CN117159736A - 一种靶向递送核酸的脂质纳米颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种靶向递送核酸的脂质纳米颗粒及其制备方法与应用。所述制备方法包括步骤：制备有机相，有机相包括阳离子脂质、DSPC、胆固醇、PEG2000‑DMG和PEG2000‑COOH；制备含核酸的水相；采用微流控技术混合有机相和无机相得到核酸脂质纳米微粒，再和氨基修饰的CSA多肽（CSA‑NH2）进行脱水缩合反应，得到靶向递送核酸的脂质纳米颗粒。所制得的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒具有优越的生物相容性、稳定性和特异性，能够将mRNA/DNA有效地靶向递送到胎盘或肿瘤组织中，从而实现有效治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种靶向递送核酸的脂质纳米颗粒及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，肿瘤治疗和妊娠疾病的治疗取得了显著的进展，但仍然面临许多挑战。特异性地递送治疗药物到病变组织以最大限度地降低正常组织的副作用和毒性是实现有效治疗的关键。
mRNA和DNA作为具有广泛潜力的治疗分子，已经成为研究的热点，但它们的体内递送仍然面临很多挑战。 纳米技术在药物递送领域的应用已经取得了突破性进展。纳米颗粒作为一种有效的药物载体，可以通过调节其大小、形状和表面性质来实现药物的靶向递送。然而，针对胎盘和肿瘤组织的特异性递送依然是一个亟待解决的问题。胎盘和肿瘤组织之间存在许多相似之处，如生长速度快、血管生成旺盛等特点，因此开发一种能够同时针对这两种组织的递送系统具有重要的临床意义。
mRNA和DNA作为具有编码蛋白质和调控基因表达功能的重要生物分子，具有广泛的应用潜力。例如，mRNA可以用于合成缺失或者异常的蛋白质，从而实现基因治疗；DNA可以作为疫苗用于预防和治疗多种疾病。然而，mRNA和DNA在体内的稳定性较低，容易受到核酸酶的降解，同时它们的体内递送效率较低。因此，开发一种能够有效保护mRNA和DNA，并将其特异性地递送到胎盘和肿瘤组织的纳米颗粒具有重要的研究价值。
因此，现有技术仍有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明提供了一种靶向递送核酸的脂质纳米颗粒及其制备方法与应用，旨在解决如何开发一种能够有效保护mRNA和DNA，并将其特异性地递送到胎盘和肿瘤组织的纳米颗粒的问题。
具体地，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种靶向递送核酸的脂质纳米颗粒的制备方法，包括步骤：
制备有机相，所述有机相包括阳离子脂质、DSPC（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱）、胆固醇、PEG2000-DMG（磷脂PEG衍生物）和PEG2000-COOH（含羧酸的PEG衍生物）；
制备含核酸的水相；
将所述有机相和所述水相通过微流控技术混合，离心后，得到核酸脂质纳米微粒；
将所述核酸脂质纳米微粒溶于EDC/NHS溶液，得到核酸脂质纳米微粒的分散液；
对所述核酸脂质纳米微粒的分散液调节pH，加入氨基修饰的CSA多肽（CSA-NH2）进行脱水缩合反应，得到所述靶向递送核酸的脂质纳米颗粒。
可选地，所述阳离子脂质选自1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷DODAP、1,2-二油烷氧基-3-二甲基氨基-丙烷DODMA、N,N-二甲基-2,2-二-(9Z,12Z)-9,12-十八碳烯-1-基-1,3-二氧戊环-4-乙胺DLin-KC2-DMA、1,2-二-O-十八烯酰-3-三甲铵丙烷（氯化盐）DOTMA、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯D-Lin-MC3-DMA中的一种或多种。
可选地，所述有机相中阳离子脂质、DSPC、胆固醇、PEG2000-DMG和PEG2000-COOH的摩尔比为45~50：10：35~40：2.5：2.5。
可选地，所述制备含核酸的水相的步骤，包括：
取核酸溶于缓冲液进行稀释，得到所述核酸的水相，所述缓冲液为pH 4 ~5的柠檬酸缓冲液或醋酸缓冲液；
所述核酸为mRNA、DNA、siRNA、质粒和反义寡核苷酸中的一种或多种。
可选地，在所述微流控技术中，所述有机相和所述水相混合的氮磷比为4~4.5:1。
可选地，在所述微流控技术中，所述水相和所述有机相的流速比为3:1。
可选地，所述EDC/NHS溶液的制备，包括：
将EDC（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺）和NHS（N-hydroxysuccinimide,N-羟基琥珀酰亚胺）依次加入生物缓冲剂（MES，2-吗啉乙磺酸）中，制备得到EDC/NHS溶液。
可选地，对所述核酸脂质纳米微粒的分散液调节pH的步骤，包括：在所述核酸脂质纳米微粒的分散液中加入20×PBS缓冲液，调节pH值至7.5。
本发明还提供一种由以上所述制备方法制得的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒。
本发明另外提供一种所述的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒在制备胎盘或肿瘤靶向药物中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种靶向递送核酸的脂质纳米颗粒及其制备方法，通过使有机相中的PEG2000-COOH与氨基修饰的CSA多肽（CSA-NH2）进行连接，以使核酸脂质纳米微粒连接靶向CSA多肽，得到的脂质纳米颗粒结构具有优越的生物相容性、稳定性和特异性，能够将mRNA/DNA有效地靶向递送到胎盘或肿瘤组织中，从而实现有效治疗。
附图说明
图1为本发明实施例本发明实施例中靶向递送核酸的脂质纳米颗粒的制备流程示意图；
图2为本发明实施例所制得的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒的SEM电镜图，比例尺为500 nm；
图3为本发明实施例所制得的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒的粒径分布图；
图4为本发明实施例所制得的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒靶向体外的绒毛膜癌滋养层细胞系以及小鼠体内的胎盘的免疫荧光图和小动物活体成像图；
图5为本发明实施例所制得的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒注射胎盘后肾上腺髓质素蛋白印迹图。
具体实施方式
本发明提供一种靶向递送核酸的脂质纳米颗粒及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。
本发明实施例中提供一种靶向递送核酸的脂质纳米颗粒的制备方法，包括步骤：
制备有机相，所述有机相包括阳离子脂质、DSPC（1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱）、胆固醇、PEG2000-DMG（磷脂PEG衍生物）和PEG2000-COOH（含羧酸的PEG衍生物）；
制备含核酸的水相；
将所述有机相和所述水相通过微流控技术混合，离心后，得到核酸脂质纳米微粒；
将所述核酸脂质纳米微粒溶于EDC/NHS溶液，得到核酸脂质纳米微粒的分散液；
对所述核酸脂质纳米微粒的分散液调节pH，加入氨基修饰的CSA多肽进行脱水缩合反应，得到所述靶向递送核酸的脂质纳米颗粒。
在合成核酸脂质纳米微粒后，通过脱水缩合反应，使PEG2000-COOH与氨基修饰的CSA多肽（CSA-NH2）进行连接，促使核酸脂质纳米微粒连接靶向多肽。CSA多肽的序列为EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC，其不但能够结合到胎盘滋养层上，并且与发育各阶段胎盘（早、中、晚期）中的滋养细胞相结合，而与母体的其他组织器官无结合作用。因而所述靶向递送核酸的脂质纳米颗粒能够靶向胎盘或肿瘤组织递送核酸药物，从而达到有效治疗。
在一些实施方式中，所述阳离子脂质选自1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷DODAP、1,2-二油烷氧基-3-二甲基氨基-丙烷DODMA、N,N-二甲基-2,2-二-(9Z,12Z)-9,12-十八碳烯-1-基-1,3-二氧戊环-4-乙胺DLin-KC2-DMA、1,2-二-O-十八烯酰-3-三甲铵丙烷（氯化盐）DOTMA、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯D-Lin-MC3-DMA中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述有机相中阳离子脂质、DSPC、胆固醇、PEG2000-DMG和PEG2000-COOH的摩尔比为45~50：10：35~40：2.5：2.5。此比例条件下的有机相可以使合成的纳米颗粒稳定性更好。
在一些实施方式中，所述制备含核酸的水相的步骤，包括：
取核酸溶于缓冲液进行稀释，得到所述核酸的水相，所述缓冲液为pH 4 ~5的柠檬酸缓冲液或醋酸缓冲液；
所述核酸为mRNA、DNA、siRNA、质粒和反义寡核苷酸中的一种或多种。
其中，所述柠檬酸或醋酸缓冲液用于给可电离型脂质提供酸性环境。当所述核酸为mRNA时，有机相中阳离子脂质更优地选择Dlin-MC3-DMA。DLin-MC3-DMA 是一种可电离的阳离子脂质，是一种有效的递送载体。
在一些实施方式中，在所述微流控技术中，所述有机相和所述水相混合的氮磷比为4~4.5:1。有机相与水相的氮磷比对于合成稳定包括核酸的脂质纳米颗粒非常重要。
在一些实施方式中，在所述微流控技术中，所述水相和所述有机相的流速比为3:1。
在一些实施方式中，所述EDC/NHS溶液的制备，包括：
将EDC（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺）和NHS（N-hydroxysuccinimide,N-羟基琥珀酰亚胺）依次加入生物缓冲剂MES（MES，2-吗啉乙磺酸）中，制备得到EDC/NHS溶液。
在具体的实施例中，采用MES缓冲液将溶液的pH值调节至5左右，在此条件下EDC/NHS的活性最好，EDC/NHS是羧基和氨基发生酰胺反应的缩合剂，使PEG2000-COOH与CSA-NH2通过脱水缩合反应进行连接，从而使核酸脂质纳米微粒连接靶向多肽。
在一些实施方式中，对所述核酸脂质纳米微粒的分散液调节pH的步骤，包括：在所述核酸脂质纳米微粒的分散液中加入20×PBS缓冲液，调节pH值至7.5。
本发明实施例还提供一种由以上所述制备方法制得的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒。
本发明实施例另外提供一种所述的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒在制备胎盘或肿瘤靶向药物中的应用。
下面以具体的实施例对本发明的方案作进一步的说明。
实施例1
配制有机相：有机相的溶剂为无水乙醇，总浓度：12.5mmol/L，按照摩尔占比，其中阳离子脂质Dlin-MC3-DMA 占48%， DSPC占10%， 胆固醇占37%， PEG2000-DMG 占2.5%，PEG2000-COOH占2.5%。
配制水相：CleanCap mRNA 溶于DEPC水中，取1.1 mL CleanCap mRNA（1 mg/mL），加入Formulation buffer（柠檬酸缓冲液，pH为4.5）稀释到6.47 mL（浓度为0.17 mg/ml），得到CleanCap mRNA溶液作为水相，其中CleanCap mRNA的浓度为0.17 mg/ml, 该浓度是在有机相保持12.5 mM，且氮磷比为4:1时计算得到的浓度。
采用NanoAssemblr Ignite（制造商Precision NanoSystem Inc）合成CleanCap核酸脂质纳米微粒：使用10 mL BD注射器吸取mRNA溶液（6.2 mL）并固定于仪器C通道。使用3 mL BD注射器有机相（2.06 mL）并固定于仪器R通道。设置参数流速比（C:R）为3:1，总体积8.26 mL，流速12 mL/min，起始死体积0.95 mL，终末死体积0.05 mL。放置样品离心管和废液离心管，运行仪器。结束后用D-PBS缓冲液稀释至290 mL左右（40倍稀释），标记为“CleanCap 40x Diluted”。将稀释液超滤浓缩，使用超滤管，离心转速2000rcf，常温离心30min。收集离心后的CleanCap mRNA核酸脂质纳米微粒。
取合成的CleanCap 核酸脂质纳米微粒，加3ml 0.1M MES（2-morpholinoethanesulfonic acid，2-吗啉乙磺酸），调节溶液pH值至5，室温静置1小时，加入催化剂28.3 ug EDC（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺），加入17 ug NHS（N-hydroxysuccinimide，N-羟基琥珀酰亚胺），避光置于室温摇床反应1-2小时，得到核酸脂质纳米微粒的分散液。在核酸脂质纳米微粒的分散液中加入250ul 20×PBS，调节PH 至7.5，加入0.5mg CSA-NH2，充分混匀，室温摇床避光过夜反应。使用超滤管，用DEPC水洗涤三次，离心转速2000rcf，常温离心5min，得到靶向递送核酸的脂质纳米颗粒。
实施例2
配制有机相：有机相的溶剂为无水乙醇，总浓度：12.5mmol/L，按照摩尔占比，其中阳离子脂质Dlin-MC3-DMA 占48%， DSPC占10%， 胆固醇占37%， PEG2000-DMG 占2.5%，PEG2000-COOH占2.5%。
配制水相：ADM mRNA 溶于DEPC水中，取1.1 mL ADM mRNA（1 mg/mL），加入Formulation buffer（醋酸缓冲液，pH为4.5）稀释到6.47 mL（浓度为0.17 mg/ml），得到ADMmRNA溶液作为水相，其中ADM mRNA的浓度为0.17 mg/ml, 该浓度是在有机相保持12.5 mM，且氮磷比为4:1时计算得到的浓度。
采用NanoAssemblr Ignite（制造商Precision NanoSystem Inc）合成ADM mRNA（肾上腺髓质素）核酸脂质纳米微粒：使用10 mL BD注射器吸取ADM mRNA溶液（8.4 mL）并固定于仪器C通道。使用3 mL BD注射器吸取有机相（2.06 mL）并固定于仪器R通道设置参数流速比（C:R）为3:1，总体积11.20 mL，流速12 mL/min，起始死体积0.95 mL，终末死体积0.05mL。放置样品离心管和废液离心管，运行仪器。结束后用D-PBS缓冲液稀释至400 mL左右（40倍稀释），标记为“ADM 40x Diluted”。将稀释液超滤浓缩，使用超滤管，离心转速2000rcf，常温离心30 min。收集离心后的ADM mRNA核酸脂质纳米微粒。
取合成的ADM 核酸脂质纳米微粒，加3ml 0.1M MES（2-morpholinoethanesulfonic acid，2-吗啉乙磺酸），调节溶液pH值至5，室温静置1小时，加入催化剂28.3 ug EDC（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺），加入17 ug NHS（N-hydroxysuccinimide，N-羟基琥珀酰亚胺），避光置于室温摇床反应1-2小时，得到核酸脂质纳米微粒的分散液。在核酸脂质纳米微粒的分散液中加入250ul 20×PBS，调节PH 至7.5，加入0.5mg CSA-NH2，充分混匀，室温摇床避光过夜反应。使用超滤管，用DEPC水洗涤三次，离心转速2000rcf，常温离心5min，得到靶向递送核酸的脂质纳米颗粒。
图1为本发明实施例中靶向递送核酸的脂质纳米颗粒的制备流程示意图，采用阳离子脂质DLin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇、PEG2000-DMG与PEG2000-COOH作为有机相，以mRNA溶液作为水相，采用微流控技术混合有机相和水相，收集得到的核酸脂质纳米微粒和CSA-NH2发生脱水缩合反应，生成靶向递送核酸的脂质纳米颗粒。
如图2所示，对所制得的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒的结构与形貌进行表征，从扫描电镜图可以看出，靶向递送核酸的脂质纳米颗粒均一。
如图3中的粒径分布图可知，靶向递送核酸的脂质纳米颗粒的大小约80-120 nm。
如图4所示，将合成的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒加入绒毛膜癌滋养层细胞系的培养基中，发现靶向递送核酸的脂质纳米颗粒靶向绒毛膜癌滋养层细胞系，通过尾静脉注射到小鼠体内，48小时后检测可以直接靶向子宫内的胚胎。分离胎盘与胎儿，靶向递送核酸的脂质纳米颗粒可以特异靶向体外的绒毛膜癌滋养层细胞系以及小鼠体内的胎盘。
将靶向递送ADM mRNA脂质纳米颗粒通过尾静脉注射小鼠48小时后，取出胎盘，并检测胎盘中ADM蛋白的表达水平。如图5所示，和对照组相比，注射靶向递送ADM mRNA脂质纳米颗粒的胎盘ADM表达显著提高，因此，靶向递送核酸的脂质纳米颗粒可以增加胎盘的肾上腺髓质素蛋白的表达。
综上所述，本发明通过制备靶向递送核酸的脂质纳米颗粒，使有机相中的PEG2000-COOH与氨基修饰的CSA多肽（CSA-NH2）进行连接，以使核酸脂质纳米微粒连接靶向CSA多肽，制得的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒具有优越的生物相容性、稳定性和特异性，能够将mRNA/DNA有效地靶向递送到胎盘或肿瘤组织中，从而实现有效治疗。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种靶向递送核酸的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括步骤：
制备有机相，所述有机相包括阳离子脂质、DSPC、胆固醇、PEG2000-DMG和PEG2000-COOH；
制备含核酸的水相；
将所述有机相和所述水相通过微流控技术混合，离心后，得到核酸脂质纳米微粒；
将所述核酸脂质纳米微粒溶于EDC/NHS溶液，得到核酸脂质纳米微粒的分散液；
对所述核酸脂质纳米微粒的分散液调节pH，加入氨基修饰的CSA多肽进行脱水缩合反应，得到所述靶向递送核酸的脂质纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述阳离子脂质选自1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷DODAP、1,2-二油烷氧基-3-二甲基氨基-丙烷DODMA、N,N-二甲基-2,2-二-(9Z,12Z)-9,12-十八碳烯-1-基-1,3-二氧戊环-4-乙胺DLin-KC2-DMA、1,2-二-O-十八烯酰-3-三甲铵丙烷（氯化盐）DOTMA、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯D-Lin-MC3-DMA中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述有机相中阳离子脂质、DSPC、胆固醇、PEG2000-DMG和PEG2000-COOH的摩尔比为45~50：10：35~40：2.5：2.5。
4.根据权利要求1所述的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述制备含核酸的水相的步骤，包括：
取核酸溶于缓冲液进行稀释，得到所述核酸的水相，所述缓冲液为pH 4 ~5的柠檬酸缓冲液或醋酸缓冲液；
所述核酸为mRNA、DNA、siRNA、质粒和反义寡核苷酸中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，在所述微流控技术中，所述有机相和所述水相混合的氮磷比为4~4.5:1。
6.根据权利要求1或5所述的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，在所述微流控技术中，所述水相和所述有机相的流速比为3:1。
7.根据权利要求1所述的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述EDC/NHS溶液的制备，包括：
将EDC和NHS依次加入生物缓冲剂MES中，制备得到EDC/NHS溶液。
8.根据权利要求1所述的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒的制备方法，其特征在于，对所述核酸脂质纳米微粒的分散液调节pH的步骤，包括：在所述核酸脂质纳米微粒的分散液中加入20×PBS缓冲液，调节pH值至7.5。
9.一种由如权利要求1~8任一所述的制备方法所制得的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒。
10.一种如权利要求9所述的靶向递送核酸的脂质纳米颗粒在制备胎盘或肿瘤靶向药物中的应用。
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