CN209961688U - 病原微生物药敏的快速检测仪器 - Google Patents
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Abstract
本实用新型涉及病原微生物药敏的快速检测仪器,属于微生物检测技术领域。病原微生物药敏的快速检测仪器包括白光成像单元与拉曼单元,白光成像单元用于拍摄样品白光像,实现细胞自动识别和定位,拉曼单元用于测量病原微生物细胞拉曼光谱,得到病原微生物细胞的指纹特征,当拍摄白光像识别细胞时,白光成像单元移入光路,拉曼单元移出光路,当测量拉曼信号时,白光成像单元移出光路,拉曼单元移入光路。本实用新型技术方案通过显微镜下对单细胞测试他们的代谢活性,因此大大缩短了检测的时间,并且可以得到单细胞层面的准确度。在本实验室中,最快可以在30min内得到结果。与微量肉汤稀释法对比发现,使用本设备的准确度可达到90%以上。
Description
技术领域
本实用新型涉及微生物检测技术领域,尤其是涉及病原微生物药敏的快速检测仪器。
背景技术
现行尿液中病原微生物的药敏主要通过对尿液分离得到的菌株在不同抗生素作用下的增殖情况判断。由尿液中分离菌株需要将尿液在固体培养基上涂布,培养 16h以上,得到单菌落后,将单菌落接种至不同的抗生素中,再经过6h-3天,在这过程中,通过浊度、吸光度等的变化或沉淀的生成来检测细胞的增殖,并以此判断微生物的药敏。
专利EP2820147B1公开了微生物药敏快速测定试剂盒和系统,使用其所描述的试剂盒和系统允许基于微生物的抗生素的敏感性测定少量的微生物。该技术方案主要是利用试剂盒进行检测,其检测成本高。
专利US20180135093A1公开了自动微生物鉴定及药敏检测系统,包括:试剂盒,一种试剂级,暗盒,暗盒,载物台,移液器组件,光学检测系统,所述系统被设计成动态地调节电机空转转矩来控制热负荷和采用快速聚焦方法用于确定真实的微生物个体的焦点位置。所述系统还可包括量化相对使用动态稀释样品中活微生物的丰度,有利于生长的微生物进行快速,准确的抗微生物敏感性测试。该检测系统结构复杂,操作繁琐。
实用新型内容
本实用新型的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供病原微生物药敏的快速检测仪器。
本实用新型的目的可以通过以下技术方案来实现:
本实用新型第一方面:提供第一种病原微生物药敏的快速检测仪器。
本实用新型提供的第一种病原微生物药敏的快速检测仪器,包括:
白光成像单元:用于拍摄样品白光像,实现细胞自动识别和定位;
拉曼单元:用于采集病原微生物细胞拉曼信号;
当拍摄白光像识别细胞时,白光成像单元移入光路,拉曼单元移出光路,当测量拉曼信号时,白光成像单元移出光路,拉曼单元移入光路。
在本实用新型的一个实施方式中,所述病原微生物药敏的快速检测仪器还包括用于放置样品的载玻片,以及用于移动载玻片的自动平移台。
所述载玻片,也称之为芯片,用于放置样品,在载玻片上设置有一个标记,用于标记坐标原点。
所述载玻片以可以更好减少激光反射同时增强拉曼信号收集的材料或结构为宜,如石英、氟化钙或金属镀层材质。
在本实用新型的一个实施方式中,所述病原微生物药敏的快速检测仪器还包括白光成像单元与拉曼单元共用的物镜。
在本实用新型的一个实施方式中,所述白光成像单元包括白光灯、半透半反镜片组及照相机,
所述白光灯用于发出光,
所述半透半反镜片组用于将光反射后,经物镜聚焦至样品上,并将样品散射光经物镜收集后反射出,
所述相机用于接收半透半反镜片组反射的光,记录图像。
在本实用新型的一个实施方式中,所述半透半反镜片组包括两个半透半反镜,白光灯发出的光经第一个半透半反镜反射后,再经物镜聚焦至样品上,样品散射光经物镜收集,在透射过第一个半透半反镜后经第二个半透半反镜反射后,由相机记录图像。
在本实用新型的一个实施方式中,所述拉曼单元包括激光发射单元,所述激光发射单元包括激光器、激光窄带滤光片,所述激光器用于产生激光,所述激光窄带滤光片用于滤除激光中的杂线。
在本实用新型的一个实施方式中,所述拉曼单元还包括:
光栅:用于使激光作用下样品产生的拉曼信号按波长分布按不同角度衍射,
探测器:用于采集并记录光栅分光后的拉曼光谱。
在本实用新型的一个实施方式中,所述激光器为488nm激光器、514nm激光器、532nm激光器、633nm激光器或785nm激光器中的一种。
在本实用新型的一个实施方式中,激光窄带滤光片通常可选532/2nm以滤除激光中的杂线,532nm处透过率大于90%,透过率曲线半高全宽2nm。
在本实用新型的一个实施方式中,所述激光发射单元还包括激光功率衰减片,用于对激光强度进行不同程度的衰减,以调节激光强度。
在本实用新型的一个实施方式中,激光功率衰减片可选6组衰减片以对激光强度进行不同程度的衰减,以更好的满足保护样品和增强拉曼信号的功能。
在本实用新型的一个实施方式中,所述拉曼单元还包括拉曼滤光片,所述拉曼滤光片用于将反射镜组发射过来的激光反射后由物镜聚焦至样品上,当测量拉曼信号时,所述物镜用于收集样品散射的拉曼散射信号和瑞利散射信号,并使拉曼散射信号和瑞利散射信号返回拉曼滤光片,所述拉曼滤光片还用于阻挡样品散射的瑞利散射信号,透过样品散射的拉曼散射信号。
在本实用新型的一个实施方式中,所述拉曼单元还包括共聚焦针孔、狭缝,
所述共聚焦针孔与狭缝设置在拉曼滤光片后方,用于使激光穿过后投射到光栅上,所述光栅为反射式光栅。
所述共聚焦针孔用于在共焦模式下阻挡杂散信号,非共焦模式下提升样品信号强度。
所述共聚焦针孔通过调节针孔大小,达到共焦模式下阻挡杂散信号、提高样品成像的三维空间分辨率,非共焦模式下提升样品信号强度的目的;光栅将拉曼信号按波长分布按不同角度衍射。
在本实用新型的一个实施方式中,所述探测器选择EMCCD探测器,用以记录光栅分光后的拉曼光谱。
在本实用新型的一个实施方式中,所述拉曼单元还包括反射镜组,所述反射镜组包括第一反射镜与第二反射镜。
当测量拉曼信号时,激发光经激光器发出,经过激光窄带滤光片滤除杂线,再经激光功率衰减片调节强度后,由反射镜将激光以优化后的入射角度投射至拉曼滤光片;激光经拉曼滤光片反射后由物镜聚焦至样品上;自动平移台可以根据白光成像下软件对于细胞坐标的识别结果,自动移动样品将细胞移动至物镜的焦点处并采集拉曼光谱,以达到扫描成像目的;由样品散射的拉曼散射信号(拉曼信号橙色) 和瑞利散射信号(激光信号绿色)被物镜收集后返回拉曼滤光片,在此瑞利散射信号被阻挡而拉曼散射信号透过拉曼滤光片;拉曼散射信号再经过共聚焦小孔和狭缝由凹面镜准直后投射到反射式光栅上,经光栅衍射后按波长排布的平行光再经另一凹面镜聚集至探测器上,最终输出拉曼信号。
在本实用新型的一个实施方式中,所述病原微生物药敏的快速检测仪器还包括数据处理设备,
所述数据处理设备用于对白光成像单元拍摄的样品白光像进行分析,实现细胞自动识别和定位;并且用于对拉曼单元所获拉曼光谱进行分析、对比与判断,检测病原微生物。
在本实用新型的一个实施方式中,所述数据处理设备为计算机,所述计算机与照相机、探测器、自动平移台连接。
在本实用新型的一个实施方式中,所述病原微生物药敏的快速检测仪器主要用于尿液中病原微生物药敏的快速检测,即作为种尿液中病原微生物药敏的快速检测仪器使用。
本实用新型第二方面:提供第二种病原微生物药敏的快速检测仪器。
本实用新型提供的第二种病原微生物药敏的快速检测仪器,包括:
白光成像单元:用于拍摄样品白光像,实现细胞自动识别和定位;
拉曼单元:用于采集病原微生物细胞拉曼信号;
当拍摄白光像识别细胞时,白光成像单元移入光路,拉曼单元移出光路,当测量拉曼信号时,白光成像单元移出光路,拉曼单元移入光路。
在本实用新型的一个实施方式中,所述病原微生物药敏的快速检测仪器还包括用于放置样品的载玻片,以及用于移动载玻片的自动平移台。
所述载玻片,也称之为芯片,用于放置样品,在载玻片上设置有一个标记,用于标记坐标原点。
所述载玻片以可以更好减少激光反射同时增强拉曼信号收集的材料或结构为宜,如石英、氟化钙或金属镀层材质。
在本实用新型的一个实施方式中,所述病原微生物药敏的快速检测仪器还包括白光成像单元与拉曼单元共用的物镜。
在本实用新型的一个实施方式中,所述白光成像单元包括白光灯、半透半反镜片组及照相机,
所述白光灯用于发出光,
所述半透半反镜片组用于将光反射后,经物镜聚焦至样品上,并将样品散射光经物镜收集后反射出,
所述相机用于接收半透半反镜片组反射的光,记录图像。
在本实用新型的一个实施方式中,所述半透半反镜片组包括两个半透半反镜,白光灯发出的光经第一个半透半反镜反射后,再经物镜聚焦至样品上,样品散射光经物镜收集,在透射过第一个半透半反镜后经第二个半透半反镜反射后,由相机记录图像。
在本实用新型的一个实施方式中,所述拉曼单元包括:
激光发射单元:包括激光器、激光窄带滤光片,所述激光器用于产生激光,所述激光窄带滤光片用于滤除激光中的杂线,
拉曼散射信号过滤单元:用于使激光作用下样品产生的拉曼散射信号被波长过滤装置或设备选择性的过滤,
拉曼散射信号采集单元:用于接收通过拉曼散射信号过滤单元的拉曼散射信号,使用光子读取装置或设备作为探测器。
特别需要说明的是,本实用新型第二方面中提供的固定波长的拉曼散射快速采集和成像设备不使用光栅。
在本实用新型的一个实施方式中,拉曼散射信号过滤单元所用的波长过滤装置或设备为一个或多个滤光片。
在本实用新型的一个实施方式中,拉曼散射信号采集单元的光子读取装置或设备的探测器为一个或多个光子计数器或光电倍增管。
在本实用新型的一个实施方式中,所述拉曼散射信号过滤单元包括分束片、第一窄带滤光片、第二窄带滤光片,所述分束片用于使一部分拉曼信号穿透分束片后,经第一窄带滤光片过滤;剩余的拉曼信号被分束片反射后,经第二窄带滤光片后过滤。
在本实用新型的一个实施方式中,经第一窄带滤光片后过滤的拉曼散射信号被第一探测器读取,经第二窄带滤光片后过滤的拉曼散射信号被第二探测器读取。
在本实用新型的一个实施方式中,所述分束片为a:b分束片,a和b分别为光线透射过分束片和被分束片反射后的光强,a:b的比值大于0,小于1。
例如,所述分束片为10:90分束片,90%拉曼信号穿透分束片后,经第一窄带滤光片后被第一探测器读取,10%的拉曼信号被分束片反射后,经第二窄带滤光片后被第二探测器读取。
在本实用新型的一个实施方式中,所述分束片工作范围至少覆盖比激光器激发波长更长的任意100cm-1波数的连续波长范围区间;
优选地,所述分束片工作范围至少覆盖比激光器激发波长红移2000cm-1到2300cm-1波数范围的波长。
在本实用新型的一个实施方式中,所述分束片为二向色镜。
在本实用新型的一个实施方式中,所述分束片为二向色镜,其截止波长在 607nm-620nm之间。
在本实用新型的一个实施方式中,所述第一窄带滤光片选用在激光器激发波长红移方向2040cm-1到2300cm-1波数范围内的光学透过率大于80%的滤光片。
在本实用新型的一个实施方式中,所述第二窄带滤光片选用在激光器激发波长红移方向1800cm-1-2040cm-1或2260cm-1到2700cm-1波数范围内中任意连续的 30cm-1或30cm-1以上的波数范围内的光学透过率大于80%的滤光片。
例如所述第一窄带滤光片选用600/14nm以读取588-608nm范围内的拉曼散射信号和该区域拉曼背景信号;
例如所述第二窄带滤光片选用591/6nm以读取586-596nm范围内的拉曼背景信号。
在本实用新型的一个实施方式中,所述激光发射单元还包括激光功率衰减片,用于对激光强度进行不同程度的衰减,以调节激光强度。
在本实用新型的一个实施方式中,所述激光器可以为488nm激光器、514nm 激光器、532nm激光器、633nm激光器或785nm激光器中的一种。
在本实用新型的一个实施方式中,所述激光功率衰减片选6组衰减片以对激光强度进行不同程度的衰减,以更好的满足保护样品和增强拉曼信号的功能。
在本实用新型的一个具体实施方式中,所述激光器选功率可调的532nm激光器,所述激光窄带滤光片选532nm处透过率大于90%,透过率曲线半高全宽2nm,以滤除激光中的杂线。
在本实用新型的一个具体实施方式中,所述拉曼散射信号采集单元还包括拉曼滤光片与物镜,所述拉曼滤光片用于将反射镜组发射过来的激光反射后由物镜聚焦至样品上,所述物镜用于收集样品散射的拉曼散射信号和瑞利散射信号,并使拉曼散射信号和瑞利散射信号返回拉曼滤光片;
所述拉曼滤光片还用于阻挡样品散射的瑞利散射信号,透过样品散射的拉曼散射信号。
在本实用新型的一个具体实施方式中,还包括反射镜组,所述反射镜组包括第一反射镜与第二反射镜。
在本实用新型的一个具体实施方式中,所述拉曼散射信号采集单元还包括共聚焦针孔、狭缝,所述共聚焦针孔与狭缝设置在拉曼滤光片后方,用于使激光穿过后投射到分束片上,所述共聚焦针孔用于在共焦模式下阻挡杂散信号,非共焦模式下提升样品信号强度。
在本实用新型的一个实施方式中,所述病原微生物药敏的快速检测仪器还包括数据处理设备,
所述数据处理设备用于对白光成像单元拍摄的样品白光像进行分析,实现细胞自动识别和定位;并且用于对拉曼单元所获拉曼光谱进行分析、对比与判断,检测病原微生物。
在本实用新型的一个实施方式中,所述数据处理设备为计算机,所述计算机与照相机、第一探测器、第二探测器、自动平移台连接。
在本实用新型的一个实施方式中,所述病原微生物药敏的快速检测仪器主要用于尿液中病原微生物药敏的快速检测,即作为种尿液中病原微生物药敏的快速检测仪器使用。
本实用新型的工作原理是:激光激发样品的拉曼散射后,通过由特定滤光片选择性的透过特定波长范围的拉曼光子,并使用光子读取装置或设备捕获和读取拉曼信号强度。从而实现快速拉曼检测和拉曼成像的目的。
本实用新型技术方案不依赖于样品中微生物的分离、培养,也不通过检测抗生素作用下微生物的增殖,而是通过显微镜下对单细胞测试他们的代谢活性,因此大大缩短了检测的时间,并且可以得到单细胞层面的准确度。在本实验室中,最快可以在30min内得到结果。与微量肉汤稀释法对比发现,使用本设备的准确度可达到90%以上。
附图说明
图1为实施例1中使用白光成像单元工作时结构示意图;
图2为实施例1中使用拉曼单元工作时结构示意图;
图3为实施例3中固定波长的拉曼散射快速采集和成像设备结构示意图;
图4为实施例4中吸收了不同程度氘的大肠杆菌的单细胞拉曼光谱。
图1、2中标号所示:1、激光器,2、激光窄带滤光片,3、激光功率衰减片, 4、第一反射镜,5、第二反射镜,6、拉曼滤光片,7、物镜,8、载玻片,9、自动平移台,10、共聚焦针孔,11、狭缝,12、光栅,13、探测器,14、白光灯,15 第一半透半反镜片,16、第二半透半反镜片,17、照相机。
图3中标号所示:1、激光器,2、激光窄带滤光片,3、激光功率衰减片,4、第一反射镜,5、第二反射镜,6、拉曼滤光片,7、物镜,8、载玻片,9、自动平移台,10、共聚焦针孔,11、狭缝,18、分束片,19、第一窄带滤光片,20、第一探测器,21、第二窄带滤光片,22、第二探测器。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本实用新型进行详细说明。
实施例1
提供病原微生物药敏的快速检测仪器。
参考图1、图2,本实施例提供的提供病原微生物药敏的快速检测仪器,包括:
白光成像单元:用于拍摄样品白光像,实现细胞自动识别和定位;
拉曼单元:用于测量病原微生物细胞拉曼光谱,得到病原微生物细胞的指纹特征;
用于放置样品的载玻片8,以及用于移动载玻片8的自动平移台9;
白光成像单元与拉曼单元共用的物镜7;
数据处理设备:所述数据处理设备用于对白光成像单元拍摄的样品白光像进行分析,实现细胞自动识别和定位;并且用于对拉曼单元所获拉曼光谱进行分析、对比与判断,检测病原微生物。
当拍摄白光像识别细胞时,白光成像单元移入光路,拉曼单元移出光路,参考图1,当测量拉曼信号时,白光成像单元移出光路,拉曼单元移入光路,参考图2。
本实施例中,所述白光成像单元包括白光灯14、半透半反镜片组及照相机17,所述白光灯14用于发出光,所述半透半反镜片组用于将光反射后,经物镜7聚焦至样品上,并将样品散射光经物镜7收集后反射出,所述相机17用于接收半透半反镜片组反射的光,记录图像。
其中,所述半透半反镜片组包括两个半透半反镜片,白光灯14发出的光经第一半透半反镜片15反射后,再经物镜7聚焦至样品上,样品散射光经物镜7收集,在透射过第一半透半反镜片15后经第二半透半反镜片16反射后,由相机17记录图像。
本实施例中,所述拉曼单元包括:
激光发射单元,所述激光发射单元包括激光器1、激光窄带滤光片2、激光功率衰减片3,所述激光器1用于产生激光,所述激光窄带滤光片2用于滤除激光中的杂线,激光功率衰减片3,用于对激光强度进行不同程度的衰减,以调节激光强度;
反射镜组:所述反射镜组包括第一反射镜4与第二反射镜5;
拉曼滤光片6:所述拉曼滤光片6用于将反射镜组发射过来的激光反射后由物镜7聚焦至样品上,当测量拉曼信号时,所述物镜7用于收集样品散射的拉曼散射信号和瑞利散射信号,并使拉曼散射信号和瑞利散射信号返回拉曼滤光片6,所述拉曼滤光片6还用于阻挡样品散射的瑞利散射信号,透过样品散射的拉曼散射信号:
共聚焦针孔10、狭缝11:所述共聚焦针孔10与狭缝11设置在拉曼滤光片6 后方,用于使激光穿过后投射到光栅12上;
光栅12:用于使激光作用下样品产生的拉曼信号按波长分布按不同角度衍射,所述光栅12为反射式光栅;
探测器13:用于采集并记录光栅分光后的拉曼光谱。
其中,所述激光器1为488nm激光器、514nm激光器、532nm激光器、633nm 激光器或785nm激光器中的一种。激光窄带滤光片2通常可选532/2nm以滤除激光中的杂线,532nm处透过率大于90%,透过率曲线半高全宽2nm。激光功率衰减片3可选6组衰减片以对激光强度进行不同程度的衰减,以更好的满足保护样品和增强拉曼信号的功能。所述共聚焦针孔10用于在共焦模式下阻挡杂散信号,非共焦模式下提升样品信号强度。所述共聚焦针孔10通过调节针孔大小,达到共焦模式下阻挡杂散信号、提高样品成像的三维空间分辨率,非共焦模式下提升样品信号强度的目的;光栅12将拉曼信号按波长分布按不同角度衍射。所述探测器13 选择EMCCD探测器,用以记录光栅分光后的拉曼光谱。
当测量拉曼信号时,激发光经激光器发出,经过激光窄带滤光片滤除杂线,再经激光功率衰减片调节强度后,由反射镜将激光以优化后的入射角度投射至拉曼滤光片;激光经拉曼滤光片反射后由物镜聚焦至样品上;自动平移台可以根据白光成像下软件对于细胞坐标的识别结果,自动移动样品将细胞移动至物镜的焦点处并采集拉曼光谱,以达到扫描成像目的;由样品散射的拉曼散射信号(拉曼信号橙色) 和瑞利散射信号(激光信号绿色)被物镜收集后返回拉曼滤光片,在此瑞利散射信号被阻挡而拉曼散射信号透过拉曼滤光片;拉曼散射信号再经过共聚焦小孔和狭缝由凹面镜准直后投射到反射式光栅上,经光栅衍射后按波长排布的平行光再经另一凹面镜聚集至探测器上,最终输出拉曼信号。
本实施例中,所述载玻片8,也称之为芯片,用于放置样品,在载玻片8上设置有一个标记,用于标记坐标原点。所述载玻片8以可以更好减少激光反射同时增强拉曼信号收集的材料或结构为宜,如石英、氟化钙或金属镀层材质。
本实施例中,所述数据处理设备为计算机,所述计算机与照相机17、探测器 13、自动平移台9连接。
本实施例中,所述病原微生物药敏的快速检测仪器主要用于尿液中病原微生物药敏的快速检测,即作为种尿液中病原微生物药敏的快速检测仪器使用。
实施例2
使用实施例1提供的仪器进行病原微生物药敏的快速检测方法,包括以下步骤:
A、对样品进行前处理,前处理方法为:将样品与不同种类和浓度的抗生素混合,构成混合体系,在至少两个混合体系中,只有样品、培养基,没有抗生素,分别记为体系 P和体系N,向除体系N以外的混合体系中加入氘水,向体系N中加入等体积不含氘的水;
B、白光成像单元拍摄样品白光像,实现细胞自动识别和定位;
C、细胞定位后,利用拉曼单元测量细胞拉曼光谱,得到病原微生物细胞的拉曼光谱,即待检测光谱;
D、数据分析:计算拉曼光谱中以2170cm-1为中心的,宽度以2170cm-1向左右各至少移动70cm-1个波数范围内的拉曼光谱下的面积,作为碳-氘峰面积(C-D),计算以2950cm-1为中心的,宽度以2950cm-1为中心向左右各至少移动80cm-1个波数范围内的拉曼光谱下的面积作为碳-氢峰面积(C-H),微生物的代谢指标通过氘代的程度来反映:
D%=(C-D)/(C-D+C-H)
比较抗生素作用下的D%与体系P和体系N的D%,当抗生素作用下的D%明显低于体系P并且接近体系N时,认为该抗生素在该浓度作用下有效的抑制微生物,微生物对该浓度的抗生素敏感,反之认为该微生物对该浓度的该抗生素耐药。
本实施例中,所述方法用于尿液中病原微生物药敏的快速检测。
本实施例中,尿液样品的前处理方法为:
将尿液分成多份(3-20ml),分别与不同种类和浓度的抗生素混合,以上混合体系中,大部分都同时包括尿液、培养基、抗生素,一个混合体系中可以含有一种或两种抗生素,混合体系体积为10ul-2ml。在至少两个混合体系中,只有尿液、培养基,没有抗生素,分别记为体系P和体系N。
培养基通常为MH培养基。
混合体系在35-37℃下反应0-4h。向除体系N以外的混合体系中加入氘水,混匀后氘水体积百分比为10-90%。向体系N中加入等体积不含氘的水。在35-37℃下反应 30min-7h。
之后样品通过离心的方式进行洗涤,具体为:在3000-10000rpm转速下离心2-10min,弃去上清后,加入一定体积的去离子水或者蒸馏水或者超纯水,通过振荡或者用移液枪吹打均匀重悬,再次按上述条件离心,再次弃去上清并重悬。之后可再重复0-2次。最终重悬在水中的样品,取一定体积(0.2ul-10ul)至载玻片上,自然晾干或烘干后,移至病原微生物药敏的快速检测仪器准备测试。
本实施例中,步骤B的具体方法为:
B1、载玻片上有一个标记用于标记坐标原点,病原微生物药敏的快速检测仪器首先会校正载玻片上标记点的位置,之后自动平移台带动载玻片移动,病原微生物药敏的快速检测仪器将记录载有样品的载玻片移动的方向与距离;
B2、在使用照相机拍摄图片之前,照相机成像尺寸需由微米级别的标准尺寸样品矫正,以记录相机芯片单个像素对应的相的尺寸,相机芯片是指相机的CCD 或者CMOS,从而在后续拍摄样品照片中读取所拍摄物品的尺寸;
B3、单细胞自动识别与定位过程中,照相机拍摄样品白光像,细胞和杂质颗粒均被记录在图像文件中,通过分析图像的对比度、亮度能够区分背景和样品,通过分析样品的面积大小、表面光滑程度、形状等,通过预先设置的筛选条件,可将细胞从杂质中分离出来,并根据坐标原点以及载玻片移动的方向和距离信息,得到细胞所处位置的二维坐标。
其中,分析图像的对比度、亮度区分背景和样品通过数据处理设备的内置软件实现,分析样品的面积大小、表面光滑程度、形状等通过数据处理设备的内置软件实现,并且在数据处理设备上预先设置筛选条件,这些技术均可以以现有的技术手段实现,例如,Sobel/Prewitt等图像处理算法。
本实施例中,步骤C的具体方法为:
标记激光测量点(测试样品的芯片上有一个固定的位置,将激光对焦至该固定位置,把该点的坐标设置为(0,0)),并选定目标测量细胞(在白光成像下,由于已知坐标原点(0,0),也知道成像下每单位距离(CCD上)对应的空间实际距离,因此可以给出成像下每个细胞相对于(0,0)的坐标,当需要测试拉曼光谱时,根据这个坐标,移动激光点/或者对焦的中心点到这个目标细胞上),根据白光成像单元拍摄样品白光像,实现细胞自动识别和定位后,根据记录的细胞坐标位置,每个细胞对应激光测量点将获得一个移动向量参数,数据处理设备触发自动平移台根据每个移动向量参数,将目标细胞单个依次移动至激光测量点,并随即由自动平移台发出一个采谱触发信号给探测器,指令探测器完成该细胞的采谱,如此重复若干次,完成微生物单细胞的显微成像,每个样品应采集10-200个单细胞的拉曼图谱,记为待检测光谱。
实施例3
提供第二种病原微生物药敏的快速检测仪器。
本实施例提供的第二种病原微生物药敏的快速检测仪器,包括:
白光成像单元:用于拍摄样品白光像,实现细胞自动识别和定位;
拉曼单元:用于测量病原微生物细胞拉曼光谱,得到病原微生物细胞的指纹特征;
用于放置样品的载玻片8,以及用于移动载玻片8的自动平移台9;
白光成像单元与拉曼单元共用的物镜7;
数据处理设备:所述数据处理设备用于对白光成像单元拍摄的样品白光像进行分析,实现细胞自动识别和定位;并且用于对拉曼单元所获拉曼光谱进行分析、对比与判断,检测病原微生物。
当拍摄白光像识别细胞时,白光成像单元移入光路,拉曼单元移出光路,当测量拉曼信号时,白光成像单元移出光路,拉曼单元移入光路。
本实施例中,所述白光成像单元包括白光灯、半透半反镜片组及照相机,所述白光灯用于发出光,所述半透半反镜片组用于将光反射后,经物镜聚焦至样品上,并将样品散射光经物镜收集后反射出,所述相机用于接收半透半反镜片组反射的光,记录图像。由于上述结构与实施例1相同,这里面没有通过附图再进行描述。
其中,所述半透半反镜片组包括两个半透半反镜片,白光灯14发出的光经第一半透半反镜片15反射后,再经物镜7聚焦至样品上,样品散射光经物镜7收集,在透射过第一半透半反镜片15后经第二半透半反镜片16反射后,由相机17记录图像。
本实施例第二种病原微生物药敏的快速检测仪器,除掉与实施例1相同的白光成像单元以外,其他结构如图3所示,其是一种固定波长的拉曼散射快速采集和成像设备。包括激光发射单元、反射镜组、拉曼散射信号过滤单元及拉曼散射信号采集单元。激光发射单元用于获得功率调整后的激光,反射镜组用于将功率调整后的激光反射到拉曼散射信号过滤单元,拉曼散射信号过滤单元用于使功率调整后的激光打到样品表面发生拉曼散射,并阻挡样品散射的瑞利散射信号,透过样品散射的拉曼散射信号,拉曼散射信号采集单元用于接收拉曼散射信号,拉曼散射信号采集单元包括分束片18,分束片18用于将拉曼散射信号分成两股,且分别由两组探测器读取。
具体而言,激光发射单元包括激光器1、激光窄带滤光片2及激光功率衰减片 3,激光器1用于产生激光,激光窄带滤光片2用于滤除激光中的杂线,激光功率衰减片3用于对激光强度进行不同程度的衰减,以调节激光强度。激光功率衰减片 3选6组衰减片以对激光强度进行不同程度的衰减,以更好的满足保护样品和增强拉曼信号的功能。
激光器1通常可选功率可调的532nm激光器或其他可选波长的激光器,包括488nm、514nm、633nm、785nm等等;为匹配532nm激光器,激光窄带滤光片2通常可选532/2nm,即532nm处透过率大于90%,透过率曲线半高全宽2nm,以滤除激光中的杂线。
拉曼散射信号过滤单元包括拉曼滤光片6与物镜7,拉曼滤光片6用于将反射镜组发射过来的功率调整后的激光反射后由物镜7聚焦至样品上,物镜7用于收集样品散射的拉曼散射信号和瑞利散射信号,并使拉曼散射信号和瑞利散射信号返回拉曼滤光片6,拉曼滤光片6还用于阻挡样品散射的瑞利散射信号,透过样品散射的拉曼散射信号。包括用于放置样品的载玻片8,载玻片8设在自动平移台9上。载玻片以可以更好减少激光反射的材料或结构为宜。
反射镜组包括第一反射镜4与第二反射镜5。
拉曼散射信号采集单元包括共聚焦针孔10、狭缝11、分束片18、第一窄带滤光片19、第一探测器20、第二窄带滤光片21及第二探测器22,共聚焦针孔10与狭缝11设置在拉曼滤光片6后方,用于使激光穿过后投射到分束片18上,共聚焦针孔10用于在共焦模式下阻挡杂散信号、提高样品成像的三维空间分辨率,非共焦模式下提升样品信号强度,分束片18用于使一部分拉曼信号穿透分束片18后,经第一窄带滤光片19后被第一探测器20读取,使剩余的拉曼信号被分束片18反射后,经第二窄带滤光片21后被第二探测器22读取。分束片18为10:90分束片, 90%拉曼信号穿透分束片18后,经第一窄带滤光片19后被第一探测器20读取, 10%的拉曼信号被分束片18反射后,经第二窄带滤光片21后被第二探测器22读取。
分束片18可选工作范围为400-700nm,第一窄带滤光片19选用600/14nm,即中心波长600nm,593-607nm范围内光学透过率大于80%,以读取588-608nm 范围内的C-D拉曼散射信号和该区域拉曼背景信号;第二窄带滤光片21选用591/6 nm,即中心波长591nm,588-595nm范围内光学透过率大于80%,以读取586- 596nm范围内的拉曼背景信号。
固定波长的拉曼散射快速采集和成像设备的应用,包括以下步骤:实验过程中,激发光经激光器1发出,经过激光窄带滤光片2滤除杂线,再经激光功率衰减片3 调节强度后,由反射镜组将激光以优化后的入射角度投射至拉曼滤光片6;激光经拉曼滤光片6反射后由物镜7聚焦至载玻片8上的样品上;自动平移台9可以根据软件设定自动移动样品位置,以达到扫描成像目的;由样品散射的拉曼散射信号和瑞利散射信号被物镜7收集后返回拉曼滤光片6,在此瑞利散射信号被阻挡而拉曼散射信号透过拉曼滤光片6;拉曼散射信号再经过共聚焦针孔10和狭缝11投射到分束片18上,在此90%的拉曼信号将过分束片再经第一窄带滤光片19,透射范围在C-D拉曼波长区域,后被第一探测器20读取,10%的拉曼信号将过分束片再经第二窄带滤光片21,透射范围在C-D波长区域之前的拉曼背景信号区域,而C-D 拉曼波长区域透过率为0,后被第二探测器22读取;第一探测器20读取C-D拉曼信号以及拉曼背景信号,第二探测器22读取的仅拉曼背景信号,最后通过算法,扣除第一探测器20读取的背景信号,以得到纯净的C-D拉曼信号。
吸收了氘的大肠杆菌的单细胞拉曼光谱采集:
从平板上挑取E.coli(保藏编号为ATCC25922,购于ATCC)单克隆,接种到5ml LB液体培养基中,置于恒温培养箱(37℃,150rpm)过夜培养。以1:1000比例将过夜培养的细菌转接到5ml含有浓度范围为0%到50%的不同浓度的D2O的 LB液体培养基中,恒温培养箱(37℃,150rpm)中孵育4h。各取1ml菌液,5000rpm 离心2min去掉上清,加入1ml无菌水,移液抢吹打3~5次,5000rpm离心2min 去掉上清,重复上述加水洗涤步骤1次。最后加1ml无菌水,移液枪吹打混匀菌液即可进行点样检测。点样时,取1μl样品至氟化钙载玻片上,室温自然风干。
将点好样的载玻片拿到实施例1所述的仪器进行检测,在100倍物镜下找到E.coli单细胞并聚焦清楚,进行单细胞拉曼光谱采集。测试条件为532nm激光(功率100mW),光栅:300gr/mm,采集时间:20s。得到如图4所示的单细胞拉曼光谱。
实施例4
基于实施例3病原微生物药敏的快速检测仪器,也可以称之为固定波长的拉曼散射快速采集和成像设备,进行病原微生物药敏的快速检测方法。具体为:
A、对样品进行前处理,前处理方法为:将样品与不同种类和浓度的抗生素混合,构成混合体系,在至少两个混合体系中,只有样品、培养基,没有抗生素,分别记为体系 P和体系N,向除体系N以外的混合体系中加入氘水,向体系N中加入等体积不含氘的水;
B、测量体系N的样品的拉曼信号,计算出两个探测器读数之间的函数关系: y=ax+b,其中y为第二探测器的读数,x为第一探测器的读数,通过足够多的测量值,找到拟合出最逼近真值的a,b参数;
C、测量其他每个体系的样品的拉曼信号,第二探测器读数为y’,第一探测器读数为x’,则所要求的去除背景的目标信号值为:y=y’-(ax’+b);
D、当每个体系计算出的y明显低于体系P的y而接近体系N的y时,认为该抗生素在该浓度作用下有效的抑制样品中的微生物,微生物对该浓度的抗生素敏感,反之认为该微生物对该浓度的该抗生素耐药。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用实用新型。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本实用新型不限于上述实施例,本领域技术人员根据本实用新型的揭示,不脱离本实用新型范畴所做出的改进和修改都应该在本实用新型的保护范围之内。
Claims (18)
1.病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,包括:
白光成像单元:用于拍摄样品白光像,实现细胞自动识别和定位;
拉曼单元:用于采集病原微生物细胞拉曼信号;
当拍摄白光像识别细胞时,白光成像单元移入光路,拉曼单元移出光路,当测量拉曼信号时,白光成像单元移出光路,拉曼单元移入光路;
所述拉曼单元包括:
激光发射单元,所述激光发射单元包括激光器(1)、激光窄带滤光片(2),所述激光器(1)用于产生激光,所述激光窄带滤光片(2)用于滤除激光中的杂线;
拉曼散射信号过滤单元:用于使激光作用下样品产生的拉曼散射信号被波长过滤装置或设备选择性的过滤,
拉曼散射信号采集单元:用于接收通过拉曼散射信号过滤单元的拉曼散射信号,使用光子读取装置或设备作为探测器;
拉曼散射信号过滤单元所用的波长过滤装置或设备包括一个或多个滤光片。
2.根据权利要求1所述病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,还包括用于放置样品的载玻片(8),以及用于移动载玻片(8)的自动平移台(9)。
3.根据权利要求1或2所述病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,还包括白光成像单元与拉曼单元共用的物镜(7)。
4.根据权利要求3所述病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,所述白光成像单元包括白光灯(14)、半透半反镜片组及照相机(17),
所述白光灯(14)用于发出光,
所述半透半反镜片组用于将光反射后,经物镜(7)聚焦至样品上,并将样品散射光经物镜(7)收集后反射出,
所述相机(17)用于接收半透半反镜片组反射的光,记录图像。
5.根据权利要求4所述病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,所述拉曼单元还包括:
光栅(12):用于使激光作用下样品产生的拉曼信号按波长分布按不同角度衍射,
探测器(13):用于采集并记录光栅分光后的拉曼光谱。
6.根据权利要求1所述病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,拉曼散射信号采集单元的光子读取装置或设备的探测器为一个或多个光子计数器或光电倍增管。
7.根据权利要求1所述病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,所述拉曼散射信号过滤单元包括分束片(18)、第一窄带滤光片(19)、第二窄带滤光片(21),
所述分束片(18)用于使一部分拉曼信号穿透分束片(18)后,经第一窄带滤光片(19)过滤;剩余的拉曼信号被分束片(18)反射后,经第二窄带滤光片(21)后过滤。
8.根据权利要求7所述病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,经第一窄带滤光片(19)后过滤的拉曼散射信号被第一探测器(20)读取,经第二窄带滤光片(21)后过滤的拉曼散射信号被第二探测器(22)读取。
9.根据权利要求7所述病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,所述分束片(18)为a:b分束片,a和b分别为光线透射过分束片和被分束片反射后的光强,a:b的比值大于0,小于1。
10.根据权利要求9所述病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,所述分束片(18)工作范围至少覆盖比激光器(1)激发波长更长的任意100cm-1波数的连续波长范围区间,并且其工作范围至少覆盖激光器(1)激发波长红移2000cm-1到2300cm-1波数范围的波长。
11.根据权利要求7所述的病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,所述分束片(18)为二向色镜。
12.根据权利要求11所述的病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,所述分束片(18)截止波长在607nm-620nm之间。
13.根据权利要求7所述病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,所述第一窄带滤光片(19)选用在激光器(1)激发波长红移方向2040cm-1到2300cm-1波数范围内的光学透过率大于80%的滤光片。
14.根据权利要求7所述病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,所述第二窄带滤光片(21)选用在激光器(1)激发波长红移方向1800cm-1-2040cm-1或2260cm-1到2900cm-1波数范围内中任意连续的30cm-1或30cm-1以上的波数范围内的光学透过率大于80%的滤光片。
15.根据权利要求1或5所述病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,所述激光器(1)为488nm激光器、514nm激光器、532nm激光器、633nm激光器或785nm激光器中的一种;
所述激光发射单元还包括激光功率衰减片(3),用于对激光强度进行不同程度的衰减,以调节激光强度;
所述拉曼单元还包括拉曼滤光片(6),所述拉曼滤光片(6)用于将反射镜组发射过来的激光反射后由物镜(7)聚焦至样品上,当测量拉曼信号时,所述物镜(7)用于收集样品散射的拉曼散射信号和瑞利散射信号,并使拉曼散射信号和瑞利散射信号返回拉曼滤光片(6),所述拉曼滤光片(6)还用于阻挡样品散射的瑞利散射信号,透过样品散射的拉曼散射信号。
16.根据权利要求1或5所述病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,所述拉曼单元还包括共聚焦针孔(10)、狭缝(11),
所述共聚焦针孔(10)与狭缝(11)设置在拉曼滤光片(6)后方,用于使激光穿过后投射到光栅(12)上,
所述共聚焦针孔(10)用于在共焦模式下阻挡杂散信号,非共焦模式下提升样品信号强度。
17.根据权利要求1所述病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,还包括数据处理设备,
所述数据处理设备用于对白光成像单元拍摄的样品白光像进行分析,实现细胞自动识别和定位;并且用于对拉曼单元所获拉曼光谱进行分析、对比与判断,检测病原微生物。
18.根据权利要求17所述病原微生物药敏的快速检测仪器,其特征在于,所述数据处理设备为计算机,所述计算机与照相机(17)、自动平移台(9)、探测器(13)连接,或,
所述计算机与照相机(17)、自动平移台(9)、第一探测器(20)、第二探测器(22)。
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WO2023231289A1 (zh) * | 2022-05-26 | 2023-12-07 | 苏州国科医工科技发展(集团)有限公司 | 快速药敏检测方法 |
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