CN117180313A - 一种培养基或药物和促进肝细胞增殖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备培养基或药物的方法。所述方法包括采用机械感知阳离子通道激动剂对第二内皮细胞进行激活处理，得到第一内皮细胞；将所述第一内皮细胞进行培养处理，得到所述培养基或药物。所述机械感知阳离子通道包括双孔钾通道、上皮钠离子通道、瞬时受体电位通道家族和PIEZO家族中的至少之一。本发明的方法制备得到的培养基或药物可以在体外有效地促进肝细胞增殖，为细胞治疗肝功能衰竭和肝脏再生不足提供基础；采用该方法制备的培养基或药物可建立体外促进肝细胞增殖方法体系，用于体外促进肝细胞增殖。
Description
技术领域
本发明属于生物医疗技术领域，具体地，本发明涉及一种培养基或药物和促进肝细胞增殖的方法，更具体地，本发明涉及一种第一内皮细胞或其培养液在制备药物中的用途、培养基或药物及其制备方法和它们的用途。
背景技术
研究表明，不同地区引起肝衰竭的原因有所不同：一方面，药物及肝毒性物质(乙醇、化药等)是引起急性、亚急性肝衰竭的主要原因，而酒精性肝损害常引起慢加急性肝衰竭；另一方面，肝炎病毒(主要是HBV)也可引起肝衰竭。
肝脏外科常见疾病如原发性肝癌、肝门胆管癌、胆囊癌、甚至胰腺癌等手术治疗均可涉及肝部分切除术。然而，剩余肝脏体积不足引起的肝功能衰竭是限制手术治疗主要原因之一。目前治疗肝衰竭的主要原则包括：(1)内科治疗：相应的病因治疗及并发症防治；(2)有条件者进行人工肝治疗；(3)国际公认的最有效措施——肝移植。由于肝衰竭病因复杂多样，各种原因可独立或协同致病，且发病机制不甚清楚，内科治疗死亡率很高；我国目前只有1％～10％肝衰竭患者有机会接受移植治疗，肝移植在未来较长时期内很难普及。寻求新的有效治疗手段，从总体上提高我国肝衰竭的治疗水平，遏制肝病诊疗费用的增长，具有重要的经济和社会意义。
因此，亟需开发一种能够实现体外促进肝细胞增殖的培养方法，为细胞治疗肝功能衰竭和肝脏再生不足提供基础。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种培养基或药物和促进肝细胞增殖的方法，本发明的培养基和药物可促进肝细胞增殖，采用上述培养基可在体外有效地促进肝细胞增殖。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
肝脏再生是一个极其复杂的生物学过程，需要炎症因子和生长因子等参与，在外科操作后出现的血流动力学变化逐渐成为肝脏实质缺失后引起肝脏再生的重要“触发点及调节器”，术后血流速度增加带来的剪切力变化和肝脏内部“相对性淤血”带来的血管扩张对血管内皮细胞及肝血窦内皮细胞产生的生物力学作用，是启动及调节肝脏再生的关键。
进一步地，发明人发现，在门静脉栓塞术后，肝内门静脉血管扩张导致内皮细胞受到牵张力增加，产生大量的白介素6可启动肝脏再生。门静脉血流向动力学变化促进肝细胞生长因子的表达增加，促进肝细胞增殖、肥大及减少凋亡促进肝脏的再生。总之，肝脏血流动力学变化对肝脏再生微环境中细胞的刺激是促进及调节肝脏再生的重要因素。
机械感知阳离子通道是一类能够直接感知机械力的刺激并主要通过钙离子流动来实现力化学信号的转导。目前发现的机械敏感性离子通道主要有双孔钾通道、上皮钠离子通道、瞬时受体电位通道家族和PIEZO家族。然而目前关于机械敏感性离子通道调节肝细胞增殖的培养方法还未见报道。
基于此，发明人意外发现，在外科手术后，由于门静脉血流的变化导致残余肝脏处于“开源节流”并存的状态，导致肝脏内部血液暂时性瘀滞。血管内皮细胞中机械敏感性离子通道(例如机械感知蛋白Piezo1)的激活可能促进肝细胞的增殖。
因此，本发明的第一方面，本发明提供了第一内皮细胞或其培养液在制备药物中的用途，所述药物用于促进肝细胞增殖、或者治疗和/或预防肝细胞凋亡引起的相关疾病；其中，所述第一内皮细胞具有机械感知阳离子通道激活活性。根据本发明的实施例，采用第一内皮细胞或其培养液制备的药物可促进肝细胞增殖，从而可采用上述药物用于治疗和/或预防肝细胞凋亡引起的相关疾病。
根据本发明的实施例，所述肝细胞凋亡引起的相关疾病包括肝衰竭、肝脏再生不足、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝和自身免疫性肝病中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述肝衰竭为急性肝衰竭。
根据本发明的实施例，所述肝细胞包括LO2、HepaRG、MIHA、THLE-2、THLE-3。
根据本发明的实施例，所述第一内皮细胞是采用机械感知阳离子通道激动剂对第二内皮细胞进行激活处理得到。
根据本发明的实施例，所述机械感知阳离子通道包括双孔钾通道、上皮钠离子通道、瞬时受体电位通道家族和PIEZO家族中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述机械感知阳离子通道包括Piezo1、Piezo2、Kcnk10、Kcnk2、Kcnk4、Stoml3、Trpa1和Trpv4中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述机械感知阳离子通道激动剂为Yoda1。
根据本发明的实施例，所述Yoda1的浓度为1～20μM。
根据本发明的实施例，所述激活处理的时间为5～6h。
根据本发明的实施例，所述第二内皮细胞包括HUVEC、SK-hep-1。
本发明的第二方面，本发明提供了一种培养基或药物。根据本发明的实施例，所述培养基或药物包括第一内皮细胞，所述第一内皮细胞具有机械感知阳离子通道激活活性。根据本发明的实施例，采用第一内皮细胞或其培养液制备的培养基可用于体外培养肝细胞，具有促进肝细胞增殖等优点；采用第一内皮细胞或其培养液制备的药物可促进肝细胞增殖，从而可采用上述药物用于治疗和/或预防肝细胞凋亡引起的相关疾病。
根据本发明的实施例，所述培养基或药物进一步包括无血清培养基。
根据本发明的实施例，所述无血清培养基选自无血清DMEM培养基、RPMI1640培养基。
根据本发明的实施例，所述产品为培养基或药物。
根据本发明的实施例，所述第一内皮细胞是采用机械感知阳离子通道激动剂对第二内皮细胞进行激活处理得到。
根据本发明的实施例，所述机械感知阳离子通道包括双孔钾通道、上皮钠离子通道、瞬时受体电位通道家族和PIEZO家族中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述机械感知阳离子通道包括Piezo1、Piezo2、Kcnk10、Kcnk2、Kcnk4、Stoml3、Trpa1和Trpv4中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述机械感知阳离子通道激动剂为Yoda1。
根据本发明的实施例，所述Yoda1的浓度为1～20μM。
根据本发明的实施例，所述激活处理的时间为5～6h。
根据本发明的实施例，所述第二内皮细胞包括HUVEC、SK-hep-1。
本发明的第三方面，本发明提供了一种制备培养基或药物的方法。根据本发明的实施例，所述制备培养基或药物的方法包括采用机械感知阳离子通道激动剂对第二内皮细胞进行激活处理，得到第一内皮细胞；将所述第一内皮细胞进行培养处理，得到所述培养基或药物。根据本发明实施例的方法制备的培养基可用于体外培养肝细胞，具有促进肝细胞增殖等优点；制备的药物可促进肝细胞增殖，从而可采用上述药物用于治疗和/或预防肝细胞凋亡引起的相关疾病。并且，该方法具有制备工艺简单等优点。
根据本发明的实施例，所述激活处理的时间为5～6h。
根据本发明的实施例，所述机械感知阳离子通道包括双孔钾通道、上皮钠离子通道、瞬时受体电位通道家族和PIEZO家族中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述机械感知阳离子通道包括Piezo1、Piezo2、Kcnk10、Kcnk2、Kcnk4、Stoml3、Trpa1和Trpv4中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述机械感知阳离子通道激动剂为Yoda1。
根据本发明的实施例，所述Yoda1的浓度为1～20μM。
根据本发明的实施例，所述培养处理是在无血清培养基中进行的。
根据本发明的实施例，所述无血清培养基选自无血清DMEM培养基、RPMI1640培养基。
根据本发明的实施例，所述培养处理的时间为20～30h。
根据本发明的实施例，所述激活处理之后，将激活处理产物进行清洗处理，以便得到所述第一内皮细胞。
根据本发明的实施例，所述清洗处理是采用PBS进行的。
根据本发明的实施例，所述第二内皮细胞包括HUVEC、SK-hep-1。
本发明的第四方面，本发明提供了一种第二方面所述的培养基或药物、或者依据第三方面所述的方法制备的培养基或药物在制备产品中的用途，所述产品用于促进肝细胞增殖、或者治疗和/或预防肝细胞凋亡引起的相关疾病。
根据本发明的实施例，所述肝细胞凋亡引起的相关疾病包括肝衰竭、肝脏再生不足、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝和自身免疫性肝病中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述肝衰竭为急性肝衰竭。
根据本发明的实施例，所述肝细胞包括LO2、HepaRG、MIHA、THLE-2、THLE-3。
本发明的第五方面，本发明提供了一种体外促进肝细胞增殖的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括本发明第二方面所述的培养基或药物、或者依据本发明第三方面所述的方法制备的培养基或药物培养所述肝细胞。由前可知，上述的培养基或药物具有促进肝细胞增殖等优点。因此，采用培养基或药物培养肝细胞，可有效促进肝细胞的增殖。
根据本发明的实施例，所述培养是在适于所述肝细胞生长条件下进行的。
根据本发明的实施例，所述肝细胞包括LO2、HepaRG、MIHA、THLE-2、THLE-3。
附图说明
图1是本发明实施例1中GEPIA网站中在不同种类的癌旁组织中Piezol的表达水平。
图2是本发明实施例1中多种单细胞测序数据库Piezo1在肝脏组织中的表达情况。
图3是本发明实施例1中GEO数据库Piezo1在肝血窦内皮细胞中的表达情况。
图4是本发明实施例2中内皮细胞中Piezo1激活产生的条件培养基收集示意图。
图5是本发明实施例2中内皮细胞中Piezo1激活产生的条件培养基能够促进肝细胞增殖的示意图。
图6是本发明实施例3中内皮细胞中Piezo1敲低稳转细胞系的构建示意图。
图7是本发明实施例4中内皮细胞中Piezo1的敲除能够逆转对肝细胞的促进作用的构建示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中，术语“含有”、“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
本发明提出了第一内皮细胞在制备药物中的用途、培养基或药物以及制备培养基或药物和体外促进肝细胞增殖的方法，下面将分别对其进行详细描述。
第一内皮细胞在制备药物中的用途
本发明的第一方面，本发明提供了第一内皮细胞或其培养液在制备药物中的用途，所述药物用于促进肝细胞增殖、或者治疗和/或预防肝细胞凋亡引起的相关疾病；其中，所述第一内皮细胞具有机械感知阳离子通道激活活性。
发明人在试验过程中发现，具有机械感知阳离子通道激活活性的第一内皮细胞可释放促进肝细胞增殖的细胞因子，采用具有机械感知阳离子通道激活活性的第一内皮细胞或其培养液制备的药物，可促进肝细胞增殖，尤其是可采用上述药物用于治疗和/或预防肝细胞凋亡引起的相关疾病。
在本文中，术语“机械感知阳离子通道激活活性”是指机械感知阳离子通道被激活后，可释放相关因子。本文中，将内皮细胞中的机械感知阳离子通道可被激活这一特征称为机械感知阳离子通道激活活性。
在本文中，术语“第一内皮细胞的培养液”是指将第一内皮细胞进行培养后获得的培养液，该培养液可以为含有第一内皮细胞的培养液，也可以为不含有第一内皮细胞的培养液。当所述第一内皮细胞的培养液为不含有第一内皮细胞的培养液时，该第一内皮细胞的培养液中含有第一内皮细胞释放的细胞因子或其他成分。
示例性地，所述第一内皮细胞的培养液为含有第一内皮细胞的培养液。
在本发明的一些可选实施例中，所述肝细胞凋亡引起的相关疾病包括肝衰竭、肝脏再生不足、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝和自身免疫性肝病中的至少之一。
在本发明的一些可选实施例中，所述肝衰竭为急性肝衰竭。
在本发明的一些可选实施例中，所述肝细胞包括LO2、HepaRG、MIHA、THLE-2、THLE-3。
在本发明的一些可选实施例中，所述第一内皮细胞是采用机械感知阳离子通道激动剂对第二内皮细胞进行激活处理得到。
在本发明的一些可选实施例中，所述机械感知阳离子通道包括双孔钾通道、上皮钠离子通道、瞬时受体电位通道家族和PIEZO家族中的至少之一。
在本发明的一些可选实施例中，所述机械感知阳离子通道包括Piezo1、Piezo2、Kcnk10、Kcnk2、Kcnk4、Stoml3、Trpa1和Trpv4中的至少之一。
在本发明的一些可选实施例中，所述机械感知阳离子通道激动剂为Yoda1。由此，可有效激活第二内皮细胞中的机械感知阳离子通道。
在本发明的一些可选实施例中，所述Yoda1的浓度为1～20μM，例如1μM、2μM、3μM、4μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM以及它们任意两个点值之间的范围值，如2μM～20μM、5μM～20μM、5μM～15μM、8μM～20μM、8μM～15μM、8μM～12μM。由此，可有效激活第二内皮细胞中的机械感知阳离子通道。
在本发明的一些可选实施例中，所述激活处理的时间为5～6h。由此，可进一步提高对第二内皮细胞中的机械感知阳离子通道的激活效果，有利于得到的第一内皮细胞释放相关的因子，得到相关的因子含量高的第一内皮细胞培养液，从而可进一步提高对肝细胞增殖的促进作用。
在本发明的一些可选实施例中，所述第二内皮细胞包括HUVEC、SK-hep-1。
培养基或药物
本发明的第二方面，本发明提供了一种培养基或药物。根据本发明的实施例，所述培养基或药物包括第一内皮细胞，所述第一内皮细胞具有机械感知阳离子通道激活活性。根据本发明的实施例，采用第一内皮细胞或其培养液制备的培养基可用于体外培养肝细胞，具有促进肝细胞增殖等优点；采用第一内皮细胞或其培养液制备的药物可促进肝细胞增殖，从而可采用上述药物用于治疗和/或预防肝细胞凋亡引起的相关疾病。
在本发明的一些可选实施例中，所述培养基或药物进一步包括无血清培养基。
在本发明的一些可选实施例中，所述无血清培养基选自无血清DMEM培养基、RPMI1640培养基。
在本发明的一些可选实施例中，所述产品为培养基或药物。
在本发明的一些可选实施例中，所述第一内皮细胞是采用机械感知阳离子通道激动剂对第二内皮细胞进行激活处理得到。
在本发明的一些可选实施例中，所述机械感知阳离子通道包括双孔钾通道、上皮钠离子通道、瞬时受体电位通道家族和PIEZO家族中的至少之一。
在本发明的一些可选实施例中，所述机械感知阳离子通道包括Piezo1、Piezo2、Kcnk10、Kcnk2、Kcnk4、Stoml3、Trpa1和Trpv4中的至少之一。
在本发明的一些可选实施例中，所述机械感知阳离子通道激动剂为Yoda1。由此，可有效激活第二内皮细胞中的机械感知阳离子通道。
在本发明的一些可选实施例中，所述Yoda1的浓度为1～20μM，例如1μM、2μM、3μM、4μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM以及它们任意两个点值之间的范围值，如2μM～20μM、5μM～20μM、5μM～15μM、8μM～20μM、8μM～15μM、8μM～12μM。由此，可有效激活第二内皮细胞中的机械感知阳离子通道。
在本发明的一些可选实施例中，所述激活处理的时间为5～6h。由此，可进一步提高对第二内皮细胞中的机械感知阳离子通道的激活效果，有利于得到的第一内皮细胞释放相关的因子，得到相关的因子含量高的第一内皮细胞培养液，从而可进一步提高对肝细胞增殖的促进作用。
在本发明的一些可选实施例中，所述第二内皮细胞包括HUVEC、SK-hep-1。
制备培养基或药物的方法
本发明的第三方面，本发明提供了一种制备培养基或药物的方法。根据本发明的实施例，所述制备培养基或药物的方法包括采用机械感知阳离子通道激动剂对第二内皮细胞进行激活处理，得到第一内皮细胞；将所述第一内皮细胞进行培养处理，得到所述培养基或药物。根据本发明实施例的方法制备的培养基可用于体外培养肝细胞，具有促进肝细胞增殖等优点；制备的药物可促进肝细胞增殖，从而可采用上述药物用于治疗和/或预防肝细胞凋亡引起的相关疾病。并且，该方法具有制备工艺简单等优点。
在本发明的一些可选实施例中，所述机械感知阳离子通道激动剂为Yoda1。由此，可有效激活第二内皮细胞中的机械感知阳离子通道。
在本发明的一些可选实施例中，所述机械感知阳离子通道包括双孔钾通道、上皮钠离子通道、瞬时受体电位通道家族和PIEZO家族中的至少之一。
在本发明的一些可选实施例中，所述机械感知阳离子通道包括Piezo1、Piezo2、Kcnk10、Kcnk2、Kcnk4、Stoml3、Trpa1和Trpv4中的至少之一。
在本发明的一些可选实施例中，所述机械感知阳离子通道激动剂为Yoda1。
在本发明的一些可选实施例中，所述Yoda1的浓度为1～20μM，例如1μM、2μM、3μM、4μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、20μM以及它们任意两个点值之间的范围值，如2μM～20μM、5μM～20μM、5μM～15μM、8μM～20μM、8μM～15μM、8μM～12μM。由此，可有效激活第二内皮细胞中的机械感知阳离子通道。
在本发明的一些可选实施例中，所述培养处理是在无血清培养基中进行的。
在本发明的一些可选实施例中，所述无血清培养基选自无血清DMEM培养基、RPMI1640培养基。
在本发明的一些可选实施例中，所述培养处理的时间为20～30h，例如20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h以及它们任意两个点值之间的范围值，如20h～29h、20h～28h、20h～27h、20h～26h、20h～25h、20h～24h。
在本发明的一些可选实施例中，所述激活处理之后，将激活处理产物进行清洗处理，以便得到所述第一内皮细胞。
在本发明的一些可选实施例中，所述清洗处理是采用PBS进行的。
在本发明的一些可选实施例中，所述第二内皮细胞包括HUVEC、SK-hep-1。
用途
本发明的第四方面，本发明提供了一种第二方面所述的培养基或药物、或者依据第三方面所述的方法制备的培养基或药物在制备产品中的用途，所述产品用于促进肝细胞增殖、或者治疗和/或预防肝细胞凋亡引起的相关疾病。
在本发明的一些可选实施例中，所述肝细胞凋亡引起的相关疾病包括肝衰竭、肝脏再生不足、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝和自身免疫性肝病中的至少之一。
在本发明的一些可选实施例中，所述肝衰竭为急性肝衰竭。
在本发明的一些可选实施例中，所述肝细胞包括LO2、HepaRG、MIHA、THLE-2、THLE-3。
体外促进肝细胞增殖的方法
本发明的第五方面，本发明提供了一种体外促进肝细胞增殖的方法，包括本发明第二方面所述的培养基或药物、或者依据本发明第三方面所述的方法制备的培养基或药物培养所述肝细胞。由前可知，上述的培养基或药物具有促进肝细胞增殖等优点。因此，采用培养基或药物培养肝细胞，可有效促进肝细胞的增殖。
在本发明的一些可选实施例中，所述培养是在适于所述肝细胞的生长条件下进行的。
需要说明的是，“适于所述肝细胞生长条件”可包括温度、pH值、细胞密度等条件，其可根据不同细胞的生长条件进行调整，具体不受限制，均在本发明的保护范围内。
在本发明的一些可选实施例中，所述肝细胞包括LO2、HepaRG、MIHA、THLE-2、THLE-3。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：公共数据库挖掘Piezo1在肝脏和肝内皮细胞中的表达情况
发明人首先挖掘在线公共数据库中Piezo1在全身和肝脏不同细胞种类中的表达情况。GEPIA是对TCGA数据库的可视化在线网站，本发明通过GEPIA网站对各种不同种类的瘤旁组织中Piezo1的表达水平进行分析发现，全身多种组织中均可表达Piezo1，分布较为广泛。LIHC(肝癌)癌旁组织中Piezo1的表达水平处于中等水平。确认肝脏组织中Piezo1的表达后，本发明进一步检索多种单细胞测序数据库明确肝脏组织中Piezo1的表达在哪种组织中的表达较高。肝脏图谱在线网站(http://liveratlasvilarinholab.med.yale.edu/)中发现，肝脏中内皮细胞中Piezo1的表达水平最高，血窦内皮细胞中的表达在所有细胞中排在第四位。在人类细胞图谱在线网站中(https://bis.zju.edu.cn/HCL/)大动脉，大静脉以及肝血窦内皮细胞中的表达水平属于较为位置，明显高于肝细胞和胆管细胞中的表达。在人类蛋白质图谱网站中(HPA)发现肝脏组织单细胞测序中Piezo1在内皮细胞中表达较高，仅次于平滑肌细胞中的表达。在肝脏细胞图谱(https://livercellatlas.org)网站中本发明检索了人、小鼠、猴和猪中Piezo1的表达，结果发现在肝脏组织中内皮细胞中Piezo1的表达较高。因此，基本确定了内皮细胞中Piezo1作为主要的效应对象，并通过进一步研究发现在肝血窦内皮细胞中，Piezo1的表达远远高于其他的机械感知阳离子通道。其中，公共数据库挖掘Piezo1在肝脏和肝内皮细胞中的表达情况参见图1、图2和图3。
实施例2：内皮细胞-肝细胞共培养体系的构建
为了进一步探索内皮细胞中Piezo1的激活促进肝细胞增殖的机制，本实施例设计并构建了内皮细胞-肝细胞的条件培养基共培养体系，并选择Yoda1作为Piezo1的特异性激动剂来进行后续的体外研究。具体试验步骤如下：
1、参见图4，取对数生长期的HUVEC或SK-hep-1细胞，应用胰蛋白酶进行消化，终止消化后离心收集细胞，制备成单细胞悬液。应用细胞计数板计数后，将HUVEC(200-300万)或者SK-hep-1(300-350万)细胞铺入10cm的细胞培养皿中，细胞密度维持在30-40％左右即可。过夜培养后细胞贴壁，弃去含有10％胎牛血清的DMEM培养基(Gibco，LOT#2370809)，用PBS清洗细胞3次，去除培养基中的胎牛血清。将分别含有Yoda1(MedChemExpress，CAT.NO.HY-18723)(10μM)、DMSO和完全空白(不添加任何成分的无血清DMEM培养基)的无血清DMEM培养基分别加入不同的组别细胞(HUVEC或SK-hep-1)中。采用Yoda1对细胞中的Piezo1进行激活处理，经过5-6h(本实施例中为6h)的激活处理后，弃去培养基，对细胞应用大量PBS进行清洗3次，每次3-5分钟左右。之后更换为无血清DMEM培养基再次将细胞放入培养箱中培养20-24h，本实施例中培养了24h，得到条件培养基。
2、铺肝细胞LO2或HepaRG 5000个/孔于96孔板中，设置为3组，贴壁后分别加入本实施例步骤1中获得的条件培养基(含有Yoda1的无血清DMEM培养基、即为HCMYoda1组或SCMYoda1组；含有DMSO的无血清DMEM培养基、即为HCMDMSO组或SCMDMSO组；无血清DMEM培养基、即为HCM组或SCM组)，待不同生长时间加入MTT工作液(工作终浓度为5mg/ml)，继续孵育4小时。4小时后弃上述液体，每孔加入100μl DMSO，在37℃条件下孵育10分钟后，使底部结晶物质充分溶解后，在多功能微孔板检测仪上进行检测，检测波长为490nm测量OD值。整个过程中，空白对照组(不加入细胞组)进行同样操作，每个梯度重复孔≥3个。计算细胞活性(％)＝(实验组OD值-空白对照组OD值)/(不加药组OD值-空白对照组OD值)，结果参见图5，其中，HUVEC细胞制备的条件培养基组简称HCM；SK-hep-1细胞制备的条件培养基组简称SCM。结果显示，HUVEC和SK-hep-1细胞的Piezo1激活的条件培养基能够明显的促进肝细胞的增殖。
实施例3：内皮细胞中Piezo1敲低稳转细胞系的构建
本实施例中应用sh-Piezo1的慢病毒(吉凯基因设计并构建sh-09：gcACTCCATTATGTTCGAGGA(SEQ ID NO:1)，sh-10：gaAGACCACATTCAGGTGGAA(SEQ ID NO:2)，sh-11：ccCTGTGCATTGATTATCCCT(SEQ ID NO:3))感染HUVEC和SK-hep-1细胞株。将慢病毒加入含有HUVEC和SK-hep-1细胞株的细胞培养基中，慢病毒的感染和培养条件以及慢病毒的添加滴度参见慢病毒说明书，待48h后荧光拍照检测慢病毒感染效果良好。继续应用嘌呤霉素进行筛选逐渐构建稳定转染的细胞株。利用实时荧光定量PCR和WB检测Piezo1的表达水平，结果参见图6，其中，shNC组为采用不含shPiezo1慢病毒感染的HUVEC和SK-hep-1细胞株。结果显示，Sh-09号病毒敲低效果最好，Sh-09号病毒敲低的HUVEC和SK-hep-1细胞株简称shPiezo1组，继续用于后续试验分析。
实施例4：内皮细胞中Piezo1的敲低能够逆转对肝细胞的促进作用
在本实施例中，将实施例3中制备的HUVEC(shNC组和shPiezo1组)及SK-hep-1(shNC和shPiezo1)细胞经消化及计数后，分别按照实施例2中制备条件培养基步骤中的细胞密度要求铺入10cm细胞培养皿中，过夜贴壁，在shNC和shPiezo1细胞培养皿中分别加入含有DMSO的无血清DMEM培养基和含有Yoda1的无血清DMEM培养基，按照条件培养基收集流程收集条件培养基。铺肝细胞LO2或HepaRG 5000个/孔于96孔板中。贴壁后加入条件培养基，待不同生长时间加入MTT工作液(工作终浓度为5mg/ml)，继续孵育4小时。4小时后弃上述液体，每孔加入100μl DMSO，37℃孵育10分钟后，使底部结晶物质充分溶解后，在多功能微孔板检测仪上进行检测，检测波长为490nm测量OD值。整个过程中，空白对照组(不加入细胞组)进行同样操作，每个梯度重复孔≥3个。计算细胞活性(％)＝(实验组OD值-空白对照组OD值)/(不加药组OD值-空白对照组OD值)，结果参见图7。
结果显示，Piezo1敲低后得到的条件培养基对肝细胞增殖的促进作用被抑制。因此，本实施例进一步说明，Piezo1激动剂激活后的内皮细胞及其培养液可促进肝细胞增殖。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.第一内皮细胞或其培养液在制备药物中的用途，所述药物用于促进肝细胞增殖、或者治疗和/或预防肝细胞凋亡引起的相关疾病；
其中，所述第一内皮细胞具有机械感知阳离子通道激活活性。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肝细胞凋亡引起的相关疾病包括肝衰竭、肝脏再生不足、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝和自身免疫性肝病中的至少之一；
任选地，所述肝衰竭为急性肝衰竭；
任选地，所述肝细胞包括LO2、HepaRG、MIHA、THLE-2、THLE-3。
3.一种培养基或药物，其特征在于，包括第一内皮细胞或其培养液；
所述第一内皮细胞具有机械感知阳离子通道激活活性。
4.根据权利要求3所述的培养基或药物，其特征在于，进一步包括无血清培养基；
任选地，所述无血清培养基选自无血清DMEM培养基、RPMI1640培养基；
任选地，所述产品为培养基或药物。
5.根据权利要求1～2任一项所述的用途或权利要求3～4任一项所述的培养基或药物，其特征在于，所述第一内皮细胞是采用机械感知阳离子通道激动剂对第二内皮细胞进行激活处理得到的；
任选地，所述机械感知阳离子通道包括双孔钾通道、上皮钠离子通道、瞬时受体电位通道家族和PIEZO家族中的至少之一；
任选地，所述机械感知阳离子通道包括Piezo1、Piezo2、Kcnk10、Kcnk2、Kcnk4、Stoml3、Trpa1和Trpv4中的至少之一；
任选地，所述机械感知阳离子通道激动剂为Yoda1；
任选地，所述Yoda1的浓度为1～20μM；
任选地，所述激活处理的时间为5～6h；
任选地，所述第二内皮细胞包括HUVEC、SK-hep-1。
6.一种制备培养基或药物的方法，其特征在于，包括：
采用机械感知阳离子通道激动剂对第二内皮细胞进行激活处理，得到第一内皮细胞；
将所述第一内皮细胞进行培养处理，得到所述培养基或药物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述激活处理的时间为5～6h；
任选地，所述机械感知阳离子通道包括双孔钾通道、上皮钠离子通道、瞬时受体电位通道家族和PIEZO家族中的至少之一；
任选地，所述机械感知阳离子通道包括Piezo1、Piezo2、Kcnk10、Kcnk2、Kcnk4、Stoml3、Trpa1和Trpv4中的至少之一；
任选地，所述机械感知阳离子通道激动剂为Yoda1；
任选地，所述Yoda1的浓度为1～20μM；
任选地，所述培养处理是在无血清培养基中进行的；
任选地，所述无血清培养基选自无血清DMEM培养基、RPMI1640培养基；
任选地，所述培养处理的时间为20～30h；
任选地，所述激活处理之后，将激活处理产物进行清洗处理，以便得到所述的第一内皮细胞；
任选地，所述清洗处理是采用PBS进行的；
任选地，所述第二内皮细胞包括HUVEC、SK-hep-1。
8.权利要求3～5任一项所述的培养基或药物、或者依据权利要求6～7任一项所述的方法制备的培养基或药物在制备产品中的用途，所述产品用于促进肝细胞增殖、或者治疗和/或预防肝细胞凋亡引起的相关疾病；
任选地，所述肝细胞凋亡引起的相关疾病包括肝衰竭、肝脏再生不足、病毒性肝炎、肝纤维化、肝硬化、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝和自身免疫性肝病中的至少之一；
任选地，所述肝衰竭为急性肝衰竭；
任选地，所述肝细胞包括LO2、HepaRG、MIHA、THLE-2、THLE-3。
9.一种体外促进肝细胞增殖的方法，其特征在于，包括：
采用权利要求3～5任一项所述的培养基或药物、或者依据权利要求6～7任一项所述的方法制备的培养基或药物培养所述肝细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养是在适于所述肝细胞生长条件下进行的；
任选地，所述肝细胞包括LO2、HepaRG、MIHA、THLE-2、THLE-3。
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| CN202310982206.8A Pending CN117180313A (zh) | 2023-08-04 | 2023-08-04 | 一种培养基或药物和促进肝细胞增殖的方法 |
Country Status (1)
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|---|---|
| CN (1) | CN117180313A (zh) |
-
2023
- 2023-08-04 CN CN202310982206.8A patent/CN117180313A/zh active Pending
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