CN117209802A - 胶原水凝胶、制备方法及应用 - Google Patents

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CN117209802A
CN117209802A CN202311027251.4A CN202311027251A CN117209802A CN 117209802 A CN117209802 A CN 117209802A CN 202311027251 A CN202311027251 A CN 202311027251A CN 117209802 A CN117209802 A CN 117209802A
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刘智禹
陈贝
肖美添
乔琨
许旻
吴靖娜
蔡水淋
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Abstract

本发明公开了胶原水凝胶、制备方法及应用，属于生物医药材料技术领域，胶原水凝胶制备方法，包括以下步骤：S1：分别配制酸溶性胶原溶液、氧化海藻酸钠溶液、PVA水溶液和交联剂溶液，S2：将酸溶性胶原溶液与氧化海藻酸钠溶液混合，得到混合液A，S3：向混合液A中加入PVA水溶液，搅拌均匀后获得混合液B，S4：向混合液B中缓慢加入交联剂溶液，搅拌均匀后静置，获得水凝胶。本发明的胶原水凝胶、制备方法及应用，以酸溶性胶原为原料，复合氧化海藻酸钠和聚乙烯醇，以硼砂为交联剂，制备具有自愈性、可注射性、可作为伤口敷料的胶原水凝胶。

Description

胶原水凝胶、制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物医药材料技术领域，尤其涉及一种胶原水凝胶、制备方法及应用。
背景技术
水凝胶是由聚合物链组成的三维网络结构，具有在其网络中保持大量水并在溶胀后保持结构的能力。水凝胶具有多孔结构、亲水性、柔韧性、粘附性、透明性以及生物相容性等许多性能优势，目前已经广泛应用于生物医学领域。水凝胶作为创面敷料具有很强的吸水性能，并且为创面提供了一个有利于组织再生的湿润环境，同时可以有效避免更换敷料时发生伤口粘连造成的二次伤害。
胶原是保证细胞外基质弹性和强度的一个重要因素，且有助于组织结构和生理的完整性，在调节伤口愈合过程中发挥着重要作用。海藻酸钠是一种天然植物高分子聚合物，被广泛应用于伤口敷料中，具有良好的抗菌性和亲水性。聚乙烯醇(PVA)是一种合成高分子聚合物，除安全无毒外，还具有良好的成膜能力和机械性能。
发现目前，水凝胶存在制备过程复杂、力学性能较差以及被破坏后无法自修复的问题，限制了水凝胶的广泛应用。因此需要提供一种制备方法简单、具有一定力学性能和优良自愈性能的水凝胶。
发明内容
本发明的目的在于提出一种胶原水凝胶、制备方法及应用，以克服现有技术中的上述至少一种缺陷。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供的胶原水凝胶制备方法，包括以下步骤：S1：分别配制酸溶性胶原溶液、氧化海藻酸钠溶液、PVA水溶液和交联剂溶液，S2：将酸溶性胶原溶液与氧化海藻酸钠溶液混合，得到混合液A，S3：向混合液A中加入PVA水溶液，搅拌均匀后获得混合液B，S4：向混合液B中缓慢加入交联剂溶液，搅拌均匀后静置，获得水凝胶。
优选地，酸溶性胶原溶液的制备方法包括以下步骤：S111：酸溶性胶原的提取，在0-4℃条件下，取河鲀鱼皮，冲洗后充分沥干河鲀鱼皮表面水分，按料液比19-21:1mL/g加入0.4-0.6mol/L乙酸溶液，待鱼皮溶胀后搅碎，在0.4-0.6mol/L乙酸溶液中浸提35-42h，提取液离心后得到上清液，对上清液进行盐析沉淀，静置后，进行离心，得沉淀，将沉淀完全溶解于0.4-0.6mol/L乙酸溶液，分别于0.08-0.12mol/L乙酸溶液中透析1天，于蒸馏水中透析2天，每7-9h更换一次透析液，最后对透析得到的溶液冷冻干燥22-26h，得到酸溶性胶原，S112：将步骤S111提取的酸溶性胶原溶解于PBS缓冲液中，制备质量浓度为35-45mg/mL的酸溶性胶原溶液。
优选地，步骤S111中，选用的河鲀鱼皮为暗纹东方鲀鱼皮，透析前的乙酸溶液的摩尔浓度为0.5mol/L，浸提时间为40h，乙酸溶液与河鲀鱼皮的料液比20:1mL/g。
优选地，氧化海藻酸钠溶液的制备方法包括以下步骤：S121：将海藻酸钠分散于无水乙醇中，得海藻酸钠悬浮液，将高碘酸钠充分溶解于蒸馏水中，得高碘酸钠溶液，在避光条件下，将海藻酸钠悬浮液和高碘酸钠溶液混合，室温搅拌反应8-10h，得混合溶液C，S122：往混合溶液C中加入乙二醇，继续搅拌0.8-1.2h以终止氧化反应，S123：对步骤S122搅拌后的溶液透析2-4d，将透析所得溶液冷冻干燥12-26h，得到白色絮状的含双醛基的氧化海藻酸钠，S124：将步骤S123所得的氧化海藻酸钠溶解于PBS缓冲液，制备质量浓度为5-100mg/mL的氧化海藻酸钠溶液。
优选地，海藻酸钠与无水乙醇的料液比为1:8-12g/mL，高碘酸钠与蒸馏水的料液比为1:8-12g/mL，海藻酸钠悬浮液和高碘酸钠溶液的体积比为1:0.8-1.2，乙二醇与无水乙醇的体积比为2-4:100，采用分子截留量为2500-3500D的透析袋进行透析，透析液为蒸馏水。
优选地，PVA水溶液的制备方法包括以下步骤：取PVA，加入蒸馏水，85-95℃加热搅拌1.5-2.5h，使其充分溶解，配制8-10wt％PVA水溶液。
优选地，步骤S2中酸溶性胶原溶液与氧化海藻酸钠溶液的体积比为1：0.8-1.2，步骤S3中混合液A与PVA水溶液的体积比为1：0.8-1.2，步骤S4中混合液B与交联剂溶液的体积比为10-20：1，交联剂溶液的摩尔浓度为0.05-0.15mol/L，交联剂为硼砂。
本发明还提供胶原水凝胶，由上述的胶原水凝胶制备方法制得，按体积份数计，包括以下组分：酸溶性胶原溶液1份，氧化海藻酸钠溶液0.8-1.2份，PVA水溶液1.4-2.7份，交联剂溶液0.16-0.49份。
优选地，酸溶性胶原溶液为河鲀鱼皮酸溶性胶原溶液，氧化海藻酸钠溶液含有双醛基。
本发明还提供上述的胶原水凝胶制备方法制得的胶原水凝胶或上述的胶原水凝胶在制备促进皮肤伤口愈合药物中的应用。
本发明的有益效果为：
1、以酸溶性胶原为原料，复合氧化海藻酸钠和聚乙烯醇，以硼砂为交联剂，制备具有自愈性、可注射性、可作为伤口敷料的胶原水凝胶，由亚胺键、二元-硼酸酯键以及氢键形成动态网络构建而成，相较于传统水凝胶，具有三维网络结构发生破坏后能够快速进行自我修复的能力，解决了水凝胶被破坏后无法自我修复的问题。
2、胶原水凝胶具有良好吸收和保水能力，能够有效保持伤口的清洁和湿润。此外，本发明的胶原水凝胶具有良好的可注射性、可降解性、柔韧性、粘附性等特点，作为敷料可以制备成任意尺寸和形状，适用于多种伤口且易于贴合粘附。
3、胶原水凝胶的制备方法简单，操作方便、整个成胶过程温和，有利于大规模工业化生产。
4、拓展河鲀鱼皮酸溶性胶原的应用，实现低值鱼类副产物资源的高值化利用。
附图说明
图1是本发明各实施例和对比例的胶原水凝胶的红外光谱图。
图2是本发明各个实施例和对比例的胶原水凝胶的扫描电子显微镜图。
图3是本发明各个实施例和对比例的胶原水凝胶在不同物质表面粘附性的示意图。
图4是本发明各个实施例和对比例的胶原水凝胶通过针头注射并写下字样示意图。
图5是本发明各个实施例和对比例的胶原水凝胶的的复合黏度随角频率的变化曲线图。
图6是本发明COLP胶原水凝胶的应变扫描图。
图7是本发明COSP(4/1)胶原水凝胶的应变扫描图。
图8是本发明COSP(2/1)胶原水凝胶的应变扫描图。
图9是本发明COSP(1/1)胶原水凝胶的应变扫描图。
图10是本发明OSAP胶原水凝胶的应变扫描图。
图11是本发明COLP胶原水凝胶的连续阶跃应变扫描。
图12是本发明COSP(4/1)胶原水凝胶的连续阶跃应变扫描。
图13是本发明COSP(2/1)胶原水凝胶的连续阶跃应变扫描。
图14是本发明COSP(1/1)胶原水凝胶的连续阶跃应变扫描。
图15是本发明OSAP胶原水凝胶的连续阶跃应变扫描。
图16是本发明各个实施例和对比例的胶原水凝胶的含水率和保水率图。
图17是本发明各个实施例和对比例的胶原水凝胶的溶胀率图。
图18是本发明各个实施例和对比例的胶原水凝胶的失水率图。
图19是本发明不同时间阶段各组的伤口图。
图20是本发明不同时间阶段各组的伤口愈合率图。
图21是本发明小鼠伤口及伤口周围组织的H&E染色图。
图22是本发明小鼠伤口及伤口周围组织的Masson染色图。
图23是本发明各个实施例和对比例的胶原水凝胶在溶菌酶-PBS溶液中的降解程度图。
具体实施方式
现结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明。
实施例一：
本实施例中提供的胶原水凝胶制备方法，包括以下步骤：
S1：分别配制酸溶性胶原溶液、氧化海藻酸钠溶液、PVA水溶液和交联剂溶液。
酸溶性胶原溶液的制备方法包括以下步骤：
S111：酸溶性胶原的提取，以下所有操作过程均在4℃条件下进行。
取暗纹东方鲀鱼皮，用蒸馏水冲洗后，充分沥干河鲀鱼皮表面水分，准确称取5.00g河鲀鱼皮，按料液比20:1mL/g加入0.5mol/L乙酸溶液，待鱼皮溶胀后使用绞肉机完全搅碎，在0.5mol/L乙酸溶液中浸提40h，提取液在4℃、10000rpm、15min条件下离心后得到上清液，上清液中加入最终浓度为0.9mol/L的NaCl进行盐析沉淀，静置后，以4℃、12000rpm、20min的条件进行离心，得沉淀，将沉淀完全溶解于少量0.5mol/L乙酸溶液，分别于0.1mol/L乙酸溶液中透析1天，于蒸馏水中透析2天，每8h更换一次透析液，最后对透析得到的溶液于-76℃冷冻干燥24h，得到酸溶性胶原(ASC)。
S112：将步骤S111提取的酸溶性胶原溶解于PBS缓冲液(pH＝7.4)中，制备质量浓度为40mg/mL的酸溶性胶原溶液。
氧化海藻酸钠(OSA)溶液的制备方法包括以下步骤：
S121：将5g海藻酸钠分散于50mL无水乙醇中，得海藻酸钠悬浮液，将5g高碘酸钠充分溶解于50mL蒸馏水中，得高碘酸钠溶液。在避光条件下，将等量的海藻酸钠悬浮液和0.1g/mL高碘酸钠溶液混合，室温搅拌反应8h，得混合溶液C，反应全程使用铝箔纸进行避光处理。
S122：往混合溶液C中加入1.5mL乙二醇，继续搅拌1h以终止氧化反应。
S123：采用分子截留量为3000D的透析袋对步骤S122搅拌后的溶液透析3d，透析液为蒸馏水，将透析所得溶液冷冻干燥24h，得到白色絮状的含双醛基的氧化海藻酸钠。
S124：将步骤S123所得的氧化海藻酸钠溶解于PBS缓冲液(pH＝7.4)，制备质量浓度为10mg/mL的氧化海藻酸钠溶液。
PVA水溶液的制备方法包括以下步骤：
取PVA，加入蒸馏水，90℃加热搅拌2h，使其充分溶解，配制9wt％PVA水溶液。
交联剂溶液制备方法包括以下步骤：
取适量硼砂溶于蒸馏水中，配制0.1mol/L硼砂溶液。
S2：将酸溶性胶原溶液与氧化海藻酸钠溶液以1:1体积比混合，得到混合液A，体积为1mL。
S3：向混合液A中加入1mL 9wt％PVA水溶液，搅拌均匀后获得混合液B，体积为2mL。
S4：向混合液B中缓慢加入摩尔浓度为0.1mol/L的硼砂溶液200uL，搅拌均匀后静置，获得胶原水凝胶，记为COSP(4/1)。
本实施例还提供胶原水凝胶，由上述的胶原水凝胶制备方法制得，按体积份数计，包括以下组分：
酸溶性胶原溶液1份，氧化海藻酸钠溶液1份，PVA水溶液2份，交联剂溶液0.4份。其中，酸溶性胶原溶液为河鲀鱼皮酸溶性胶原溶液，氧化海藻酸钠溶液含有双醛基。
本实施例还提供上述的胶原水凝胶制备方法制得的胶原水凝胶或上述的胶原水凝胶在制备促进皮肤伤口愈合药物中的应用。胶原水凝胶作为伤口敷料、组织粘合剂或医疗植入物。
实施例二：
本实施例与实施例一的区别在于：步骤S124中，制备的氧化海藻酸钠溶液的质量浓度为20mg/mL。获得的胶原水凝胶记为COSP(2/1)。
实施例三：
本实施例与实施例一的区别在于：步骤S124中，制备的氧化海藻酸钠溶液的质量浓度为40mg/mL。获得的胶原水凝胶记为COSP(1/1)。
对比例一：
本实施例与实施例一的区别在于：
S1：分别配制酸溶性胶原溶液、PVA水溶液和交联剂溶液。
S2：将酸溶性胶原溶液与PBS缓冲液(pH＝7.4)以1:1体积比混合，得到混合液A，体积为1mL。
S3：向混合液A中加入1mL 9wt％PVA水溶液，搅拌均匀后获得混合液B，体积为2mL。
S4：向混合液B中缓慢加入摩尔浓度为0.1mol/L的硼砂溶液200uL，搅拌均匀后静置，获得水凝胶，记为COSP。
对比例二：
本实施例与实施例一的区别在于：
S1：分别配制氧化海藻酸钠溶液、PVA水溶液和交联剂溶液。
S2：将氧化海藻酸钠溶液与PBS缓冲液(pH＝7.4)以1:1体积比混合，得到混合液A，体积为1mL。
S3：向混合液A中加入1mL 9wt％PVA水溶液，搅拌均匀后获得混合液B，体积为2mL。
S4：向混合液B中缓慢加入摩尔浓度为0.1mol/L的硼砂溶液200uL，搅拌均匀后静置，获得水凝胶，记为OSAP。
本发明制得的胶原水凝胶的结构表征：
(1)傅里叶变换红外光谱：将胶原水凝胶冷冻干燥后磨成粉状，与干燥KBr颗粒在研钵内充分研磨至均匀，用压片机制得透明薄片，进行扫描测试。
(2)扫描电子显微镜：胶原水凝胶冻干后经液氮脆断处理，喷金后观察水凝胶横截面形貌。
胶原水凝胶的结构表征如图1所示。图1是胶原水凝胶的傅里叶变换红外光谱图。由图1可知，胶原水凝胶在1641.12cm-1和1543.26cm-1处出现新的吸收峰，与席夫碱(C＝N)相对应，说明动态亚胺键的成功生成。所有水凝胶在1429.48cm-1、1336.43cm-1处都有弱吸收峰，这些峰与B-O-C的不对称伸缩有关，说明体系中存在二元-硼酸酯键。图2是各个实施例和对比例的胶原水凝胶的扫描电子显微镜图。发现随着氧化海藻酸钠含量的增加，胶原水凝胶的网络结构更加致密，孔径减小。本发明得到的多孔网状结构的胶原水凝胶可以储存更多的液体，使伤口处于相对湿润的环境中；此外，有利于氧气和营养物质的输送，这对伤口部位的细胞和血管生长十分重要。
胶原水凝胶的粘附性测试：
以实施例三为例进行测试，将制备好的COSP(2/1)胶原水凝胶置于不同材质的物品上，用手轻按5秒粘合，观察其粘附性。
由图3可知，COSP(2/1)胶原水凝胶在不同物质表面具有良好的粘附性，可以较稳定的粘附在人体皮肤、丁腈、鸡骨头等物质表面上，且剥离后不会有残留。胶原水凝胶具有的良好粘附性，为其应用于伤口敷料等医药领域提供了可能性。
胶原水凝胶的可注射性：
以实施例三为例进行测试，将制备好的COSP(2/1)胶原水凝胶用微量罗丹明B溶液染色，使用一次性注射器及“20G”大小的针头将胶原水凝胶打出，并在板上写下字母来证明胶原水凝胶的注射性能。此外，在流变仪系统上测试得复合黏度(η*)随角频率变化的关系曲线。
胶原水凝胶得可注射性实验如图4所示。图4是胶原水凝胶通过20G针头打出并写下字样的照片，说明制备的水凝胶具有可注射性。图5是胶原水凝胶的复合黏度随角频率的变化曲线，可以看出，随着角频率的增大，复合黏度减小，说明胶原水凝胶具有剪切变稀的特点，赋予其良好的可注射性。
胶原水凝胶的自愈性；
(1)宏观自愈性：制备了两个圆盘状水凝胶，其中一个使用微量罗丹明B溶液进行染色以便于观察。分别将两个水凝胶对半切开，接着将两个不同颜色的半圆状胶原水凝胶沿着切面接触放置，不施加任何外力，在室温下观察胶原水凝胶的自愈合情况。
(2)流变学研究：通过应变扫描和连续阶跃应变扫描，对胶原水凝胶的自愈合效率进行了分析。首先进行应变扫描确定胶原水凝胶的临界应变，设置流变仪条件，得到储能模量(G')和损耗模量(G")随应变的变化关系。接着进行连续阶跃应变扫描，改变应变条件，其余设置不变。以1％和100％的应变在固定的时间间隔内进行阶跃应变扫描。
常规胶原水凝胶在被疲劳使用或破坏时，会产生不可逆的损伤，失去原有性能。因此，迫切需要开发具有自主自愈能力的胶原水凝胶，以恢复其网络结构和功能完整性，特别是在用作伤口敷料、组织粘合剂和医疗植入物时。本发明将氧化后带有双醛基的海藻酸钠引入胶原中，使醛基和胶原侧链上存在的大量活性氨基反应形成动态亚胺键，赋予水凝胶自愈的能力。同时在COL-OSA体系中引入硼砂，形成二醇-硼酸酯键，进一步支持动态网络。此外复合PVA以增强水凝胶机械强度。
胶原水凝胶的宏观自愈性结果体现了胶原水凝胶良好的自修复性能，被机械分离的两块半圆胶原水凝胶能够再次快速闭合形成整体，不同部分之间的界面在视觉上消失。而OSAP水凝胶虽然也能重新连接在一起，但在表面仍然看到明显的粘接痕迹。COLP与OSAP水凝胶具有自愈性能归因于COL(或OSA)与硼砂之间的可逆二醇-硼酸酯键。用镊子夹取自愈合后的胶原水凝胶，胶原水凝胶不会断裂，说明切面愈合处的强度能够支撑整个胶原水凝胶的质量。对于COSP胶原水凝胶，样品在被夹取时可以维持一定的圆盘状，这表明COL-OSA-PVA网络具有理想的自愈合能力和良好的强度。此外，发现随着氧化海藻酸钠含量比例的增大，胶原水凝胶被夹取时维持初始形状的能力越强，说明COL与OSA的进一步交联为维持水凝胶形状提供了额外的机械强度。
基于宏观自愈合实验结果，选择COSP(4/1)、COSP(2/1)、COSP(1/1)胶原水凝胶，在光学显微镜下进一步研究其自愈合能力。在胶原水凝胶表面制造划痕，并于第0min、10min、30min、60min拍照记录划痕形貌。发现经过60min后，胶原水凝胶的划痕逐渐模糊。特别是对于COSP(4/1)胶原水凝胶，在10min后划痕相较其他两组更加模糊，60min后划痕几乎不可见。实验结果表明胶原水凝胶的自愈合不是自身简单的物理粘附，而是由于胶原水凝胶内部断裂界面的分子可以流动和排列，重新生成可逆亚胺键导致的。同时，胶原水凝胶中所含氧化海藻酸钠比例越小，水凝胶内部分子的流动性更强，自愈合效果越好。这些观察结果进一步证明COSP胶原水凝胶在环境温度下几乎可以完成自我修复，而不需要外界的任何刺激。
胶原水凝胶的应变扫描结果如图6、7、8、9、10所示。当应变较小时，G'>G"，说明此时胶原水凝胶表现为稳定的凝胶状态；随着应变的增大，G'<G"，表明胶原水凝胶的网络结构开始破坏。G'与G"曲线交点的应变值即为临界应变。COLP、COSP(4/1)、COSP(2/1)、COSP(1/1)和OSAP胶原水凝胶的临界应变分别为49.14％、26.70％、12.24％、2.80％和4.38％。发现随着氧化海藻酸钠含量的增加，胶原水凝胶的临界应变减小。相关研究表明，交联度越大，胶原水凝胶的临界应变越小，然而临界应变较大的胶原水凝胶具有更好的柔韧性和可塑性。
胶原水凝胶的连续阶跃应变扫描结果如图11、12、13、14、15所示，除OSAP胶原水凝胶外，其余胶原水凝胶都具有良好的可恢复性和触变性，这与宏观自愈实验的结果相吻合。自愈行为涉及到更快的储能模量和损耗模量的恢复。当应变为1％时，胶原水凝胶的G'和G"几乎维持两条平行的直线，且G'始终大于G"，说明胶原水凝胶表现为稳定的凝胶状态。当应变跃升至100％时，G'和G"发生了很大的变化，G'急剧下降，G"增大，最后G"大于G'，表明此时胶原水凝胶网络结构被破坏使胶原水凝胶转变为类溶胶状态。然而当应变恢复到1％后，G'和G"又快速恢复到了原来的水平，显示胶原水凝胶网络的良好恢复。可以看到胶原水凝胶网络经过两次破坏后，G'和G"依然能够恢复到近100％的水平，表明胶原水凝胶具有良好且高效的自愈性。这种快速的自愈能力归功于可逆键的重新生成，例如动态亚胺键、动态二醇-硼酸酯键，以及胶原-氧化海藻酸钠-PVA体系中形成的氢键和缠绕等大分子相互作用。胶原水凝胶的应变曲线(ω＝10rad/s，γ＝0.01-100％)及连续阶跃应变曲线(ω＝10rad/s，γ＝1％和γ＝100％交替循环，时间间隔固定为120s)。
胶原水凝胶的保水性能测试：
分别对胶原水凝胶进行了含水率与保水率、溶胀率、失水率测试。
由图16至18可知，氧化海藻酸钠含量增大使胶原水凝胶的含水率、保水率及溶胀率增加，失水率降低，因此加入氧化海藻酸钠可以有效提高胶原水凝胶的保水能力。
胶原水凝胶对小鼠伤口愈合作用的测试：
(1)以实施例三为例进行测试，设立空白对照组和阳性对照组。选择SPF级雄性ICR小鼠(25g)，小鼠经麻醉后，在背部制造了直径为6mm的全层皮肤缺损模型。空白对照组用纱布处理伤口，水凝胶组用COSP(2/1)胶原水凝胶处理、阳性对照组用3M TegadermTM处理。为了观察伤口愈合情况，分别在第0、4、7、14天拍照记录伤口部位，并采用软件定量计算不同日期的伤口面积，计算伤口愈合率。
(2)组织学分析：分别于第4、7、14天安乐死小鼠，立即切除小鼠的整个伤口及伤口周围组织，在4％多聚甲醛溶液中固定，采用石蜡包埋制成组织切片。使用苏木精和伊红(H&E)对切片染色进行形态学评估，使用Masson三色染色评价胶原纤维沉积，倒置显微镜观察拍照。
图19、20分别为不同时间阶段各组的伤口照片和伤口愈合率。由图19、20可知，第14天，各组伤口面积大大减小，水凝胶组的伤口愈合率为95.54±3.92％，基本趋近于闭合，高于空白组(73.33±3.30％)和阳性组(89.36±2.70％)。此外，用胶原水凝胶处理的伤口在第14天几乎完全被再生的皮肤和毛发所覆盖(为了清楚观察伤口，拍照前进行了局部脱毛处理)，而空白组的结痂甚至还未脱落，阳性组虽然痂皮脱落但新生皮肤面积较大。
图21为小鼠伤口及伤口周围组织的H&E染色图。由图可知，胶原水凝胶可以促进成纤维细胞的增殖和生长、促进皮肤附属器官和新生血管的生成，具有良好的伤口愈合效果。图22为小鼠伤口及伤口周围组织的Masson染色图，由图可知，水凝胶组在整个皮肤再生过程中表现出最好的胶原蛋白沉积能力，且胶原纤维排列更加整齐有序、密度大，反映出较高的伤口愈合效率。
胶原水凝胶的降解性能：
测量不同的胶原水凝胶在溶菌酶-PBS溶液中孵育21天的剩余质量率来评估水凝胶的降解性能。
如图23所示，COLP和COSP(4/1)胶原水凝胶在降解第一天剩余质量率仍高达80％以上，直到第三天才被大量降解；而COSP(2/1)、COSP(1/1)以及OSAP胶原水凝胶在第一天时就发生快速降解。在降解前期，胶原水凝胶中氧化海藻酸钠含量比例越高，其降解程度越高，主要是由于溶菌酶可以水解多糖中β-(1,4)-糖苷键，切割氧化海藻酸钠的主链从而使其降解。
胶原水凝胶的热稳定性：
差示扫描量热法用于研究胶原水凝胶的热稳定性。胶原蛋白受热变性后，发生三螺旋结构破坏以及分离的单肽链展开后随即卷曲的现象，而胶原分子间形成更牢固的连接能够提高胶原的热稳定性。COLP胶原水凝胶的热变性温度为35.4℃，而COSP(4/1)、COSP(2/1)、COSP(1/1)胶原水凝胶的热变性温度分别为44.6℃、47.6℃、49.5℃，说明加入OSA后，水凝胶的热稳定性显著提高，OSA的醛基与胶原的氨基之间的交联相互作用以剂量依赖的方式加强。胶原水凝胶越加致密的交联网络有利于提高热稳定，该结果与胶原水凝胶SEM实验结果相吻合。
暗纹东方鲀鱼皮胶原的提取工艺优化：
单因素实验：
以胶原提取率为指标，先后考察乙酸浓度、提取时间、液料比3个因素对酸法提取暗纹东方鲀鱼皮胶原工艺的影响。
乙酸浓度对ASC提取率的影响：
称取5.00g充分沥干表面水分的鱼皮，固定液料比为20∶1(mL/g)，提取时间为24h，分别于浓度为0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L、0.9mol/L的乙酸溶液中提取胶原。测定胶原提取率，确定最优乙酸浓度，每个条件重复两次实验。
提取时间对ASC提取率的影响：
称取5.00g充分沥干表面水分的鱼皮，固定液料比为20∶1(mL/g)，乙酸浓度为上述步骤中得到的最优参数，分别在提取时间为12h、24h、36h、48h、60h的条件下提取胶原。测定胶原提取率，确定最优提取时间，每个条件重复两次实验。
液料比对ASC提取率的影响：
称取5.00g充分沥干表面水分的鱼皮，在最优的乙酸浓度和提取时间下，分别改变液料比为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL/g)提取胶原。测定胶原提取率，确定最优液料比，每个条件重复两次实验。
Box-Behnken响应面法优化酸法提取工艺：
根据酸法单因素实验结果，选择最优取值中心，利用Box-Behnken中心组合原理设计三因素三水平的响应面优化实验。选取三个影响因素：乙酸浓度(A)、提取时间(B)、液料比(C)，以ASC提取率(Y)为评价指标，运用DesignExpert 8.0.6软件进行响应面分析。ASC响应面实验的因素与水平如表1所示：
表1 ASC响应面实验的因素与水平
结果与分析：
胶原的提取率：
暗纹东方鲀鱼皮ASC的提取率为19.22％。
ASC的单因素实验结果：
乙酸浓度对ASC提取率的影响：
固定提取时间为24h，液料比为20∶1(mL/g)，考察乙酸浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mol/L时对ASC提取率的影响。随着乙酸浓度的增加，ASC提取率先增加后降低。在乙酸浓度为0.5mol/L时，ASC具有最高提取率19.22％；当乙酸浓度超过0.5mol/L时，提取率开始下降。当乙酸浓度过低时，胶原不能被充分提取出来；当乙酸浓度过高时，提取剂的pH过低可能会导致蛋白质发生变性，使提取率下降。根据响应面实验设计原理，选择各个单因素实验的最优取值点，以及以最优点为中心在上下区域分别选取1个水平值，作为响应面的设计水平，下同。因此以乙酸浓度0.5mol/L为最优取值，选择0.3、0.5、0.7mol/L这3个浓度进行后续响应面实验分析。
提取时间对ASC提取率的影响：
固定乙酸浓度为0.5mol/L，液料比为20∶1(mL/g)，考察提取时间分别为12、24、36、48、60h时对ASC提取率的影响。ASC提取率随提取时间的增加呈现先上升后下降的趋势，当提取时间为36h时，提取率达到最大值。推测可能是随着提取时间增加，胶原与乙酸之间反应逐渐充分而使提取率提高，但过长的反应时间会导致胶原的水解。因此，36h为最优提取时间，同时选择24、36、48h这3个时间进行后续响应面实验。
液料比对ASC提取率的影响：
固定乙酸浓度为0.5mol/L、提取时间为36h，考察液料比分别为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1(mL/g)时对ASC提取率的影响。随着液料比的增大，胶原提取率呈现上升、下降、再上升的变化趋势。当液料比较小时，鱼皮不能与乙酸充分接触，因此此时的提取率较小。当液料比从10∶1(mL/g)增加到20∶1(mL/g)，ASC提取率达到最大值为24.21％。而此后提取率虽然有所增加，但仍没有超过20∶1(mL/g)时的提取率。这可能是因为液料比过高时，搅拌子形成的剪切力变小，导致胶原的提取受到限制。同时考虑到后续离心时间成本和提取剂废液处理的问题，选择液料比20∶1(mL/g)为最优提取参数，选择10∶1、20∶1、30∶1(mL/g)作为设计水平进行后续响应面实验分析。
ASC的响应面优化实验结果：
回归模型和显著性校验：
根据单因素实验的结果，选取乙酸浓度(A)、提取时间(B)、液料比(C)三个因素，以ASC提取率(Y)为评价指标，利用Box-Behnken中心组合原理设计3因素3水平的响应面实验。响应面实验设置为允许条件下最少的实验组合，一共建立17个实验点。
利用Design-Exper8.0.6软件对上述实验结果进行多元线性拟合回归分析，乙酸浓度(A)、提取时间(B)、液料比(C)对ASC提取率(Y)影响的二次多项回归模型方程为：Y＝23.75+2.04A+0.42B-0.33C-(7.500E-003)AB-0.25AC+1.43BC-7.93A2-0.92B2-11.46C2。
模型的P值0.05，说明对结果影响不显著，表示模型预测值与实际值之间的误差较小，模型对实验的拟合度高，无失拟因素存在。决定系数R2＝0.9984>0.95，说明各因素与响应值之间具有良好的相关性，因此用该模型对酸法提取胶原的工艺进行分析和预测是可行的。校正决定系数Radj 2＝0.9963，表明该模型中响应值的变化99.63％由所选的因素决定。根据显著性校验结果，由F值的大小可知3个因素对ASC提取率的影响程度分别为：A(乙酸浓度)>B(提取时间)>C(液料比)。A及二次项A2、C2对ASC提取率的影响极其显著(P＜0.0001)；BC、B2对结果的影响较为显著(P＜0.01))；B对结果有显著影响(P＜0.05)；C、AB、AC对结果影响不显著(P>0.05)。
各因素相互作用分析；
提取时间和液料比之间交互作用的响应面最陡，且等高线最接近椭圆形，说明这两个因素之间的相互作用对ASC提取率的影响最为显著，这与回归模型的方差分析和显著性校验结果一致。
最优工艺的确定及模型验证:
采用Design-Expert 8.0.6软件依据建立的数学模型对参数进行最优化分析，得到预测的最优工艺条件：乙酸浓度0.53mol/L，提取时间38.68h，液料比19.98∶1(mL/g)，在此条件下，ASC的最大提取率为23.93％。考虑到实际生产的可操作性，将上述提取工艺条件调整为：乙酸浓度为0.5mol/L，提取时间40h，液料比20∶1(mL/g)。按照该条件进行3次平行实验验证，最终ASC提取率为23.01％，与软件分析基本吻合，说明该模型具有可行性，存在一定的实际应用价值。
暗纹东方鲀鱼皮胶原的理化性质分析：
胶原的紫外吸收光谱：
由于胶原肽链中存在一些基团(如C＝O、-COOH、CONH2)，以及丰富的特征氨基酸—脯氨酸和羟脯氨酸，会导致胶原在230nm左右有一个最大吸收峰，这是胶原重要的鉴定方法。暗纹东方鲀鱼皮ASC在233.2nm处出现了强吸收峰。此外，酪氨酸和色氨酸的存在会在280nm处出现吸收峰。胶原在280nm只有微弱的吸收峰，说明提取的胶原中含有少量的酪氨酸和色氨酸。结果表明所提取的蛋白质为胶原蛋白，该结果与金枪鱼鱼皮胶原、鳗鱼鱼皮胶原的紫外吸收光谱图相似。
胶原的傅里叶变换红外光谱：
胶出现了酰胺A、B以及酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ特征带。
ASC的酰胺A带出现在3400.85cm-1处，通常与N-H的伸缩振动相关。酰胺B带位于2930.79cm-1，是由于-CH2的不对称性伸缩振动引起的。酰胺Ⅰ带源于C＝O的伸缩振动，通常和蛋白质的二级结构相关，ASC的酰胺Ⅰ带出现在1646.91cm-1。由于分子有序性增加，酰胺Ⅰ带的峰会向较高波数移动。酰胺Ⅱ带位于1532.65cm-1，是由于N-H平面弯曲和C-N伸缩振动产生的。酰胺Ⅲ带是由于N-H平面弯曲与C-N伸缩振动，以及甘氨酸主链和脯氨酸侧链的CH2基团摇摆振动引起的，当酰胺III带与1454cm-1的吸收比为1.0时，标志着胶原的三螺旋结构完整。ASC酰胺Ⅲ带的吸收峰出现于1243.38cm-1处，与1454cm-1处的比值为1.07，非常接近1.0，说明胶原的三螺旋结构在提取过程中没有被破坏。综上所述，提取的酸溶性胶原具有完整的三螺旋结构。
胶原的SDS-PAGE凝胶电泳：
胶原含有两条不同的α单链(α1和α2)，此外还含有高分子交联二聚体(β链)和少量的三聚体(λ链)，其中α链和β二聚体是其主要成分，而λ三聚体在胶原中只有少量存在。α1与α2链的条带强度比约为2∶1，表明所提取的胶原为Ⅰ型胶原，它主要由α1(Ⅰ)α2(Ⅰ)α3(Ⅰ)构成。α1与α2链的条带强度比有所不同，可能是由于在所用的电泳条件下无法鉴定出α3链，它会迁移到α1链的位置。该结果与牛腱Ⅰ型标准胶原、斑点叉尾鱼鱼皮胶原、金枪鱼鱼皮胶原的SDS-PAGE凝胶电泳图谱相似。
胶原的热稳定性分析：
胶原的热收缩温度(TS)是指当外部环境温度达到一个临界温度时，胶原纤维会急剧收缩到其初始长度的1/3，并且在这个收缩过程中胶原的三螺旋结构出现解旋，单肽链发生随机卷曲。胶原的热稳定性可由TS来表示。差示扫描量热法(DSC)是一种利用热分析方法，通过测量样品的吸热或放热的速率，来研究样品的反应热、转变热、相变过程以及纯度等。在蛋白质的相变及其它热过程中，由于热流率存在不同，可以得到蛋白质的结构变化，因此被广泛地用于蛋白质的热变性研究中。暗纹东方鲀鱼皮胶原的差示扫描量热结果显示，ASC TS为72.9℃。研究发现胶原的热稳定性取决于其氨基酸组成、提取方法、生物来源以及生物来源的生长温度。
胶原的表面形貌：
在较低放大倍数(1000X)下观察，ASC表现出片状、多层聚集的结构，且有不规则纤维细丝缠绕。此外，胶原的表面部分起皱，这可能是由于冷冻干燥过程中脱水所致。在较高放大倍数(10000X)下观察，可以看到ASC具有网状的纤维结构。ASC的纤维管直径较小，且拥有较为完整均匀的网状结构，说明经胃蛋白酶处理后，胶原纤维会遭到一定程度的破坏，网络孔隙变大，且部分蛋白降解后聚集形成不规则形状。孔大小、孔隙率和比表面积是生物材料应用于生物医药领域的重要参数。一些其他结构特征，如孔隙形状、孔壁形态和连接方式，也被认为是细胞繁殖、迁移、生长以及基因表达的基础。根据SEM的结果，从暗纹东方鲀鱼皮中提取的胶原具有应用于生物医药的潜能。
NaCl浓度对胶原溶解性的影响：
胶原的相对溶解度均随着NaCl浓度的增加而呈现下降的趋势。这可以用蛋白质的盐析现象来解释，一方面盐离子会与蛋白质争夺水分子，随着盐离子强度的增加，蛋白质的疏水作用也会增强，导致蛋白质胶体颗粒表面水膜的破坏，使溶解性降低；另一方面，大量中性盐会中和蛋白质颗粒表面的电荷，导致蛋白质在水中聚集，并产生沉淀。
pH对胶原溶解性的影响：
胶原的相对溶解度整体呈现先下降后上升的趋势，在pH为5时相对溶解度最低，在碱性范围内(>7)有最大相对溶解度。但值得注意的是，过酸或过碱的条件会对胶原的结构产生一定的破坏。胶原的溶解性与其等电点有密切关联，等电点指的是蛋白质分子的净电荷为零时的pH值。过酸或过碱的条件下蛋白质具有更高的表面电荷，而较高的表面电荷会导致分子间相互排斥，从而导致稳定的分散悬浮；越接近等电点，蛋白质分子的表面静电荷越趋近于零，因此相邻的颗粒间没有排斥力，蛋白质的结构更疏水、更不稳定，很容易发生聚集和沉淀。胶原的等电点根据其来源的不同而不同，这一结果可能与胶原中碱性氨基酸和酸性氨基酸的含量有关。
结论：
紫外吸收表明酸溶性胶原在233.2nm处出现强吸收峰，说明提取的蛋白质为胶原蛋白；红外光谱显示酸溶性胶原出现五种酰胺特征带，说明酸溶性胶原的三螺旋结构保存完好。
SDS-PAGE和XRD结果表明ASC为典型Ⅰ型胶原。
热稳定性实验表明ASC的热收缩温度为72.9℃。
SEM显示胶原呈现多层聚集的片状结构，且有不规则纤维结构缠绕。ASC的纤维网络均匀完整，适用于作为生物医药的载体和基材。
溶解性分析表明，胶原的相对溶解度随着氯化钠浓度的提高而增大，在氯化钠浓度大于1.2mol/L时趋于平衡；在pH＝5时相对溶解度最低。
FTIR实验表明成功生成动态亚胺键和二醇-硼酸酯键，赋予胶原水凝胶自愈性能；XRD实验表明胶原能够良好地分散在水凝胶中；SEM实验表明所有胶原水凝胶都呈现多孔的网状结构，随着氧化海藻酸钠含量增加网状结构更加致密。
热稳定性和保水性能实验结果表明增大氧化海藻酸钠含量可以提高胶原水凝胶热稳定性和保水性能。
流变学研究表明，胶原水凝胶表现出稳定的凝胶状态，凝胶-溶胶转变温度远高于人体表面温度。
自愈实验结果表明胶原水凝胶在无外界刺激下具有优异的自愈性能；可注射性实验结果表明胶原水凝胶具有剪切变稀的特点，有望用于3D打印。
小鼠全层皮肤缺损模型和H&E、Masson染色实验结果表明，经胶原水凝胶处理的伤口在第14天伤口愈合率最高(95.54±3.92％)，显著高于空白对照组(P＜0.01)，伤口基本趋近于闭合且被新生毛发覆盖；胶原水凝胶能够促进成纤维细胞生长增殖、新生血管和皮肤附属器官的生成，同时有利于胶原沉积和胶原纤维的规则排序，能够有效加速伤口愈合。
以暗纹东方鲀鱼皮为原料，采用酸法提取胶原，并以胶原提取率为指标，通过单因素结合响应面实验的方法对两种提取工艺进行优化，得到最优工艺参数。
本发明以酸溶性胶原为原料，复合氧化海藻酸钠和聚乙烯醇，以硼砂为交联剂，制备具有自愈性、可注射性、可作为伤口敷料的胶原水凝胶，由亚胺键、二元-硼酸酯键以及氢键形成动态网络构建而成，相较于传统水凝胶，具有三维网络结构发生破坏后能够快速进行自我修复的能力，解决了水凝胶被破坏后无法自我修复的问题。研究了胶原水凝胶的结构性质和功能特性，评估了胶原水凝胶对小鼠全层皮肤缺损模型的治疗效果。本发明旨在拓展河鲀鱼皮酸溶性胶原的应用，实现低值鱼类副产物资源的高值化利用。本发明提供的胶原水凝胶具有良好吸收和保水能力，能够有效保持伤口的清洁和湿润。此外，本发明的胶原水凝胶具有良好的可注射性、可降解性、柔韧性、粘附性等特点，作为敷料可以制备成任意尺寸和形状，适用于多种伤口且易于贴合粘附。本发明提供的胶原水凝胶的制备方法简单，操作方便、整个成胶过程温和，有利于大规模工业化生产。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.胶原水凝胶制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：分别配制酸溶性胶原溶液、氧化海藻酸钠溶液、PVA水溶液和交联剂溶液；
S2：将酸溶性胶原溶液与氧化海藻酸钠溶液混合，得到混合液A；
S3：向混合液A中加入PVA水溶液，搅拌均匀后获得混合液B；
S4：向混合液B中缓慢加入交联剂溶液，搅拌均匀后静置，获得水凝胶。
2.根据权利要求1所述的胶原水凝胶制备方法，其特征在于，酸溶性胶原溶液的制备方法包括以下步骤：
S111：酸溶性胶原的提取，在0-4℃条件下，取河鲀鱼皮，冲洗后充分沥干河鲀鱼皮表面水分，按料液比19-21:1mL/g加入0.4-0.6mol/L乙酸溶液，待鱼皮溶胀后搅碎，在0.4-0.6mol/L乙酸溶液中浸提35-42h，提取液离心后得到上清液，对上清液进行盐析沉淀，静置后，进行离心，得沉淀，将沉淀完全溶解于0.4-0.6mol/L乙酸溶液，分别于0.08-0.12mol/L乙酸溶液中透析1天，于蒸馏水中透析2天，每7-9h更换一次透析液，最后对透析得到的溶液冷冻干燥22-26h，得到酸溶性胶原；
S112：将步骤S111提取的酸溶性胶原溶解于PBS缓冲液中，制备质量浓度为35-45mg/mL的酸溶性胶原溶液。
3.根据权利要求2所述的胶原水凝胶制备方法，其特征在于：
步骤S111中，选用的河鲀鱼皮为暗纹东方鲀鱼皮，透析前的乙酸溶液的摩尔浓度为0.5mol/L，浸提时间为40h，乙酸溶液与河鲀鱼皮的料液比20:1mL/g。
4.根据权利要求1所述的胶原水凝胶制备方法，其特征在于，氧化海藻酸钠溶液的制备方法包括以下步骤：
S121：将海藻酸钠分散于无水乙醇中，得海藻酸钠悬浮液，将高碘酸钠充分溶解于蒸馏水中，得高碘酸钠溶液，在避光条件下，将海藻酸钠悬浮液和高碘酸钠溶液混合，室温搅拌反应8-10h，得混合溶液C；
S122：往混合溶液C中加入乙二醇，继续搅拌0.8-1.2h以终止氧化反应；
S123：对步骤S122搅拌后的溶液透析2-4d，将透析所得溶液冷冻干燥12-26h，得到白色絮状的含双醛基的氧化海藻酸钠；
S124：将步骤S123所得的氧化海藻酸钠溶解于PBS缓冲液，制备质量浓度为5-100mg/mL的氧化海藻酸钠溶液。
5.根据权利要求4所述的胶原水凝胶制备方法，其特征在于：
海藻酸钠与无水乙醇的料液比为1:8-12g/mL；
高碘酸钠与蒸馏水的料液比为1:8-12g/mL；
海藻酸钠悬浮液和高碘酸钠溶液的体积比为1:0.8-1.2；
乙二醇与无水乙醇的体积比为2-4:100；
采用分子截留量为2500-3500D的透析袋进行透析，透析液为蒸馏水。
6.根据权利要求1所述的胶原水凝胶制备方法，其特征在于，PVA水溶液的制备方法包括以下步骤：
取PVA，加入蒸馏水，85-95℃加热搅拌1.5-2.5h，使其充分溶解，配制8-10wt％PVA水溶液。
7.根据权利要求1所述的胶原水凝胶制备方法，其特征在于：
步骤S2中酸溶性胶原溶液与氧化海藻酸钠溶液的体积比为1：0.8-1.2；
步骤S3中混合液A与PVA水溶液的体积比为1：0.8-1.2；
步骤S4中混合液B与交联剂溶液的体积比为10-20：1；
交联剂溶液的摩尔浓度为0.05-0.15mol/L，交联剂为硼砂。
8.胶原水凝胶，其特征在于，由权利要求1-7任一项所述的胶原水凝胶制备方法制得，按体积份数计，包括以下组分：
酸溶性胶原溶液1份；
氧化海藻酸钠溶液0.8-1.2份；
PVA水溶液1.4-2.7份；
交联剂溶液0.16-0.49份。
9.根据权利要求1所述的胶原水凝胶，其特征在于：
酸溶性胶原溶液为河鲀鱼皮酸溶性胶原溶液；
氧化海藻酸钠溶液含有双醛基。
10.权利要求1-7任一项所述的胶原水凝胶制备方法制得的胶原水凝胶或权利要求8-9任一项所述的胶原水凝胶在制备促进皮肤伤口愈合药物中的应用。
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