CN117180511A - 一种具有抗凝血和/或原位内皮化功能的白蛋白涂层及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有抗凝血和/或原位内皮化功能的白蛋白涂层及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医用材料技术领域，公开一种具有抗凝血和/或原位内皮化功能的白蛋白涂层及其制备方法和应用。制备过程包括步骤：将活化后的基底浸泡在含有环氧官能团的硅氧烷溶液中，得到改性基底；或，将活化后的基底和含环氧官能团的硅氧烷一同静置在真空环境中，得到改性基底；将改性基底浸泡在白蛋白溶液中，得到所述白蛋白涂层。本发明发现白蛋白涂层不仅具有优异的抗凝血功能，还具有原位内皮化功能，能够在涂层表面快速形成完整的内皮层，抑制平滑肌细胞的过度增生，避免术后再狭窄的发生，可用于心血管支架、心脏瓣膜、心脏封堵器等一系列植介入医疗器械表面，为其提供优异的抗凝血和/或原位内皮化效果。
Description
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域，具体涉及一种具有抗凝血和/或原位内皮化功能的白蛋白涂层及其制备方法和应用。
背景技术
心血管疾病是严重危害人类生命健康的杀手，动脉粥样硬化作为最常见的心血管疾病，是造成心肌梗塞、中风、心绞痛和猝死等现象的根本原因之一。心血管支架被广泛用于植介入手术以治疗心血管疾病。而血栓形成和支架内再狭窄等问题严重降低了其治疗效果。原因是支架植入过程中，血管内膜的内皮层遭到破坏和剥离，加之支架材料本身易吸附和激活血小板，导致凝血级联反应，从而形成血栓；同时，内皮层的破坏使得血管中间层暴露，致使平滑肌细胞从血管的中间层迁移至内皮层并大量增殖，最终导致新生内膜过度增生，从而产生了再狭窄。赋予支架表面一定的抗凝血和细胞选择性，避免血栓形成，同时抑制平滑肌细胞的过度增殖，促进内皮细胞在植入材料表面的覆盖，实现快速内皮化以防止再狭窄，是提高植介入手术成功率的关键。
现有的抗凝血和细胞选择性表面通常是通过结合抗污背景(如聚乙二醇(PEG)、两性离子聚合物等)和生物活性分子(如细胞生长因子，特异性识别多肽等)制备的，其设计与制备成本较高，步骤繁琐。另一方面，生物活性分子易失活的特性，大大提高了该类产品的灭菌与存储成本。
申请人前期专利CN101962422A公开了具有内皮细胞选择性的心血管支架涂层材料及其制备和应用方法，可以抗血小板和平滑肌细胞粘附，并特异性促进内皮细胞的粘附，使涂层具有内皮细胞选择性。但其制备方法涉及工艺复杂的三元共聚和昂贵的选择性多肽，设计与生产成本较高。
CN110876819A公开一种具有内皮细胞选择性基因递送表面的生物材料或医疗器械及制备方法，可在生物材料或医疗器械表面原位转染内皮细胞，促进细胞在生物材料或医疗器械表面的增殖和迁移，实现快速内皮化。然而其制备过程涉及链霉亲和素、多肽、生物素等昂贵的生物活性分子，设计、生产、存储与灭菌成本同样有待降低。
发明内容
本发明针对现有技术中原位内皮化功能的生物材料制备方法复杂，设计成本高等问题，提供一种具有抗凝血和/或原位内皮化功能的涂层，该涂层以白蛋白为功能层，通过共价接枝的方式稳固结合在不同基底材料上，制备方法简单，原料来源广泛。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种具有抗凝血和/或原位内皮化功能的白蛋白涂层的制备方法，包括步骤：
步骤1，将基底等离子体或臭氧活化处理；
步骤2，将活化后的基底浸泡在含有环氧官能团的硅氧烷溶液中，得到改性基底；或，将活化后的基底和含环氧官能团的硅氧烷一同静置在真空环境中，得到改性基底；
步骤3，将改性基底浸泡在白蛋白溶液中，得到所述白蛋白涂层。
发明人在研究中意外发现，白蛋白涂层不仅具有优异的抗凝血功能，还具有原位内皮化功能，能够有效地选择性支持内皮细胞的粘附、增殖和迁移，而抑制平滑肌细胞的粘附、增殖和迁移，从而在涂层表面快速形成完整的内皮层，抑制平滑肌细胞的过度增生，避免术后再狭窄的发生。与现有技术中原位内皮化研究不同，白蛋白属于常规的生物来源分子，价格实惠，来源广泛，也无需进行复杂的合成过程。
但仅仅是普通的白蛋白物理涂覆在基底上其效果并不理想，发明人对基底进行活化处理后，表面存在大量羟基，利用羟基与硅氧烷之间的脱水缩合作用，即可实现在不同基底表面的环氧功能化修饰；随后，将改性基底浸泡在白蛋白溶液中，通过环氧基团与白蛋白上的氨基之间的反应可快速实现白蛋白在基底表面的化学锚定，从而制备得到稳定的白蛋白涂层。该涂层具有更稳定、长效的原位内皮化功能，可用于心血管支架、心脏瓣膜、心脏封堵器等一系列植介入医疗器械表面，为其提供优异的抗凝血和抗再狭窄效果。
所述基底包括但不限于以下材料中的任一种：
(1)金属材料：不锈钢、钛及其合金、钴基合金、镍钛合金、镁及其合金、锌及其合金、铁及其合金中任一种；或，
(2)无机材料：玻璃、二氧化硅、二氧化钛、碳素材料、硅、氮化钛中任一种；或，
(3)高分子材料：纤维素、甲壳素、透明质酸、胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、涤纶、聚乙烯醇、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚4-乙烯基吡啶、聚乙烯基吡咯烷酮、聚酯、聚烯烃、聚氨酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚醚醚酮、硅橡胶、聚乳酸、聚乙交酯、聚丙交酯、聚己内酯、聚磷腈、聚氨基酸及其共聚物或衍生物中的任一种。
优选地，所述基底材料为不锈钢、镍钛合金、镁合金、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚酯、聚乳酸、聚己内酯、聚烯烃、聚氨酯、聚酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚醚醚酮、硅橡胶中的至少一种。以上均为植介入器械的常用材料，而本发明的方法能够实现白蛋白在多种基底上的牢固结合。
步骤1中，等离子体或臭氧活化时间为1～60min；等离子体处理机的频率为40KHz～13.56MHz；活化处理是为了增加基底表面的羟基密度，更有利于后续硅氧烷的接枝。
所述含环氧官能团硅氧烷包括3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基甲基二乙氧基硅烷中的至少一种。优选地，所述具有环氧官能团的硅氧烷为3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，相比于其他两种硅氧烷，其具有更高的反应活性。
步骤2中，改性基底的制备选择方法一或方法二，其中，
方法一包括步骤：将活化基底浸泡在含环氧官能团的硅氧烷溶液中，从而将环氧硅烷修饰到基底表面，浸泡时间为0.1-72h，温度为0-50℃；
方法二包括步骤：将活化基底和含环氧官能团的硅氧烷一起置于真空环境中，通过气相沉积的方式将硅氧烷修饰到基底表面，静置时间为1-48h，温度为15-40℃。优选室温下进行。
优选地，所述改性基底的反应时间为8-20h。
优选地，当基底为耐溶剂材料时，采用方法一的液相溶液浸泡方法，当基底为不耐溶剂材料时，采用方法二的气相沉积法。
所述含有环氧官能团的硅氧烷溶液中含环氧官能团硅氧烷的体积分数为0.01％～10％；优选地，所述含环氧官能团硅氧烷的体积分数为0.1-0.5％
含环氧官能团硅氧烷的溶液采用的溶剂包括甲苯、无水乙醇、无水甲醇、水中一种或多种。优选甲苯。
所述硅氧烷修饰后的基底用甲苯、无水甲醇、无水乙醇或超纯水浸泡清洗并烘干得到改性基底。
所述白蛋白包括胎牛血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、猪血清白蛋白、人血清白蛋白中的至少一种；优选地，所述白蛋白为胎牛血清白蛋白。
所述白蛋白溶液采用的溶剂包括去离子水、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、醋酸缓冲液、碳酸盐缓冲液中的至少一种；
所述白蛋白溶液中白蛋白的质量浓度为0.001mg/mL～400mg/mL。
步骤3中，改性基底在白蛋白溶液中浸泡1min～72h，浸泡温度为4-60℃；
步骤3中，以所述白蛋白溶液总体积为100％计，溶液中加入体积分数为0.001％～2％的酸，优选0.1-0.5％的酸，所述酸包括乙酸、甲酸、盐酸、硫酸、硝酸、氢溴酸、三氟乙酸中的至少一种。加入酸催化改性基底上硅氧烷的环氧基团与白蛋白上的氨基基团进行反应，使白蛋白结合速度更快。
本发明还提供根据所述的制备方法制得的具有抗凝血和/或原位内皮化功能的白蛋白涂层，涂层与基底结合稳固。
更重要的是，本发明提供所述的白蛋白涂层在制备抗凝血和/或原位内皮化功能材料中的应用。现有技术中通常需要设计复杂的生物活性分子，用以促进内皮细胞在生物材料或器械表面的粘附、增殖和迁移，实现内皮化。但存在分子设计成本高，效果很难确定，原料来源有限，价格昂贵等缺点。
所述白蛋白涂层具有如下功能之一：
(1)抑制血小板的粘附和激活；
(2)抑制凝血反应发生；
(3)抑制平滑肌细胞粘附、增殖和迁移；
(4)支持内皮细胞粘附、增殖和迁移；
(5)促进原位内皮化。
本发明意外发现白蛋白具有优异的抗凝血和/或原位内皮化功能，能够有效地抑制血小板在材料表面的粘附和激活，抑制凝血反应的发生；同时，其能够选择性支持内皮细胞的粘附、增殖和迁移，而抑制平滑肌细胞的粘附、增殖和迁移，使得涂层表面内皮细胞的生长速率远大于平滑肌细胞，从而促进涂层表面快速形成完整的内皮层，抑制平滑肌细胞的过度增生，避免术后再狭窄的发生。因此，该白蛋白涂层可用于心血管支架、心脏瓣膜、心脏封堵器等一系列植介入医疗器械表面，为其提供优异的抗凝血和/或原位内皮化效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用环氧硅烷的共价桥接作用，分别与基底上的羟基和蛋白质分子上的氨基反应，快速高效地在不同基底上制备白蛋白涂层，所得涂层与基底结合稳固，具有优异的抗凝血效果，并可以实现内皮细胞在表面上的选择性粘附，同时抑制平滑肌细胞的粘附，极大促进了基底表面的原位内皮化，可应用于各种生物材料或医疗器械表面，实现快速原位内皮化，可用于心血管支架、心脏瓣膜、心脏封堵器等一系列植介入医疗器械表面，为其提供优异的抗凝血和/或原位内皮化效果，具有较大的医学应用价值和潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1和对比例中带有胎牛血清白蛋白涂层的玻璃(BSA-Glass和BSA+Glass)、正丙胺封端玻璃(PA-Glass)和未经处理的玻璃(Glass)表面的X射线光电子能谱(XPS)N1s图。
图2为实施例1和对比例中带有胎牛血清白蛋白涂层的玻璃(BSA-Glass和BSA+Glass)和未经处理的玻璃(Glass)表面的水接触角。
图3为实施例1和对比例中带有胎牛血清白蛋白涂层的玻璃(BSA-Glass和BSA+Glass)和未经处理的玻璃(Glass)表面的内皮细胞/平滑肌细胞粘附密度统计图。
图4为实施例1-4中带有不同物种血清白蛋白涂层的玻璃表面的内皮细胞/平滑肌细胞粘附密度统计图。
图5为实施例1中带有胎牛血清白蛋白涂层的玻璃(BSA-Glass)和未经处理的玻璃(Glass)表面的内皮细胞/平滑肌细胞增殖情况。
图6为实施例1中带有胎牛血清白蛋白涂层的玻璃(BSA-Glass)和未经处理的玻璃(Glass)表面的凝血情况。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。
以下具体实施方式中所采用的原料均购于市场。
实施例1
代表性具有抗凝血和/或原位内皮化功能的白蛋白涂层的制备：
(1)等离子体活化处理：将玻璃片(2cm×2cm×1mm)置于烧杯中，加入足量超纯水，置于超声清洗机中超声5min；将烧杯中的超纯水倒净，加入无水乙醇，超声5min；将清洗后的玻璃片取出，N2吹干，置于等离子体清洗机中以13.56MHz的频率处理3min进行表面亲水改性；
(2)基底的环氧改性：在甲苯中溶解0.5vol％的3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，并将活化后的玻璃片浸泡在所得硅烷溶液中，室温下浸泡12h，然后依次用甲苯、无水乙醇、超纯水各泡洗2遍，每次浸泡5min，再用无水乙醇泡洗1遍，放入烘箱中烘干，烘箱温度为60℃，烘干时间为1h；
(3)基底的白蛋白接枝：在PBS缓冲液中溶解20mg/mL的胎牛血清白蛋白和0.2vol％的乙酸，并将环氧改性后的玻璃片浸泡在所得溶液中，37℃下浸泡12h，取出后即得到所述白蛋白涂层(BSA-Glass)。
实施例2
代表性具有抗凝血和原位内皮化功能的白蛋白涂层的制备：
(1)等离子体活化处理：将玻璃片(2cm×2cm×1mm)置于烧杯中，加入足量超纯水，置于超声清洗机中超声5min；将烧杯中的超纯水倒净，加入无水乙醇，超声5min；将清洗后的玻璃片取出，N2吹干，置于等离子体清洗机中以13.56MHz的频率处理3min进行表面亲水改性；
(2)基底的环氧改性：在甲苯中溶解0.5vol％的3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，并将活化后的玻璃片浸泡在所得硅烷溶液中，室温下浸泡12h，然后依次用甲苯、无水乙醇、超纯水各泡洗2遍，每次浸泡5min，再用无水乙醇泡洗1遍，放入烘箱中烘干，烘箱温度为60℃，烘干时间为1h；
(3)基底的白蛋白接枝：在PBS缓冲液中溶解20mg/mL的大鼠血清白蛋白和0.2vol％的乙酸，并将环氧改性后的玻璃片浸泡在所得溶液中，37℃下浸泡12h，取出后即得到所述白蛋白涂层(RSA-Glass)。
实施例3
代表性具有抗凝血和原位内皮化功能的白蛋白涂层的制备：
(1)等离子体活化处理：将玻璃片(2cm×2cm×1mm)置于烧杯中，加入足量超纯水，置于超声清洗机中超声5min；将烧杯中的超纯水倒净，加入无水乙醇，超声5min；将清洗后的玻璃片取出，N2吹干，置于等离子体清洗机中以13.56MHz的频率处理3min进行表面亲水改性；
(2)基底的环氧改性：在甲苯中溶解0.5vol％的3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，并将活化后的玻璃片浸泡在所得硅烷溶液中，室温下浸泡12h，然后依次用甲苯、无水乙醇、超纯水各泡洗2遍，每次浸泡5min，再用无水乙醇泡洗1遍，放入烘箱中烘干，烘箱温度为60℃，烘干时间为1h；
(3)基底的白蛋白接枝：在PBS缓冲液中溶解20mg/mL的猪血清白蛋白和0.2vol％的乙酸，并将环氧改性后的玻璃片浸泡在所得溶液中，37℃下浸泡12h，取出后即得到所述白蛋白涂层(PSA-Glass)。
实施例4
代表性具有抗凝血和原位内皮化功能的白蛋白涂层的制备：
(1)等离子体活化处理：将玻璃片(2cm×2cm×1mm)置于烧杯中，加入足量超纯水，置于超声清洗机中超声5min；将烧杯中的超纯水倒净，加入无水乙醇，超声5min；将清洗后的玻璃片取出，N2吹干，置于等离子体清洗机中以13.56MHz的频率处理3min进行表面亲水改性；
(2)基底的环氧改性：在甲苯中溶解0.5vol％的3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，并将活化后的玻璃片浸泡在所得硅烷溶液中，室温下浸泡12h，然后依次用甲苯、无水乙醇、超纯水各泡洗2遍，每次浸泡5min，再用无水乙醇泡洗1遍，放入烘箱中烘干，烘箱温度为60℃，烘干时间为1h；
(3)基底的白蛋白接枝：在PBS缓冲液中溶解20mg/mL的人血清白蛋白和0.2vol％的乙酸，并将环氧改性后的玻璃片浸泡在所得溶液中，37℃下浸泡12h，取出后即得到所述白蛋白涂层(HSA-Glass)。
对比例1
血清白蛋白物理吸附而非共价接枝到基底表面
(1)等离子体活化处理：将玻璃片(2cm×2cm×1mm)置于烧杯中，加入足量超纯水，置于超声清洗机中超声5min；将烧杯中的超纯水倒净，加入无水乙醇，超声5min；将清洗后的玻璃片取出，N2吹干，置于等离子体清洗机中以13.56MHz的频率处理3min进行表面亲水改性；
(2)基底的环氧改性：在甲苯中溶解0.5vol％的3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，并将活化后的玻璃片浸泡在所得硅烷溶液中，室温下浸泡12h，然后依次用甲苯、无水乙醇、超纯水各泡洗2遍，每次浸泡5min，再用无水乙醇泡洗1遍，放入烘箱中烘干，烘箱温度为60℃，烘干时间为1h；
(3)正丙胺封端环氧基团：在四氢呋喃中溶解0.2vol％的正丙胺，并将环氧改性的玻璃片浸泡在所得溶液中，室温浸泡12h，然后依次用四氢呋喃、无水乙醇、超纯水冲洗，N2吹干，得到正丙胺封端玻璃片(PA-Glass)；
(4)基底的白蛋白吸附：在PBS缓冲液中溶解20mg/mL的胎牛血清白蛋白和0.2vol％的乙酸，并将正丙胺封端玻璃片(PA-Glass)浸泡在所得溶液中，37℃下浸泡12h，然后在PBS溶液中泡洗2遍，取出后即得到通过物理吸附制备的白蛋白涂层(BSA+Glass)。
应用例
一、代表性白蛋白涂层表征
X射线光电子能谱(XPS)数据是用配备有Al KαX射线源(1486.6eV)的ThermoScientific ESCALAB 250Xi光谱仪获得的。所有光谱都是在与样品表面成30°的起飞角处收集的。对实施例1和对比例1制备的含白蛋白涂层的玻璃、正丙胺封端的玻璃以及未做处理的玻璃表面进行测试。
从图1中可以观察到未经处理的玻璃组(Glass)不具有氮元素，没有表现出N元素信号；正丙胺封端的玻璃(PA-Glass)出现了一定的N元素信号，表明正丙胺的成功封端；而物理吸附白蛋白组(BSA+Glass)相比PA-Glass组N元素信号有一定的增强，表明白蛋白在其表面成功吸附；化学接枝白蛋白组(BSA-Glass)则表现出了极强的N元素信号，表明有大量白蛋白被固定到基底表面，证明了白蛋白涂层的成功制备。
通过接触角角度计(Dataphysics OCA 20)检查表面的亲水性变化。从图2中可以看到与无涂层的玻璃(Glass)基底相比，化学接枝(BSA-Glass)或物理吸附(BSA+Glass)的白蛋白涂层组都表现出了接触角的上升，其中BSA-Glass上升最为明显。接触角的变化也从侧面证明了白蛋白涂层的成功制备。
二、代表性白蛋白涂层材料表面的体外细胞粘附和增殖情况
细胞培养：所用内皮细胞(EC)与平滑肌细胞(SMC)分别为人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)。两者均从新鲜的人脐带样品中分离。脐带样品的获得得到了当地医学伦理委员会的同意。EC的培养基为添加了10％胎牛血清(FBS)，20μg/mL ECGS，1％UI/mL青霉素-链霉素的EC培养基。SMC的培养基为添加了10％FBS，1％UI/mL青霉素-链霉素的SMC培养基。EC和SMC均在温度为37℃，CO2含量为5％的培养箱(Series II,FormaScientific Inc.)中培养。细胞每两到三天换一次液，细胞所用代数在3-8代之间，当细胞铺满培养皿80-90％时可以进行细胞实验。
细胞粘附实验：将EC和SMC分别用CellTrackerTM Orange CMTMR(5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino)tetramethylrhodamine)(1μg/mL)和CellTrackerTM GreenCMFDA(5-chloromethylfluorescein diacetate)(1μg/mL)进行30min活细胞染色。然后，向EC和SMC培养皿中分别加入2mL胰酶，消化2min，加入2mL培养基进行中和，用滴管吹打使细胞脱壁，将细胞悬液加入15mL离心管中离心(1000rpm，5min)，加入EC培养基混匀以制备细胞悬液，使用血球计数板对细胞进行计数，稀释、混合。将2cm×2cm的白蛋白涂层材料放置在6孔板里，以2000细胞/cm2(EC、SMC各半)的密度种植细胞(每孔2.5mL培养基)，培养箱孵育4小时。然后将细胞用4％多聚甲醛进行固定，用荧光显微镜拍摄细胞荧光图片，并用ImageJ软件统计每个样品上的细胞数量。每组样品测试三个平行样，取平均值。
从图3可以看到，玻璃(Glass)表面EC和SMC都大量粘附，其EC/SMC比值接近1，表明两种细胞在玻璃表面的粘附情况相近；物理吸附白蛋白(BSA+Glass)表面EC和SMC粘附量相比玻璃表面有一定下降，且SMC下降更多，但两者均仍具有较高的初始值，EC/SMC比值约为1.65，表明在该表面上EC相对于SMC有一定的粘附优势，但并不明显；
而化学接枝白蛋白(BSA-Glass)表面相比玻璃表面，其EC粘附量略有下降，但SMC粘附量则急剧下降，导致EC/SMC比值高达近20，表现出了极为优异的EC选择性粘附。
从图4可以看到，不同物种血清白蛋白涂层均表现出了相似的选择性支持EC粘附，抑制SMC粘附的效果，表明所述白蛋白涂层的EC选择性效果在物种来源方面具有普适性。
细胞增殖实验：将EC和SMC分别用CellTrackerTM橙色CMTMR染料(5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino)tetramethylrhodamine)(1μg/mL)和CellTrackerTM绿色CMFDA染料(5-chloromethylfluorescein diacetate)(1μg/mL)进行一小时活细胞染色。然后，向EC和SMC培养皿中分别加入2mL胰酶，消化2min，加入2mL培养基进行中和，用滴管吹打使细胞脱壁，将细胞悬液加入15mL离心管中离心(1000rpm 5min)，加入培养基混匀以制备细胞悬液，使用血球计数板对细胞进行计数，稀释、混合。将样品放置在24孔板里，以20000细胞/cm2(EC、SMC各半)的密度种植细胞(每孔1mL培养基)，培养箱孵育4小时/1天/2天/3天后，将细胞用4％多聚甲醛进行固定，用荧光显微镜扫描细胞荧光图片，并用ImageJ软件统计每个样品上的细胞数量。每组样品测试三个平行样，取平均值。
从图5可以看到，玻璃表面EC和SMC在4H时的初始粘附量相当，在后续增殖过程中，两者的生长速率也相近，因此两者的细胞密度始终同步增长，保持在相近水平；而化学接枝白蛋白(BSA-Glass)表面上EC在4H时的初始粘附量远大于SMC，因此，在后续增殖过程中，EC快速生长，而SMC生长速率很慢，使得两者的细胞密度差距不断增大，最终可快速形成完整的内皮层，表明化学接枝白蛋白涂层具有优异的原位内皮化功能。
三、代表性白蛋白涂层材料表面的抗凝血效果
钱德勒环实验：往钱德勒环中加入5mL生理盐水(0.9wt％NaCl溶液)，用接口将管子两端相连，固定在旋转架上，37℃水浴，转速为10rpm，润洗15min；然后将生理盐水倒出，加入5mL新鲜兔血和250μL 0.15mol/L的CaCl2溶液，放入样品并固定，封好后放到旋转架上，37℃水浴，转速为10rpm，处理15min；最后将样品取出，并用超纯水清洗后拍照记录表面凝血情况。
从图6可以看到，玻璃表面存在大量凝血块无法清洗掉，而在化学接枝白蛋白(BSA-Glass)表面则几乎未观察到明显的凝血块，表明其具有优异的抗凝血效果。
Claims (10)
1.一种具有抗凝血和/或原位内皮化功能的白蛋白涂层的制备方法，其特征在于，包括步骤：
步骤1，将基底等离子体或臭氧活化处理；
步骤2，将活化后的基底浸泡在含有环氧官能团的硅氧烷溶液中，得到改性基底；或，将活化后的基底和含环氧官能团的硅氧烷一同静置在真空环境中，得到改性基底；
步骤3，将改性基底浸泡在白蛋白溶液中，得到所述白蛋白涂层。
2.根据权利要求1所述的具有抗凝血和/或原位内皮化功能的白蛋白涂层的制备方法，其特征在于，所述基底包括以下材料中的任一种：
(1)金属材料：不锈钢、钛及其合金、钴基合金、镍钛合金、镁及其合金、锌及其合金、铁及其合金中任一种；或，
(2)无机材料：玻璃、二氧化硅、二氧化钛、碳素材料、硅、氮化钛中任一种；或，
(3)高分子材料：纤维素、甲壳素、透明质酸、胶原蛋白、明胶、海藻酸钠、涤纶、聚乙烯醇、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚4-乙烯基吡啶、聚乙烯基吡咯烷酮、聚酯、聚烯烃、聚氨酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚丙烯腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚醚醚酮、硅橡胶、聚乳酸、聚乙交酯、聚丙交酯、聚己内酯、聚磷腈、聚氨基酸及其共聚物或衍生物中的任一种。
3.根据权利要求1所述的具有抗凝血和/或原位内皮化功能的白蛋白涂层的制备方法，其特征在于，步骤1中，等离子体或臭氧活化时间为1～60min；等离子体处理机的频率为40KHz～13.56MHz；
和/或，所述含环氧官能团硅氧烷包括3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基甲基二乙氧基硅烷中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的具有抗凝血和/或原位内皮化功能的白蛋白涂层的制备方法，其特征在于，步骤2中，改性基底的制备选择方法一或方法二，其中，
方法一包括步骤：将活化基底浸泡在含环氧官能团的硅氧烷溶液中，从而将环氧硅烷修饰到基底表面，浸泡时间为0.1-72h，温度为0-50℃；
方法二包括步骤：将活化基底和含环氧官能团的硅氧烷一起置于真空环境中，通过气相沉积的方式将硅氧烷修饰到基底表面，静置时间为1-48h，温度为15-40℃。
5.根据权利要求1或4所述的具有抗凝血和/或原位内皮化功能的白蛋白涂层的制备方法，其特征在于，所述含有环氧官能团的硅氧烷溶液中含环氧官能团硅氧烷的体积分数为0.01％～10％；
含环氧官能团硅氧烷的溶液采用的溶剂包括甲苯、无水乙醇、无水甲醇、水中一种或多种。
6.根据权利要求1所述的具有抗凝血和/或原位内皮化功能的白蛋白涂层的制备方法，其特征在于，所述硅氧烷修饰后的基底用甲苯、无水甲醇、无水乙醇或超纯水浸泡清洗并烘干得到改性基底。
和/或，所述白蛋白包括胎牛血清白蛋白、大鼠血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、猪血清白蛋白、人血清白蛋白中的至少一种；
和/或，所述白蛋白溶液采用的溶剂包括去离子水、PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Tris缓冲液、MES缓冲液、醋酸缓冲液、碳酸盐缓冲液中的至少一种；
和/或，所述白蛋白溶液中白蛋白的质量浓度为0.001mg/mL～400mg/mL。
7.根据权利要求1所述的具有抗凝血和/或原位内皮化功能的白蛋白涂层的制备方法，其特征在于，步骤3中，改性基底在白蛋白溶液中浸泡1min～72h，浸泡温度为4-60℃；
和/或，步骤3中，以所述白蛋白溶液总体积为100％计，溶液中加入体积分数为0.001％～2％的酸，所述酸包括乙酸、甲酸、盐酸、硫酸、硝酸、氢溴酸、三氟乙酸中的至少一种。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的具有抗凝血和/或原位内皮化功能的白蛋白涂层。
9.根据权利要求8所述的白蛋白涂层在制备抗凝血和/或原位内皮化功能材料中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述白蛋白涂层具有如下功能之一：
(1)抑制血小板的粘附和激活；
(2)抑制凝血反应发生；
(3)抑制平滑肌细胞粘附、增殖和迁移；
(4)支持内皮细胞粘附、增殖和迁移；
(5)促进原位内皮化。
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