CN117205117A

CN117205117A - 一种茶发酵提取液的制备方法及其在儿童牙膏制备中的应用

Info

Publication number: CN117205117A
Application number: CN202311102858.4A
Authority: CN
Inventors: 林振江; 丁琳
Original assignee: Guangzhou Youyihui Health Management Co ltd
Current assignee: Guangzhou Youyihui Health Management Co ltd
Priority date: 2023-08-28
Filing date: 2023-08-28
Publication date: 2023-12-12

Abstract

本发明公开了一种茶发酵提取液的制备方法及其在儿童牙膏制备中的应用，其包括：酿酒酵母和乳酸乳球菌对茶进行协同发酵，制备成茶发酵提取液；进一步可以制备成儿童牙膏。所述酿酒酵母保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 2.3965。所述乳酸乳球菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.15072。

Description

一种茶发酵提取液的制备方法及其在儿童牙膏制备中的应用

技术领域

本发明涉及一种茶发酵提取液的制备方法及其在牙膏制备中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

龋病是儿童口腔的常见疾病之一，变异链球菌和粘性放线菌是口腔常见的主要致龋细菌，而牙的窝沟处为容易患龋的部位。窝沟处釉质脱矿，一旦突破了釉牙本质界，进入牙本质后会导致了病损的迅速进展，对儿童和青少年的身心健康造成重大影响。

茶在中国源远流长，古代很多关于茶的描述，唐代《七碗茶诗》中就描述了茶对中国人的重要感知。现代科技进步，人们对茶进行了多方面的深入研究，研究发现了茶多酚、茶色素、茶氨酸、茶多糖等物质，每种物质都对人体具有生理调节作用。其中茶色素是从制茶发酵中提取的一类水溶性酚性色素，有较多的活性羟基,具有较强的药理作用。茶色素能够防治口腔常见疾病，抑制病原菌、抵抗病毒等，茶色素本身还具有一定的粘附功能，常常饮茶的人，其牙齿表面会有色素沉积。龋齿发生一般位于窝沟处，位置较深，茶色素可以通过粘附对局部窝沟处起到一定的封堵作用。

随着现代社会水平不断提高,目前儿童精加工食品摄入太多,导致蛀牙发生率越来越高，儿童牙膏目前多是化学抑菌，减少酸性物质的产生。但是目前茶制品应用于预防儿童龋齿的牙膏还非常少。本发明旨在提供一种茶发酵提取液的制备方法，并将其应用于儿童牙膏制备，具体通过添加茶发酵提取液，有助于抑制致龋菌，并增加茶色素物质的粘附起到一定的封堵作用。

发明内容

本发明旨在提供一种茶发酵提取液的制备方法，并将其应用于儿童牙膏制备，具体通过添加茶发酵提取液，有助于抑制致龋菌，并增加茶色素物质的粘附起到一定的封堵作用。

随着现代社会发展,精加工食品增多,目前儿童蛀牙发生率非常高，而儿童牙膏目前多是化学抑菌，从而减少酸性物质的产生。目前茶制品应用于预防儿童龋齿的牙膏还非常少。为此，我们期待研发一种有机茶物质预防龋齿的儿童牙膏。

本发明所述乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，该菌株已于2015年1月25日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.15072。

本发明所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，该菌株已于2008年1月9日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 2.3965。

本发明所述乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，该菌株已于2014年1月17日，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.12794。

本发明团队在研究和实践过程中，发现酿酒酵母CGMCC 2.3965+乳酸乳球菌CGMCC1.15072联用能够出乎预料的产生协同作用，大大提高茶发酵提取液的抑菌能力和溶液粘度，考虑乳酸乳球菌CGMCC 1.15072的加入改变了酿酒酵母CGMCC 2.3965发酵茶的微生物过程，令制备的茶发酵提取液具有更多的茶色素等物质，能够明显提升抑菌能力和溶液粘度值。可以用该茶发酵提取液来制备儿童牙膏。

本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。

一种茶发酵提取液的制备方法，其包括：

本发明所述接种量均为v/v。

菌种种子液制备：

酿酒酵母CGMCC 2.3965：称取保藏的酿酒酵母菌株进行解冻，划线于YPD固体培养基上培养，30℃条件下培养24小时使其重新复活，在YPD固体培养基上挑取菌落特征明显的酿酒酵母菌株接种于YPD液体培养基中，30℃，200r/分钟培养24小时，调整菌液浓度为1*10⁷CFU/ml酿酒酵母菌种子液。

乳酸乳球菌CGMCC 1.15072：取一环乳酸乳球菌接种到MRS固体培养基中划线，30℃厌氧培养24小时。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，厌氧培养成1*10⁷CFU/ml乳酸乳球菌CGMCC 1.15072种子液。

乳酸乳球菌CGMCC 1.12794：乳酸乳球菌种子液制备方法同上。

茶粉的制备：

按照GB/T8302—2002《茶取样》规定取茶样，将茶样磨碎，过40目筛，4℃密封保存。

茶发酵提取液制备：

(1)取磨碎后的茶粉1份，加入1倍的水混合，接种酿酒酵母CGMCC 2.3965种子液2％，接种乳酸乳球菌CGMCC 1.15072种子液1％，平均相对湿度为67％，保持30℃发酵48小时。

(2)加入5倍水，水温90℃，恒温箱内浸提30分钟，浸液倒出。再次加入5倍水，水温90℃，恒温箱内浸提30分钟，浸液倒出。

(3)合并2次的浸液，过0.22um过滤膜，再将合并后的浸提液减压蒸馏浓缩至1倍体积。4℃密闭保存。

本研究实施例展示的是红茶的制备，本研究还发现其他茶类在制备过程中，酿酒酵母CGMCC 2.3965+乳酸乳球菌CGMCC 1.15072联合使用也可以有效提升抑菌能力，提升发酵液的粘度值。

所述的茶发酵提取液还可以进一步制备成儿童牙膏。

所述的儿童牙膏上的应用，其配方包括：茶发酵提取液1份、甘油30份，山梨醇30份、瓜尔胶1份、二氧化硅20份、薄荷醇0.5份、柠檬酸钠0.5份、糖精钠0.5份、十二烷基硫酸钠2份、去离子水5份。

所述儿童牙膏的制作方法包括：

S1.将薄荷醇、柠檬酸钠、糖精钠预先溶解于去离子水中，制备成水溶液；

S2.将瓜尔胶，加入甘油、山梨醇，置磁力搅拌器上搅拌，80℃，使其均匀分散；

S3.再加入制备好的水溶液中，搅拌使胶溶，陈化2小时；

S4. 500r/min机械搅拌下加入二氧化硅、十二烷基硫酸钠、茶发酵提取液搅拌2小时，最后在真空下高速搅拌30分钟，即得儿童牙膏。

本发明的优点：

本发明制备的茶发酵提取液抑制致龋菌能力强，液体粘度值高，可以制备成儿童牙膏，不但能够抑制龋齿致病菌，还能够对牙齿局部起到一定的封堵作用，对儿童的牙齿健康保护具有重要的意义。

附图说明

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明的具体实施例如以下说明。

实施例1

本发明所述接种量均为v/v。

菌种种子液制备：

酿酒酵母CGMCC 2.3965：称取保藏的酿酒酵母菌株进行解冻，划线于YPD固体培养基上培养，30℃条件下培养24小时使其重新复活，在YPD固体培养基上挑取菌落特征明显的酿酒酵母菌株接种于YPD液体培养基中，30℃，200r/分钟培养24小时，调整菌液浓度为1*10⁷(CFU/ml)酿酒酵母菌种子液。

乳酸乳球菌CGMCC 1.15072：取一环乳酸乳球菌接种到MRS固体培养基中划线，30℃厌氧培养24小时。挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，厌氧培养成1*10⁷(CFU/ml)乳酸乳球菌CGMCC 1.15072种子液。

乳酸乳球菌CGMCC 1.12794：乳酸乳球菌种子液制备方法同上。

红茶的制备：

按照GB/T8302—2002《茶取样》规定取武夷山红茶，将茶样磨碎，过40目筛，4℃密封保存。

茶叶发酵提取液制备：

(3)合并2次的浸液，过0.22um过滤膜，将合并后的浸提液减压蒸馏浓缩至1倍体积。4℃密闭保存。

实施例2

对比例1(只加入酿酒酵母CGMCC 2.3965)：

菌种种子液制备和红茶的制备方法同实施例1。

茶叶发酵提取液制备：

(1)取磨碎后的茶粉1份，加入1倍的水混合，接种酿酒酵母CGMCC 2.3965种子液3％，平均相对湿度为67％，保持30℃发酵48小时。

对比例2(只加入乳酸乳球菌CGMCC 1.15072)：

菌种种子液制备和红茶的制备方法同实施例1。

茶叶发酵提取液制备：

(1)取磨碎后的茶粉1份，加入1倍的水混合，平均相对湿度为67％，接种乳酸乳球菌CGMCC 1.15072种子液3％，保持30℃发酵48小时。

对比例3(将乳酸乳球菌CGMCC 1.15072替换为乳酸乳球菌CGMCC 1.12794)：

菌种种子液制备和红茶的制备方法同实施例1。

茶叶发酵提取液制备：

(1)取磨碎后的茶粉1份，加入1倍的水混合，平均相对湿度为67％，接种酿酒酵母CGMCC 2.3965种子液2％，接种乳酸乳球菌CGMCC 1.12794种子液1％，保持30℃发酵48小时。

空白组(不添加菌液发酵)：

红茶的制备方法同实施例1。

茶叶提取液制备：

(1)取磨碎后的茶粉1份，加入1倍的水混合，平均相对湿度为67％，保持48小时。

实施例3

抑菌实验

变异链球菌和粘性放线菌是口腔常见的主要致龋细菌，我们将市购的变异链球菌UA159和粘性放线菌标准株作为检验菌株，评估茶叶发酵提取液的抑菌能力。

致病菌培养：用无菌接种环将变异链球菌和粘性放线菌分别接种于BHI琼脂培养基37℃厌氧培养48小时，取上述复苏的标准株单个菌落接分别种于BHI液体培养基内，37℃厌氧培养24小时，使用BHI液体培养基稀释配置成1*10⁶CFU/ml的种子液。

取100uL制备得到的变异链球菌和粘性放线菌悬液(1×10⁶CFU/ml)分别均匀涂布在BHI固体培养基中，打孔器在培养皿上打孔后(孔径6mm)，每孔内添加30uL实施例1和实施例2所得到的茶发酵提取液，阳性对照组为复方氯己定含漱液。培养24小时后用游标卡尺测定抑菌圈直径。每组重复3次，以抑菌圈直径进行敏感性判断，抑菌圈直径小于6mm考虑为无抑菌活性。结果如表1所示。

表1不同组别抑菌活性检测

	变异链球菌抑菌圈直径(mm)	粘性放线菌抑菌圈直径(mm)
			阳性对照组	21.53±0.34	19.86±0.35
实施例1组	20.96±0.37¹	17.13±0.29¹
			对比例1组	14.11±0.23^1，2	13.13±0.34^1，2
对比例2组	11.97±0.43²	11.10±0.21²
			对比例3组	14.78±0.44^1,2	13.31±0.38^1，2
空白组	11.34±0.25	10.67±0.32

注：t检验,l：P<0.05(与空白组比较)；2：P<0.05(和阳性对照组比较)

结果显示：实施例1、对比例1-3，空白组均有一定的抑菌功能，茶叶发酵提取物会产生茶色素等多种物质，茶色素等物质能够对多种龋齿致病菌起到抑制作用，抑菌环都大于6mm。

对比例1组单独添加酿酒酵母CGMCC 2.3965进行红茶发酵，相对于空白组有统计学差异(p<0.05)，考虑酿酒酵母CGMCC 2.3965在发酵红茶过程中，能够产生更多抑菌物。对比例2组单独添加乳酸乳球菌CGMCC 1.15072进行红茶发酵，相对于空白组无统计学差异(p<0.05)，考虑单独使用乳酸乳球菌CGMCC 1.15072发酵红茶，并不会产生更多的抑菌物质。而实施例1组显示同时使用酿酒酵母CGMCC 2.3965+乳酸乳球菌CGMCC 1.15072发酵红茶，和复方氯己定含漱液组无统计学差异，显示两者联用能够出乎预料的产生协同作用，大大增加红茶发酵的抑菌物质产生。而使用其他亚型的乳酸乳球菌，并不能增强酿酒酵母CGMCC2.3965茶发酵提取液的抑菌功能(实施例1相对于对比例3也有统计学意义)，说明的乳酸乳球菌CGMCC 1.15072的加入改变了酿酒酵母CGMCC 2.3965发酵红茶的微生物过程，获得的茶发酵提取液具有非常的抑制杂菌的功能。

实施例4

粘度值检测：

准备好待测的实施例1、实施例2的茶发酵提取液，倒入烧杯中，待发酵液恢复至室温后，使用数字粘度计测定茶色素溶液粘度。为保持测量稳定，每个样本平行测量10次。结果如表2所示。

表2不同组别溶液的粘度值检测

	粘度值(mPa·s)
		实施例1组	2.13±0.21¹
对比例1组	1.51±0.13¹
		对比例2组	1.33±0.16
对比例3组	1.58±0.19¹
		空白组	1.23±0.15

注：t检验,l：P<0.05(与空白组比较)

结果显示：实施例1、对比例1-3组相对于空白组，溶液粘度值都升高了。对比例1组单独添加酿酒酵母CGMCC 2.3965进行红茶发酵，相对于空白组有统计学差异(p<0.05)，考虑发酵会增加有机物物质的溶解度，提升粘度。对比例2组单独添加乳酸乳球菌CGMCC1.15072进行红茶发酵，粘度值升高较小，考虑单独使用乳酸乳球菌CGMCC 1.15072发酵红茶效果一般。而实施例1组显示同时使用酿酒酵母CGMCC 2.3965+乳酸乳球菌CGMCC1.15072发酵红茶，粘度大大提高，明显大于空白组(无细菌发酵溶液)，也明显高于酿酒酵母CGMCC 2.3965+其他乳酸乳球菌组(对比例3组)，显示酿酒酵母CGMCC 2.3965+乳酸乳球菌CGMCC 1.15072联用能够出乎预料的产生协同作用，大大提高红茶发酵的粘度物质产生，其他亚型的乳酸乳球菌不能增强酿酒酵母CGMCC 2.3965茶发酵提取液的粘度值(实施例1相对于对比例3也有统计学意义)，推测乳酸乳球菌CGMCC 1.15072的加入改变了酿酒酵母CGMCC 2.3965发酵红茶的微生物过程，令制备的茶发酵提取液具有更多的茶色素等物质，能够明显提升溶液粘度值。

实施例5

制备儿童牙膏的示范例：

按照实施例1和实施例2制备的茶发酵提取液各自添加以下成分制备儿童牙膏，按照重量份：

茶发酵提取液1份、甘油30份，山梨醇30份、瓜尔胶1份、二氧化硅20份、薄荷醇0.5份、柠檬酸钠0.5份、糖精钠0.5份、十二烷基硫酸钠2份、去离子水5份。

所述牙膏的制备方法为：

S1.薄荷醇、柠檬酸钠、糖精钠预先溶解于去离子水中，制备成A组分备用；

S2.将瓜尔胶，加入甘油、山梨醇，置磁力搅拌器上搅拌，80℃，使其均匀分散，制备成B组分；

S3.将A组分加入B组分中，搅拌使胶溶，然后在500r/min机械搅拌下加入二氧化硅、十二烷基硫酸钠、茶发酵提取液搅拌2小时，最后在真空下高速搅拌30分钟，即得儿童牙膏。

本方法制备得牙膏，各项指标符合国家相关规定。

本研究还发现不仅是红茶，白茶、绿茶、黄茶等茶类在制备过程中，酿酒酵母CGMCC2.3965+乳酸乳球菌CGMCC 1.15072联合使用也可以有效提升抑菌能力，提升发酵液的粘度值，可以制备成预防龋齿的儿童牙膏。

综上所述，本发明团队在研究和实践过程中，发现酿酒酵母CGMCC 2.3965+乳酸乳球菌CGMCC 1.15072联合使用能够更好的抑制口腔常见的主要致龋细菌，并且可以大大提高茶发酵过程中的粘度物质产生，而其他亚型的乳酸乳球菌不能增强酿酒酵母CGMCC2.3965发酵液的粘度值，推测乳酸乳球菌CGMCC 1.15072的加入改变了酿酒酵母CGMCC2.3965发酵茶的微生物过程，令制备的茶发酵提取液具有更多的茶色素等物质，能够明显提升抑菌功能，增加溶液粘度。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种茶发酵提取液，其特征在于制备方法如下：

(1)茶粉1份，加入1倍的水混合，接种酿酒酵母CGMCC 2.3965种子液2％，接种乳酸乳球菌CGMCC 1.15072种子液1％，平均相对湿度为67％，保持30℃发酵48小时；

(2)加入5倍水，水温90℃，恒温箱内浸提30分钟，浸液倒出，再次加入5倍水，水温90℃，恒温箱内浸提30分钟，浸液倒出；

(3)合并2次的浸液，过0.22um过滤膜，将合并后的浸提液减压蒸馏浓缩至1倍体积，4℃密闭保存。

2.权利要求1所述的茶发酵提取液，其特征在于所述的茶粉的制作方法如下：

3.权利要求1所述的茶发酵提取液，其酿酒酵母CGMCC 2.3965种子液种子液制备如下：

取酿酒酵母CGMCC 2.3965菌株划线于YPD固体培养基上培养，30℃条件下培养24小时使其重新复活，在YPD固体培养基上挑取菌落特征明显的酿酒酵母菌株接种于YPD液体培养基中，30℃，200r/分钟培养24小时，调整菌液浓度为1*10⁷CFU/ml酿酒酵母菌种子液。

4.权利要求1所述的茶发酵提取液，其乳酸乳球菌CGMCC 1.15072种子液种子液制备如下：

取一环乳酸乳球菌CGMCC 1.15072接种到MRS固体培养基中划线，30℃厌氧培养24小时，挑取平板中长势较好的单菌落接种至MRS液体培养基中活化，厌氧培养成1*10⁷CFU/ml乳酸乳球菌CGMCC 1.15072种子液。

5.权利要求1-4任一项所述的茶发酵提取液，其在儿童牙膏上的应用。

6.权利要求5所述的在儿童牙膏上的应用，所述儿童牙膏配方包括：茶发酵提取液1份、甘油30份，山梨醇30份、瓜尔胶1份、二氧化硅20份、薄荷醇0.5份、柠檬酸钠0.5份、糖精钠0.5份、十二烷基硫酸钠2份、去离子水5份。

7.权利要求6所述的在儿童牙膏上的应用，其特征在于所述儿童牙膏包括以下制作步骤：

S3.将A组分加入B组分中，搅拌使胶溶，在500r/min的机械搅拌下加入二氧化硅、十二烷基硫酸钠、茶发酵提取液后搅拌2小时，最后在真空下高速搅拌30分钟，即得儿童牙膏。