CN117187381A - 一种用于妊娠期糖尿病早期辅助诊断的甲基化区域标志物组合及其应用 - Google Patents
一种用于妊娠期糖尿病早期辅助诊断的甲基化区域标志物组合及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于妊娠期糖尿病早期辅助诊断的甲基化区域标志物组合及其应用。该甲基化区域标志物是妊娠期糖尿病早期相关的甲基化区域chr11:118498190‑118498259,chr13:111841565‑111842079,chr14:104208350‑104208437,chr1:205089780‑205089897,chr20:43996165‑43996235,chr22:48960889‑48961073,chr3:48697595‑48697883等7个甲基化区域的组合。该甲基化区域标志物的特异性扩增引物可以用于制备妊娠期糖尿病早期辅助诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和女性生殖健康领域,涉及一种用于妊娠期糖尿病早期辅助诊断的甲基化区域标志物及其应用。
背景技术
妊娠期糖尿病(Gestational Diabetes Mellitus,GDM)是一种常见的妊娠期疾病,特指在妊娠期间被首次诊断出糖耐量异常。研究表明,GDM作为高危妊娠会增加妊娠高血压及先兆子痫的风险,GDM孕妇发生Ⅱ型糖尿病的风险比健康孕妇高7倍以上。另一方面,GDM对子代近期和远期的生长发育过程均会带来不良影响,近期可能导致新生儿低血糖、高胆红素血症和巨大儿等,远期会增加子代肥胖、II型糖尿病和高血压等多种代谢综合征的风险,给家庭和社会带来严重的心理和经济学负担。
近年来越来越多的研究开始关注表观遗传标志物在GDM发生发展中的作用。表观遗传学因其整合了遗传因素(如基因突变)与非遗传因素(如外在环境影响、生活方式改变)的信息,近年来被认为对疾病风险的揭示具有更强更直接的影响。DNA甲基化作为表观遗传最重要的一种形式,直接或间接的方式参与了基因表达的调控,早期GDM领域候选基因研究结果表明某些关键基因的甲基化水平改变了GDM的病理过程,如经典的脂联素ADIPOQ基因和瘦素基因启动子区域的异常甲基化与母体葡萄糖代谢存在显著关联。随着生物技术的快速发展,以芯片或测序技术为基础的全基因组甲基化检测在GDM相关研究领域得到了大规模应用,鉴定出了更多的潜在甲基化位点。其中最有代表性的是全球妊娠和儿童表观遗传学联盟,其联盟的研究对象均采用了illumina 450K芯片进行全基因组的甲基化检测,联合孕产妇吸烟、BMI、高血压和新生儿体重等表型进行了多方面的评估,获得了大量与各类孕期状态(包括GDM在内)相关的甲基化位点。另一篇来自中国台湾的研究显示,利用甲基化芯片对GDM女性和健康女性分娩前的外周血进行了全基因组甲基化检测后,发现了富集在内分泌失调、代谢性疾病、碳水化合物代谢和脂质代谢等通路上的200多个差异甲基化位点。
综上,尽管基于全基因组水平的甲基化研究大大提高了GDM相关甲基化位点的鉴定,然而以上现有研究大多是探讨GDM发生之后甲基化特征的改变,缺乏基于前瞻性队列研究的证据。现有研究发现的甲基化位点并不能很好的解释GDM的病因学推断。目前,还没有将甲基化应用于妊娠期糖尿病早期辅助诊断的报道,若能找出与妊娠期糖尿病早期相关的甲基化特征以及受甲基化影响的妊娠期糖尿病早期相关基因,并研制相应的诊断试剂盒,对我国妊娠期糖尿病早期的诊断现状必将是一次有力的推动,也为其药物筛选、药效评价开辟了新的途径。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述问题,提出一种用于妊娠期糖尿病早期辅助诊断的甲基化区域组合标志物。
本发明的第二个目的是提供上述扩增上述甲基化区域的特异性引物组合。
本发明的第三个目的是提供上述特异性引物组合在制备妊娠期糖尿病早期辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是提供妊娠期糖尿病早期辅助诊断试剂盒。
发明人通过研究妊娠期糖尿病早期患者和健康对照的甲基化数据,寻找与妊娠期糖尿病早期发病风险高度相关的高特异性和高敏感性的甲基化区域组合,并研制出可用于临床应用的妊娠期糖尿病早期辅助诊断试剂盒,为妊娠期糖尿病的早期辅助诊断提供数据支持,为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的:
一种用于妊娠期糖尿病早期辅助诊断相关的甲基化区域标志物。该甲基化区域标志物组合是妊娠期糖尿病早期相关的甲基化区域chr11:118498190-118498259,chr13:111841565-111842079,chr14:104208350-104208437,chr1:205089780-205089897,chr20:43996165-43996235,chr22:48960889-48961073,chr3:48697595-48697883的组合。
所述的甲基化区域标志物的特异性扩增引物,这些引物为(兼并碱基R代表A/G):
chr11:118498190-118498259的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2;
chr13:111841565-111842079的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.4;
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chr3:48697595-48697883的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.13,SEQ ID NO.14。
所述的甲基化区域标志物在制备妊娠期糖尿病早期辅助诊断试剂盒中的应用。
一种妊娠期糖尿病早期辅助诊断试剂盒,该试剂盒用于检测外周血DNA中chr11:118498190-118498259,chr13:111841565-111842079,chr14:104208350-104208437,chr1:205089780-205089897,chr20:43996165-43996235,chr22:48960889-48961073,chr3:48697595-48697883的甲基化程度。
所述的诊断试剂盒,该试剂盒含有上述甲基化区域标志物的特异性扩增引物。
所述的诊断试剂盒,该试剂盒含有的甲基化区域标志物的特异性扩增引物,这些引物为(兼并碱基R代表A/G):
chr11:118498190-118498259的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2;
chr13:111841565-111842079的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.4;
chr14:104208350-104208437的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6;
chr1:205089780-205089897的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.8;
chr20:43996165-43996235的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.9,SEQ ID NO.10;
chr22:48960889-48961073的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.11,SEQ ID NO.12;
chr3:48697595-48697883的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.13,SEQ ID NO.14。
所述诊断试剂盒,该试剂盒还包括以下任意一种或多种甲基化检测方法所使用的试剂,所述甲基化检测方法包括:全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性聚合酶链式反应(甲基化特异性PCR,Methylation-Specific PCR,MS-PCR)、亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、甲基化敏感限制性内切酶-PCR/Southern法、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(Combined BisulfiteRestriction Analysis,COBRA)、数字聚合酶链式反应、限制性界标基因组扫描、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、甲基化图谱分析(Methylation Profiling)、甲基化芯片中一种或多种方法所使用的试剂。
所述诊断试剂盒,该试剂盒还包括处理样品的试剂。
所述处理可以包括提取DNA的步骤、使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤。
所述使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤所使用的试剂最常见的是亚硫酸氢盐试剂。
所述亚硫酸氢盐试剂包括亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液。
所述DNA的提取试剂可以包括裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液。
所述裂解缓冲液包括蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂组成。
所述结合缓冲液包括蛋白变性剂和pH缓冲剂组成。
所述pH缓冲剂选自Tris、硼酸、磷酸盐、和MES中的一种或多种。
所述核酸酶抑制剂选自EDTA、EGTA和DEPC中的一种或多种。
所述清洗缓冲液选自Tris、硼酸、山梨醇、聚乙二醇和巯基乙醇中的一种或多种。
所述洗脱缓冲液选自NaCl、Tris-HCl和EDTA中的一种或多种。
(1) 建立统一标准的标本库和数据库:以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本,系统收集完整的人口学资料和临床资料。
(2)重亚硫酸盐全基因组测序:选择妊娠期糖尿病患者和健康对照孕早期的外周血,利用重亚硫酸盐全基因组测序,在全基因组范围内找出与两者之间的差异甲基化区域。
(3)妊娠期糖尿病早期辅助诊断试剂盒的研制:根据妊娠期糖尿病患者和健康对照孕早期外周血中筛选的显著差异的甲基化区域用于妊娠期糖尿病早期辅助诊断的试剂盒。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分:
1 .研究样本的选择
本研究的样本来源于南京市妇幼保健院纳入的自然怀孕孕妇前瞻性队列,孕早期血糖水平正常但孕中期75g OGTT筛查时被诊断为GDM并最终成功分娩的孕妇作为病例组,同时期孕早期血糖正常最终成功分娩的孕妇作为健康对照。均排除患有GDM以外的其它妊娠合并症者,排除孕前糖尿病者。
孕早期采血留存;
本研究共纳入221例符合标准的样本进行研究。
QIAamp DNA Kit提取血液样本基因组DNA,按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μl DNA,纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
3. Illumina HiSeq X Ten平台全基因组甲基化检测
提取外周血DNA:使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取DNA。
片段化处理:在100ng样本DNA中加入约1%外源性噬菌体DNA,1.25µL FragmentBuffer,2.5µL Enzyme,加入ddH2O至12.5µL,4℃加热1min,37℃加热14min,4℃静置。以将DNA打断成200-300bp片段。
末端修复和添加A尾;取DNA 12.5µL加入ER-AT buffer 1.75µL,ER-AT Enzyme0.75µL,20℃加热30min,65℃加热30min,4℃静置。
DNA连接:使用KAPA DNA HyperPlus试剂盒。取DNA 15µL,加入Ligation Buffer7.5µL,Enzyme 2.5µL,Methy-Adapter 1µL,加入ddH2O至27.5µL。20℃加热4h或4℃过夜保存。
片段纯化:DNA beads室温平衡0.5h后,加入0.8×上步骤反应体系体积的beads到上步完成体系混匀,室温静置孵育5min,至于磁力架上待液体澄清,弃尽上清。接着加入200µL 80%乙醇(ddH2O稀释)重悬磁珠,磁力架上静置,弃上清,重复此步骤一次。EB洗脱,磁力架上转移上清液至新的PCR管。
重亚硫酸盐转化:使用EZ DNA Methylation-Lightning™ Kit(D5030T)试剂盒对DNA进行亚硫酸盐转化。试剂盒使用前需要将24mL 100%乙醇添加到6mL M-Wash缓冲液浓缩液中制备M-Wash缓冲液。
PCR扩增:采用KAPA HIFI HotStartReadyMix(2802)进行高效PCR反应。先98℃加热45s,循环以下操作十次:98℃加热15s,65℃加热30s,72℃加热30s。循环操作结束后72℃加热1min,4℃静置。
片段纯化:DNA beads室温平衡0.5h后,加入0.8×上步骤反应体系体积的beads到上步完成体系混匀,室温静置孵育5min,至于磁力架上待液体澄清,弃尽上清;加入200µL80%乙醇(ddH2O稀释)重悬磁珠,磁力架上静置,弃上清,重复此步骤一次; EB洗脱,磁力架上转移上清液至新的PCR管,测定浓度。
上机测序:上述制备WGBS文库通过Illumina HiSeq X Ten高通量测序平台进行全基因组测序。
4.统计分析方法
使用t检验比较病例对照组的全局、基因元件区域的甲基化水平差异。对甲基化区域进行差异分析,使用超几何分布检验进行富集分析。
DNA甲基化差异分析通过R统计软件进行。使用的bsseq包对亚硫酸氢盐测序数据进行平滑处理。使用DSS包进行配对差异甲基化分析。本研究中,差异甲基化区域(Differently methylated locus,DML)定义为P值小于1×10-5的差异区域,差异甲基化区域(Differently methylated region,DMR)确定为以P值小于0.05的差异区域结合形成最小宽度为50bp,至少包含3个CpG区域的区域,基于R软件的glmnet包对所有差异高甲基化区域进行lasso回归模型降维,最终获得7个候选甲基化区域。
为了进一步研究这7个甲基化区域构成的综合指征用于早期诊断的效果,我们构建了一个数学公式,综合考虑每个甲基化区域的甲基化水平与妊娠期糖尿病早期发病的关联情况和关联强度。具体来说,我们综合考虑每个甲基化区域的情况给每个研究对象确定一个评估分值。评估分值的算法如下:评估分值=(18.07×chr13:111841565-111842079-16.93×chr11:118498190-118498259-5.56×chr14:104208350-104208437+4.73×chr1: 205089780-205089897-0.12×chr20:43996165-43996235+8.58×chr22:48960889- 48961073+6.33×chr3:48697595-48697883),获得的分值系数以及界限值被直接应用于甲基化关联分析研究的样本中。
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(R语言,v4.0.2)。统计学显著性水平设为0.05,所有统计学检验均为双侧检验。
5.诊断试剂盒制备方法
Illumina HiSeq X Ten平台进行全基因组甲基化测序,在甲基化差异分析后确定妊娠期糖尿病患者和健康对照孕早期外周血中显著的差异甲基化区域作为妊娠期糖尿病早期诊断的指标。最后筛选出的与妊娠期糖尿病早期发病有关的差异甲基化区域用于制作辅助诊断试剂盒(chr11:118498190-118498259,chr13:111841565-111842079,chr14:104208350-104208437,chr1:205089780-205089897,chr20:43996165-43996235,chr22:48960889-48961073,chr3:48697595-48697883)。诊断试剂可以包括这些甲基化区域的特异性引物,以及DNA提取和重亚硫酸盐转化等试剂,这些物质可以全部装配在一个试剂盒中,也可以分散在一系列试剂盒中组合使用。
以下是本发明进一步的说明:
在上述221例符合条件的妊娠期糖尿病患者和健康对照孕早期外周血中,我们将这两组人群使用Illumina HiSeq X Ten重亚硫酸盐全基因组甲基化测序获得相关结果。
根据Illumina HiSeq X Ten全基因组甲基化检测,本发明人检测到在“妊娠期糖尿病患者”组和“健康对照”组中孕早期外周血甲基化表达存在差异的区域包括: chr11:118498190-118498259,chr13:111841565-111842079,chr14:104208350-104208437,chr1:205089780-205089897,chr20:43996165-43996235,chr22:48960889-48961073,chr3:48697595-48697883等7个差异甲基化区域。
7个差异甲基化区域的组合用于妊娠期糖尿病早期诊断的效果,发现其组合能够很好的区分病例与对照。
根据上述实验结果,本发明人制备了一种能用于妊娠期糖尿病早期辅助诊断的试剂盒,包含测定受试者血标本DNA中上述甲基化区域的特异性引物和其他检测试剂。
具体而言,这7个甲基化区域的组合,或者这7个甲基化区域的特异性引物构成的相关诊断试剂盒有助于妊娠期糖尿病早期的辅助诊断,为临床医生辅助判断孕妇潜在的疾病状态,及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
本发明提供的一种用于妊娠期糖尿病早期辅助诊断的甲基化区域及其应用的优点在于:
(1) DNA甲基化是一种新型生物标志物,区别于传统生物标志物,在病理早期或亚健康期就可被检测到,可大大提高疾病诊断的敏感性和特异性。妊娠期糖尿病人群早期甲基化特征的发现有利于临床医生快速准确的提供精准干预,为高危人群及时采取更具个性化的防治方案。
(2) 甲基化试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒,有助于反映不同受试者甲基化水平,结合受试者的代谢组数据可以迅速判断受试者的早期发病风险是对之前妊娠期糖尿病预测的强有力补充。
(3)采用严密的验证和评价体系,本发明人采用重亚硫酸盐全基因组测序技术直接测量甲基化DNA序列进一步分析获取疾病相关的甲基化图谱;以上方法和策略的应用加速和保证了DNA甲基化和诊断试剂盒在临床上的应用,也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过研究妊娠期糖尿病患者和健康对照孕早期外周血的甲基化数据,寻求可用于妊娠期糖尿病早期检测的甲基化相关标志物。因此,本发明获得了妊娠期糖尿病早期的甲基化数据库和受甲基化影响的相关基因;通过对妊娠期糖尿病早期甲基化差异区域的应用,促进妊娠期糖尿病相关研究结果的临床转化和不同实验室间研究结果的比较,为高危人群的早期筛查和精准干预提供基础数据和科学依据,并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1:显示全基因组甲基化关联研究妊娠期糖尿病患者和健康对照孕早期外周血的ROC曲线。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步阐述。
实施例1 .研究样本的选择
本研究的样本来源于南京市妇幼保健院纳入的自然怀孕孕妇前瞻性队列,孕早期血糖水平正常但孕中期75g OGTT筛查时被诊断为GDM并最终成功分娩的孕妇作为病例组,同时期孕早期血糖正常最终成功分娩的孕妇作为健康对照。均排除患有GDM以外的其它妊娠合并症者,排除孕前糖尿病者。
孕早期采血留存;
本研究共纳入221例符合标准的样本进行研究。
QIAamp DNA Kit提取血液样本基因组DNA,按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μl DNA,纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
3. Illumina HiSeq X Ten平台全基因组甲基化检测
提取外周血DNA:使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒进行提取DNA。
片段化处理:在100ng样本DNA中加入约1%外源性噬菌体DNA,1.25µL FragmentBuffer,2.5µL Enzyme,加入ddH2O至12.5µL,4℃加热1min,37℃加热14min,4℃静置。以将DNA打断成200-300bp片段。
末端修复和添加A尾;取DNA 12.5µL加入ER-AT buffer 1.75µL,ER-AT Enzyme0.75µL,20℃加热30min,65℃加热30min,4℃静置。
DNA连接:使用KAPA DNA HyperPlus试剂盒。取DNA 15µL,加入Ligation Buffer7.5µL,Enzyme 2.5µL,Methy-Adapter 1µL,加入ddH2O至27.5µL。20℃加热4h或4℃过夜保存。
片段纯化:DNA beads室温平衡0.5h后,加入0.8×上步骤反应体系体积的beads到上步完成体系混匀,室温静置孵育5min,至于磁力架上待液体澄清,弃尽上清。接着加入200µL 80%乙醇(ddH2O稀释)重悬磁珠,磁力架上静置,弃上清,重复此步骤一次。EB洗脱,磁力架上转移上清液至新的PCR管。
重亚硫酸盐转化:使用EZ DNA Methylation-Lightning™ Kit(D5030T)试剂盒对DNA进行亚硫酸盐转化。试剂盒使用前需要将24mL 100%乙醇添加到6mL M-Wash缓冲液浓缩液中制备M-Wash缓冲液。
PCR扩增:采用KAPA HIFI HotStartReadyMix(2802)进行高效PCR反应。先98℃加热45s,循环以下操作十次:98℃加热15s,65℃加热30s,72℃加热30s。循环操作结束后72℃加热1min,4℃静置。
片段纯化:DNA beads室温平衡0.5h后,加入0.8×上步骤反应体系体积的beads到上步完成体系混匀,室温静置孵育5min,至于磁力架上待液体澄清,弃尽上清;加入200µL80%乙醇(ddH2O稀释)重悬磁珠,磁力架上静置,弃上清,重复此步骤一次; EB洗脱,磁力架上转移上清液至新的PCR管,测定浓度。
上机测序:上述制备WGBS文库通过Illumina HiSeq X Ten高通量测序平台进行全基因组测序。
4.统计分析方法
使用t检验比较病例对照组的全局、基因元件区域的甲基化水平差异。对甲基化区域进行差异分析,使用超几何分布检验进行富集分析。
DNA甲基化差异分析通过R统计软件进行。使用的bsseq包对亚硫酸氢盐测序数据进行平滑处理。使用DSS包进行配对差异甲基化分析。本研究中,差异甲基化区域(Differently methylated locus,DML)定义为P值小于1×10-5的差异区域,差异甲基化区域(Differently methylated region,DMR)确定为以P值小于0.05的差异区域结合形成最小宽度为50bp,至少包含3个CpG区域的区域。
为了进一步研究这7个甲基化区域构成的综合指征用于早期诊断的效果,我们构建了一个数学公式,综合考虑每个甲基化区域的甲基化水平与妊娠期糖尿病早期发病的关联情况和关联强度。具体来说,我们综合考虑每个甲基化区域的情况给每个研究对象确定一个评估分值。评估分值的算法如下:评估分值=(18.07×chr13:111841565-111842079-16.93×chr11:118498190-118498259-5.56×chr14:104208350-104208437+4.73×chr1: 205089780-205089897-0.12×chr20:43996165-43996235+8.58×chr22:48960889- 48961073+6.33×chr3:48697595-48697883),获得的分值系数以及界限值被直接应用于甲基化关联分析研究的样本中。
统计学分析均通过专门的统计学分析软件完成(R语言,v4.0.2)。统计学显著性水平设为0.05,所有统计学检验均为双侧检验。
5、结果分析:
为了评估该模型对妊娠期糖尿病早期的预测效能,使用R软件对以上7个甲基化区域进行模型构建和评估。以妊娠期糖尿病早期为表型,构建Logistic回归模型。基于221例全基因组甲基化测序样本数据,其中80%的样本被用于训练模型,20%的样本用于验证模型的性能。使用rROC软件包绘制受试者工作特征曲线 (receiver operatingcharacteristic curve,简称ROC曲线),又称为感受性曲线(sensitivity curve),以假阳性概率(False positive rate)为横轴,真阳性(True positive rate)为纵轴所组成的坐标图,曲线下面积AUC代表了模型区分妊娠期糖尿病患者与健康对照的能力,大于0.85代表模型的分类效能优秀,该模型在验证集样本中的AUC值为0.874,说明能够很好地区分妊娠期糖尿病患者与健康对照。
实施例2:诊断试剂盒制备方法
Illumina HiSeq X Ten平台进行全基因组甲基化测序,在甲基化差异分析后确定妊娠期糖尿病患者和健康对照孕早期外周血中显著的差异甲基化区域作为妊娠期糖尿病早期诊断的指标。最后筛选出的与妊娠期糖尿病早期发病有关的差异甲基化区域用于制作辅助诊断试剂盒(chr11:118498190-118498259,chr13:111841565-111842079,chr14:104208350-104208437,chr1:205089780-205089897,chr20:43996165-43996235,chr22:48960889-48961073,chr3:48697595-48697883)。
诊断试剂可以包括这些甲基化区域的特异性引物,以及DNA提取和重亚硫酸盐转化等试剂,这些物质可以全部装配在一个试剂盒中,也可以分散在一系列试剂盒中组合使用。
具体是,一种妊娠期糖尿病早期辅助诊断试剂盒,该试剂盒用于检测外周血DNA中chr11:118498190-118498259,chr13:111841565-111842079,chr14:104208350-104208437,chr1:205089780-205089897,chr20:43996165-43996235,chr22:48960889-48961073,chr3:48697595-48697883的甲基化程度,该试剂盒含有的特异性扩增引物组合如下(兼并碱基R代表A/G):
甲基化区域 | 上游引物 | 下游引物 |
chr11:118498190-118498259 | AAGGAGAAATTGAGGATAAGTGA(SEQ ID NO.1) | CCCRAAAACCAAAACTAAAAAA(SEQ ID NO.2) |
chr13:111841565-111842079 | AATAAGTTTTGTTGGGGAAA(SEQ ID NO.3) | CCCAACAACAATTAAAATCT(SEQ ID NO.4) |
chr14:104208350-104208437 | AGGAAAGGTTTAATGGTTAT(SEQ ID NO.5) | CTCCCATCCCRAATATAAACAAA(SEQ ID NO.6) |
chr1:205089780-205089897 | TTATATTTTAGTTTGTTGAT(SEQ ID NO.7) | CCCCCAAACCTATAAAAAAATT(SEQ ID NO.8) |
chr20:43996165-43996235 | GTTTTATTTTTTTGGGATAGTTG(SEQ ID NO.9) | ACCTACATTTCTTTCTATAACTC(SEQ ID NO.10) |
chr22:48960889-48961073 | GGTTAGAAGGGAATTAAAAT(SEQ ID NO.11) | AAACTAAAACAAAAACATCACCC(SEQ ID NO.12) |
chr3:48697595-48697883 | TTGAGTAGTGGGTATTTTGAAA(SEQ ID NO.13) | ACCAAATTAAAATACTCCCT(SEQ ID NO.14) |
该试剂盒还含有处理样品的试剂,所述处理包括提取DNA的步骤、使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤;其中:
所述使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤所使用的试剂最常见的是亚硫酸氢盐试剂,包括亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液;
所述DNA的提取试剂包括裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液,其中,裂解缓冲液包括蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂;结合缓冲液包括蛋白变性剂和pH缓冲剂;pH缓冲剂包括Tris、硼酸、磷酸盐、MES中的一种或多种;所述核酸酶抑制剂包括EDTA、EGTA和DEPC中的一种或多种;清洗缓冲液包括Tris、硼酸,山梨醇,聚乙二醇和巯基乙醇中的一种或多种;洗脱缓冲液包括NaCl,Tris-HCl和EDTA中的一种或多种。
该试剂盒还包括任意一种或多种甲基化检测方法所使用的试剂,所述甲基化检测方法包括:全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)、焦磷酸测序(Pyrosequencing)、亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性聚合酶链式反应(甲基化特异性PCR,Methylation-Specific PCR,MS-PCR)、亚硫酸氢盐特异性聚合酶链式反应、甲基化敏感限制性内切酶-PCR/Southern法、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(Combined Bisulfite Restriction Analysis,COBRA)、数字聚合酶链式反应、限制性界标基因组扫描、CpG岛微阵列、单核苷酸引物延伸SNUPE、甲基化图谱分析(Methylation Profiling)、甲基化芯片中一种或多种方法。
Claims (8)
1.一种用于妊娠期糖尿病早期辅助诊断相关的甲基化区域标志物组合,其特征在于,该甲基化区域标志物组合是妊娠期糖尿病早期相关的甲基化区域chr11:118498190-118498259,chr13:111841565-111842079,chr14:104208350-104208437,chr1:205089780-205089897,chr20:43996165-43996235,chr22:48960889-48961073,chr3:48697595-48697883的组合。
2.用于扩增权利要求1所述的甲基化区域标志物的特异性扩增引物组合,其特征在于,所述引物组合为:
chr11:118498190-118498259的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2;
chr13:111841565-111842079的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.4;
chr14:104208350-104208437的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6;
chr1:205089780-205089897的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.8;
chr20:43996165-43996235的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.9,SEQ ID NO.10;
chr22:48960889-48961073的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.11,SEQ ID NO.12;
chr3:48697595-48697883的特异性扩增引物为:SEQ ID NO.13,SEQ ID NO.14。
3.权利要求2所述的特异性扩增引物组合在制备妊娠期糖尿病早期辅助诊断试剂盒中的应用。
4.一种妊娠期糖尿病早期辅助诊断试剂盒,其特征在于,该试剂盒包含检测外周血DNA中chr11:118498190-118498259,chr13:111841565-111842079,chr14:104208350-104208437,chr1:205089780-205089897,chr20:43996165-43996235,chr22:48960889-48961073,chr3:48697595-48697883的甲基化程度的试剂。
5.根据权利要求4所述的辅助诊断试剂盒,其特征在于,该试剂盒含有权利要求2所述的特异性扩增引物组合。
6.根据权利要求5所述的辅助诊断试剂盒,其特征在于,该试剂盒还含有处理样品的试剂。
7.根据权利要求6所述的辅助诊断试剂盒,其特征在于,所述处理包括提取DNA的步骤、使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤;其中:
所述使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤所使用的试剂最常见的是亚硫酸氢盐试剂,包括亚硫酸氢盐缓冲液和保护缓冲液;
所述DNA的提取试剂包括裂解缓冲液、结合缓冲液、清洗缓冲液和洗脱缓冲液,其中,裂解缓冲液包括蛋白变性剂、去垢剂、pH缓冲剂和核酸酶抑制剂;结合缓冲液包括蛋白变性剂和pH缓冲剂;pH缓冲剂选自Tris、硼酸、磷酸盐、MES中的一种或多种;所述核酸酶抑制剂选自EDTA、EGTA或DEPC中的一种或多种;清洗缓冲液选自Tris、硼酸,山梨醇,聚乙二醇和巯基乙醇中的一种或多种;洗脱缓冲液选自NaCl,Tris-HCl或EDTA中的一种或多种。
8.根据权利要求5所述的辅助诊断试剂盒,其特征在于,该试剂盒还包括任意一种或多种甲基化检测方法所使用的试剂。
Priority Applications (1)
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