CN117169207A - 快速药敏检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速药敏检测方法，包括以下步骤：1)提供凝胶基底，所述凝胶基底提供细菌原位生长的培养环境；2)将细菌和测试药物点样至所述凝胶基底上，培养；3)置于显微镜下成像；4)采用图像处理方法分析计算步骤3)获得的细菌图像中细菌成像面积的变化量，从而判断细菌对测试药物的耐药性。本发明提供的快速药敏检测方法，采用凝胶基底作为载体，通过对细菌在抗生素作用下的分裂和数量变化进行成像，并结合图像处理方法分析细菌生长变化情况，从而判断出细菌对测试药物的耐药性，能够实现快速、准确的药敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及病原微生物检测诊断领域，特别涉及一种快速药敏检测方法。
背景技术
由细菌性病原体引起的传染病是导致死亡的最常见的原因之一。微生物的药敏检测对细菌感染治疗和促进抗生素的管理是极为重要的。
常见的药敏检测方法有纸片扩散法，稀释法(包括琼脂和肉汤稀释法)，抗生素浓度梯度法(E-test法)，和自动化仪器等。
微量肉汤稀释法药敏法的金标准之一。其检验原理为，试剂含有倍比稀释的抗菌药物，受试菌被定量的抗菌药物抑制，根据生长抑制情况判断受试菌的最低抑菌浓度(MIC)。该药敏板需在35℃±2℃孵育16～20h，实验耗时长，严重影响诊断效率，从而导致延误治疗时机。
除去现有的常见方法的进一步高度自动化手段，绝大多数药敏检测技术突破都体现了两大趋势，即非培养技术和单细胞技术。目前发展的非培养技术主要基于分子诊断，是目前研发快速病原菌诊断的主要手段，GeneXpert、Filmarray等产品在国内外市场得到了认可。然而分子诊断方法所适用的目标微生物种类受探针和引物的数量和种类所限，而且对耐药基因的检测内容较为单一。更重要的是，耐药基因的存在并不代表微生物具有耐药表型，同时新的耐药表型经常是通过全新的耐药性基因体现。因而基因诊断的发展在根本上会依赖于对新的耐药基因的发现，对抗菌药物的合理应用和精准抗感染指导有限，因此基于表型的药敏分析具有的临床意义更为巨大。此外，分子诊断手段较高的价格也阻碍了其在临床方面的普及。
利用单细胞进行药敏分析是另一发展趋势。基于单细胞水平的分析不但可以在更基础的层面准确反应细菌的特征，更由于单细胞技术无需传统微生物培养，无需微生物增值过程的漫长等待，是目前很有潜力的可用于快速病原菌诊断的新方法，也成为了国际研究热点，涌现了一系列的基于单细胞成像的创新技术方法。例如在显微镜下观察固定在基质上的细菌在抗生素作用下单细胞的分裂过程，以及基于微流控芯片通道上细菌分裂观察的耐药评价方法等。但是上述细菌单细胞分裂的耐药评价方法虽然微流控芯片设计较为精巧，且成像分辨率高，但过于复杂所以很难满足临床一个样品要进行二十余种抗生素的测试的真实场景，需要对其关键技术细节和核心器件进行优化设计。由于整体设计较为复杂，目前仍局限于实验室阶段，也没有较充足的数据支撑其有效性。
所以，现在需要一种更可靠的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种快速药敏检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种快速药敏检测方法，包括以下步骤：
1)提供凝胶基底，所述凝胶基底提供细菌原位生长的培养环境；
2)将细菌和测试药物点样至所述凝胶基底上，培养；
3)置于显微镜下成像；
4)采用图像处理方法分析计算步骤3)获得的细菌图像中细菌成像面积的变化量，从而判断细菌对测试药物的耐药性。
优选的是，所述步骤4)具体包括：
4-1)在细菌图像中提取包含噪点的区域作为ROI图像；
4-2)对ROI图像中的某一个噪点p，在每个时刻得到的ROI图像中获取该噪点p在图像中的坐标(x，y)，计算该噪点p每个时刻i的坐标与该噪点p在初始时刻的坐标的横纵坐标差值，得到噪点i每个时刻的位移量Δxi和Δyi；在所有时刻的位移量Δx和Δy中，取Δx和Δy的最大值，分别记为maxΔx和maxΔy；取-Δx和-Δy的最小值，分别记为minΔx和minΔy；以maxΔx、maxΔy、minΔx和minΔy作为最大偏差绘制图像，将所有时刻的ROI图像放在同一坐标体系内，提取所有ROI图像都包含的区域作为最终用于计算的图像集Z；
4-3)在图像集Z中，分别对不同时刻的图像以及背景进行负相操作，然后每时刻图像分别减去背景，得到特征区域；然后以周长、面积、形状、灰度作为特征对特征区域进行筛选，勾画出图像中的细菌，并记录细菌参数：个数、总面积、平均周长和平均面积，通过计算不同时刻4个细菌参数中的至少一个的变化率判断细菌是否增长，从而判断细菌对测试药物的耐药性；
其中，针对不同种类的细菌，以不同范围的周长、面积、形状、灰度对特征区域进行筛选。
优选的是，所述步骤4-1)具体为：在细菌图像中提取块区域对其进行负相处理，再转成灰度图像，然后利用大津阈值法将图像转为二值图像；通过中值滤波对二值图像进行平滑处理，最后通过canny算子对区域进行轮廓提取最终找到背景当中的噪点位置，从而得到细菌图像中所有包含噪点的区域，并作为ROI图像。
优选的是，所述凝胶基底中包括培养基和凝胶材料，所述培养基为MH培养基。
优选的是，所述MH培养基的组分包括：牛肉浸粉、可溶性淀粉、酸水解酪蛋白和超纯水。
优选的是，所述MH培养基的制备方法为：将牛肉浸粉、可溶性淀粉、酸水解酪蛋白加入超纯水中，使用灭菌锅加热，使混合物完全溶解为澄清溶液，得到液态的MH培养基。
优选的是，所述凝胶基底的制备方法为：将凝胶材料加入到液态的MH培养基中，使用灭菌锅加热，待凝胶材料完全溶解之后，将混合物从灭菌锅中取出，转移到微孔板中，自然冷却，形成凝胶基底。
优选的是，所述凝胶材料为琼脂糖、明胶、卡拉胶、黄原胶和琼脂中的任意一种或多种。
优选的是，所述MH培养基的制备方法为：将0.4g牛肉浸粉、0.3g可溶性淀粉、3.5g酸水解酪蛋白加入200ml超纯水中，使用灭菌锅于0.1mpa下加热至121℃，使混合物完全溶解为澄清溶液，得到液态的MH培养基。
优选的是，所述凝胶基底的制备方法为：称取4g琼脂糖粉末，加入到200ml的MH培养基中，使用灭菌锅于0.1mpa下加热至121℃，待凝胶完全溶解之后，将混合物从灭菌锅中取出，用移液枪转移到微孔板中，自然冷却，形成凝胶基底。
本发明的有益效果是：本发明提供的快速药敏检测方法，采用凝胶基底作为载体，通过对细菌在抗生素作用下的分裂和数量变化进行成像，并结合图像处理方法分析细菌生长变化情况，从而判断出细菌对测试药物的耐药性，能够实现快速、准确的药敏检测。
附图说明
图1为本发明的实施例中MH培养基与LB、TB培养基的效果对比结果；
图2为未添加抗菌药物时，ATCC29213在具有凝胶基底的药敏板上自由生长3小时的显微成像照片；
图3为添加万古霉素时，ATCC29213在具有凝胶基底的药敏板上抑制生长3小时的显微成像照片；
图4为ATCC29213在不同浓度万古霉素作用下的3小时内生长曲线；
图5为ATCC29213在不同浓度万古霉素作用下的不同时刻测得的平均面积。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
本实施例的一种快速药敏检测方法，包括以下步骤：
1)提供凝胶基底，凝胶基底提供细菌原位生长的培养环境；
2)将细菌和测试药物点样至凝胶基底上，置于37℃培养箱中进行培养；
3)置于显微镜下成像；
4)采用图像处理方法分析计算步骤3)获得的细菌图像中细菌成像面积的变化量，从而判断细菌对测试药物的耐药性。
本实施例中，凝胶基底中包括培养基和凝胶材料。凝胶基底水分含量不高，不支持细菌的自由移动，用于提供细菌原位生长的培养表面，同时也能够便于成像观察。其中，培养基用于提供细菌生长所需要的营养物质，凝胶材料用于形成凝胶状的基底，以提供细菌的截留载体。
在优选的实施例中，培养基为MH培养基，进一步的，MH培养基的组分包括：牛肉浸粉、可溶性淀粉、酸水解酪蛋白和超纯水。凝胶材料为琼脂糖、明胶、卡拉胶、黄原胶和琼脂中的任意一种或多种。但需要理解的是，与MH培养基功能相似的营养物质如LB、TB培养基，以及与上述凝胶材料功能相似的物质都应视作该专利的保护范围之内。
通过琼脂糖的物理空间结构可知，琼脂糖是线性多聚物，化学结构是由1,3连结的β-D-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-L-半乳糖交替连接起来的长链构成。琼脂糖在水中加热到80℃溶解于水，35-40℃会形成良好的半固体凝胶，凝胶含水量高，具有很强的吸收水分的能力。因此当我们把培养液滴在琼脂糖凝胶上时，培养基中的水、无机盐和有机小分子进入琼脂糖凝胶的网状结构中，凝胶表面只留下细菌，这样就可以很容易在显微镜下同一个位置观察不同种类细菌数量的变化，从而可以判断细菌的生长情况。
所以，在本实施例中，选用MH培养基，且以琼脂糖作为凝胶材料。进一步的，本实施例中，对凝胶基底的成分进行了优选，具体为：牛肉浸粉0.4g、可溶性淀粉0.3g、酸水解酪蛋白3.5g、超纯水200ml、琼脂糖粉末4g。
该凝胶基底的制备方法为：
1、制备MH培养基：将0.4g牛肉浸粉、0.3g可溶性淀粉、3.5g酸水解酪蛋白加入200ml超纯水中，使用灭菌锅于0.1mpa下加热至121℃，使混合物完全溶解为澄清溶液，得到液态的MH培养基；
2、制备凝胶基底：称取4g琼脂糖粉末，加入到200ml的MH培养基中，使用灭菌锅于0.1mpa下加热至121℃，待凝胶完全溶解之后，将混合物从灭菌锅中取出，用移液枪转移到微孔板中，自然冷却，形成凝胶基底。
本实施例中，对MH培养基与LB和TB培养基的效果进行了对比，参照图1，为不同浓度和种类培养基条件下，ATCC29213的自然生长曲线；可以看出，MH培养基更有利于细菌的生长，生长速度明显领先。不使用2倍浓度的MH是因为浓度的翻倍并没有使生长速率有很大的变化。
本发明中，采用了自动化的图像处理方法对显微镜获取的图像进行处理，通过对图像中的细菌的个数、总面积以及平均面积等参数分析，判断细菌生长状态，从而确定细菌对测试药物的耐药性，图像处理的具体步骤如下：
4-1)在细菌图像中提取包含噪点的区域作为ROI图像：
图像内容易包含难以与细菌区分的背景杂质，因此需要对图像进行去背景处理；且实际拍摄过程中会引入一些微小的人工操作所引起的位移偏差，所以需要消除掉位移偏差才可以准确的对后续不同时刻的细菌图像进行去背景处理。本实施例中采用的方法如下：在细菌图像中提取块区域对其进行负相处理，再转成灰度图像，然后利用大津阈值法将图像转为二值图像；通过中值滤波对二值图像进行平滑处理，最后通过canny算子对区域进行轮廓提取最终找到背景当中的噪点位置，从而得到细菌图像中所有包含噪点的区域，并作为ROI图像。
4-2)对ROI图像中的某一个噪点p，在每个时刻得到的ROI图像中获取该噪点p在图像中的坐标(x，y)，计算该噪点p每个时刻i的坐标与该噪点p在初始时刻的坐标的横纵坐标差值，得到噪点i每个时刻的位移量Δxi和Δyi；在所有时刻的位移量Δx和Δy中，取Δx和Δy的最大值，分别记为maxΔx和maxΔy；取-Δx和-Δy的最小值，分别记为minΔx和minΔy；以maxΔx、maxΔy、minΔx和minΔy作为最大偏差绘制图像，将所有时刻的ROI图像放在同一坐标体系内，提取所有ROI图像都包含的区域作为最终用于计算的图像集Z；
4-3)在图像集Z中，分别对不同时刻的图像以及背景进行负相操作，然后每时刻图像分别减去背景，得到特征区域；然后以周长、面积、形状、灰度作为特征对特征区域进行筛选，勾画出图像中的细菌，并记录细菌参数：个数、总面积、平均周长和平均面积，通过计算不同时刻4个细菌参数中的至少一个的变化率判断细菌是否增长，从而判断细菌对测试药物的耐药性。
其中，针对不同种类的细菌，以不同范围的周长、面积、形状、灰度对特征区域进行筛选，例如，对于金黄色葡萄球菌，步骤3)具体为：
基于直方图阈值法得到的自适应阈值将图像转换为二值图像，并找到所有特征区域，对所有提取的特征区域进行以下判定：周长大于50并小于180像素；圆度小于2；面积大于250并小于1200像素，满足这些条件，则判定为细菌；最终以细菌的平均面积的增长率判断细菌是否增长，从而判断细菌对测试药物的耐药性。
参照图2，是未添加抗菌药物时，ATCC29213在具有凝胶基底的药敏板上自由生长3小时的显微成像照片；图3是添加万古霉素时，ATCC29213在具有凝胶基底的药敏板上抑制生长3小时的显微成像照片，可以明显看出，细菌生长受到了万古霉素的抑制。其中，凝胶成像使用白光，透射的方式，可以是倒置物镜也可以是正置物镜，本实施例中采用了倒置显微镜。
参照图4，为本实施例中，ATCC29213在不同浓度万古霉素作用下的3小时内生长曲线，可以看出，抗生素在开始时并没有明显的抑制作用，但是随着浓度的提高，抑制作用开始明显。使用肉汤稀释法测得ATCC29213的MIC在2ug/ml，使用本方法可以在3小时内得到其MIC。通过这种成像药敏方法，可以将原来的16-24h的药敏实验缩短到当天出报告。
参照图5，为本实施例中，ATCC29213在不同浓度万古霉素作用下的不同时刻测得的平均面积。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (10)
1.一种快速药敏检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提供凝胶基底，所述凝胶基底提供细菌原位生长的培养环境；
2)将细菌和测试药物点样至所述凝胶基底上，培养；
3)置于显微镜下成像；
4)采用图像处理方法分析计算步骤3)获得的细菌图像中细菌成像面积的变化量，从而判断细菌对测试药物的耐药性。
2.根据权利要求1所述的快速药敏检测方法，其特征在于，所述步骤4)具体包括：
4-1)在细菌图像中提取包含噪点的区域作为ROI图像；
4-2)对ROI图像中的某一个噪点p，在每个时刻得到的ROI图像中获取该噪点p在图像中的坐标(x，y)，计算该噪点p每个时刻i的坐标与该噪点p在初始时刻的坐标的横纵坐标差值，得到噪点i每个时刻的位移量Δxi和Δyi；在所有时刻的位移量Δx和Δy中，取Δx和Δy的最大值，分别记为maxΔx和maxΔy；取-Δx和-Δy的最小值，分别记为minΔx和minΔy；以maxΔx、maxΔy、minΔx和minΔy作为最大偏差绘制图像，将所有时刻的ROI图像放在同一坐标体系内，提取所有ROI图像都包含的区域作为最终用于计算的图像集Z；
4-3)在图像集Z中，分别对不同时刻的图像以及背景进行负相操作，然后每时刻图像分别减去背景，得到特征区域；然后以周长、面积、形状、灰度作为特征对特征区域进行筛选，勾画出图像中的细菌，并记录细菌参数：个数、总面积、平均周长和平均面积，通过计算不同时刻4个细菌参数中的至少一个的变化率判断细菌是否增长，从而判断细菌对测试药物的耐药性；
其中，针对不同种类的细菌，以不同范围的周长、面积、形状、灰度对特征区域进行筛选。
3.根据权利要求2所述的快速药敏检测方法，其特征在于，所述步骤4-1)具体为：在细菌图像中提取块区域对其进行负相处理，再转成灰度图像，然后利用大津阈值法将图像转为二值图像；通过中值滤波对二值图像进行平滑处理，最后通过canny算子对区域进行轮廓提取最终找到背景当中的噪点位置，从而得到细菌图像中所有包含噪点的区域，并作为ROI图像。
4.根据权利要求1所述的快速药敏检测方法，其特征在于，所述凝胶基底中包括培养基和凝胶材料，所述培养基为MH培养基。
5.根据权利要求4所述的快速药敏检测方法，其特征在于，所述MH培养基的组分包括：牛肉浸粉、可溶性淀粉、酸水解酪蛋白和超纯水。
6.根据权利要求5所述的快速药敏检测方法，其特征在于，所述MH培养基的制备方法为：将牛肉浸粉、可溶性淀粉、酸水解酪蛋白加入超纯水中，使用灭菌锅加热，使混合物完全溶解为澄清溶液，得到液态的MH培养基。
7.根据权利要求6所述的快速药敏检测方法，其特征在于，所述凝胶基底的制备方法为：将凝胶材料加入到液态的MH培养基中，使用灭菌锅加热，待凝胶材料完全溶解之后，将混合物从灭菌锅中取出，转移到微孔板中，自然冷却，形成凝胶基底。
8.根据权利要求7所述的快速药敏检测方法，其特征在于，所述凝胶材料为琼脂糖、明胶、卡拉胶、黄原胶和琼脂中的任意一种或多种。
9.根据权利要求8所述的快速药敏检测方法，其特征在于，所述MH培养基的制备方法为：将0.4g牛肉浸粉、0.3g可溶性淀粉、3.5g酸水解酪蛋白加入200ml超纯水中，使用灭菌锅于0.1mpa下加热至121℃，使混合物完全溶解为澄清溶液，得到液态的MH培养基。
10.根据权利要求9所述的快速药敏检测方法，其特征在于，所述凝胶基底的制备方法为：称取4g琼脂糖粉末，加入到200ml的MH培养基中，使用灭菌锅于0.1mpa下加热至121℃，待凝胶完全溶解之后，将混合物从灭菌锅中取出，用移液枪转移到微孔板中，自然冷却，形成凝胶基底。
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