기 방법은 "계면 대 계면" 구조를 형성하기 위해 다수의 관 계면을 연결하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 다수-계면 구조에서, 성장 배지를 포함하는 유체는 다수 조직의 자연적인 생리학적 특성에 따라 변하는 상이한 관 특성(예컨대, 직경, 밀도, 접합 강도, 매트릭스 강직도)을 갖는 일련의 관을 통해 관류될 수 있다. 예를 들면, 500 ㎛ 직경을 갖는 큰 관은 동맥을 모델링하기 위해 형성되고, 100 ㎛의 평균 직경을 갖는 소동맥-크기 관의 인접한 3D 관 계면에 계면화되며, 다시 피닝(pinning)을 통해 주사되는 10-20 ㎛의 평균 직경을 갖는 미세 관 네트워크에 계면화된다. 상기 계면화된 구조는 상기 모델 내에 또는 다른 관 타입 상에 함유되는 표적 실질 또는 기관 조직에 추가로 계면화되어 대규모 내지 소규모 관의 완전한 순환 모델을 형성할 수 있다. 도 11 및 도 12는 다수의 관 계면 물질을 통해 유체 통신하는 다수의 분리되고 인접한 조직을 보여준다. 일부 구현예에서, 유체는 더 크거나 더 작은 관에 대한 연속적인 일련의 관 계면으로서 시험관내 모델 내에서 상이한 규모의 순환 시스템을 시뮬레이션하기 위해 관류될 수 있다. 예를 들면, 상기 구조는 일련의 2D 또는 3D 관 계면을 포함할 수 있고, 여기서 한 계면은 실질성 조직 없이 다음 계면에 계면화될 수 있다. 비-제한적 구현예에서, 도 13 및 도 14에 나타낸 것과 같이, 다수의 조직은 다수의 관 계면 물질을 둠으로써 인트라-관화될 수 있고, 이로 인해 계속적으로 관류가능한 다수-조직 물질을 형성한다.
실시예 Ⅰ: 다수-조직 관 계면(췌장 섬 모델)
본 개시된 발명을 이용하여 생체내 인간 섬의 조밀하게 관을 이룬 환경을 재현하는 외식된 섬을 갖는 관 계면을 생성함으로써 췌장 섬의 모델이 개발되었다. 상기 모델의 목적은 시험관내 외식된 섬의 생존력을 장기간 동안 유지하고, 섬 기능을 측정하는 포도당-자극된 인슐린 분비의 평가를 포함하는 목적을 위해 섬 역학의 정보를 얻도록 하는 것이다.
상기 목표를 달성하기 위하여, 도 3에 나타낸 것과 같이, 신속하게 형성되고 조밀한 관류가능한 관 계면이1차 인간 관 내피 세포 및 섬유아세포를 포함하는 관형성 조직으로부터 조작되었다. 상기 관은 1차 인간 섬의 자연적인 미세 관에 문합시켰고, 이렇게 함으로써 풍부한 관구조 및 적절한 내피 및 생체내에서 섬의 기능에 본질적인 인간 췌장에서의 섬에 자연적인 엔도크린(endocrine) 조직 사이의 결과물인 파라크린(paracrine) 신호전달을 재현하였으며, 따라서 본 발명의 미세 생리학적 3D 조직 배양 장치에서 생체외(ex vivo) 섬 기능을 계속하기 위해 유망하다.
상기 조작된 관 계면은 높은 시간적 해상도로 섬의 기능을 일시적으로 테스트하게 한다: 조작된 관 계면을 관류함으로써, (인슐린을 포함하는) 섬 조직에 의한 임의의 호르몬 분비물은 섬 조직의 주변부에 남아 있거나 유체 현탁액 내에 희석되기 보다는 상기 관류물 내로 직접 들어가고, 장치 용출액 내에 샘플링될 수 있다. 또한, 도 4에 나타낸 것과 같이, 상기 조작된 관 계면은 형광 이미징 기술에 의해 시각화되었다.
실시예 Ⅱ: 다수-조직 관 계면(골수 모델)
본 실시예에서, 2개의 관 계면 사이에 인간 골수의 절편 또는 층을 공간적으로 패터닝함으로써 혈류 내로의 백혈구 이동의 모델이 생성되었다. 상기 혈류 내로의 백혈구 이동은 신체 어느 곳의 감염에 의해 방출되는 염증성 사이토카인에 대한 반응으로 초래될 수 있다. 본 모델에서 2개 3D 관 계면의 공간적 패터닝은 상기 관 계면에 의해 공간적으로 고정될 수 있는 3D 콜라겐 및 히알루론산 겔 또는 ECM 스캐폴드에 부유된 인간-유래 전체 골수의 후속 주사를 위한 이들 사이의 방(room)을 포함하였다. 주사 후, 상기 관 계면 내의 관형성 조직은 관신생적으로 상기 골수 조직 내로 스프라우팅되어 이를 관화시키고, 또한 골수 조직 내에 자연적인 관구조로 문합시켰다. 유체 접근 채널을 패터닝하여 큰 관 모델을 형성하고 이를 내피 세포의 단층으로 코팅하여 관 계면을 형성함으로써 제2 관류가능한 관 계면이 생성되었다. 상기 관 계면은 이전에 형성된 3D 관 계면에 문합시켜서 골수 조직을 계면화하였다.
도 5에 나타낸 것과 같이, 생성된 모델은 이들 사이의 골수 조직의 후속 주사를 고정하기 위하여 2개의 관 계면을 이용하였다. 상기 관 계면은 자가-관화하였고, 그 내강을 통한 백혈구의 통과를 선택적으로 허용하면서 액체 흐름으로 인해 더 큰 벌크(bulk) 골수 조직이 옮겨지는 것을 방지할 수 있는 미세 관을 형성하였다. 또한, 바깥의 패턴화된 유동 채널은 관 내피 세포의 단층 내강으로 접종되어 3D 관 계면에서 더 작은 관과 계면화할 수 있는 큰-관의 관 계면을 생성하였다. 골수 조직에 대한 상기 일련의 계면은, 예컨대 염증성 사이토카인 노출에 대한 반응시 골수 모세관 내로의 백혈구 관외유출(extravasation)(즉, 상기 관구조 내로의 이동)을 허용하였고, 그 후 상기 백혈구는 순환 시스템을 통해 염증성 조직을 향한 그 운반을 모델링하기 위해 더 큰 관으로 운반되었다. 도 6에 나타낸 것과 같이, 조작된 3D 관 유체 계면을 통한 중심 골수 조직 구획으로부터의 백혈구의 관류가 검출되었다. 상기 관류는 그 내부에 형성된 관의 내강 직경에 의해 선택적으로 조절되었다. 도 7은 유체 현탁액(가운데) 내의 포획된 백혈구의 유입 및 유출 측 상의 내피를 갖는 3D 관 계면을 보여준다. 도 8은 골수 모델을 생성하기 위해 사용되는 장치의 대안적 이용을 보여준다. 본 실험에서, 2개의 조밀한 3D 관 계면을 패턴화된 레인 내로 접종하였고, 그 사이 및 그 바깥에 단층의 관 내피 세포가 접종되어 관 계면의 부가적인 층을 생성하였다. 바깥 레인(맨 위 및 맨 아래) 상에, 상기 단층의 관 계면은 큰 관(동맥 및 정맥)을 모델링하였다. 안쪽 레인 상에, 상기 단층의 관 계면은 상기 3D 관 계면 내로 관신생적으로 스프라우팅하였고, 이것은 상기 3D 관 계면에서 관의 내강에 대한 더 크고 보다 강력한 접속을 형성하도록 하였다. 상기 접속의 확립 후, 골수 조직을 중심 채널 내로 접종하였고, 그 내부로 상기 단층으로부터 관신생성 스프라우팅이 형성되어 관류가능한 관 계면을 형성할 수 있다. 상기 관류가능한 관 계면은 상기 모델의 상부 채널로부터 하부에 걸쳐 있었다.
전술한 내용은 단지 본 개시의 원리를 설명하기 위한 것일 뿐, 본 개시의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 본 기술분야의 기술자에 의해 다양한 변형이 행해질 수 있음이 이해될 것이다.
Claims (5)
- 적어도 2개의 조직을 관형성 요소를 포함하는 3D 구조 내로 매립하는 단계;
상기 적어도 2개의 조직 내로 영양분 관류를 위한 관 계면을 형성하는 단계;
관 속성을 변형시켜 자연적인 생물학적 표적 조직 또는 표적 환경의 특성을 갖도록 상기 관 계면을 조율하는 단계; 및
성장 유체를 제공하기 위해 상기 3D 구조에 커플링된 유체 계면 채널을 라이닝하는 단계;를 포함하는 미세생리학적 장치를 이용한 조직의 배양 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 적어도 2개의 조직 사이에 관형성 조직의 절편, 요소, 또는 층을 도입하여 관 계면을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 관형성 요소는 저산소증 유도 인자(HIF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 및/또는 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF)를 포함하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 관 속성은 관 밀도, 관 직경, 관 장벽 기능, 및/또는 관 질환 증상을 포함하는 방법. - 청구항 1에 있어서,
복수의 관 계면을 연결하여 멀티-레인 관구조 배양 시스템을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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