CN116287097A - 利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法及系统 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法及系统，该方法包括以下步骤：S1、制备培养基，所述培养基中包括培养基母液、标记物以及生长抑制剂；S2、利用步骤S1制备的培养基对待测样本进行培养；S3、对经步骤S2培养后的待测样本进行拉曼光谱采集，并根据拉曼特征峰识别病原活菌；S4、根据步骤s3的结果对病原活菌进行计数。本发明提供的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方案能够有效克服传统方案存在的尿路感染中病原活菌计数所需培养时间长、效率低和操作复杂等缺陷，以及常规拉曼光谱结合重水标记技术存在的准确性不够的缺陷，本发明能够实现尿路感染样本中病原活菌的快速计数，在短时间内为医生提出更可靠的计数结果。
Description
技术领域
本发明涉及病原菌检测技术领域，特别涉及一种利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法及系统。
背景技术
尿路感染是最常见的病原菌感染疾病之一，全世界范围内每年有1.5亿左右人口受其影响。根据统计，50％的女性人口和10％的男性人口在一生中至少患得一次尿路感染。用于病原微生物计数的分离富集培养法自1950年以来一直是临床尿路感染诊断的金标准：当尿液中病原菌含量超过105CFU/mL时，可以判断为尿路感染。这种方法可以有效地识别尿液样本中的病原活菌，进而确定致病病原菌。但是，这种传统的金标准依赖于长时间的隔夜培养与分纯，其从“样本”到“报告”的诊断时间往往长达18个小时，整体流程参照图7。较长的诊断时间延误了诊断的时机，临床中出现了较多的凭经验用药现象，进而造成了抗生素的滥用，乃至细菌耐药性问题的发展和蔓延。
确定尿液样本中具有代谢活性的病原菌种属信息是临床确定使用抗生素种类、防止抗生素滥用的先行条件。目前，除分离富集培养法以外，临床可以进行病原菌活菌计数的技术还有涂片镜检与(免疫)荧光成像技术。涂片镜检是细菌、真菌检查的最经典方法，其操作简单、快速，可根据高倍物镜下视野内的细菌个数来判断尿液样本中细菌的浓度。一般每高倍镜视野下细菌数量达到15-20个，则对应该段尿液在培养法下的菌落数大于105CFU/mL。但该方法诊断的敏感度和特异度因人而异，十分依赖于实验人员的操作手法与经验，因此在临床中并不被推荐使用。荧光成像计数方法指的是通过荧光活性染料与细菌表面抗体结合，将具有代谢活性的细菌标记上荧光分子，最后通过荧光显微镜直接统计细菌涂片的荧光信号数量。这种免培养的检测方法大大提升了活菌计数的灵敏度与特异度，缩短了检测时间。但由于自发荧光与荧光信号不稳定，容易发生荧光猝灭的现象，这种方法的稳定性与计数准确度仍具有较大的局限。
单细胞拉曼光谱技术指的是通过共聚焦拉曼光谱仪对微区内的单细胞样品进行拉曼光谱采集与分析的技术，可以获得该单细胞样品的自发拉曼光谱指纹信息，进而可以定性、定量地分析单细胞样品在不同实验条件下的分子成分变化。
传统的拉曼光谱结合重水标记的方法虽然可以较快地确定检测样本中的病原活菌数量，然而，由于细菌会在重水标记时进行生长，导致细菌数量上升，因此该方法无法还原原始尿液样本中的活菌数量。根据实验经验，我们在使用单细胞拉曼光谱技术检测病原微生物的代谢活性时，会使用重水(D2O)等含有稳定同位素的培养基对微生物进行培养，培养时间一般最少为2小时，代谢活性的细菌会在其光谱静默区出现较为明显的“碳—氘”波段信号(1970-2370cm-1)，参照图4。而根据细菌的生长曲线特性，一般培养的细菌在2小时内数量往往会产生数量级的改变。因此，在使用拉曼光谱仪判断细菌单细胞活性时，这样的数量变化往往会影响医生对样本中病原活菌原始浓度的判断，进而会影响对尿路感染程度的判断。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法及系统。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，包括以下步骤：
S1、制备培养基，所述培养基中包括培养基母液、标记物以及生长抑制剂；
所述标记物参与病原菌代谢并使病原活菌具有拉曼特征峰，从而根据该拉曼特征峰能够判断病原菌活性；所述生长抑制剂为对病原菌的生长具有抑制作用，且所述生长抑制剂不影响所述标记物参与病原菌代谢；
S2、利用步骤S1制备的培养基对待测样本进行培养；
S3、对经步骤S2培养后的待测样本进行拉曼光谱采集，并根据拉曼特征峰识别病原活菌；
S4、根据步骤s3的结果对病原活菌进行计数。
优选的是，所述生长抑制剂为醋酸钠、乳酸钠以及柠檬酸钠中的一种或多种。
优选的是，所述生长抑制剂为醋酸钠，且所述培养基中醋酸钠的浓度为64-1024mM。
优选的是，所述标记物为重水，其在所述培养基中的质量浓度为20-80％。
优选的是，重水参与病原菌代谢并使病原活菌具有碳—氘拉曼特征峰，位置为1970-2370cm-1。
优选的是，所述步骤S1中制备的培养基包括：灭菌后重水、灭菌后的醋酸钠、LB培养基母以及无菌水，其中，醋酸钠的浓度优选为128或256mM、重水的质量浓度为40％。
优选的是，所述步骤S2具体包括：将待测样本离心清洗，去除上清液后用无菌水重悬到待测样本的原始浓度，得到处理后的样本溶液，以样本溶液：培养基的体积比为K的比例，将样本溶液加入到培养基中，混合均匀后在37℃下培养2小时。
优选的是，所述步骤S3具体包括：
使用移液枪将体积为V1的经培养后得到的样本点样到镀铝载玻片表面，室温干燥后在共聚焦拉曼光谱仪下进行拉曼光谱采集，计算具有碳—氘拉曼特征峰的所有病原活菌的数量，记为n；
所述步骤S4中按照以下公式计算得到原待测样本中的病原活菌数量N：
其中，V0为步骤S2中所取的待测样本的体积。
优选的是，所述步骤S2中待测样本的体积V0＝1mL；样本溶液：培养基的体积比为K为1:10；
所述步骤S3具体包括：
使用移液枪将体积为0.2μL的经培养后得到的样本点样到镀铝载玻片表面，室温干燥后在共聚焦拉曼光谱仪下以7mW、1s的激光参数进行拉曼光谱采集，计算具有碳—氘拉曼特征峰的所有病原活菌的数量，记为n；
所述步骤S4中按照以下公式计算得到原待测样本中的病原活菌数量N：
优选的是，所述步骤S3具体包括：
使用移液枪将体积为V1的经培养后得到的样本点样到镀铝载玻片表面，室温干燥后在共聚焦拉曼光谱仪下进行拉曼光谱采集；
所述步骤S4中通过图像识别算法计算得到原待测样本中的病原活菌数量，具体方法为：
1)对点样区域的显微图像进行采集，并通过病原活菌的图像识别算法筛选到符合细菌形貌特征的显微图形，并对该显微图形进行病原活菌计数，从而获得点样体积内所有病原活菌数量，记为M；
2)计算点样区域的面积，记为A；
以显微图像中的点样区域视野中心为参考点，在该参考点上、下、左、右方向随机选择x个面积均为a的代表性区域使用图像识别算法识别代表性区域内的所有病原活菌，并计算得到平均病原活菌数量，记为M’；通过拉曼光谱对x个代表性区域内部的具有碳—氘拉曼特征峰的病原活菌进行识别，并统计数量，然后计算x个代表性区域中病原活菌的平均数量，记为m；
3)通过具有碳—氘拉曼特征峰的病原活菌数量占平均所有细菌数量的比值m/M’评估点样体积内活菌数量，再换算得到原待测样本中的病原活菌数量N，即：
其中，V0为步骤S2中所取的待测样本的体积。
优选的是，病原活菌的图像识别算法具体为：
对图像进行负相处理，再转成灰度图像；然后利用大津阈值法将图像转为二值图像，通过中值滤波对图像进行平滑处理；最后通过canny算子对区域进行轮廓提取，从而最终找到图像中所有的菌落位置，并对所有轮廓进行标注显示以及计数，从而得到图像中的病原活菌数量。
本发明还提供一种利用拉曼光谱的病原活菌快速计数系统，其采用如上所述的方法进行病原活菌的计数，该系统包括：
培养基，其包括灭菌后重水、灭菌后的醋酸钠、LB培养基母以及无菌水；
培养装置，其用于对待测样本进行培养；
拉曼光谱仪，其用于进行拉曼光谱采集。
本发明的有益效果是：
本发明提供的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法及系统能够有效克服传统方案存在的尿路感染中病原活菌计数所需培养时间长、效率低和操作复杂等缺陷，以及常规拉曼光谱结合重水标记技术存在的准确性不够的缺陷，本发明能够实现尿路感染样本中病原活菌的快速计数，在短时间内为医生提出更可靠的计数结果；
本发明首次提出利用醋酸钠等有机酸盐可以抑制细菌生长并不影响其单细胞的代谢活性这一特性，将其添加到培养基中来应用于病原活菌计数，能够有效提高计数结果的准确率。醋酸钠一般用于食品行业的抑菌，对于临床中的病原活菌计数这一需求尚未存在相关报道，且醋酸钠等有机酸盐对细胞的代谢活性作用、细菌在醋酸钠中能否继续保持单细胞的代谢活性等也未有相关的报道。本发明中，通过实验发现醋酸钠在短时间内对细菌的生长具有明显抑制作用，且不会影响细菌代谢重水中氘元素的能力，将其添加到培养基，并进一步结合拉曼光谱技术形成的病原活菌计数的方案，能够克服传统拉曼光谱结合重水标记进行计数的方案中存在的因病原菌在培养期间数量显著变化而导致影响对病原活菌原始浓度的判断这一缺陷，从而可以提高计数的准确性；
本发明在单细胞水平对细胞活性进行检测，可以从单个细胞水平反应单细胞样品的代谢水平，免过夜培养、无需分纯，周转时间一般在3小时以内；
本发明的检测结果可信度高，相比于荧光计数、涂片镜检等活性细菌计数方法或尿路感染诊断方法，本发明所阐述的方法具有更稳定指纹谱信号、更科学直观的计数方式，避免了荧光信号的不稳定以及镜检的敏感度、特异度不足的问题，结果更为可靠；
本发明适用范围广，对于不同的病原微生物样本，如真菌，在使用其他手段诊断尿路感染时，需要换用不同的荧光染料。因此，在使用荧光方法时，往往由于尿路感染病原菌种类未知而造成荧光染料的浪费。同时，如果为真菌引起的尿路感染，其金标准分纯培养所需的时间要更久，会极大程度地威胁病人的生命健康。而本发明的方法可以避免以上问题的产生，仅需延长额外的2小时的培养时间，便可以完成代谢活性真菌的识别与计数。
附图说明
图1为本发明的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法的流程示意图；
图2为不同浓度醋酸钠对两种细菌的生长抑制作用结果；
图3为256mM醋酸钠对细菌代谢重水影响的结果；
图4为单细胞细菌的“碳—氘”拉曼光谱波段；
图5为5×7单一视野图像合并后得到的所有视野中的病原菌计数图像；
图6为本发明的方法与金标准的计数结果对比；
图7为本发明的方法与临床现行金标准病原活菌计数流程的对比。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
下列实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下列实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供了一种利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，参照图1，包括以下步骤：
S1、制备培养基，培养基中包括培养基母液、标记物以及生长抑制剂。
标记物参与病原菌代谢并使病原活菌具有拉曼特征峰(1970-2370cm-1)，从而根据该拉曼特征峰能够判断病原菌活性；生长抑制剂为对病原菌的生长具有抑制作用，且生长抑制剂不影响标记物参与病原菌代谢。
在优选的实施例中，生长抑制剂为醋酸钠、乳酸钠以及柠檬酸钠中的一种或多种。进一步优选的，生长抑制剂为醋酸钠，且培养基中醋酸钠的浓度为64-1024mM。
醋酸钠、乳酸钠，以及柠檬酸钠等有机酸盐在短时间内对细菌的生长存在着较明显的抑制作用。在本发明中，通过实验表明，随着培养基中醋酸钠浓度的不断升高，革兰氏阳性菌和阴性菌的分裂生长在短时间内都会受到明显的抑制，参照图2，为不同浓度醋酸钠对两种细菌的生长抑制作用结果。且醋酸钠对细菌代谢重水中氘元素的能力无显著性影响，所以不会影响重水的标记，参照图3，为256mM醋酸钠对细菌代谢重水影响的结果。
醋酸钠一般用于食品行业的抑菌，对于临床中的病原活菌计数这一需求尚未存在相关报道，且醋酸钠等有机酸盐对细胞的代谢活性作用也未有相关的实验进行探索，细菌在醋酸钠中能否继续保持单细胞的代谢活性也未有相关报道。本发明中，通过大量实验发现醋酸钠在短时间内对细菌的生长具有明显抑制作用，且不会影响细菌代谢重水中氘元素的能力，将其添加到培养基，并进一步结合拉曼光谱技术实现病原活菌的计数，能够克服传统拉曼光谱结合重水标记进行计数的方案中因病原菌在培养期间数量显著变化而导致影响对病原活菌原始浓度的判断这一缺陷，从而可以提高计数的准确性。
在优选的实施例中，标记物为重水，其在培养基中的质量浓度为20-80％；进一步优选的，质量浓度为40％。含有稳定同位素的重水(D2O)对微生物进行培养时，代谢活性的病原活菌会在其拉曼光谱静默区出现较为明显的“碳—氘”波段信号(1970-2370cm-1，即碳氘拉曼特征峰)，参照图4，从而通过该拉曼特征峰能够判断病原菌的活性。
S2、利用步骤S1制备的培养基对待测样本进行培养：
将待测样本离心清洗，去除上清液后用无菌水重悬到待测样本的原始浓度，得到处理后的样本溶液，以样本溶液：培养基的体积比为K的比例，将样本溶液加入到培养基中，混合均匀后在37℃下培养2小时。
S3、对经步骤S2培养后的待测样本进行拉曼光谱采集，并根据拉曼特征峰识别病原活菌：
使用移液枪将体积为V1的经培养后得到的样本点样到镀铝载玻片表面，室温干燥后在共聚焦拉曼光谱仪下进行拉曼光谱采集，计算具有碳—氘拉曼特征峰的所有病原活菌的数量，记为n；
S4、根据步骤S3的结果对病原活菌进行计数。
按照以下公式计算得到原待测样本中的病原活菌数量N：
其中，V0为步骤S2中所取的待测样本的体积。
在另外一些实施例中，步骤S4中可以通过图像识别算法进行细菌数量的快速识别。
具体方法为：
1)对点样区域的显微图像进行采集(如需要的话可进行图像拼接拟合)，并通过病原活菌的图像识别算法筛选到符合细菌形貌特征的显微图形，并对该显微图形进行病原活菌计数，从而获得点样体积内所有病原活菌数量，记为M；
2)计算点样区域的面积，记为A；
以显微图像中的点样区域视野中心为参考点，在该参考点上、下、左、右方向随机选择x个面积均为a的代表性区域使用图像识别算法识别代表性区域内的所有病原活菌，并计算得到平均病原活菌数量，记为M’；通过拉曼光谱对x个代表性区域内部的具有碳—氘拉曼特征峰的病原活菌进行识别，并统计数量，然后计算x个代表性区域中病原活菌的平均数量，记为m；
3)通过具有碳—氘拉曼特征峰的病原活菌数量占平均所有细菌数量的比值m/M’评估点样体积内活菌数量，再换算得到原待测样本中的病原活菌数量N，即：
其中，V0为步骤S2中所取的待测样本的体积。
在优选的实施例中，病原活菌的图像识别算法具体为：
对图像进行负相处理，再转成灰度图像；然后利用大津阈值法将图像转为二值图像，通过中值滤波对图像进行平滑处理；最后通过canny算子对区域进行轮廓提取，从而最终找到图像中所有的菌落位置，并对所有轮廓进行标注显示以及计数，从而得到图像中的病原活菌数量。该算法不受到离散采样区域数量与方位的限制。
实施例1
一种利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，包括以下步骤：
S1、制备培养基
培养基包括：过滤灭菌后的99.9％重水、高温灭菌后的醋酸钠、LB培养基母以及无菌水，其中，醋酸钠的浓度优选为128或256mM、重水的质量浓度为40％。
S2、样本培养
将1mL临床收集疑似的尿液感染的待测样本离心清洗三次，去除上清液后用无菌水重悬到待测样本的原始浓度，得到处理后的样本溶液，以样本溶液：培养基的体积比为1:10(K)的比例，将样本溶液加入到培养基中，混合均匀后在37℃的摇床或培养箱中培养2小时。
S3、拉曼光谱采集
本实施例中，病原活菌的单细胞识别通过共聚焦自发拉曼光谱技术完成，具体方法为：
使用移液枪将体积为0.2μL(V1)的经培养后得到的样本点样到镀铝载玻片表面，室温干燥后将镀铝载玻片转移到共聚焦拉曼光谱仪的电动载物台上，首先通过宽场成像的方式找到细菌的像(物镜：日本奥林巴斯，100×，NA 0.8)；经多次实验测量，单次0.2μL的点样量在镀铝载玻片表面干燥后的点样区域近似为一个直径为950μm的圆；经计算，实验采用的相机的单一视野长宽分别为200μm和150μm，因此，需要合并5×7个单一视野的显微图像来完成整个0.2μL点样区域内的细菌计数；在单一视野内，通过光谱仪自带的空间位置记录功能，结合细菌的图像识别，自动或手动记录单一视野内要采集的所有单细胞细菌的坐标(剔除杂质干扰)；随后，以7mW、1s的激光参数对已记录空间位置的所有点进行光谱采集，依据是否有碳氘拉曼特征峰(1970-2370cm-1)判断病原菌活性，剔除所有不带碳氘拉曼特征峰的拉曼光谱，最后，记录5×7所有视野内的带有“碳—氘”波段的病原菌数量(即病原活菌)，记为n。参照图5，5×7单一视野图像合并后得到的所有视野中的病原菌计数图像。
S4、病原活菌计数
按照以下公式计算得到原待测样本中的病原活菌数量N：
V0为步骤S2中的待测样本的体积，V0＝1mL，V1＝0.2μL，K＝1/10。
本实施例中，采用实施例1的方法与金标准对9例尿液样本进行了病原活菌的计数，对比结果如图6所示，可以看出实施例1与金标准(分离富集培养法)的结果一致性较好。
参照图7，为本发明的方法与临床现行金标准病原活菌计数流程的对比，可以看出，本发明的方法能够大幅度缩短计数所需的时间
实施例2
一种利用拉曼光谱的病原活菌快速计数系统，其采用实施例1的方法进行病原活菌的计数，该系统包括：
培养基，其包括灭菌后重水、灭菌后的醋酸钠、LB培养基母以及无菌水；
培养装置，其用于对待测样本进行培养；
拉曼光谱仪，其用于进行拉曼光谱采集。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (12)
1.一种利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备培养基，所述培养基中包括培养基母液、标记物以及生长抑制剂；
所述标记物参与病原菌代谢并使病原活菌具有拉曼特征峰，从而根据该拉曼特征峰能够判断病原菌活性；所述生长抑制剂为对病原菌的生长具有抑制作用，且所述生长抑制剂不影响所述标记物参与病原菌代谢；
S2、利用步骤S1制备的培养基对待测样本进行培养；
S3、对经步骤S2培养后的待测样本进行拉曼光谱采集，并根据拉曼特征峰识别病原活菌；
S4、根据步骤S3的结果对病原活菌进行计数。
2.根据权利要求1所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，所述生长抑制剂为醋酸钠、乳酸钠以及柠檬酸钠中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，所述生长抑制剂为醋酸钠，且所述培养基中醋酸钠的浓度为64-1024mM。
4.根据权利要求3所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，所述标记物为重水，其在所述培养基中的质量浓度为20-80％。
5.根据权利要求4所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，重水参与病原菌代谢并使病原活菌具有碳—氘拉曼特征峰，位置为1970-2370cm-1。
6.根据权利要求4所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，所述步骤S1中制备的培养基包括：灭菌后重水、灭菌后的醋酸钠、LB培养基母以及无菌水，其中，醋酸钠的浓度为128或256mM、重水的质量浓度为40％。
7.根据权利要求6所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括：将待测样本离心清洗，去除上清液后用无菌水重悬到待测样本的原始浓度，得到处理后的样本溶液，以样本溶液：培养基的体积比为K的比例，将样本溶液加入到培养基中，混合均匀后在37℃下培养2小时。
8.根据权利要求7所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：
使用移液枪将体积为V1的经培养后得到的样本点样到镀铝载玻片表面，室温干燥后在共聚焦拉曼光谱仪下进行拉曼光谱采集，计算具有碳—氘拉曼特征峰的所有病原活菌的数量，记为n；
所述步骤S4中按照以下公式计算得到原待测样本中的病原活菌数量N：
其中，V0为步骤S2中所取的待测样本的体积。
9.根据权利要求8所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，所述步骤S2中待测样本的体积V0＝1mL；样本溶液：培养基的体积比为K为1:10；
所述步骤S3具体包括：
使用移液枪将体积为0.2μL的经培养后得到的样本点样到镀铝载玻片表面，室温干燥后在共聚焦拉曼光谱仪下以7mW、1s的激光参数进行拉曼光谱采集，计算具有碳—氘拉曼特征峰的所有病原活菌的数量，记为n；
所述步骤S4中按照以下公式计算得到原待测样本中的病原活菌数量N：
10.根据权利要求7所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：
使用移液枪将体积为V1的经培养后得到的样本点样到镀铝载玻片表面，室温干燥后在共聚焦拉曼光谱仪下进行拉曼光谱采集；
所述步骤S4中通过图像识别算法计算得到原待测样本中的病原活菌数量，具体方法为：
1)对点样区域的显微图像进行采集，并通过病原活菌的图像识别算法筛选到符合细菌形貌特征的显微图形，并对该显微图形进行病原活菌计数，从
而获得点样体积内所有病原活菌数量，记为M；
2)计算点样区域的面积，记为A；
以显微图像中的点样区域视野中心为参考点，在该参考点上、下、左、右方向随机选择x个面积均为a的代表性区域使用图像识别算法识别代表性区域内的所有病原活菌，并计算得到平均病原活菌数量，记为M’；通过拉曼光谱对x个代表性区域内部的具有碳—氘拉曼特征峰的病原活菌进行识别，并统计数量，然后计算x个代表性区域中病原活菌的平均数量，记为m；
3)通过具有碳—氘拉曼特征峰的病原活菌数量占平均所有细菌数量的比值m/M’评估点样体积内活菌数量，再换算得到原待测样本中的病原活菌数量N，即：
其中，V0为步骤S2中所取的待测样本的体积。
11.根据权利要求10所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，病原活菌的图像识别算法具体为：
对图像进行负相处理，再转成灰度图像；然后利用大津阈值法将图像转为二值图像，通过中值滤波对图像进行平滑处理；最后通过canny算子对区域进行轮廓提取，从而最终找到图像中所有的菌落位置，并对所有轮廓进行标注显示以及计数，从而得到图像中的病原活菌数量。
12.一种利用拉曼光谱的病原活菌快速计数系统，其特征在于，其采用如权利要求1-11中任意一项所述的方法进行病原活菌的计数，该系统包括：培养基，其包括灭菌后重水、灭菌后的醋酸钠、LB培养基母以及无菌水；培养装置，其用于对待测样本进行培养；
拉曼光谱仪，其用于进行拉曼光谱采集；
以及病原活菌计数模块，其用于统计病原活菌数量。
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