CN114486743A - 一种自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器及检测方法，装置包括，包括电动位移平台、成像模块、激发光模块、显微聚焦模块、拉曼主光路及传输模块、同轴照明模块、和自动采集控制模块；电动位移平台，用于放置样品芯片；激发光模块，用于发射激光；显微聚焦模块，用于将激光自动聚焦到最佳采集位置处的待测菌斑，使待测菌斑产生拉曼信号；同轴照明模块，用于为显微聚焦模块提供同轴照明光；拉曼主光路及传输模块，用于获取待测菌斑的拉曼光谱；自动采集控制模块，用于对激发光模块、拉曼主光路及传输模块、显微聚焦模块、同轴照明模块、成像模块和电动位移平台进行控制，并对采集待测菌斑的拉曼光谱进行处理，实现待测菌斑自动化检测及快速耐药性鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，尤其涉及一种自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器及检测方法。
背景技术
临床上传统的致病菌耐药性的检测主要是通过培养法，该方法存在检测时间长、对实验操作人员专业要求高，而且容易出现假阳性等缺点。对于遏制耐药性的蔓延不仅需要研发新型的抗生素，还需要研发耐药性快检检测仪器和方法，以提高现有抗生素使用的针对性和有效性，从而推迟与遏制耐药性的传播。
目前，最有前景的方向之一是“单细胞”耐药检测技术，即跳过细胞培养增殖，直接针对样品中原有单细胞的“生长”或“代谢”表型进行单细胞精度的表征，从原理上实现快速、基于表型、适用范围广的目标。
拉曼光谱是一种高效的信息识别技术，通过特定入射光线对化合物的非弹性散射谱线分析，可以直接检测化合物分子振动或转动能级。通过对拉曼特征谱线的分析，可以获得化合物分子构成和结构的信息。现有采用拉曼技术的检测仪器只能对单细胞样品检测，适用于慢生长、难培养的微生物，无法快速定位样品位置，检测速度慢、效率低，无法对菌斑进行检测。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器及检测方法，能够对微生物细胞的菌斑进行检测，快速定位菌斑位置，实现微生物样品的自动化快速检测。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器，包括电动位移平台、成像模块、激发光模块、显微聚焦模块、拉曼主光路及传输模块、同轴照明模块和自动采集控制模块；
所述电动位移平台，用于放置样品芯片；
所述成像模块，用于拍摄样品芯片的全景信息及菌斑的显微信息，且配合所述电动平移平台快速定位所述样品芯片上的待测菌斑，确定待测菌斑的采集位置；
所述激发光模块，用于发射激光；
所述显微聚焦模块，用于将激光自动聚焦到采集位置处的待测菌斑，使待测菌斑产生拉曼信号；
所述同轴照明模块，用于为所述显微聚焦模块提供同轴照明光；
所述拉曼主光路及传输模块，用于获取所述待测菌斑的拉曼光谱；
所述自动采集控制模块，用于对所述激发光模块、所述拉曼主光路及传输模块、所述显微聚焦模块、所述同轴照明模块、所述成像模块和所述电动位移平台进行控制，并对采集待测菌斑的拉曼光谱进行处理，实现待测菌斑自动化检测。
优选地，所述自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器包括图像观测模式和拉曼测量模式；
图像采集模式用于获取样品芯片的图像信息；
拉曼测量模式用于实现样品芯片待测菌斑拉曼信息的采集。
优选地，所述激发光模块包括激光器、电动快门、扩束镜和电动可调衰减器；所述拉曼主光路及传输模块包括宽带反射镜、二向色镜、第二透镜、针孔、显微物镜、光谱仪和探测器；
所述激光器发出的激光，依次经过所述电动快门、所述扩束镜、所述电动可调衰减器、反射镜、二向色镜和带宽反射镜反射至所述显微物镜聚焦在所述电动位移平台上的样品芯片；
样品芯片经激发产生的拉曼信号光依次经过所述显微物镜、宽带反射镜、二向色镜、第二透镜、针孔和所述光谱仪发射到探测器。
优选地，宽带反射镜的带宽范围为激光器激发波长加上100nm～200nm。
优选地，所述同轴照明模块包括LED光源和半透半反镜，所述成像模块包括CCD相机和第一透镜；
所述LED光源出射的白光依次经过所述半透半反镜、显微物镜聚焦到样品芯片；所述LED光源照射到样品芯片上形成的反射光通过所述显微物镜、半透半反镜、第一透镜进入所述CCD相机，形成样品芯片的图像。
优选地，所述激发光模块、所述拉曼主光路及传输模块、所述同轴照明模块和所述成像模块固定在同一光学箱体内部，所述光学箱体为全封闭结构，所述拉曼主光路及传输模块与所述显微聚焦模块位于同一平面。
优选地，该检测仪器还包括灭菌模块，用于消除环境中的微生物，防止交叉污染。
一种自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器的检测方法，包括如下步骤：
成像模块拍摄整个样品芯片的图像，获得各待测菌斑的位置信息；
移动电动位移平台到第一个待测菌斑,确定待测菌斑的最佳采集位置；
激发模块发射激光通过显微聚焦模块将激光自动聚焦到待测菌斑，使得待测菌斑产生拉曼信号；
拉曼主光路及传输模块获取菌斑的拉曼光谱，并通过自动采集控制模块完成菌斑检测；
移到电动位移平台下一个待测菌斑重复上述过程，对每个待测菌斑的拉曼光谱数据进行处理，完成耐药性检测。
优选地，确定待测菌斑的最佳采集位置，包括：
采集菌斑图像；
将该图像处理转换为灰度图并进行滤波处理；
对图像像素点进行判定，若高于设定的阈值，则所述图像像素点为亮斑点；若低于设定的阈值，则在其周边位置查找出菌斑是否存在；
定位亮斑点密集区域为该菌斑位置。
优选地，自动聚焦过程包括：
利用爬山搜索算法选取第一个待测菌斑的多个位置点；
对所述多个位置点用清晰度评价函数值作为该多个位置点所在局部曲线进行拟合；
判断该曲线内是否含有大于所设定阈值的坡峰，若含有该坡峰，则返回该段位置点中最靠近最大值点的前一点，以此点为起点，以最大值点的后一点为终点，重新划分搜索范围并缩小搜索步长；重复进行搜索，最终达到所需聚焦精度，若不含有该坡峰，则继续沿原始方向移动，重复上述聚焦操作，最终确认最优的焦面。
本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明提供的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器及检测方法，通过显微聚焦模块、拉曼主光路及传输模块、同轴照明模块、成像模块、电动位移平台和自动采集控制模块的相互配合，能够对微生物细胞的菌斑进行检测，降低了定焦难度，降低了对探测器的要求，能够快速定位菌斑位置，同时减少了检测时间、降低了检测成本，实现自动化的微生物样品的快速检测，其灵敏度高、稳定性高。2、本发明提供的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器及检测方法，通过采用拉曼技术对临床病原菌微生物菌斑进行自动化检测，一体化、全封闭式结构，大大提升检测速度，解放人力，能够快速实现病原菌每样品每种耐药性检测。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的检测仪器的光路示意图；
图2为本发明一实施例提供的检测仪器的光学箱体结构示意图；
图3为本发明一实施例提供的检测仪器的内部结构示意图；
图4为本发明实施例2的检测方法工作流程图；
图5为本发明一实施例的自动聚焦方案示意图；
图6为本发明一实施例的重水标记微生物菌版拉曼光谱图。
图中各附图标记：
1为激光器，2为电动快门，3为扩束镜，4为电动可调衰减器，5为反射镜，6为二向色镜，7为带一维电动位移台的宽带反射镜，8为显微物镜，9为电动位移平台，10为LED光源，11为半透半反镜，12为第一透镜，13为面阵CCD，14为第二透镜，15为针孔，16为光谱仪，17为探测器，18为成像CCD；19为紫外灯，20为光学箱体；21为支撑架；22为样品芯片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的系统或组件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“装配”、“设置”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个组件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明提供的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器及检测方法，能够通过采用拉曼技术对临床病原菌微生物菌斑进行自动化检测，快速实现病原菌的耐药性检测，提升检测速度，解放人力，提高检测精度和稳定性。
下面，结合附图对本发明实施例提供的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器及检测方法进行详细的说明。
实施例1
如图1所示，本实施例提供的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器，包括电动位移平台、成像模块、激发光模块、显微聚焦模块、拉曼主光路及传输模块、同轴照明模块、和自动采集控制模块；
电动位移平台，用于放置样品芯片，配合成像模块实现样品的自动聚焦，快速定菌斑位置；
成像模块，用于拍摄样品芯片的全景信息，获得各菌斑的位置信息，形成每个菌斑与预设菌斑对比所得的位置矫正信息；同时用于拍摄菌斑的显微图像，且配合电动平移平台快速定位样品芯片上的待测菌斑，确定待测菌斑的采集位置；
激发光模块，用于发射激光；
显微聚焦模块，用于将激光自动聚焦到采集位置处的待测菌斑，使待测菌斑产生拉曼信号，同时此聚焦模块也是白光成像的聚焦部件；
拉曼主光路及传输模块，用于获取菌斑的拉曼光谱，并向自动采集控制模块传输菌斑的拉曼光谱信息；
同轴照明模块，用于为显微聚焦模块提供同轴照明光；拉曼主光路及传输模块，用于获取待测菌斑的拉曼光谱；
自动采集控制模块，用于对激发光模块、拉曼主光路及传输模块、显微聚焦模块、同轴照明模块、成像模块和电动位移平台进行控制，并对采集待测菌斑的拉曼光谱进行处理，实现待测菌斑自动化检测。
其中，检测仪器还包括灭菌模块，用于消除环境中的微生物，防止交叉污染；
电动位移平台为三维移动平台，可以实现在XYZ三个方向上自动移动。
激发光模块包括激光器1、电动快门2、扩束镜3和电动可调衰减器4。
扩束镜3的扩束比例为3:1或4:1或5:1。
电动可调衰减器4具有至少两个不同的衰减率，电动可调衰减器4可以通过软件调整衰减效果。
本实施例提供的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器，可以包括两种工作模式，即图像观测模式和拉曼测量模式，图像采集模式可以获取样品的图像信息，拉曼测量模式主要实现样品拉曼信息的采集。可以通过带一维电动位移台的宽带反射镜7共光路切换该两种工作模式，从而全部收集拉曼信号，实现最优的拉曼信号收集，二者可以快速切换，从而保证最快的获取样品的拉曼信号，减少细菌耐药性鉴定的时间。
宽带反射镜7安装在一维电动位移台上，并放置于拉曼主光路及传输模块与成像模块的光路交汇处。
显微聚焦模块包括显微物镜8，显微物镜8为四倍、十倍、五十倍或一百倍复/半复消色差物镜。
拉曼主光路及传输模块包括宽带反射镜7、二向色镜6、第二透镜14，针孔15、光谱仪16和探测器17。
反射镜5的带宽范围为激光器1激发波长加上100nm～200nm。
二向色镜6为高通低反镜，二向色镜6的反射率和透射率均高于90％。
针孔15用于在共焦情况下阻挡杂散光的信号。
光谱仪16用于获得拉曼散射光的分光。
探测器17为线阵或者面阵CCD，用于获得拉曼散射光的信号。
同轴照明模块包括LED光源10和半透半反镜11。
灭菌模块包括紫外灯19，紫外灯19放置于显微物镜周围。
成像模块可以包括两部分，一是观测用相机，观测用相机可以为成像CCD18，成像CCD18可以实现整个样品芯片的宽场成像；二是由面阵CCD13、第二透镜12和显微物镜8组成的显微成像，用于获得菌斑的显微图像。
如图1所示，本实施例提供的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器，二向色镜6的透射光方向上依次设置第二透镜14、针孔15、光谱仪16和探测器17；带宽反射镜7的透射光方向上设置半透半反镜11，半透半反镜11的透射光方向上依次设置第一透镜12和面阵CCD13，半透半反镜11的反射光方向上设置LED光源10。
激光器1发出的激光，依次经过电动快门2、扩束镜3和电动可调衰减器4后，依次经反射镜5、二向色镜6和带一维电动位移台的宽带反射镜7反射进入显微物镜8，最后聚焦在放置于电动位移平台9上样品芯片22，产生细菌的拉曼信号；细菌产生的拉曼信号依次经过显微物镜8、带一维电动位移台的宽带反射镜7、二向色镜6、第二透镜14、针孔15、光谱仪16发射到探测器17，最终形成拉曼光谱数据；LED光源10出射的白光依次经过半透半反镜11、显微物镜8最终聚焦到样品芯片22；白光照射样品产生的反射光依次通过显微物镜8、半透半反镜11和第一透镜12，最终进入面阵CCD13相机，形成样品的图像。
其中，激光器1可以为532nm激光器、633nm激光器、785nm或1064nm激光器中的一种，检测时对细胞损害小。电动快门2可以快速实现光路中激光的通断，从而避免由于激光器断电或者调电流的方式时激光的通断，影响激光输出的稳定性。扩束镜3可以对激光光束进行扩束从而达到更好的聚焦效果。电动可调衰减器4可以对激光强度进行不同程度的衰减，以便通过软件快速调整激光能量，获得更好的信号。光谱仪16将样品拉曼信号进行分光，从而根据波长由低到高进入探测器17。探测器17可以选择线阵CCD或面阵CCD或EMCCD探测器，用以记录光谱仪分光后的拉曼光谱信息。
当测量拉曼信号时，激光器1发射激光，经电动可调衰减器4调节强度后，由反射镜5将激光投射至二向色镜6；激光经二向色镜6反射后由带一维电动位移台的宽带反射镜7反射至物镜聚焦至样品上；电动位移平台9可配LED白光光源对细胞样品菌斑进行聚焦成像，自动选取最优的采集区域精准聚焦后采集拉曼光谱信号；由细胞菌斑散射的拉曼后向散射信号被显微物镜收集后经反射镜返回二向色镜6，此时拉曼信号可以透过二向色镜6，而其他非所需的杂散光包括瑞利信号被阻挡；拉曼信号经针孔15及光谱仪16分光后被探测器17所收集，最终形成拉曼光谱。
如图2和图3所示，激发光模块、拉曼主光路及传输模块、同轴照明模块和成像模块固定在同一光学箱体20内部。
光学箱体20包括支撑架支撑21，支撑架可以包括左、右、后三组，使得光学箱体20具有预设高度。
显微聚焦模块位于光学箱体20下部；拉曼主光路及传输模块位于光学箱体20一侧，例如右侧，且拉曼主光路及传输模块与显微聚焦模块位于同一平面，使光路更稳定，调节更方便。
光学箱体20为一体化铸造成型，且为全封闭结构。
本实施例中，样品芯片22，用于放置样品，其平整度要求较高，可以采用石英玻片、氟化钙玻片或金属等，其可以承载样品而且本身在2200-3000cm-1区域无干扰的拉曼峰。
本实施例中，自动采集控制模块包括数据分析处理设备，数据分析处理设备可以为计算机，计算机与激光器1，电动快门2，电动可调衰减器4，带一维电动位移台的宽带反射镜7，电动位移平台9，LED光源10，面阵CCD13，针孔15，光谱仪16，探测器17，成像CCD18控制连接。
本实施例中，自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器主要用于尿液、胃液、血液、脑脊液等病原微生物耐药性的快速检测。
自动采集控制模块主要对激光器1、光谱仪16、探测器17，CCD18等关键器件进行控制，实现自动化的确定样品点、校正样品位置、自动聚焦和自动采谱。自动聚焦需要配合系统的成像模块以及电动位移平台9实现。电动位移平台9的Z轴同时拍摄样品的图像，通过Tenengrad梯度函数用作聚焦评价函数方法，评价函数方法既保留了传统灰度函数计算简单、处理速度快的优点，又存在单峰性好、峰形尖锐突出等优点。基于评价函数方法，通过开发搜索算法实现自动化寻找最优焦平面。搜索算法具体是将曲线拟合法的思想嵌入到传统爬山搜索算法的局部搜索中，改进了聚焦搜索策略，具体是在爬山搜索过程中选取多个位置点的清晰度评价函数值作为一段局部曲线进行“拟合”，判断该曲线内是否含有大于所设定阈值的坡峰，若存在，则说明在该段位置点范围内必包含有最佳对焦位置(单峰)，此时返回该段位置点中最靠近最佳对焦位置点(最大值点)的前一点，以此点为起点，以最佳对焦位置点的后一点为终点，将此范围重新划分并缩小步长重复进行搜索，最终达到所需聚焦精度，而若在曲线内不存在大于所设定阈值的坡峰，则继续沿原始方向移动，重复上述聚焦操作，最终确认最优的焦面。
获取最优焦面后，由于在显微状态下菌斑位置出现的随机性，为了能快速定位到样品点上，通过开发菌斑智能判别技术实现智能对菌斑和背景区域进行判定和定位。采集的图像先经过图像处理转换为灰度图并进行高斯滤波处理，以减少高频噪声。然后对图像像素点进行判定，若高于设定的阈值，则认为该处为亮斑点。最终定位时，优先定位亮斑点密集区域。
定位到菌斑位置后，在自动化光谱采集过程中，通过实时光谱数据分析，如图5所示，焦面从离焦、近焦、对焦、近焦和远焦的变化图，通过智能调整采集参数，如激光功率、曝光时间、采集位置等参数，从而获得最优光谱数据。
实施例2
如图4所示，实施例1中提供的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器的检测方法，包括以下步骤：
S01，成像模块拍摄整个样品芯片的图像，获得各待测菌斑的位置信息；
具体地，对样品进行制作：
将取到的单克隆样品与培养基混合，建立对照组，分别加入不同浓度和种类的抗生素及清水；另外建立实验组，在培养基中分别加入不同浓度和种类的抗生素及与对照组同清水体积相同的重水D2O。对照组和实验组孵育相同的时间。将对照组和实验组的菌液预处理及制作检测芯片，将检测芯片放到电动位移平台，开始拍摄样品芯片全景图像。使用成像CCD18拍摄菌斑的全景图片，获得芯片上待测菌斑的位置信息，通过成像判定菌斑的位置信息，形成每个菌斑与设计菌斑的位置矫正信息；
S02，移动电动位移平台到第一个待测菌斑,确定待测菌斑的最佳采集位置；
具体的，通过菌斑的矫正位置信息识别菌斑位置，自动采集控制模块控制电动位移平台自动移动到第一个待测菌斑的坐标点，确定该菌斑的最佳采集位置；
具体地，采用50倍物镜采集菌斑的显微图像；将该图像处理转换为灰度图并进行滤波处理；对图像像素点进行判定，若高于设定的阈值，则认为该处为亮斑点；若低于设定的阈值，则在其周边位置查找出菌斑是否存在；定位亮斑点密集区域为该菌斑位置；
具体地，利用爬山搜索算法选取第一个待测菌斑的多个位置点；对多个位置点用清晰度评价函数值作为该多个位置点所在局部曲线进行拟合；判断该曲线内是否含有大于所设定阈值的坡峰，若含有该坡峰，则返回该段位置点中最靠近最大值点的前一点，以此点为起点，以最大值点的后一点为终点，重新划分搜索范围并缩小搜索步长；重复进行搜索，最终达到所需聚焦精度，若不含有该坡峰，则继续沿原始方向移动，重复上述聚焦操作，最终确认最优的焦面；
S03，激发模块发射激光通过显微聚焦模块将激光自动聚焦到待测菌斑，使得待测菌斑产生拉曼信号；
具体地，在定位亮斑点密集区域为该菌斑位置中所确定的该菌斑位置处，自动定焦样品，
S04，拉曼主光路及传输模块获取菌斑的拉曼光谱，并通过自动采集控制模块完成菌斑检测；
具体地，利用拉曼主光路及传输模块采集菌斑的拉曼光谱，实时光谱数据分析，判断是否获得满足分析需求的光谱数据；是，则自动智能调整采集参数，获得最优光谱数据；采集参数包括激光功率、曝光时间、采集位置中的一个或多个；采集的拉曼光谱数量为5-40个；否，则根据步骤通过成像CCD18拍摄的芯片全景图，获得各待测菌斑的位置信息，形成每个菌斑与设计菌斑的位置矫正信息中，所确定的位置信息，自动移到下一个菌斑，重复步骤确定该菌斑的最佳采集位置至步骤自动采集拉曼光谱；
S05，移到电动位移平台下一个菌斑重复上述过程，对每个待测菌斑的拉曼光谱数据进行处理，完成耐药性检测。
具体地，自动采集控制模块控制电动位移平台下一个菌斑，重复上述过程，完成对每个待测菌斑的拉曼光谱数据的采集和处理，自动采集控制模块对每个待测菌斑的最优光谱数据是在光谱数据获得后再通过自动计算C-D/(C-D+C-H)的比值来确定样品是否耐药，自动数据处理，自动生产检测报告。如图6所示，计算拉曼光谱中以2180cm-1为中心的，宽度以2180cm-1向左右各至少移动85cm-1个波数范围内的拉曼光谱下的面积，作为碳-氘峰面积(C-D)，计算以2940cm-1为中心的，宽度以2940cm-1为中心向左右各至少移动85cm-1个波数范围内的拉曼光谱下的面积作为碳-氢峰面积(C-H)，临床微生物的耐药指标通过氘代的程度来反映：D％＝(C-D)/(C-D+C-H)。
上述实施例中的检测方法可用于痰液中临床结核分枝杆菌耐药性的快速检测。
具体地，结核分枝杆菌耐药性在50倍物镜下进行拉曼测量，检测参数为：曝光时间1s，激光波长532nm,能量80mW，光谱范围500～3500cm-1。每个样品在不同视野内随机测量收集细菌细胞菌斑大约30个不同位置的拉曼图谱。
数据处理时，采集到的拉曼光谱经去背景、基准线归一化和最大值标准化处理后。分析C-D峰面积(拉曼图谱中2050-2300cm-1区域)和C-H面积(拉曼图谱中2800-3050cm-1)，计算不同药物浓度下的C-D ratio，将孵育24h添加异烟肼/利福平组的C-D ratio减去未添加异烟肼/利福平组的C-D ratio，从而计算得到ΔC-D ratio。
结果显示，利福平和异烟肼对敏感株和临床分离株的ΔC-D ratio值的影响不同，在利福平耐药性试验中，孵育24h后，药物浓度为16mg/L时，敏感株L0和分离株L2的ΔC-Dratio具有显著差异(P<0.05)；在异烟肼耐药性试验中，当药物浓度为4mg/L时，敏感株L0和分离株L4的ΔC-D ratio具有显著差异(P<0.05)，定义ΔC-D ratio大于临界值-0.02时，为耐药株。
上述实施例中，结核分枝杆菌样品的制作方法，包括：
第一步，材料制备：
7H9培养基制备：取4.7g 7H9粉末、90mL OADC，于900mL ddH2O中，充分溶解，于121℃，灭菌15min；
菌悬液制备：将经7H9培养基复苏的结核分枝杆菌敏感株(L0)和临床分离株(利福平耐药株L2、异烟肼耐药株L4)离心，并用滴管吸取管底菌落于注射用水中，用细菌超声分散计数仪调至麦氏比浊为1。
第二步，建立敏感株及耐药株药物孵育体系：
将麦氏比浊为1的菌悬液分装为2mL/份，3000g，离心20min，弃上清，将沉淀分别转移至含7H9培养基、重水、ddH2O以及药物的孵育体系中，体系中重水含量为50％(体积比)，药物的终浓度为：异烟肼0mg/L、4mg/L、16mg/L、64mg/L，利福平0mg/L、16mg/L、64mg/L、256mg/L，建立异烟肼/利福平的耐药性孵育体系，每个体系3个重复。至37℃恒温培养箱中进行孵育，24h后取样，进行拉曼检测。
第三步，待测样品处理，包括：
灭活；
具体地，灭活方法，取1.0mL孵育体系于1.5mL离心管中，10000rpm离心2min，弃上清，用配制的冻存液重悬后，于金属浴上，80℃、30min金属浴灭活。若待测样品不能即时检测，则灭活后的样品于-80℃中保存。
制片；
具体地，灭活后的待测样品，10000rpm离心2min，弃上清，用500μL ddH2O重悬，10000rpm离心2min，去上清，重复洗涤2-3次，最后用ddH2O重悬至终浓度达到106CFU/mL。取10μL重悬液转移到检测基片CaF2玻片上，每个样品进行三个平行点样，于生物安全柜中自然风干，待测。
上述实施例中的检测方法，通过采用拉曼技术对临床病原菌微生物菌斑进行自动化检测，能够在0.5-1分钟内快速实现病原菌每样品每种耐药性检测。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器，其特征在于，包括电动位移平台、成像模块、激发光模块、显微聚焦模块、拉曼主光路及传输模块、同轴照明模块和自动采集控制模块；
所述电动位移平台，用于放置样品芯片；
所述成像模块，用于拍摄样品芯片的全景信息及菌斑的显微信息，且配合所述电动平移平台快速定位所述样品芯片上的待测菌斑，确定待测菌斑的采集位置；
所述激发光模块，用于发射激光；
所述显微聚焦模块，用于将激光自动聚焦到采集位置处的待测菌斑，使待测菌斑产生拉曼信号；
所述同轴照明模块，用于为所述显微聚焦模块提供同轴照明光；
所述拉曼主光路及传输模块，用于获取所述待测菌斑的拉曼光谱；
所述自动采集控制模块，用于对所述激发光模块、所述拉曼主光路及传输模块、所述显微聚焦模块、所述同轴照明模块、所述成像模块和所述电动位移平台进行控制，并对采集待测菌斑的拉曼光谱进行处理，实现待测菌斑自动化检测。
2.如权利要求1所述的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器，其特征在于，所述自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器包括图像观测模式和拉曼测量模式；
图像采集模式用于获取样品芯片的图像信息；
拉曼测量模式用于实现样品芯片待测菌斑拉曼信息的采集。
3.如权利要求1所述的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器，其特征在于，所述激发光模块包括激光器、电动快门、扩束镜和电动可调衰减器；所述拉曼主光路及传输模块包括宽带反射镜、二向色镜、第二透镜，针孔、显微物镜、光谱仪和探测器；
所述激光器发出的激光，依次经过所述电动快门、所述扩束镜、所述电动可调衰减器、反射镜、二向色镜和带宽反射镜反射至所述显微物镜聚焦在所述电动位移平台上的样品芯片；
样品芯片经激发产生的拉曼信号光依次经过所述显微物镜、宽带反射镜、二向色镜、第二透镜、针孔和所述光谱仪发射到探测器。
4.如权利要求3所述的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器，其特征在于，宽带反射镜的带宽范围为激光器激发波长加上100nm～200nm。
5.如权利要求3或4所述的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器，其特征在于，所述同轴照明模块包括LED光源和半透半反镜，所述成像模块包括CCD相机和第一透镜；
所述LED光源出射的白光依次经过所述半透半反镜、显微物镜聚焦到样品芯片；所述LED光源照射到样品芯片上形成的反射光通过所述显微物镜、半透半反镜、第一透镜进入所述CCD相机，形成样品芯片的图像。
6.如权利要求1所述的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器，其特征在于，所述激发光模块、所述拉曼主光路及传输模块、所述同轴照明模块和所述成像模块固定在同一光学箱体内部，所述光学箱体为全封闭结构，所述拉曼主光路及传输模块与所述显微聚焦模块位于同一平面。
7.如权利要求1所述的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器，其特征在于，该检测仪器还包括灭菌模块，用于消除环境中的微生物，防止交叉污染。
8.基于权利要求1-7任一所述的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
成像模块拍摄整个样品芯片的图像，获得各待测菌斑的位置信息；
移动电动位移平台到第一个待测菌斑,确定待测菌斑的最佳采集位置；
激发模块发射激光通过显微聚焦模块将激光自动聚焦到待测菌斑，使得待测菌斑产生拉曼信号；
拉曼主光路及传输模块获取菌斑的拉曼光谱，并通过自动采集控制模块完成菌斑检测；
移到电动位移平台下一个待测菌斑重复上述过程，对每个待测菌斑的拉曼光谱数据进行处理，完成耐药性检测。
9.如权利要求8所述的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器的检测方法，其特征在于，确定待测菌斑的最佳采集位置，包括：
采集菌斑图像；
将该图像处理转换为灰度图并进行滤波处理；
对图像像素点进行判定，若高于设定的阈值，则所述图像像素点为亮斑点；若低于设定的阈值，则在其周边位置查找出菌斑是否存在；
定位亮斑点密集区域为该菌斑位置。
10.如权利要求8所述的自动化微生物拉曼耐药性快速检测仪器的检测方法，其特征在于，自动聚焦过程包括：
利用爬山搜索算法选取第一个待测菌斑的多个位置点；
对所述多个位置点用清晰度评价函数值作为该多个位置点所在局部曲线进行拟合；
判断该曲线内是否含有大于所设定阈值的坡峰，若含有该坡峰，则返回该段位置点中最靠近最大值点的前一点，以此点为起点，以最大值点的后一点为终点，重新划分搜索范围并缩小搜索步长；重复进行搜索，最终达到所需聚焦精度，若不含有该坡峰，则继续沿原始方向移动，重复上述聚焦操作，最终确认最优的焦面。
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|---|---|---|---|---|
| CN117705775A (zh) * | 2024-02-05 | 2024-03-15 | 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 | 多色荧光显微成像系统、成像方法、自动聚焦方法 |
| CN118392845A (zh) * | 2024-06-25 | 2024-07-26 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种用于对空气浮游微生物进行监测鉴别的复合功能多孔金属膜及检测系统、以及空气浮游微生物监测鉴别方法 |
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