CN117165515A - 一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，涉及类胚胎致畸物技术领域；为了解决动物胚胎确定致畸物致畸能力的限制问题；具体包括以下步骤：建立ES、TS和XEN细胞系，并进行标志性蛋白鉴定；建立特异性钙黏蛋白均一表达细胞系；构建ETX胚胎；确立致畸物致畸效应和致畸浓度；所述ETX胚胎的构建方法。本发明可用来评估常见致畸物对于胚胎发育过程和发育性器官形成的影响及其分子机制，可以替代传统体内动物实验方法，来评估各种小分子化合物和药物的潜在致畸效应和机制，解决了传统动物胚胎实验样品小、耗时多、成本高等缺点，对于新药研发、化合物合成、生殖医学等领域有着重大的科学和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及类胚胎致畸物技术领域，尤其涉及一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法。
背景技术
目前，出生缺陷或先天性畸形是导致婴儿死亡的主要原因之一，占所有婴儿死亡的20％，在引起出生缺陷或先天性畸形的因素中，外部环境中存在的致畸物，包括小分子药物(如丙戊酸VPA)、塑料(如增塑剂甲氧基乙醇MeTH)、化妆品(如邻苯二甲酸二甲酯DiPH)等，被认为是十分重要的致畸因素。然而，很多常见致畸物对于胚胎发育关键行为的影响及其分子机制还不是很清楚，了解这个问题可以有助于我们探索先天性发育疾病发生发展机制，并可为预防致畸物导致的胚胎畸形提供相关理论依据。
有研究显示，致畸物对于着床后胚胎的影响十分显著，基于技术和伦理上的诸多限制，要全面了解不同致畸物对于早期胚胎发育的影响及其分子机制，特别是着床后胚胎发育相关问题，仍然十分困难。长期以来，动物胚胎研究一直是确定致畸物致畸能力的主要方法，但存在以下不足：①动物胚胎获取技术难、耗时长、样本少、成本高，导致无法高通量地研究各种小分子致畸物对于胚胎发育中形态发生、器官形成等关键事件的影响；②母体对于致畸物的吸收、分布和代谢会因动物种类、遗传背景、给药途径、年龄、饮食等而有很大差异，因此很难确定特定小分子化合物在何种浓度下通过何种机制影响特定的发育过程。基于上述限制因素，迫切需要一种有效模型和方法来研究各种小分子化合物和药物对合成胚胎的致畸能力。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，包括以下步骤：
S1：建立ES、TS和XEN细胞系，并进行标志性蛋白鉴定；
S2：建立特异性钙黏蛋白均一表达细胞系；
S3：构建ETX胚胎；
S4：确立致畸物致畸效应和致畸浓度；
所述ETX胚胎的构建方法，包括培养前处理阶段、培养中期阶段和培养后期阶段。
优选地：所述ES、TS和XEN细胞系的建立方法，包括以下内容：
A1：取两只以上E3.5时期的小鼠胚胎，将其接种于含小鼠胚胎成纤维细胞的滋养层的培养皿中；
A2：利用2iLif培养基和TSF4H培养基分别培养胚胎，1～2周后获得ES和TS细胞；
A3：然后利用XEN培养基培养ES细胞，2周后ES细胞转变为XEN细胞。
优选地：所述标志性蛋白鉴定的方式为：利用免疫荧光蛋白染色对所获得的ES细胞、TS细胞和XEN细胞进行鉴定，再分别观测ES细胞中Nanog和Oct4、TS细胞中Cdx2和Tfap2c、XEN细胞中Gata4和Gata6的表达情况。
优选地：所述特异性钙黏蛋白均一表达细胞系的建立方法，包括以下内容：
B1：利用Gateway克隆法构建基于PiggyBac和Tet-On可瞬时诱导表达特异性钙黏蛋白的质粒，实现在ES、TS和XEN细胞中分别表达Cdh1、Cdh3和Cdh6；
B2：添加1μg/mL强力霉素Dox诱导特异性钙黏蛋白的表达；
B3：在特异性钙黏蛋白诱导后的第1天、第2天和第3天，分别利用免疫荧光染色和qRT-PCR法对诱导表达的细胞进行表征和评估；
B4：在特异性钙黏蛋白诱导后的第1天、第2天和第3天，分别通过免疫荧光染色方法检测ES细胞、TS细胞和XEN细胞中Oct4、Tfap2c和Gata4的表达。
优选地：所述培养前处理阶段，包括以下内容：
C1：将ES细胞、TS细胞和XEN细胞酶解形成单个细胞，利用胶原培养板移除滋养层细胞；
C2：混合ES细胞、TS细胞和XEN细胞得到混合体，将混合体接种于抗粘附溶液处理过的含基础培养基的AggreWell培养板中，离心使混合体均匀分布后再培养。
优选地：所述培养中期阶段，包括以下内容：
C11：自组装第1天，在FC培养基中添加10M Y-27632；
C12：自组装第2-4天，使用IVC1培养基对于组装体进行培养，并每天替换一半培养基，然后在体式显微镜下选取形态正常的组装体进行后续培养步骤；
C13：自组装第5-7天，使用EUCM培养基替换IVC1培养基对组装体进行培养。
优选地：所述培养后期阶段，包括以下内容：
C111：自组装第8天，将组装体转移至含有EUCM培养基旋转生物反应器中进行培养；
C112：对自组装后的结构进行多聚甲醛固定并免疫荧光染色；
C113：通过特异性标志蛋白染色结果确定合成胚胎的神经、神经管、脑和心脏组织器官形成能力。
优选地：所述致畸效应和致畸浓度的确立方法，包括以下内容：
D1：合成胚胎形成后的第2天，在IVC1培养基中添加0.2-1mM浓度的小分子药物和1-7mM浓度的化合物；
D2：合成胚胎形成后的第3-5天，通过DAPI染色定量1000～2000个合成胚胎长度、空腔形成率参数，评估小分子药物和化合物对形态发生的影响；
D3：合成胚胎形成后的第6-7天，通过Cerberus、Brachyury、N-cadherin免疫荧光染色，结合荧光图像拼接法，高通量评估1000～2000个组装体中前后轴及原肠胚形成是否受到小分子药物和化合物影响；
D4：合成胚胎形成后的第8天，通过特异性标志蛋白染色结果评估50～100个合成胚胎组装体中，神经、神经管、脑、心脏组织器官形成能力是否受到特定浓度小分子药物和化合物的影响；
D5：酶解第6-8天的50～100个组装体，使用qRT-PCR检测组装体的所有细胞内部发育调节相关基因的表达情况。
优选地：所述小分子药物和化合物包括阿巴卡韦、维甲酸、咖啡因、卡托普利、达比加群酯、多西拉敏、乙二醇、氟尿嘧啶、乙醇酸、羟基脲、异维甲酸、甲基丙烯酸甲酯、甲醇、甲基汞、甲氧氯普胺、尼洛替尼、苯妥英钠、雷美登、沙利度胺、丙戊酸、甲氧基乙酸。
优选地：所述相关基因包括Actb、Aldh1a2、Hoxa1、Lfng、Meox1、Mixl1、Notch1、Snail、Wnt3。
本发明的有益效果为：
1.本发明，利用干细胞自组装特性，根据胚胎发育原理，模拟或重现早期胚胎着床后发育结构和功能，并可用来评估常见致畸物对于胚胎发育过程和发育性器官形成的影响及其分子机制，可以替代传统体内动物实验方法，来评估各种小分子化合物和药物的潜在致畸效应和机制，解决了传统动物胚胎实验样品小、耗时多、成本高等缺点，对于新药研发、化合物合成、生殖医学等领域有着重大的科学和应用价值。
2.本发明，利用小鼠囊胚来源的三种多能性干细胞，即外胚层来源的胚胎干细胞(ES)、滋养层来源的滋养外胚层干细胞(TS)和原始内胚层来源的胚外内胚层干细胞(XEN)，可以在不添加任何外源诱导因子的条件下，通过不同细胞之间自发建立的信号交流和形态发生素浓度梯度，可以形成着床后类胚胎结构(ETX合成胚胎)，精确重现着床后胚胎发育过程；同时通过调控不同细胞表达特异性钙黏蛋白(ES表达Cdh1，TS表达Cdh3，XEN表达Cdh6)，提高细胞间的粘附力，将类胚胎的构建效率提升至接近50％。
3.本发明的合成胚胎可在体外发育形成天然胚胎所具有的完备组织器官(包括心脏、脑、神经管、体节等)，从而高度模拟天然胚胎发育第8.5天的结构和功能，因此通过引导干细胞体外自组装，精准构建的具备发育性器官形成能力的合成胚胎，可以作为一种新模型用于小分子药物和化合物高通量筛选和研究胚胎发育毒性机制，具有重要的医学和科学意义，具有重大创新价值。
4.本发明的ETX合成胚胎能重现小鼠着床后胚胎发育路径，具备整体性、三维密集性、可诱导、自组装构成的半自主性、组织器官形成的原始性，不同于其他合成胚胎、类器官和类系统，这种ETX合成胚胎具备可启动的器官发生程序的再生性，可以形成早期生命体完整器官。通过本发明方法可以在体外构建上千个合成胚胎样结构，为药物筛选、疾病模型构建等领域的研究提供了一种高通量研究平台。
附图说明
图1为本发明提出的一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法的流程示意图；
图2为本发明提出的合成胚胎构建流程示意图；
图3为本发明提出的组装体染色图和组装效率定量结果示意图；
图4为本发明提出的标准尺100μm下形态发生染色结果示意图；
图5为本发明提出的标准尺100μm下神经(Bry/Sox1)染色结果示意图；
图6为本发明提出的标准尺100μm下神经摺(OTX2)染色结果示意图；
图7为本发明提出的标准尺100μm下神经嵴(Ap2a)染色结果示意图；
图8为本发明提出的标准尺100μm下神经管(Sox2)染色结果示意图；
图9为本发明提出的标准尺100μm下脑相关蛋白染色结果示意图；
图10为本发明提出的标准尺500μm下不同浓度VPA和MAA对于合成胚胎形态影响示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
下面详细描述本专利的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利，而不能理解为对本专利的限制。
实施例1：
一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，如图1-10所示，包括以下步骤：
S1：建立ES、TS和XEN细胞系，并进行标志性蛋白鉴定；
优选的，ES也包括商品化的不同小鼠来源的ES细胞，如E14 ES、CD1 ES等，XEN细胞可以被Gata4或Gata6过表达的ES细胞代替，TS细胞可以被CDX2过表达的TS细胞代替；
所述ES、TS和XEN细胞系的建立方法，包括以下内容：
A1：取n只E3.5时期的小鼠胚胎，将其接种于含小鼠胚胎成纤维细胞的滋养层的培养皿中；优选的，本实施例中小鼠胚胎为10只。
A2：利用2iLif培养基和TSF4H培养基分别培养胚胎，1～2周后获得ES和TS细胞；
A3：按照该Niakan et al(Nature Protocol，2013)的方法，然后利用XEN培养基培养ES细胞，2周后ES细胞转变为XEN细胞。
进一步的，所述标志性蛋白鉴定的方式为：利用免疫荧光蛋白染色对所获得的ES细胞、TS细胞和XEN细胞进行鉴定，再分别观测ES细胞中Nanog和Oct4、TS细胞中Cdx2和Tfap2c、XEN细胞中Gata4和Gata6的表达情况。
S2：建立特异性钙黏蛋白均一表达细胞系，可提升构建效率；建立起钙黏蛋白均一化表达的不同细胞系，同时在不影响细胞自身特性的情况下确定Dox诱导表达时间。
所述特异性钙黏蛋白均一表达细胞系的建立方法，包括以下内容：
B1：利用Gateway克隆法构建基于PiggyBac和Tet-On可瞬时诱导表达特异性钙黏蛋白的质粒，实现在ES、TS和XEN细胞中分别表达Cdh1、Cdh3和Cdh6；
B2：添加1μg/mL强力霉素Dox诱导特异性钙黏蛋白的表达；
B3：在特异性钙黏蛋白诱导后的第1天、第2天和第3天，分别利用免疫荧光染色和qRT-PCR法对诱导表达的细胞进行表征和评估；
B4：在特异性钙黏蛋白诱导后的第1天、第2天和第3天，分别通过免疫荧光染色方法检测ES细胞、TS细胞和XEN细胞中Oct4、Tfap2c和Gata4的表达，以评估钙黏蛋白的表达对于细胞干性维持的影响。
S3：构建ETX胚胎，构建方法参见(Nature Cell Biology，2022)；
所述ETX胚胎的构建方法，包括培养前处理、培养中期和培养后期三阶段；将ETX胚胎体外培养至发育性器官形成阶段。
进一步的，所述培养前处理阶段，包括以下内容：
C1：将钙黏蛋白诱导表达后的ES细胞、TS细胞和XEN细胞酶解形成单个细胞，利用胶原培养板移除滋养层细胞；
C2：混合ES细胞、TS细胞和XEN细胞得到混合体，将混合体接种于抗粘附溶液处理过的含基础培养基的AggreWell培养板中，离心使混合体均匀分布后再培养。
进一步的，所述培养中期阶段，包括以下内容：
C11：自组装第1天即细胞聚集阶段，在FC培养基中添加10MY-27632，提高细胞在种植密度低时的生存率；
C12：自组装第2-4天即形态发生阶段，使用IVC1培养基对于组装体进行培养，并每天替换一半培养基；
优选的，所述C12还包括在体式显微镜下选取形态正常的组装体进行后续培养步骤。
C13：自组装第5-7天即原肠胚形成阶段，使用EUCM培养基替换IVC1培养基对组装体进行培养。
再进一步的，所述培养后期阶段，包括以下内容：
C111：自组装第8天即器官形成阶段，将组装体转移至含有EUCM培养基旋转生物反应器中进行培养(实验室已配备，见前期研究成果)，从而提供组装体充足的营养物质和氧气的交换，促进合成胚胎的器官成熟和维持；
C112：对自组装后的结构进行多聚甲醛固定并免疫荧光染色；
C113：通过特异性标志蛋白染色结果确定合成胚胎的神经(Sox1/Sox2)、神经管(Pax6/Olig22/Nkx2-2)、脑(Otx2/Foxg1)和心脏(Myh2/Gata4/Nkx2-5)等组织器官形成能力；利用类胚胎体外培养技术培养ETX胚胎至发育性器官形成阶段(Amadei etal.Nature，2022；Tarazi et al.Cell，2022)。
S4：确立致畸物致畸效应和致畸浓度；采用本方法也可以评估其他常见小分子药物和化合物的致畸效应。
优选的，本实施例中致畸物为小分子药物和化合物,小分子药物和化合物包括但不限于阿巴卡韦(Abacavir)、维甲酸(Retinoic acid)、咖啡因(Caffeine)、卡托普利(Captopril)、达比加群酯(Dabigatran)、多西拉敏(Doxylamine)、乙二醇(Ethyleneglycol)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、乙醇酸(Glycolic acid)、羟基脲(Hydroxyurea)、异维甲酸(Isotretinoin)、甲基丙烯酸甲酯(MEHP)、甲醇(Methanol)、甲基汞(Methylmercury)、甲氧氯普胺(Metoclopramide)、尼洛替尼(Nilotinib)、苯妥英钠(Phenytoin)、雷美登(Ramelteon)、沙利度胺(Thalidomide)、丙戊酸(Valproic acid)、甲氧基乙酸(MAA)，本实例中小分子药物为VPA，化合物为MAA，不限于后续可以评价其他不同的致畸物；
进一步的，所述致畸效应和致畸浓度的确立方法，包括以下内容：
D1：合成胚胎形成后的第2天，在IVC1培养基中添加0.4mM浓度的VPA和2mM浓度的MAA；确定VPA和MAA会对合成胚胎的形态发生和器官形成产生影响的浓度，无任何添加组作为空白对照，利用10个E5.5时期的天然小鼠胚胎作为样品对照。
D2：合成胚胎形成后的第3-5天，通过DAPI染色定量1000～2000个合成胚胎长度、空腔形成率等参数，评估VPA和MAA对形态发生的影响；
D3：合成胚胎形成后的第6-7天，通过Cerberus、Brachyury、N-cadherin免疫荧光染色，结合荧光图像拼接法，高通量评估1000～2000个组装体中前后轴及原肠胚形成是否受到VPA和MAA影响；
D4：合成胚胎形成后的第8天，通过C112步骤中的特异性标志蛋白染色结果评估50～100个合成胚胎组装体中，神经、神经管、脑、心脏等组织器官形成能力是否受到特定浓度VPA和MAA的影响；
D5：酶解第6-8天的50～100个组装体，使用qRT-PCR检测组装体的所有细胞内部发育调节相关基因的表达情况；
优选的，基因包括Actb(管家基因，参与调控骨架蛋白形成)、Aldh1a2(参与视黄酸信号通路和心脏发育)、Hoxa1(Hox转录因子，参与调控脑发育)、Lfng(参与调控Notch信号通路和体节形成)、Meox1(参与调控体节形成)、Mixl1(参与调控中内胚层分化和原条形成)、Notch1(Notch信号通路受体，参与神经形成)、Snail(参与调控血管形成)、Wnt3(Wnt信号通路关键蛋白，参与维持胚胎和多种组织完整性)等。
本实施例在使用时，本发明利用小鼠囊胚来源的三种多能性干细胞，即外胚层来源的胚胎干细胞(ES)、滋养层来源的滋养外胚层干细胞(TS)和原始内胚层来源的胚外内胚层干细胞(XEN)，可以在不添加任何外源诱导因子的条件下，通过不同细胞之间自发建立的信号交流和形态发生素浓度梯度，可以形成着床后类胚胎结构(ETX合成胚胎)，精确重现着床后胚胎发育过程；同时通过调控不同细胞表达特异性钙黏蛋白(ES表达Cdh1，TS表达Cdh3，XEN表达Cdh6)，提高细胞间的粘附力，将类胚胎的构建效率提升至接近50％。本发明的合成胚胎可在体外发育形成天然胚胎所具有的完备组织器官(包括心脏、脑、神经管、体节等)，从而高度模拟天然胚胎发育第8.5天的结构和功能，因此通过引导干细胞体外自组装，精准构建的具备发育性器官形成能力的合成胚胎，可以作为一种新模型用于小分子药物和化合物高通量筛选和研究胚胎发育毒性机制，具有重要的医学和科学意义，具有重大创新价值。
本发明的方法在一定程度上可以替代传统体内动物实验方法，来评估各种小分子化合物和药物的潜在致畸效应和机制，解决了传统动物胚胎实验样品小、耗时多、成本高的缺点，对于新药研发、化合物合成、生殖医学等领域有着重大的科学和应用价值。本发明中的ETX合成胚胎能重现小鼠着床后胚胎发育路径，具备整体性、三维密集性、可诱导、自组装构成的半自主性、组织器官形成的原始性，不同于其他合成胚胎、类器官和类系统，这种ETX合成胚胎具备可启动的器官发生程序的再生性，可以形成早期生命体完整器官。通过本发明方法可以在体外构建上千个合成胚胎样结构，为药物筛选、疾病模型构建等领域的研究提供了一种高通量研究平台。
本实施例中，在当前致畸浓度下VPA和MAA的致畸效应结果为：对形态发生和器官形成影响不明显，合成胚胎的整体结构和对照组类似，轴向延伸能力受到轻微影响，空腔形成正常，早期器官形成能力正常。
实施例2：
一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，如图1和图10所示，所述致畸效应和致畸浓度的确立方法，包括以下内容：
D1：合成胚胎形成后的第2天，在IVC1培养基中添加0.6mM浓度的VPA和4mM浓度的MAA；确定VPA和MAA会对合成胚胎的形态发生和器官形成产生影响的浓度，无任何添加组作为空白对照，利用10个E5.5时期的天然小鼠胚胎作为样品对照。
D2：合成胚胎形成后的第3-5天，通过DAPI染色定量1000～2000个合成胚胎长度、空腔形成率等参数，评估VPA和MAA对形态发生的影响；
D3：合成胚胎形成后的第6-7天，通过Cerberus、Brachyury、N-cadherin免疫荧光染色，结合荧光图像拼接法，高通量评估1000～2000个组装体中前后轴及原肠胚形成是否受到VPA和MAA影响；
D4：合成胚胎形成后的第8天，通过C112步骤中的特异性标志蛋白染色结果评估50～100个合成胚胎组装体中，神经、神经管、脑、心脏等组织器官形成能力是否受到特定浓度VPA和MAA的影响；
D5：酶解第6-8天的50～100个组装体，使用qRT-PCR检测组装体的所有细胞内部发育调节相关基因的表达情况。
本实施例中，在当前致畸浓度下VPA和MAA的致畸效应结果为：对形态发生和器官形成有轻微影响，合成胚胎的整体结构和对照组类似，轴向延伸能力受到抑制，部分合成胚胎无法形成空腔结构，部分合成胚胎的脑、心脏和神经管等特异性蛋白不能正常表达。
实施例3：
一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，如图1和图10所示，所述致畸效应和致畸浓度的确立方法，包括以下内容：
D1：合成胚胎形成后的第2天，在IVC1培养基中添加0.8mM浓度的VPA和5mM浓度的MAA；确定VPA和MAA会对合成胚胎的形态发生和器官形成产生影响的浓度，无任何添加组作为空白对照，利用10个E5.5时期的天然小鼠胚胎作为样品对照。
D2：合成胚胎形成后的第3-5天，通过DAPI染色定量1000～2000个合成胚胎长度、空腔形成率等参数，评估VPA和MAA对形态发生的影响；
D3：合成胚胎形成后的第6-7天，通过Cerberus、Brachyury、N-cadherin免疫荧光染色，结合荧光图像拼接法，高通量评估1000～2000个组装体中前后轴及原肠胚形成是否受到VPA和MAA影响；
D4：合成胚胎形成后的第8天，通过C112步骤中的特异性标志蛋白染色结果评估50～100个合成胚胎组装体中，神经、神经管、脑、心脏等组织器官形成能力是否受到特定浓度VPA和MAA的影响；
D5：酶解第6-8天的50～100个组装体，使用qRT-PCR检测组装体的所有细胞内部发育调节相关基因的表达情况。
本实施例中，在当前致畸浓度下VPA和MAA的致畸效应结果为：对形态发生和器官形成有明显影响，合成胚胎的整体结构和对照组有很大差别，合成胚胎发育迟缓或停滞，轴向延伸能力受到明显抑制，大部分合成胚胎无法形成空腔结构，大部分合成胚胎的脑、心脏和神经管等特异性蛋白不能正常表达，导致器官形态异常或功能缺失。
实施例4：
一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，如图1和图10所示，所述致畸效应和致畸浓度的确立方法，包括以下内容：
D1：合成胚胎形成后的第2天，在IVC1培养基中添加1.0mM浓度的VPA和6mM浓度的MAA；确定VPA和MAA会对合成胚胎的形态发生和器官形成产生影响的浓度，无任何添加组作为空白对照，利用10个E5.5时期的天然小鼠胚胎作为样品对照。
D2：合成胚胎形成后的第3-5天，通过DAPI染色定量1000～2000个合成胚胎长度、空腔形成率等参数，评估VPA和MAA对形态发生的影响；
D3：合成胚胎形成后的第6-7天，通过Cerberus、Brachyury、N-cadherin免疫荧光染色，结合荧光图像拼接法，高通量评估1000～2000个组装体中前后轴及原肠胚形成是否受到VPA和MAA影响；
D4：合成胚胎形成后的第8天，通过C112步骤中的特异性标志蛋白染色结果评估50～100个合成胚胎组装体中，神经、神经管、脑、心脏等组织器官形成能力是否受到特定浓度VPA和MAA的影响；
D5：酶解第6-8天的50～100个组装体，使用qRT-PCR检测组装体的所有细胞内部发育调节相关基因的表达情况。
本实施例中，在当前致畸浓度下VPA和MAA的致畸效应结果为：对形态发生和器官形成有显著影响，合成胚胎的整体结构丧失了胚胎结构，细胞生长和轴向延伸能力受到明显抑制，不同胚层细胞之间的边界不明显，胚胎整体结构紊乱，所有合成胚胎无法形成空腔结构，所有合成胚胎的脑、心脏和神经管等特异性蛋白不能正常表达，不能形成正常的器官特异性细胞，如神经元、心肌细胞等。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：建立ES、TS和XEN细胞系，并进行标志性蛋白鉴定；
S2：建立特异性钙黏蛋白均一表达细胞系；
S3：构建ETX胚胎；
S4：确立致畸物致畸效应和致畸浓度；
所述ETX胚胎的构建方法，包括培养前处理阶段、培养中期阶段和培养后期阶段。
2.根据权利要求1所述的一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，其特征在于，所述ES、TS和XEN细胞系的建立方法，包括以下内容：
A1：取两只以上E3.5时期的小鼠胚胎，将其接种于含小鼠胚胎成纤维细胞的滋养层的培养皿中；
A2：利用2iLif培养基和TSF4H培养基分别培养胚胎，1～2周后获得ES和TS细胞；
A3：然后利用XEN培养基培养ES细胞，2周后ES细胞转变为XEN细胞。
3.根据权利要求2所述的一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，其特征在于，所述标志性蛋白鉴定的方式为：利用免疫荧光蛋白染色对所获得的ES细胞、TS细胞和XEN细胞进行鉴定，再分别观测ES细胞中Nanog和Oct4、TS细胞中Cdx2和Tfap2c、XEN细胞中Gata4和Gata6的表达情况。
4.根据权利要求1所述的一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，其特征在于，所述特异性钙黏蛋白均一表达细胞系的建立方法，包括以下内容：
B1：利用Gateway克隆法构建基于PiggyBac和Tet-On可瞬时诱导表达特异性钙黏蛋白的质粒，实现在ES、TS和XEN细胞中分别表达Cdh1、Cdh3和Cdh6；
B2：添加1μg/mL强力霉素Dox诱导特异性钙黏蛋白的表达；
B3：在特异性钙黏蛋白诱导后的第1天、第2天和第3天，分别利用免疫荧光染色和qRT-PCR法对诱导表达的细胞进行表征和评估；
B4：在特异性钙黏蛋白诱导后的第1天、第2天和第3天，分别通过免疫荧光染色方法检测ES细胞、TS细胞和XEN细胞中Oct4、Tfap2c和Gata4的表达。
5.根据权利要求1所述的一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，其特征在于，所述培养前处理阶段，包括以下内容：
C1：将ES细胞、TS细胞和XEN细胞酶解形成单个细胞，利用胶原培养板移除滋养层细胞；
C2：混合ES细胞、TS细胞和XEN细胞得到混合体，将混合体接种于抗粘附溶液处理过的含基础培养基的AggreWell培养板中，离心使混合体均匀分布后再培养。
6.根据权利要求5所述的一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，其特征在于，所述培养中期阶段，包括以下内容：
C11：自组装第1天，在FC培养基中添加10M Y-27632；
C12：自组装第2-4天，使用IVC1培养基对于组装体进行培养，并每天替换一半培养基，然后在体式显微镜下选取形态正常的组装体进行后续培养步骤；
C13：自组装第5-7天，使用EUCM培养基替换IVC1培养基对组装体进行培养。
7.根据权利要求6所述的一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，其特征在于，所述培养后期阶段，包括以下内容：
C111：自组装第8天，将组装体转移至含有EUCM培养基旋转生物反应器中进行培养；
C112：对自组装后的结构进行多聚甲醛固定并免疫荧光染色；
C113：通过特异性标志蛋白染色结果确定合成胚胎的神经、神经管、脑和心脏组织器官形成能力。
8.根据权利要求1所述的一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，其特征在于，所述致畸效应和致畸浓度的确立方法，包括以下内容：
D1：合成胚胎形成后的第2天，在IVC1培养基中添加0.2-1mM浓度的小分子药物和1-7mM浓度的化合物；
D2：合成胚胎形成后的第3-5天，通过DAPI染色定量1000～2000个合成胚胎长度、空腔形成率参数，评估小分子药物和化合物对形态发生的影响；
D3：合成胚胎形成后的第6-7天，通过Cerberus、Brachyury、N-cadherin免疫荧光染色，结合荧光图像拼接法，高通量评估1000～2000个组装体中前后轴及原肠胚形成是否受到小分子药物和化合物影响；
D4：合成胚胎形成后的第8天，通过特异性标志蛋白染色结果评估50～100个合成胚胎组装体中，神经、神经管、脑、心脏组织器官形成能力是否受到特定浓度小分子药物和化合物的影响；
D5：酶解第6-8天的50～100个组装体，使用qRT-PCR检测组装体的所有细胞内部发育调节相关基因的表达情况。
9.根据权利要求8所述的一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，其特征在于，所述小分子药物和化合物包括阿巴卡韦、维甲酸、咖啡因、卡托普利、达比加群酯、多西拉敏、乙二醇、氟尿嘧啶、乙醇酸、羟基脲、异维甲酸、甲基丙烯酸甲酯、甲醇、甲基汞、甲氧氯普胺、尼洛替尼、苯妥英钠、雷美登、沙利度胺、丙戊酸、甲氧基乙酸。
10.根据权利要求9所述的一种基于干细胞来源类胚胎的致畸物评价模型构建方法，其特征在于，所述相关基因包括Actb、Aldh1a2、Hoxa1、Lfng、Meox1、Mixl1、Notch1、Snail、Wnt3。
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