CN117157092A - 控制免疫细胞活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在已经接受或正在接受使用用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中抑制细胞免疫治疗剂的活性的方法，该方法包括：‑提供已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂治疗的受试者；‑向受试者施用用于结合细胞免疫治疗剂的分子，该分子包含该靶抗原的表位或由所述靶抗原的表位组成；其中该分子上的表位与该靶抗原上的表位竞争结合该细胞免疫治疗剂，该分子由此破坏该细胞免疫治疗剂和该靶抗原之间的相互作用；从而抑制该受试者中细胞免疫治疗剂的活性。

Description

控制免疫细胞活性的方法
技术领域
本发明涉及改进的包括免疫细胞施用的治疗方法。
相关申请
本申请要求澳大利亚临时申请AU 2021901030的优先权，其内容通过整体引用并入本文。
背景技术
过继免疫疗法涉及离体生成的抗原特异性T细胞的转移，是有前景的癌症治疗策略。细胞可以是自体的、同种异体的或衍生自HLA匹配(或部分匹配)的第三方的。用于过继性免疫疗法的T细胞可以通过抗原特异性T细胞的扩增或经由基因工程重新定向T细胞来生成。
通过转基因T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的遗传转移，已成功生成T细胞的新特异性。CAR是合成受体，由与单个融合分子中的一个或多个信号传导结构域相连的靶向部分组成。CAR已成功地使得T细胞重定向到来自各种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞的表面上表达的抗原。
已经开发了多代CAR架构，每一代的目的都是在临床前试验中增强CAR修饰的T细胞的激活信号、增殖、细胞因子的产生和效应功能。例如，开发了第二代CAR以将一种或多种共刺激分子(如CD28、OX40和4-1BB)的胞内结构域并入胞内域，并且这些结构改善了抗原特异性T细胞的激活和扩增。第三代CAR包括共刺激胞内域的组合。第四代CAR除了共刺激胞内域外，还包括激活依赖性细胞因子分泌。第五代CAR-T细胞包含从健康捐赠者获得的T细胞的人白细胞抗原(HLA)和TCR基因的缺失，以避免针对移植的CAR T细胞的宿主免疫排斥或移植物抗宿主病(GvHD)。
尽管CAR修饰的T细胞有望治疗癌症，但对其已有各种不良事件报道。在一个实例中，一名患者在环磷酰胺化疗随后输注识别抗原ERBB2(HER-2/neu)的CAR修饰T细胞后5天死亡。该毒性导致患者的临床上显著的促炎细胞因子释放、肺毒性、多器官衰竭以及最终死亡。这种不良事件和其他不良事件凸显了在使用CAR修饰的T细胞时需要谨慎，因为与针对肿瘤相关抗原的抗体不同，这些细胞不会在短时间内从体内清除。
若干研究报告了旨在提高细胞免疫疗法的功效和安全性的不同系统。在一个实例中，抑制性嵌合抗原受体(iCAR)被设计为在遇到脱靶细胞时停止/抑制T细胞功能。iCAR由与T细胞抑制性信号传导结构域融合的抗原特异性单链可变片段(scFv)组成。表达肿瘤相关抗原但不表达正常组织抗原的细胞会诱导T细胞活化、细胞毒性和细胞因子信号传导，从而杀伤中靶细胞。为了发挥作用，iCAR技术依赖于2种抗原的初步选择：一种肿瘤相关抗原和一种正常组织抗原。
另一种系统包括使用抗CD20 CAR与诱导型caspase 9(iC9)自杀开关相结合。后一个基因在前药AP1903(他克莫司)存在的情况下通过与突变的FK506结合蛋白(FKBP1)结合而发挥功能。病毒转导将DNA从载体转移到靶细胞中，载体衍生的DNA指导化学诱导二聚化(CID)和辅助蛋白的表达。当AP1903药物存在时，CID蛋白会发生二聚化，从而开启信号级联。在所施用的T细胞引起严重或危及生命的毒性的事件中，将注入AP1903以触发快速破坏和消除CaspaCIDTM启用的细胞。类似的基于多聚剂的细胞凋亡诱导系统描述于WO 2014/152177。
还开发了所谓的“适体CAR”平台，其包括模块化设计并且其中T细胞通常处于“关闭”状态，直到提供将T细胞引导至肿瘤相关抗原的适体分子，从而促进CAR-T细胞的激活。
现有技术的方法通常涉及用于控制免疫细胞活性的复杂抑制性机制或“关闭开关”机制，或者替代性地需要使用复杂的适体系统来开启CAR T细胞。此外，现有技术中描述的用于“关闭”CAR-T细胞活性的许多方法导致细胞杀伤，因此无法为CAR-T细胞免疫疗法的使用提供足够的灵活性。
需要改进的控制基于免疫细胞的疗法特别是基于CAR-T细胞的疗法的活性的方法。
本说明书中对任何现有技术的引用并不承认或建议该现有技术构成任何司法管辖区的公知常识的一部分，或者可以合理地期望该现有技术被理解、被视为相关和/或由本领域技术人员与其他现有技术组合。
发明概述
本发明基于发明人的认识，即微调识别并结合癌细胞上特定靶抗原的免疫细胞的活性是可能的。
在第一方面，本发明提供了用于减弱或暂时“关闭”或抑制细胞免疫治疗剂(例如但不限于CAR T疗法)的活性的多种方法。
在本发明第一方面的一个实施方案中，提供了用于在已经接受或正在接受细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中抑制细胞免疫治疗剂的活性的方法，该方法包括：
-提供已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂治疗的受试者；
-向受试者施用用于结合该细胞免疫治疗剂的分子，该分子包含该靶抗原的表位或由该靶抗原的表位组成；
其中分子上的表位与靶抗原上的表位竞争结合细胞免疫治疗剂，并且分子由此破坏细胞免疫治疗剂和靶抗原之间的相互作用；
从而抑制受试者中细胞免疫治疗剂的活性。
优选地，抑制是可逆的，使得一旦分子已经从受试者的循环中清除，细胞免疫治疗剂的活性就恢复。优选地，该方法不降低细胞免疫治疗剂的细胞的生存力。
技术人员将熟知可以由细胞免疫疗法触发或引起的各种细胞毒性事件。此类细胞毒性事件可包括细胞免疫疗法施用后的细胞因子的任何异常释放或炎症反应。细胞因子的异常释放可以用各种术语来指代，包括高细胞因子血症或“细胞因子风暴”。“细胞因子释放综合征”(CRS)是全身炎症反应综合征(SIRS)的一种形式，当大量白细胞被激活并释放炎症细胞因子，进而激活更多白细胞时，就会发生细胞因子释放综合征。术语“细胞因子风暴”通常与细胞因子释放综合征(CRS)宽松地互换使用，但更准确地说是一种可区分的综合征，其可以代表细胞因子释放综合征或另一种疾病实体(例如巨噬细胞激活综合征)的组成部分的严重发作。当因治疗而出现时，CRS症状可能会延迟到治疗后数天或数周。立即发作(暴发性)CRS似乎是细胞因子风暴。
因此，在本发明第一方面的又一个实施方案中，提供了用于最小化或降低已经接受或正在接受用于结合细胞上的靶抗原的细胞免疫治疗剂治疗的受试者中异常炎症反应的风险的方法，该方法包括：
-提供已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂治疗的受试者；
-向受试者施用用于结合细胞免疫治疗剂的分子，该分子包含该靶抗原的表位或由该靶抗原的表位组成；
其中分子上的表位与靶抗原上的表位竞争结合细胞免疫治疗剂，并且分子由此破坏细胞免疫治疗剂和靶抗原之间的相互作用；
从而最小化或降低受试者的异常炎症反应的风险。优选地，该方法不降低细胞免疫治疗剂的细胞的生存力。
此外，提供了治疗已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂治疗的受试者中的异常炎症反应的方法，该方法包括：
-提供已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂治疗的受试者；
-向受试者施用用于结合细胞免疫治疗剂的分子，该分子包含该靶抗原的表位或由该靶抗原的表位组成；
其中分子上的表位与靶抗原上的表位竞争结合细胞免疫治疗剂，并且分子由此破坏细胞免疫治疗剂和靶抗原之间的相互作用；
从而治疗受试者的异常炎症反应。优选地，该方法不降低细胞免疫治疗剂的细胞的生存力。
异常炎症反应可以包括细胞因子相关的毒性。炎症反应可以包括全身炎症反应，并且可以被分类为全身炎症反应综合征(SIRS)。SIRS可以被分类为“细胞因子释放综合征”(CRS)。异常炎症反应可以是高细胞因子血症或“细胞因子风暴”。
异常炎症反应可以包括本文表1中列出的一种或多种症状。
应当理解，在进一步的实施方案中，为了增加或最大化细胞治疗剂在受试者中的持久性、防止免疫细胞耗尽以及使细胞恢复效力，细胞治疗剂的周期性且可逆的“关闭”可以是期望的，(换言之，细胞治疗剂的无活性时期)。
因此，本发明提供了用于促进或增加受试者中的细胞免疫治疗剂的持久性的方法，其中细胞免疫治疗剂用于结合靶抗原，所述方法包括：
-提供已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂治疗的受试者；
-向受试者施用用于结合细胞免疫治疗剂的分子，该分子包含该靶抗原的表位或由该靶抗原的表位组成；
其中分子上的表位竞争结合细胞免疫治疗剂，并且分子由此破坏细胞免疫治疗剂和靶抗原之间的相互作用；
从而促进或增加受试者中细胞免疫治疗的持久性。
应当理解，通过施用与靶抗原竞争结合细胞免疫治疗剂的分子，该方法提供了细胞免疫治疗剂不再具有活性或具有降低的活性的时间段，从而促进细胞免疫治疗剂的持久性，如本文进一步解释的。
此外，提供了包含靶抗原的表位或由靶抗原的表位组成的分子在制备用于以下的药物中的用途：
a)抑制已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的细胞免疫治疗剂的活性；
b)最小化或降低已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中异常炎症反应的风险；
c)治疗已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的异常炎症反应；
d)最小化或降低已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中肿瘤溶解综合征的风险；
e)治疗已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的肿瘤溶解综合征；或
f)增加细胞免疫治疗剂在受试者中的持久性，其中细胞免疫治疗剂用于结合靶抗原；
其中分子与靶抗原竞争结合细胞免疫治疗剂，并且该分子由此破坏细胞免疫治疗剂和靶抗原之间的相互作用；
其中优选地，该分子不靶向用于细胞介导的杀伤的细胞免疫治疗剂。
还进一步提供了包含分子的组合物，该分子包含靶抗原的表位或由靶抗原的表位组成，所述组合物用于：
a)抑制已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的细胞免疫治疗剂的活性；
b)最小化或降低已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中异常炎症反应的风险；
c)治疗已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的异常炎症反应；
d)最小化或降低已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中肿瘤溶解综合征的风险；
e)治疗已经接受或正在接受用于结合细胞上的靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的肿瘤溶解综合征；或
f)增加受试者中的细胞免疫治疗剂的持久性，其中细胞免疫治疗剂用于结合靶抗原；
其中分子与靶抗原竞争结合细胞免疫治疗剂，并且分子由此破坏细胞免疫治疗剂和靶抗原之间的相互作用；
其中优选地，该分子不靶向用于细胞介导的杀伤的细胞免疫治疗剂。
在本发明的第一方面的其它实施方案中，提供了用于本文所述的方法的药盒，该药盒包含：
-用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂；和
-用于结合该细胞免疫治疗剂的分子，该分子包含该靶抗原的表位或由该靶抗原的表位组成；
其中分子上的表位与靶抗原上竞争结合细胞免疫治疗剂，并且分子由此破坏细胞免疫治疗剂和靶抗原之间的相互作用。
任选地，药盒包含用于本发明第一方面的方法的书面说明书。
在第一方面的任何实施方案中，分子降低细胞免疫治疗剂结合细胞上的靶抗原的能力，特别是其中靶抗原表达或存在于癌细胞表面上。优选地，该分子阻断细胞免疫治疗剂与细胞上存在的靶抗原的相互作用。换言之，细胞免疫治疗剂包含用于结合癌细胞上的靶抗原的部分，并且该分子包含与靶抗原相似或相同的表位，使得该分子与细胞上的靶抗原竞争结合细胞免疫治疗剂。因此，本发明的方法包括用于置换或防止或减少细胞免疫治疗剂与其在癌细胞上的靶抗原的结合的分子。
优选地，包含靶抗原的细胞是癌细胞并且细胞免疫治疗剂用于癌症治疗。此类用于结合癌细胞上的靶抗原的细胞免疫治疗剂的实例包括CAR-T细胞、间接的或基于配体的CAR-T细胞、具有修饰的TCR的细胞和如本文进一步定义的其他细胞治疗剂。
应当理解，根据本发明可以使用各种形式的分子，只要该分子包含与细胞免疫治疗剂竞争结合的靶抗原的表位。
在任何实施方案中，用于结合细胞免疫治疗剂的分子包含多肽或由多肽组成。多肽可以是融合蛋白或嵌合蛋白或任何其他多肽分子的形式。
在某些实施方案中，当分子是多肽时，该方法可以包括向受试者提供编码多肽的核酸。
应当理解，多种其他结构可用于包含表位的分子，例如，分子可以是包含表位、缀合或融合至任何合适的载体部分的多肽的形式。在某些实施方案中，载体部分可以选自：碳水化合物、脂质、脂质体、肽和适体，如本文进一步定义的。
在一些实施方案中，表位可以在包含PEG偶联表面上的表位的脂质体(例如，聚乙二醇化脂质体)的背景下提供。这提供了包被有被细胞免疫治疗剂识别和结合的表位的脂质体。
在第一方面的任何实施方案中，分子是包含对靶抗原特异的表位的融合蛋白的形式。融合蛋白可以包含表位和用于促进多肽的改善溶解度的另外的序列。
另外的序列可以包含抗体的Fc区。然而，应当理解，根据本发明的第一方面，优选经修饰使得其不表现出效应功能或任何可检测的效应功能的抗体的Fc区。例如，抗体的Fc区可以被修饰使得该区域不结合Fcγ受体(FcγR)，尽管其可以保留FcRn结合。抗体的Fc区可以被修饰使得该区域不被负责介导抗体依赖性细胞杀伤(ADCC)的各种细胞结合，各种细胞如NK细胞(仅表达FcγRIII)或单核细胞(表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII)或造血细胞。优选地，Fc区被修饰使得其不引发补体依赖性细胞毒性(CDC)。
另外的序列可以包含血清白蛋白、转铁蛋白、绒毛膜促性腺激素(CG)β链的羧基端肽、非精确重复肽序列、由脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物组成的多肽序列、弹性蛋白样肽(ELP)重复序列)、甘氨酸残基的均聚物或明胶样蛋白质。
在第二方面，本发明提供了用于不可逆或永久“关闭”细胞免疫治疗剂(例如但不限于CAR T疗法)的结合靶抗原优选癌细胞上的靶抗原的活性的各种方法。
在本发明第二方面的一个实施方案中，提供了用于在已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中抑制细胞免疫治疗剂的活性的方法，该方法包括：
-提供已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者；
-向受试者施用用于结合细胞免疫治疗剂的分子；其中该分子包含：
i)竞争结合细胞免疫治疗剂的靶抗原的表位，并且该分子从而破坏细胞免疫治疗剂和靶抗原之间的相互作用；
ii)用于触发细胞死亡的化合物，
其中，在分子与细胞治疗剂结合后，细胞免疫治疗剂经历细胞死亡或被靶向进行细胞杀伤；
从而抑制受试者中细胞免疫治疗剂的活性。
优选地，抑制是不可逆的，使得该方法降低细胞免疫治疗剂的细胞的生存力，任选地通过将毒素引向细胞免疫治疗剂或通过例如通过NK细胞和其他细胞毒性细胞靶向细胞来杀伤。
技术人员将熟知可以由细胞免疫疗法触发或引起的各种细胞毒性事件。此类细胞毒性事件可包括细胞免疫疗法施用后的细胞因子的任何异常释放或炎症反应。细胞因子的异常释放可以用各种术语来指代，包括高细胞因子血症或“细胞因子风暴”。“细胞因子释放综合征”(CRS)是全身炎症反应综合征(SIRS)的一种形式，当大量白细胞被激活并释放炎症细胞因子，进而激活更多白细胞时，就会发生这种情况。术语“细胞因子风暴”通常与细胞因子释放综合征(CRS)宽松地互换使用，但更准确地说是一种可区分的综合征，可以代表细胞因子释放综合征或另一种疾病实体(例如巨噬细胞激活综合征)的组成部分的严重发作。当因治疗而出现时，CRS症状可能会延迟到治疗后数天或数周。立即发作(暴发性)CRS似乎是细胞因子风暴。
因此，在本发明第二方面的又一个实施方案中，提供了用于最小化或降低已经接受或正在接受用于结合细胞上的靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中异常炎症反应的风险的方法，该方法包括：
-提供已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者；
-向受试者施用用于结合细胞免疫治疗剂的分子；其中该分子包含：
i)竞争结合细胞免疫治疗剂的靶抗原的表位，并且该分子从而破坏细胞免疫治疗剂和靶抗原之间的相互作用；
ii)用于触发细胞死亡的化合物，
其中，在分子与细胞治疗剂结合后，细胞免疫治疗剂经历细胞死亡或被靶向进行细胞介导的杀伤；
从而最小化或降低受试者异常炎症反应的风险。
优选地，该方法降低(优选靶向细胞进行降解/杀伤的)细胞免疫治疗剂的细胞的生存力，从而避免或降低可能否则由细胞免疫治疗剂触发的进一步异常免疫反应的风险。
此外，提供了治疗已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中异常炎症反应的方法，该方法包括：
-提供已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者；
-向受试者施用用于结合细胞免疫治疗剂的分子；其中该分子包含：
i)竞争结合细胞免疫治疗剂的靶抗原的表位，并且该分子从而破坏细胞免疫治疗剂和靶抗原之间的相互作用；
ii)用于触发细胞死亡的化合物，
其中，在分子与细胞治疗剂结合后，细胞免疫治疗剂经历细胞死亡或被靶向进行细胞介导的杀伤；
从而治疗受试者的异常炎症反应。
优选地，该方法降低(优选靶向细胞进行降解/杀伤的)细胞免疫治疗剂的细胞的生存力。
异常炎症反应可以包括细胞因子相关的毒性。炎症反应可以包括全身炎症反应，并且可以被分类为全身炎症反应综合征(SIRS)。SIRS可以被分类为“细胞因子释放综合征”(CRS)。异常炎症反应可以是高细胞因子血症或“细胞因子风暴”。
异常炎症反应可以包括本文表2中列出的一种或多种症状。
此外，提供了包含靶抗原的表位的分子在制备用于以下的药物中的用途：
a)抑制已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的细胞免疫治疗剂的活性；
b)最小化或降低已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的异常炎症反应的风险；或
c)治疗已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的异常炎症反应；
d)最小化或降低已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的肿瘤溶解综合征的风险；或
e)治疗已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的肿瘤溶解综合征；
其中该分子包含：
i)与靶抗原竞争结合细胞免疫治疗剂的靶抗原的表位，并且该分子从而破坏细胞免疫治疗剂和靶抗原之间的相互作用；
ii)用于触发细胞死亡的化合物，
其中，在分子和细胞治疗剂结合后，细胞免疫治疗剂经历细胞死亡或被靶向进行细胞介导的杀伤；
还进一步提供了包含分子的组合物，该分子包含靶抗原的表位，所述组合物用于：
a)抑制已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的细胞免疫治疗剂的活性；
b)最小化或降低已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的异常炎症反应的风险；
c)治疗已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的异常炎症反应；或
d)最小化或降低已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中肿瘤溶解综合征的风险；
e)治疗已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的肿瘤溶解综合征；
其中该分子包含：
i)与细胞上的靶抗原竞争结合细胞免疫治疗剂的靶抗原的表位，并且该分子从而破坏细胞免疫治疗剂和靶抗原之间的相互作用；
ii)用于触发细胞死亡的化合物，
其中，在分子与细胞治疗剂结合后，细胞免疫治疗剂经历细胞死亡或被靶向进行细胞介导的杀伤。
在本发明的第二方面的另外的实施方案中，提供了用于本文所述的方法的药盒，该药盒包含：
-用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂；和
-包含靶抗原表位的分子，
其中该分子包含：
i)与细胞上的靶抗原竞争结合细胞免疫治疗剂的靶抗原的表位，并且该分子从而破坏细胞免疫治疗剂和靶抗原之间的相互作用；
ii)用于触发细胞死亡的化合物，
其中，在分子与细胞治疗剂结合后，细胞免疫治疗剂经历细胞死亡或被靶向进行细胞介导的杀伤。
任选地，药盒包含用于本发明第二方面的方法的书面说明书。
优选地，靶抗原是癌细胞并且细胞免疫治疗剂用于癌症治疗。优选地，该分子阻断细胞免疫治疗剂与细胞上存在的靶抗原的相互作用。换言之，细胞免疫治疗剂包含用于结合癌细胞上的靶抗原的部分，并且该分子包含与靶抗原相似或相同的表位，使得该分子与细胞上的靶抗原竞争结合细胞免疫治疗剂。因此，本发明的方法包括用于置换或防止或减少细胞免疫治疗剂与其在癌细胞上的靶抗原的结合以及靶向细胞免疫治疗剂用于细胞死亡或细胞介导的杀伤的分子。
根据本发明的第二方面，用于触发细胞死亡的化合物可以是诱导细胞毒性的任何毒素或化疗剂。因此，该分子可以是蛋白质缀合物的形式，该蛋白质缀合物包含含有靶抗原表位的第一部分和细胞毒性化合物(例如，在分子结合后诱导细胞凋亡的毒素或化疗剂)形式的第二部分。在进一步的实施方案中，分子可以是用于结合细胞免疫治疗剂的抗独特型抗体的形式(即，优选用于结合细胞免疫治疗剂中负责结合靶抗原的区域)。在此类实施方案中，抗独特型抗体可包含与其缀合的毒素或化疗剂。合适的毒素或化疗剂是技术人员已知的(并且可能已发现在其他情况下的用途，例如抗体-药物缀合物)。
在第二方面的优选实施方案中，该分子是融合蛋白的形式，该融合蛋白包含对靶抗原特异的表位和用于触发细胞介导的杀伤的氨基酸序列。用于触发细胞介导的杀伤的氨基酸序列可以是当细胞免疫治疗剂被多肽结合时促进靶向细胞免疫治疗剂用于细胞介导的杀伤(例如，通过细胞毒性免疫细胞如细胞毒性T淋巴细胞或NK细胞)的任何序列。
进一步的序列优选地包含抗体的Fc区，并且在此类实施方案中，多肽可以被称为“包含对功能障碍的P2X7受体特异的表位的Fc融合蛋白”。应当理解，根据本发明的第二方面，优选抗体的Fc区表现出效应功能并结合Fcγ受体(FCγR)。抗体的Fc区优选包含被负责介导抗体依赖性细胞杀伤(ADCC)的各种细胞结合的序列，各种细胞如NK细胞(仅表达FcγRIII)或单核细胞(表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII)或造血细胞。抗体的Fc区还可以包含触发补体依赖性细胞毒性(CDC)的序列。
根据本发明的第一或第二方面，靶抗原可以是与癌细胞相关并且可以用作细胞免疫治疗剂结合的靶标的任何抗原。
用于细胞免疫治疗剂结合的靶抗原的实例包括但不限于：功能障碍的(nf)P2X7受体、间皮素、EGFR、GPC3、MUC1、HER2、GD2、CEA、EpCAM、LeY、PCSA、CD19、CD20、Clec9a、CD276、PD-L1和PD-L2。本文进一步描述了靶抗原的其他实例。
在第一和第二方面的任何实施方案中，细胞免疫治疗剂包含免疫细胞或其祖细胞，其中所述免疫细胞表达包含抗原识别结构域和信号传导结构域的受体，其中所述抗原识别结构域结合癌细胞表面上表达的靶抗原。
在第一和第二方面的替代实施方案中，细胞免疫治疗剂包含免疫细胞或其祖细胞，其中所述免疫细胞表达包含抗原识别结构域和信号传导结构域的受体，其中所述抗原识别结构域结合促进免疫细胞与癌细胞表面上表达的靶抗原结合的配体。
免疫细胞或其祖细胞可以是T细胞、NK细胞或表达用于结合癌细胞上的靶抗原的受体或结合结构域的任何其他免疫细胞。
通常，细胞免疫治疗剂表达的受体的抗原识别结构域仅识别本文定义的肿瘤相关抗原。
在一些实施方案中，信号传导结构域包括衍生自激活受体的部分。在一些实施方案中，激活受体是CD3共受体复合物的成员或者是Fc受体。在一些实施方案中，衍生自CD3共受体复合物的部分是CD3-ζ。在一些实施方案中，衍生自Fc受体的部分是FcεRI或FcγRI。
在一些实施方案中，信号传导结构域包括衍生自共刺激受体的部分。在一些实施方案中，信号传导结构域包括衍生自激活受体的部分和衍生自共刺激受体的部分。在一些实施方案中，共刺激受体选自CD27、CD28、CD30、CD40、DAP10、OX40、4-1BB(CD137)和ICOS。
在任何实施方案中，由免疫细胞表达的受体可以是结合细胞表面上表达的靶抗原的嵌合抗原受体(CAR)，并且细胞免疫治疗剂因此包含表达CAR的免疫细胞。其他受体(如修饰的TCR或基于配体的CAR)也考虑在本发明的范围内。
在任何实施方案中，表达抗原受体的免疫细胞可以是如本文所述的任何免疫细胞，或能够分化成免疫细胞的细胞(例如，免疫细胞的祖细胞)。能够分化成免疫细胞(例如表达CAR的T细胞)的细胞可以是干细胞、多谱系祖细胞或诱导多能干细胞。
在任何实施方案中，表达CAR的免疫细胞可以是如本文所述的任何免疫细胞，或能够分化成免疫细胞的细胞(例如，免疫细胞的祖细胞)。能够分化成免疫细胞(例如表达CAR的T细胞)的细胞可以是干细胞、多谱系祖细胞或诱导多能干细胞。因此，在特别优选的实施方案中，细胞免疫治疗剂包含结合肿瘤相关抗原的CAR-T细胞。
在某些实施方案中，细胞免疫治疗剂用于与癌细胞上的功能障碍的P2X7受体结合，并且由细胞免疫治疗剂表达的受体的抗原识别结构域因此与功能障碍的P2X7受体结合。
在任何实施方案中，抗原识别结构域结合与功能障碍的P2X7受体的三磷酸腺苷(ATP)结合位点相关的表位。在一些实施方案中，与功能性P2X7受体(例如，具有野生型序列并具有ATP结合受体的构象或折叠的受体)的ATP结合能力相比，功能障碍的P2X7受体在ATP结合位点具有降低的结合ATP的能力。在一些实施方案中，功能障碍的P2X7受体不能在ATP结合位点处结合ATP。
在任何实施方案中，功能障碍的P2X7受体具有导致受体功能障碍的构象变化。在一些实施方案中，构象变化是氨基酸从反式构象到顺式构象的变化。在一些实施方案中，已从反式构象变为顺式构象的氨基酸是功能障碍的P2X7受体的氨基酸位置210处的脯氨酸。
在任何实施方案中，抗原识别结构域结合包括功能障碍的P2X7受体的氨基酸位置210处的脯氨酸在内的表位。在一些实施方案中，抗原识别结构域结合包括功能障碍的P2X7受体的从氨基酸位置200处的甘氨酸到氨基酸位置216处的半胱氨酸(包括端值)的一个或多个氨基酸残基在内的表位。
受体的抗原识别结构域可以是能够与功能障碍的P2X7受体相互作用并特异性结合功能障碍的P2X7受体的任何合适的分子。然而，在一些实施方案中，抗原识别结构域包括与结合功能障碍的P2X7受体的抗体或其片段的氨基酸序列同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗原识别结构域包括与结合功能障碍的P2X7受体的抗体的片段-抗原结合(Fab)部分的氨基酸序列同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。
在任何实施方案中，抗原识别结构域包括与结合功能障碍的P2X7受体的单链可变片段(scFv)或多价scFv的氨基酸序列同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，多价scFv是二价或三价scFv。
在任何实施方案中，抗原识别结构域包括与结合功能障碍的P2X7受体的单抗体结构域(sdAb)同源的氨基酸序列。
在任何实施方案中，抗原识别结构域包括结合多肽，该结合多肽包括与结合功能障碍的P2X7受体的抗体的一个或多个互补决定区(CDR)同源的氨基酸序列。在任何实施方案中，结合多肽包括与结合功能障碍的P2X7受体的抗体的VH和/或VL链的CDR1、2和3结构域同源的氨基酸序列。在优选的实施方案中，结合多肽包含抗体的VH和/或VL链的CDR的氨基酸序列，或抗体的VH和/或VL链的氨基酸序列，或抗体或其片段的氨基酸序列，其中该抗体或其片段包含以下描述的任何抗体的氨基酸序列：PCT/AU2002/000061或PCT/AU2002/001204(或相应美国专利US 7,326,415、US 7,888,473、US 7,888,473、US 7,531,171、US 8,080,635、US 8,399,617、US 8,709,425、US 9,663,584或US10,450,380中的任一项)、PCT/AU2007/001540(或相应美国专利US 8,067,550)、PCT/AU2007/001541(或相应美国出版物US2010-0036101)、PCT/AU2008/001364(或相应美国专利US 8,440,186、US 9,181,320、US9,944,701或US10,597,451中的任一项)、PCT/AU2008/001365(或相应美国专利US 8,293,491或US 8,658,385中的任一项)、PCT/AU2009/000869(或相应美国专利US 8,597,643、US9,328,155或US10,238,716中的任一项)、PCT/AU2010/001070(或相应出版物WO/2011/020155、US 9,127,059、US 9,688,771或US10,053,508中的任一项)和PCT/AU2010/001741(或相应出版物WO 2011/075789或US 8,835,609中的任一项)，其全部内容通过引用并入本文。优选地，抗体包含PCT/AU2010/001070(或相应美国专利US 9,127,059、US 9,688,771或US 10,053,508中的任一项)中描述的2-2-1或PCT/AU2007/001541(或相应美国出版物US2010-0036101)中描述并由保藏于欧洲培养物保藏中心(ECACC)的杂交瘤AB253(保藏号为06080101)产生的BPM09的CDR氨基酸序列。
根据本发明的第一和第二方面，该方法涉及使用竞争结合细胞免疫治疗剂并取代或阻断细胞免疫治疗剂结合靶抗原的分子或多肽，优选地其中靶抗原表达或存在于癌细胞表面。
分子或多肽优选包含靶抗原的表位，使得分子或多肽优先被细胞免疫治疗剂结合，从而使细胞免疫治疗剂免于与癌细胞的结合。
生成包含用于被细胞免疫治疗剂结合的靶抗原的表位的分子或多肽(或编码多肽的核酸，视情况而定)将完全在本领域技术人员的能力范围内。例如，在结合CD19的细胞免疫治疗剂的背景下，该分子或多肽将包含被细胞免疫治疗剂识别的CD19分子的相似表位，使得细胞免疫治疗剂优先结合该分子或多肽而不是靶细胞表面上存在的CD19。
以下陈述涉及具体实例，其中靶抗原是功能障碍的P2X7受体，然而应当理解，本发明的范围不限于这些实例。
在本发明的第一或第二方面的任何实施方案中，细胞免疫治疗剂用于结合癌细胞上功能障碍的P2X7受体。因此，在此类实施方案中，分子或多肽包含竞争结合细胞治疗剂的功能障碍的P2X7受体的表位。
在第一或第二方面的任何实施方案中，分子上靶抗原的表位包含与被细胞免疫治疗剂结合的功能障碍的P2X7受体上的表位基本上相同或同源的氨基酸序列。换言之，尽管两个表位的氨基酸序列可能不同，但存在足够的同源性以使得细胞免疫治疗剂结合多肽和细胞上的功能障碍的P2X7受体两者。在任何实施方案中，多肽上的表位包含或组成为细胞免疫治疗剂所结合的功能障碍的P2X7受体上的表位的氨基酸序列。
在第一或第二方面的任何实施方案中，功能障碍的P2X7受体的表位包含或组成为仅在功能障碍的P2X7受体上发现但在P2X7受体的功能形式上未发现的表位。换言之，优选地，多肽包含或组成为对功能障碍的P2X7受体特异的表位。
在第一或第二方面的进一步实施方案中，多肽包含对应于如本文定义的E200、E300或复合E200/E300表位的表位。获得根据本发明使用，并且特别是在“阻断”或降低抗nfP2X7 CAR的结合功效的背景下使用的各种多肽将在本领域技术人员的能力范围内。例如，技术人员将理解，可以在包含被CAR结合的表位的多肽的区域的N端或C端包含额外的氨基酸。在非限制性实例中，并且在E200的背景下，其通常被定义为具有基本上如SEQ ID NO:2中所定义的氨基酸序列(并且具有如SEQ ID NO:11中所定义的最小序列)，衍生自P2X7受体天然序列的额外氨基酸可以包含在多肽中，例如，P2X7受体序列中表位N端的残基“DFP”和/或P2X7受体序列中表位C端的残基“TFHKT”。在任何实施方案中，除了E200或E300或复合表位的序列之外，多肽还可包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少6个衍生自P2X7受体序列的氨基酸。
在优选的实施方案中，E200表位的序列被进一步修饰以将半胱氨酸残基(SEQ IDNO：2中的残基17)替换为丝氨酸残基。技术人员将理解，这样做可以减少多肽与另一分子之间任何二硫键键合的可能性。
将额外的氨基酸残基包括到E200、E300或复合表位(或如上段中讨论的延伸表位)也将在本领域技术人员的范围内，如例如通过添加至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个额外的氨基酸残基至由相关表位的氨基酸序列组成的肽的N端和C端区域。通常，此类额外的氨基酸可以衍生自接头序列(如包含甘氨酸和丝氨酸残基的肽)；或衍生自免疫球蛋白的铰链区。通常，将不超过30个、不超过25个或不超过20个氨基酸残基添加至如本文定义的E200、E300或复合表位的N端和/或C端残基。
应当理解，根据本发明的第一方面，该分子可以是由功能障碍的P2X7受体的表位组成的多肽的形式。
表1中提供了(并且根据SEQ ID NO：2至70中的任一项进行定义)包含功能障碍的P2X7受体的表位并适合根据本发明使用的肽和多肽的实例。
如本文所用，除非上下文另有要求，否则术语“包含”和该术语的变体，如“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised)”，并不旨在排除另外的添加剂、组分、整数或步骤。
本发明的另外的方面以及前述段落中所描述的方面的另外的实施方案将从通过示例并参考附图给出的以下描述而变得显而易见。
附图说明
图1：A.在直接CAR系统中与抗nfP2X7 CAR T细胞+/-包含被抗nfP2X7 CAR识别的表位的肽共培养后，MOLM-13细胞活力的百分比变化。不同肽变体的存在减少了CAR T细胞对MOLM-13细胞的杀伤。B.在间接CAR T细胞系统(抗nfP2X7 CAR T细胞+包含抗nfP2X7 CAR的表位和抗CD33结合结构域的多肽)中+/-包含被抗nfP2X7 CAR识别的表位的肽共培养后MOLM-13细胞生存力的百分比变化。不同肽变体的存在减少了CAR T细胞对MOLM-13细胞的杀伤。
图2：与抗nfP2X7 CAR T细胞+/-包含被抗nfP2X7 CAR识别的表位的肽共培养后，MOLM-13细胞生存力的变化。
图3：在存在或不存在包含被CAR识别的表位的肽的情况下，T细胞和表达抗nfP2X7CAR的T细胞对JeKo-1细胞的杀伤。只有表达nfP2X7 CA R的T细胞才能在5天的时间内完全阻止JeKo-1细胞的增殖。肽(包含被nf P2X7 CAR识别的表位序列)的添加减少了CAR T细胞对JeKo-1细胞的杀伤。
图4：nfP2X7 CART细胞对MOLM-13细胞杀伤的减少是剂量依赖性的，并且可以通过改变包含被nfP2X7 CAR识别的表位的肽的浓度来控制。
序列信息
表1：示例性功能障碍的P2X7受体表位序列和包含其的肽/多肽的序列信息
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发明详述
现在将详细参考本发明的某些实施方案。虽然将结合实施方案描述本发明，但是应当理解，本发明的目的不是将本发明限制于这些实施方案。相反，本发明旨在覆盖可包括在由权利要求限定的本发明的范围内的所有替代、修改和等同物。
本领域技术人员将认识到与本文描述的那些相似或等同的许多方法和材料可以用于本发明的实践。本发明决不限于所描述的方法和材料。
应当理解，本说明书中公开和定义的本发明延伸至从文本或附图中提及或显而易见的两个或更多个单独特征的所有替代组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各个替代方面。
本文提及的所有专利和出版物均通过整体引用并入。
本文描述的本发明的一个方面基于这样的认识，即有可能降低表达结合功能障碍的P2X7受体的受体的细胞免疫治疗剂(例如CAR T细胞)结合癌细胞表面上的功能障碍的P2X7受体的能力。发明人已经确定这可以通过提供与功能障碍的P2X7受体竞争结合细胞免疫治疗剂的多肽来实现。例如，表达包含结合功能障碍的P2X7受体的抗原结合结构域的CAR的T细胞的体内活性可以通过施用包含与CAR的抗原结合结构域结合的功能障碍的P2X7受体相同的表位的多肽来降低。这种减少或抑制是可逆的并且可以维持细胞免疫治疗剂的生存力。
本文所述的本发明的另一个方面通过靶向细胞免疫治疗剂进行细胞杀伤，导致细胞免疫治疗剂的体内活性的不可逆的抑制或降低。通过施用多肽来完成靶向，所述多肽包含(a)细胞免疫治疗剂可以结合的功能障碍的P2X7受体的表位和(b)用于促进细胞免疫治疗剂靶向进行细胞介导的杀伤的序列。例如，表达包含结合功能障碍的P2X7受体的抗原结合结构域的CAR的T细胞的体内活性可以通过施用包含以下的多肽不可逆的降低：(a)与被CAR的抗原结合结构域结合的功能障碍的P2X7受体相同的表位，以及(b)靶向CAR T细胞进行细胞介导的杀伤(例如细胞毒性T细胞或NK细胞介导的杀伤)的序列(例如Fc区)。
定义
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
出于解释本说明书的目的，通常应用以下定义，并且只要适当，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。
“抗体”或“免疫球蛋白”或“Ig”是在脊椎动物的血液或其他体液中发现的γ球蛋白，其在免疫系统中发挥作用以结合抗原，从而鉴定和/或中和异物。
抗体通常是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接。根据H链同种型，两条H链通过一个或多个二硫键彼此连接。每条H链和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。
H链和L链定义了特定的Ig结构域。更具体地，每条H链在N端具有可变结构域(VH)，其后是针对各α和γ链的三个恒定结构域(CH)以及针对μ和ε同种型的四个CH结构域。每条L链的N端有一个可变结构域(VL)，其另一端有一个恒定结构域(CL)。VL与VH对齐，并且CL与重链第一恒定结构域(CHL)对齐。
抗体可以分为不同的类别或同种型。免疫球蛋白有五类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其重链分别命名为α、δ、ε、γ和μ。根据3/4序列和功能的相对较小差异，γ和α类进一步分为亚类，例如，人类表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。根据其恒定结构域的氨基酸序列，任何脊椎动物物种的L链都可以归为称为kappa和lambda的两种明显不同的类型之一。
恒定结构域包括Fc部分，该部分包含通过二硫键连接在一起的两条H链的羧基端部分。ADCC等抗体的效应功能由Fc区的序列决定，该区域也是某些类型细胞上发现的Fc受体(FcR)识别的部分。
VH和VL的配对一起形成包括抗体的重链或轻链的氨基端结构域的“可变区”或“可变结构域”。重链的可变结构域可以称为“VH”。轻链的可变结构域可以称为“VL”。V结构域含有影响抗原结合并定义特定抗体对其特定抗原的特异性的“抗原结合位点”。V区跨越约110个氨基酸残基，并由被称为“高变区”(通常约3个)的极端可变性的较短区域(高变区每个通常长9-12个氨基酸)分隔开的15-30个氨基酸的称为框架区(FR)的相对不变的延伸段(通常约4个)组成。FR主要采用β-折叠结构，高变区形成连接β-折叠结构的环，并且在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。
“高变区”是指抗体可变结构域的序列高变和/或形成结构限定环的区域。通常，抗体包含六个高变区；VH中有3个(H1、H2、H3)，和VL中有3个(L1、L2、L3)。
“框架”或“FR”残基是除了本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
“抗原结合位点”通常指至少包括赋予V结构域抗原结合功能所需的高变区和框架区的分子。抗原结合位点可以是在本文描述的方法中的抗体或抗体片段的形式(如mAb、单结构域(SD)-mAb、dAb、Fab、SD-Fab、Fd、SD-Fv、Fv、F(ab')2或scFv)。
“完全”或“完整”抗体是包含抗原结合位点以及CL和至少重链恒定结构域CH1、CH2和CH3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。
“包含可变结构域的完整抗体片段”包括SD-mAb、Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体、单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“Fab片段”由整个L链以及一条重链的H链的可变区结构域(VH)和第一个恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段对于抗原结合而言都是单价的，即其具有单个抗原结合位点。
“Fab'片段”与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基端具有额外的少量残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本文中是其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离硫醇基团的Fab'的名称。
“F(ab')2片段”大致对应于具有二价抗原结合活性并且仍能够交联抗原的两个二硫键连接的Fab片段。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。
在单链Fv(scFv)种类中，一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域可以通过柔性肽接头共价连接，使得轻链和重链可以以类似于双链Fv种类的“二聚体”结构缔合。这两个结构域的折叠产生六个高变环(H链和L链各3个环)，它们为抗原结合提供氨基酸残基，并赋予抗体抗原结合特异性。
“单链Fv”也缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接形成单多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，scFv多肽进一步包含位于VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv形成抗原结合所期望的结构。
“单可变结构域”是具有识别和结合抗原的能力的Fv的一半(仅包含对抗原具有特异性的三个CDR)，尽管通常亲和力低于整个结合位点。
“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的抗体片段，该片段包含在同一多肽链(VH-VL)中连接至轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)。小抗体片段的制备是通过构建具有在VH和VL结构域之间的短接头(约5-10个残基)的sFv片段(参见前段)，从而实现V结构域的链间而非链内配对，而得到在二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。
双抗体可以是二价的或双特异性的。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。三价抗体和四价抗体也是本领域公知的。
“分离的抗体”是已从其预先存在的环境的组分中鉴定、分离和/或回收的抗体。污染物组分是会干扰抗体治疗用途的物质，可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。
“人抗体”是指具有与人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列的抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术来产生，包括噬菌体展示文库。可以通过将抗原施用至转基因动物来制备人抗体，所述转基因动物已被修饰以响应抗原攻击而产生此类抗体，但其内源基因座已被禁用。
非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式是含有衍生自非人抗体的最少序列的嵌合抗体。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体高变区的残基被来自非人物种(如具有期望抗体特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)(供体抗体)的高变区的残基取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未出现的残基。进行这些修饰以进一步优化抗体的性能。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的那些。任选地，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。
“单克隆抗体”是指从基本同源抗体的群体获得的抗体，即构成该群体的单个抗体除了可能少量存在的可能天然发生的突变以外是相同的。单克隆抗体是针对抗原上的单个抗原位点或决定簇高度特异的。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们可以在不被其他抗体污染的情况下合成。单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备。还可以使用分子工程技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
如本文所用，“肿瘤相关抗原”是指由癌细胞表达的抗原(术语“肿瘤抗原”也可用于指代相同的抗原)。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，可引发免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答。肿瘤抗原是本领域熟知的并且包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、hK4前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、P501S前列腺蛋白、PSMA、Her2/neu、生存素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一个实施方案中，肿瘤抗原包含一种或多种与恶性肿瘤相关的抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达许多可以作为免疫攻击的靶抗原的蛋白质。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，如黑色素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和GP 100以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其他靶分子属于转化相关分子，如癌基因HER-2/Neu/ErbB-2。另一组靶抗原是癌胎儿抗原，如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原，该抗原对于个体肿瘤而言是独特的。B细胞分化抗原(如CD19、CD20和CD37)是B细胞淋巴瘤靶抗原的其他候选。其中一些抗原(CEA、HER-2、CD19、CD20、独特型)已被用作单克隆抗体被动免疫治疗的靶标，但取得的成功有限。本发明中提到的肿瘤抗原的类型也可以是肿瘤特异性抗原(TSA)。TSA是肿瘤细胞所特有的，不会发生在体内的其他细胞上。肿瘤相关抗原(TAA)并非肿瘤细胞所独有，相反，在无法诱导对该抗原的免疫耐受状态的条件下，也会在正常细胞上表达。肿瘤上抗原的表达可以在使免疫系统能够对抗原作出应答的条件下发生。TAA可能是胎儿发育期间免疫系统不成熟且无法应答时在正常细胞上表达的抗原，也可能是正常细胞上通常以极低水平存在但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。那些临床上最感兴趣的肿瘤相关抗原与相应的非肿瘤组织相比有差异表达，并允许特定T细胞或免疫球蛋白优先识别肿瘤细胞。
TSA或TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原，如MART-1/MelanA(MART-1)、gp 100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原，如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过度表达的胚胎抗原，如CEA；过度表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原；如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、1GH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，如Epstein Barr病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其他基于蛋白质的大抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p 180erbB-3、c-met、nm-23H 1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\P 1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV 18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。根据本发明的靶细胞抗原的特别优选的实例包括：CD33(Siglec-3)、CD123(IL3RA)、CD135(FLT-3)、CD44(HCAM)、CD44V6、CD47、CD184(CXCR4)、CLEC12A(CLL1)、LeY、FRp、MICA/B、CD305(LAIR-1)、CD366(TIM-3)、CD96(TACTILE)、CD133、CD56、CD29(ITGB1)、CD44(HCAM)、CD47(IAP)、CD66(CEA)、CD112(Nectin2)、CD117(c-Kit)、CD133、CD146(MCAM)、CD155(PVR)、CD171(LI CAM)、CD221(IGF1)、CD227(MUC1)、CD243(MRD1)、CD246(ALK)、CD271(LNGFR)、CD19、CD20、GD2,尤其是EGFR、间皮素、GPC3、MUC1、HER2、GD2、CEA、EpCAM、LeY、PCSACD276和功能障碍的(nf)P2X7受体。
“嘌呤能受体”通常是指以嘌呤(如ATP)作为配体的受体。
“P2X7受体”通常是指由三个蛋白质亚基或单体形成的嘌呤能受体，其中至少一个单体具有基本上如下SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：
SEQ ID NO:1
MPACCSCSDVFQYETNKVTRIQSMNYGTIKWFFHVIIFSYVCFALVSDKLYQRKEPVISSVHTKVKGIAEVKEEIVENGVKKLVHSVFDTADYTFPLQGNSFFVMTNFLKTEGQEQRLCPEYPTRRTLCSSDRGCKKGWMDPQSKGIQTGRCVVYEGNQKTCEVSAWCPIEAVEEAPRPALLNSAENFTVLIKNNIDFPGHNYTTRNILPGLNITCTFHKTQNPQCPIFRLGDIFRETGDNFSDVAIQGGIMGIEIYWDCNLDRWFHHCRPKYSFRRLDDKTTNVSLYPGYNFRYAKYYKENNVEKRTLIKVFGIRFDILVFGTGGKFDIIQLVVYIGSTLSYFGLAAVFIDFLIDTYSSNCCRSHIYPWCKCCQPCVVNEYYYRKKCESIVEPKPTLKYVSFVDESHIRMVNQQLLGRSLQDVKGQEVPRPAMDFTDLSRLPLALHDTPPIPGQPEEIQLLRKEATPRSRDSPVWCQCGSCLPSQLPESHRCLEELCCRKKPGACITTSELFRKLVLSRHVLQFLLLYQEPLLALDVDSTNSRLRHCAYRCYATWRFGSQDMADFAILPSCCRWRIRKEFPKSEGQYSGFKSPY
就P2X7受体由三个单体形成而言，其是“三聚体”或“三聚体的”。“P2X7受体”涵盖P2X7受体的天然存在的变体，例如，其中P2X7单体是剪接变体、等位基因变体、SNP和同工型，包括形成P2X7受体的单体的天然存在的截短或分泌形式(例如，由胞外结构域序列或其截短形式组成的形式)、天然存在的变体形式(例如，选择性剪接形式)和天然存在的等位基因变体。在本发明的某些实施方案中，本文公开的天然序列P2X7单体多肽是包含SEQ ID NO:1中所示的全长氨基酸序列的成熟或全长天然序列多肽。在某些实施方案中，P2X7受体可具有经修饰的氨基酸序列，例如SEQ ID NO:1所示序列中的各种氨基酸可被取代、缺失，或可插入残基。
“功能性P2X7受体”通常是指具有用于结合ATP的三个完整结合位点或裂口的P2X7受体形式。当与ATP结合时，功能性受体形成非选择性钠/钙通道，该通道转变为孔状结构，使钙离子和最高达900Da的分子进入细胞质，其结果之一可以是诱导程序性细胞死亡。在正常稳态中，功能性P2X7受体的表达通常限于经历程序性细胞死亡的细胞，如胸腺细胞、树突细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和单核细胞。红细胞和其他细胞类型上也可以有一些功能性P2X7受体的表达。
“功能障碍的P2X7受体”通常是指具有与功能性P2X7不同的构象的P2X7受体的形式，由此该受体不能形成凋亡孔，但其仍然能够通过维持位于相邻单体之间的单个功能性ATP结合位点作为非选择性通道起作用。一个实例出现在其中单体中的一个或多个在Pro210处具有顺式异构化(根据SEQ ID NO：1)。异构化可以由导致单体错误折叠的任何分子事件引起，这些事件包括例如单体一级序列的突变或异常的翻译后加工。异构化的一个结果是受体不能在三聚体上的一个、或更具体地两个ATP结合位点处与ATP结合，因此不能延长通道的开放。在这种情况下，受体不能形成孔，这限制了钙离子可以进入细胞质的程度。功能障碍的P2X7受体在大范围的上皮癌、间充质癌、生发癌、神经癌和造血癌中表达。如本文所用，术语“功能障碍的P2X7受体”可以与术语“非功能性的P2X7受体”或“nfP2X7受体”互换使用。
“癌症相关的P2X7受体”通常是在癌细胞(包括肿瘤前期、肿瘤、恶性、良性或转移性细胞)上发现的P2X7受体，但在非癌症或正常细胞上不存在。
“E200表位”通常指具有序列GHNYTTNILPGLNITC的表位(SEQ ID NO：2-11；15-70)。
“E300表位”通常指具有序列KYYKENNVEKRTLIK的表位(SEQ ID NO：12和13)。
“复合表位”通常指由E200和E300表位或这些表位的部分并置形成的表位。包含E200和E300表位的复合表位的实例是GHNYTTRNILPGAGAKYYKENNVEK(SEQ ID NO：14)。
术语“抗P2X7受体抗体”或“结合P2X7受体的抗体”是指能够以足以使得该抗体可用作靶向P2X7受体(通常是非功能性的P2X7受体或癌症相关的P2X7受体)的诊断剂和/或治疗剂的亲和力结合P2X7受体的抗体。优选地，P2X7受体抗体与不相关蛋白质的结合程度小于该抗体与P2X7受体的结合的约10％，通过例如放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、Biacore或流式细胞术测量的。在某些实施方案中，结合P2X7受体的抗体具有<1μM、<100nM、<10nM、<1nM或<0.1nM的解离常数(Kd)。抗nfP2X7受体抗体通常是具有这些血清学特征中的一些或全部并且结合功能障碍的P2X7受体但不结合功能性P2X7受体的抗体。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个高变区中具有一个或多个改变的抗体，与不具有这些改变的亲本抗体相比，这些改变导致抗体对抗原的亲和力提高。优选的亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔甚至皮摩尔的亲和力。亲和力成熟的抗体通过本领域已知的程序产生。
“阻断”抗体或“拮抗”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物活性的抗体。优选的阻断抗体或拮抗抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。
如本文所用，“激动抗体”是模拟感兴趣的多肽的至少一种功能活性的抗体。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文描述的那些方法。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持结合更长时间。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中任何一种都可以用于本发明的目的。
如本文所用，术语“抗原”旨在包括结合一种或多种抗体或诱发一种或多种抗体产生的物质，并且可以包括但不限于蛋白质、肽、多肽、寡肽、脂质、碳水化合物、及其组合，例如糖基化蛋白质或糖脂。如本文所用，术语“抗原”是指可以在靶细胞上表达并且可以通过适应性免疫系统识别的分子实体，包括但不限于抗体或TCR，或工程化分子，包括但不限于转基因TCR、CAR、scFv或其多聚体、Fab片段或其多聚体、抗体或其多聚体、单链抗体或其多聚体、或可以以高亲和力与结构进行结合的任何其他分子。
“表位”通常指与抗体的抗原结合位点结合的抗原部分。表位可以是“线性的”，即形成抗原结合位点的抗体CDR的高变环与一级蛋白质结构中的氨基酸序列结合。在某些实施方案中，表位是“构象表位”，即其中CDR的高变环与存在于三级或四级蛋白质结构中的残基结合的表位。
术语“病症”或“病况”意指受试者的功能异常或紊乱，如癌症、自身免疫病症、或病毒、细菌、寄生虫或其他感染。
例如，天然存在于活体动物体内的核酸或肽不是“分离的”，但与其自然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质还可以存在于非天然环境中，如例如宿主细胞中。
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，如小鼠、大鼠、牛、猪、山羊、鸡、狗、猴或人。优选地，受试者是人。受试者可以是患有病症如癌症的受试者(患者)，但受试者也可以是健康受试者。如本文所用，术语“受试者”、“个体”和“患者”可以互换使用。
如本文所用，术语“自体的”是指衍生自同一受试者，随后将其重新引入该受试者的任何材料。
如本文所用，术语“同种异体”是指衍生自与该材料被重新引入的受试者相同物种的不同受试者的任何材料。
术语“治疗有效量”或“治疗有效群体”是指例如在受试者中提供治疗益处的细胞群体的量。
就靶向部分而言，术语“结合”、“特异性结合”或“特异性针对”，如例如CAR中所用，是指识别并结合特定抗原，基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗原结合结构域。与来自一个物种的抗原特异性结合的抗原结合结构域或靶向部分也可以与来自另一物种的抗原结合。这种跨物种反应性是许多抗体的典型特征，因此并不违背抗原结合结构域具有特异性的定义。特异性结合抗原的抗原结合结构域还可以结合抗原的不同等位基因形式(等位基因变体、剪接变体、同工型等)或来自相同基因家族的该抗原的同源变体。这种交叉反应性是许多抗体的典型特征，因此并不违背抗原结合结构域具有特异性的定义。
如本文所用，术语“工程化细胞”和“遗传修饰细胞”可以互换使用。该术语意指含有和/或表达外源基因或核酸序列，这进而修饰细胞或其后代的基因型或表型。特别地，该术语指这样的事实：细胞，优选免疫细胞，可以通过本领域熟知的重组方法进行操纵，以稳定或瞬时表达在自然状态下这些细胞中不表达的肽或蛋白质。例如，免疫细胞被工程化以在其细胞表面表达人工构建体，如嵌合抗原受体。例如，可以使用腺病毒、基于腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒或慢病毒载体或其任何其他假型变体或任何其他基因递送机制如电穿孔或使用CRISPR/Cas9、转座子(例如睡美人)或其变体的脂转染将CAR序列递送至细胞中。基因递送可以是mRNA(瞬时)或DNA(瞬时或永久)的形式。
术语“免疫细胞”或“免疫效应细胞”是指可以是免疫系统的一部分并执行特定效应功能的细胞，如α-βT细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、Breg细胞、Treg细胞、先天性淋巴细胞(ILC)、细胞因子诱导杀伤(CIK)细胞、淋巴因子激活杀伤(LAK)细胞、γ-δT细胞、间充质干细胞或间充质基质细胞(MSC)、单核细胞或巨噬细胞或任何造血祖细胞如多能干细胞和可以成熟或分化成体细胞的早期祖细胞亚群。这些细胞可以是天然存在的或通过细胞因子暴露生成的、人工/遗传修饰的细胞(如iPSC和其他人工细胞类型)。优选的免疫细胞是具有细胞毒性效应功能的细胞，如α-βT细胞、NK细胞、NKT细胞、ILC、CIK细胞、LAK细胞或γ-δT细胞。“效应功能”是指细胞的专门功能，例如在T细胞中，效应功能可以是细胞溶解活性或辅助细胞活性，包括细胞因子的分泌。
如本文所用，术语“治疗(treat)”(治疗(treatment of))病症是指降低受试者所经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重性。
如本文所用，术语“预防”意在指至少降低罹患疾病或病症的风险(或易感性)的可能性(即，导致可能接触或易患该疾病但尚未经历或表现出该疾病症状的个体不出现该疾病的至少一种临床症状)。本文提供了用于鉴定此类患者的生物学和生理学参数，并且这些参数也是医生所熟知的。例如，异常免疫反应的预防可以以细胞免疫治疗剂治疗后细胞因子释放不增加为特征。
如本文所用，术语“表达”定义为特定核苷酸序列在细胞中由其启动子驱动的转录和/或翻译。
细胞免疫治疗剂
如本文所述，本发明包括用于结合细胞免疫治疗剂的分子的用途，其中所述细胞免疫治疗剂包含表达受体的免疫细胞，所述受体包含抗原识别结构域，并且优选地包含信号传导结构域，其中所述抗原识别结构域识别靶抗原。优选地，靶抗原在细胞表面上表达并且是如本文进一步定义的肿瘤相关或肿瘤特异性抗原。
技术人员将理解，本发明的方法可以应用于多种不同的细胞免疫治疗剂。在某些实施方案中，细胞免疫治疗剂包含表达嵌合抗原受体(CAR)(或其变体，包括基于配体的CAR)或修饰的T细胞受体(修饰的TCR)的免疫细胞，其中所述免疫细胞是CAR、TCR或其变体。还应当理解，在优选的实施方案中，抗原识别结构域通常将直接结合至靶细胞上的靶抗原(例如，所谓的“直接CAR”)。然而，本发明的方法可以应用于与靶细胞间接相互作用(例如，经由结合促进与靶细胞上的靶抗原相互作用的配体)的细胞免疫治疗剂的背景下。此种间接细胞免疫治疗剂的实例综述于Arndt et al.,(2020)Cancers(Basel),12:1302，该文献通过引用并入本文。
细胞可以是本文所述的“工程化细胞”、“遗传修饰的细胞”、“免疫细胞”或“免疫效应细胞”。此外，细胞能够分化成免疫细胞。能够分化成免疫细胞(例如表达CAR的T细胞)的细胞可以是干细胞、多谱系祖细胞或诱导多能干细胞。
本发明的免疫细胞可以是任何合适的免疫细胞或其祖细胞，或者可以是同质或异质细胞群。在一些实施方案中，细胞是白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞、T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞或γδT细胞。
在任何实施方案中，细胞可以是T细胞，其中任选地所述T细胞不表达TcRαβ、PD1、CD3或CD96(例如通过在基因水平或功能水平上敲低或敲除这些基因之一)。
在任何实施方案中，细胞可以是免疫细胞，其中任选地，所述细胞不表达辅助分子以及配体(例如通过在基因水平或功能水平上敲除这些基因之一)，辅助分子可以是检查点、耗竭或细胞凋亡相关信号传导受体，配体如PD-1、LAG-3、TIGIT、CTLA-4、FAS-L和FAS-R。
在一些实施方案中，遗传修饰的细胞包含两种或更多种不同的CAR或不同的TCR。如本文所用，术语“不同的CAR”或“不同的嵌合抗原受体”是指具有不相同的抗原识别结构域和/或不相同的信号传导结构域的任何两个或更多个CAR。在一个实例中，“不同的CAR”包括具有相同抗原识别结构域(例如，两个CAR可以均识别功能障碍的P2X7受体)但其具有不同的信号传导结构域的两个CAR，如一个CAR具有含有激活受体的一部分的信号传导结构域，而另一个CAR具有含有共刺激受体的一部分的信号传导结构域。如将理解的，该实施方案中的两个或更多个CAR中的至少一个将具有识别功能障碍的P2X7受体的抗原识别结构域，并且其他一个或多个CAR可以采取任何合适的形式并且可以针对任何合适的抗原。
一般而言，CAR或修饰的TCR可以包含含有抗原结合结构域的胞外结构域(胞外部分)、跨膜结构域和胞内信号传导结构域。胞外结构域可以通过接头连接至跨膜结构域。胞外结构域还可以包含信号肽。
抗原识别结构域的胞外结构域优选识别癌细胞上表达的靶抗原。应当理解，根据本发明可以利用表达不同抗原识别结构域以结合不同靶抗原的任何数量的不同细胞免疫治疗剂，尽管有必要利用包含竞争结合细胞免疫治疗剂的表位的分子。
例如，细胞免疫治疗剂可以包含具有抗原识别结构域的受体，用于结合以下任一者：CD33(Siglec-3)、CD123(IL3RA)、CD135(FLT-3)、CD44(HCAM)、CD44V6、CD47、CD184(CXCR4)、CLEC12A(CLL1)、FRp、MICA/B、CD305(LAIR-1)、CD366(TIM-3)、CD96(TACTILE)、CD133、CD56、CD29(ITGB1)、CD44(HCAM)、CD47(IAP)、CD66(CEA)、CD112(Nectin2)、CD117(c-Kit)、CD146(MCAM)、CD155(PVR)、CD171(LI CAM)、CD221(IGF1)、CD227(MUC1)、CD243(MRD1)、CD246(ALK)、CD271(LNGFR)、CD19、CD20、GD2，尤其是EGFR、间皮素、GPC3、MUC1、HER2、GD2、CEA、EpCAM、LeY、CD276和PCSA。
在某些实施方案中，细胞免疫治疗剂是表达用于结合功能障碍的P2X7受体的CAR(或其变体)的免疫细胞。CAR或其变体的胞外部分可包含识别本文公开的E200(或E300或E200-300复合)表位的nfP2X7结合结构域。
通常，抗原识别结构域包括结合多肽，该结合多肽包含与结合功能障碍的P2X7受体的抗体的一个或多个互补决定区(CDR)同源的氨基酸序列。在任何实施方案中，结合多肽包含与结合功能障碍的P2X7受体的抗体的VH和/或VL链的CDR1、2和3结构域同源的氨基酸序列。
在此类实施方案中，结合多肽包含以下任一项中描述的抗体的VH和/或VL链的CDR的氨基酸序列：PCT/AU2002/000061或PCT/AU2002/001204(或相应美国专利US 7,326,415、US 7,888,473、US 7,888,473、US 7,531,171、US 8,080,635、US 8,399,617、US 8,709,425、US 9,663,584或US10,450,380中的任一项)、PCT/AU2007/001540(或相应美国专利US8,067,550)、PCT/AU2007/001541(或相应美国出版物US2010-0036101)、PCT/AU2008/001364(或相应美国专利US 8,440,186、US 9,181,320、US 9,944,701或US10,597,451中的任一项)、PCT/AU2008/001365(或相应美国专利US 8,293,491或US 8,658,385中的任一项)、PCT/AU2009/000869(或相应美国专利US 8,597,643、US 9,328,155或US10,238,716中的任一项)、PCT/AU2010/001070(或相应出版物WO/2011/020155、US 9,127,059、US 9,688,771或US10,053,508中的任一项)和PCT/AU2010/001741(或相应出版物WO 2011/075789或US 8,835,609中的任一项)，其全部内容通过引用并入本文。优选地，结合多肽包含PCT/AU2010/001070(或相应美国专利US 9,127,059、US 9,688,771、US 9,688,771、US 9,127,059、US 9,688,771或US 10,053,508中任一项)描述的抗体2-2-1或PCT/AU2007/001541(或相应的美国出版物US2010-0036101)中描述并由保藏于欧洲培养物保藏中心(ECACC)的杂交瘤AB253(保藏号为06080101、WO2013185010A1或WO2019056023)产生的BPM09的VH和/或VL链的CDR的氨基酸序列。替代性地，CAR的结合多肽可以包含WO 2017/041143(也公布为US2019/0365805)和WO 2019/222796(对应于美国申请17/057,060)中描述的抗体sdAb 2-2-3、2-472-2或2-2-12的CDR的氨基酸序列，其通过引用并入本文。
CAR的结合多肽可以包含以下任一项中描述的抗体的VH和/或VL链的氨基酸序列：PCT/AU2002/000061或PCT/AU2002/001204(或相应美国专利US 7,326,415、US 7,888,473、US 7,888,473、US 7,531,171、US 8,080,635、US 8,399,617、US 8,709,425、US 9,663,584或US10,450,380中的任一项)、PCT/AU2007/001540(或相应美国专利US 8,067,550)、PCT/AU2007/001541(或相应美国出版物US2010-0036101)、PCT/AU2008/001364(或相应美国专利US 8,440,186、US 9,181,320、US 9,944,701或US10,597,451中的任一项)、PCT/AU2008/001365(或相应美国专利US 8,293,491或US 8,658,385中的任一项)、PCT/AU2009/000869(或相应美国专利US 8,597,643、US 9,328,155或US10,238,716中的任一项)、PCT/AU2010/001070(或相应出版物WO/2011/020155、US 9,127,059、US 9,688,771或US10,053,508中的任一项)和PCT/AU2010/001741(或相应出版物WO 2011/075789或US 8,835,609中的任一项)，其全部内容通过引用并入本文。优选地，结合多肽包含PCT/AU2010/001070(或相应美国专利US 9,127,059、US 9,688,771、US 9,688,771、US 9,127,059、US 9,688,771或US10,053,508中任一项)描述的抗体2-2-1或PCT/AU2007/001541(或相应的美国出版物US2010-0036101)中描述并由保藏于欧洲培养物保藏中心(ECACC)的杂交瘤AB253(保藏号为06080101、WO2013185010A1或WO2019056023)产生的BPM09的VH和/或VL链的的氨基酸序列。替代性地，CAR的结合多肽可以包含WO 2017/041143(也公布为US2019/0365805)和WO2019/222796(对应于美国申请17/057,060)中描述的抗体sdAb 2-2-3、2-472-2或2-2-12的VH和/或VL链的氨基酸序列，其通过引用并入本文。
CAR的结合多肽可以包含以下任一项中描述的抗体或其片段的氨基酸序列：PCT/AU2002/000061或PCT/AU2002/001204(或相应美国专利US 7,326,415、US 7,888,473、US7,888,473、US 7,531,171、US 8,080,635、US 8,399,617、US 8,709,425、US 9,663,584或US10,450,380中的任一项)、PCT/AU2007/001540(或相应美国专利US 8,067,550)、PCT/AU2007/001541(或相应美国出版物US2010-0036101)、PCT/AU2008/001364(或相应美国专利US 8,440,186、US 9,181,320、US 9,944,701或US10,597,451中的任一项)、PCT/AU2008/001365(或相应美国专利US 8,293,491或US 8,658,385中的任一项)、PCT/AU2009/000869(或相应美国专利US 8,597,643、US 9,328,155或US10,238,716中的任一项)、PCT/AU2010/001070(或相应出版物WO/2011/020155、US 9,127,059、US 9,688,771或US10,053,508中的任一项)和PCT/AU2010/001741(或相应出版物WO 2011/075789或US 8,835,609中的任一项)，其全部内容通过引用并入本文。优选地，结合多肽包含PCT/AU2010/001070(或相应美国专利US 9,127,059、US 9,688,771或US 10,053,508中的任一项)中描述的sdAb 2-2-1或PCT/AU2007/001541(或相应美国出版物US2010-0036101)中描述并由保藏于欧洲培养物保藏中心(ECACC)的杂交瘤AB253(保藏号为06080101、WO2013185010A1或WO2019056023)产生的抗体BPM09的氨基酸序列。替代性地，结合多肽可以包含WO 2017/041143(也公布为US2019/0365805)和WO 2019/222796(对应于美国申请17/057,060)中描述的sdAb 2-2-3、2-472-2或2-2-12的氨基酸序列，其通过引用并入本文。
“信号肽”是指指导细胞内蛋白质的运输和定位，例如至特定的细胞器(如内质网)和/或细胞表面的肽序列。
一般而言，“抗原结合结构域”是指特异性结合抗原(从而能够靶向含有抗原的细胞)的CAR的区域。本发明的CAR可以包含一个或多个抗原结合结构域。一般而言，CAR上的靶向区域是细胞外的。抗原结合结构域可以包含抗体或其抗体结合片段。抗原结合结构域可以包含例如全长重链、Fab片段、单链Fv(scFv)片段、二价单链抗体或双抗体。特异性结合给定抗原的任何分子，如亲和体或来自天然存在的受体的配体结合结构域，可以用作抗原结合结构域。通常，抗原结合结构域是scFv。通常，在scFv中，免疫球蛋白重链和轻链的可变区通过柔性接头融合以形成scFv。此类接头可以是例如“(G4/S1)3-接头”及其变体，但技术人员将理解可以使用各种接头序列和形式。
在一些情况下，抗原结合结构域衍生自将使用CAR的同一物种是有益的。例如，当计划将其在人中治疗性使用时，CAR的抗原结合结构域包含人或人源化抗体或其抗原结合片段可能是有益的。人或人源化抗体或其抗原结合片段可以通过本领域熟知的多种方法制备。如本文公开的CAR具有细胞外接头/标记表位结合结构域作为抗原结合结构域，允许其经由本文公开的靶细胞结合分子间接结合靶细胞上表达的抗原。
如本文所用，“间隔区”或“铰链”是指位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间的亲水区域。本发明的CAR可以包含细胞外间隔区结构域，但也可以省去此类间隔区。间隔区可以包括例如抗体的Fc片段或其片段、抗体的铰链区或其片段、抗体的CH2或CH3区、辅助蛋白、人工间隔区序列或其组合。间隔区的突出实例是CD8α铰链。
CAR的跨膜结构域可以衍生自此类结构域的任何期望的天然或合成来源。当来源是天然的时，结构域可以衍生自任何膜结合或跨膜蛋白。跨膜结构域可以衍生自例如CD8α或CD28。当关键信号传导和抗原识别模块(结构域)位于两个(或甚至更多个)多肽上时，CAR可以具有两个(或更多个)跨膜结构域。关键信号传导和抗原识别模块的分裂使得能够对CAR细胞表达进行小分子依赖性、可滴定和可逆的控制(Wu et al,2015,Science 350:293-303)，因为CAR的每个多肽中都存在小分子依赖性异二聚化结构域。
CAR的胞质结构域(或胞内信号传导结构域)负责激活表达CAR的免疫细胞的正常效应功能中的至少一种。“效应功能”是指细胞的专门功能，例如在T细胞中，效应功能可以是细胞溶解活性或辅助细胞活性，包括细胞因子的分泌。胞内信号传导结构域是指蛋白质中转导效应功能信号并指导表达CAR的细胞执行特定功能的部分。胞内信号传导结构域可以包括足以转导启动或阻断免疫细胞效应功能的信号的给定蛋白质的胞内信号传导结构域的任何完整的、突变的或截短的部分。
胞内结构域的功能可以是促炎或抗炎和/或免疫调节，或这些的组合。
用于CAR的胞内信号传导结构域的突出实例包括T细胞受体(TCR)的细胞质信号传导序列和在抗原受体结合后启动信号转导的共受体。
一般而言，T细胞激活可以由两类不同的细胞质信号传导序列介导，首先是那些通过TCR启动抗原依赖性初级激活的序列(初级细胞质信号传导序列)，第二是那些以不依赖于抗原的方式起作用以提供次级或共刺激信号的序列(次级细胞质信号传导序列、共刺激信号传导结构域)。因此，CAR的胞内信号传导结构域可以包含一个或多个初级细胞质信号传导结构域和/或一个或多个次级细胞质信号传导结构域。
以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可以含有ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)信号传导基序。
CAR中经常使用的含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例是衍生自TCR zeta(CD3 zeta)、FcR gamma、FcR beta、CD3 gamma、CD3 delta、CD3 epsilon、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的序列。最突出的是衍生自CD3 zeta的序列。
在一些实施方案中，共刺激受体(信号传导结构域的一部分由其衍生)选自CD27、CD28、CD30、CD40、DAP10、OX40、4-1BB(CD137)和ICOS。
CAR的胞质结构域可被设计为包含CD3-zeta信号传导结构域本身或与一个或多个任何其他期望的胞质结构域组合。CAR的胞质结构域可以包含CD3 zeta链部分和共刺激信号传导区域。共刺激信号传导区是指包含共刺激分子的胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原有效应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。共刺激分子的实例是CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C和B7-H3。
CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质信号传导序列可以通过或不通过接头以随机或指定的顺序彼此连接。短的寡聚或多肽接头，优选长度在2至10个氨基酸之间，可以形成连接。突出的接头是甘氨酸-丝氨酸双联体。
作为实例，胞质结构域可以包含CD3-zeta的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实例中，胞质结构域可以包含CD3-zeta的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一个另外的实例中，胞质结构域可以包含CD3-zeta的信号传导结构域、CD28的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。
如上所述，CAR的胞外部分或跨膜结构域或胞质结构域还可以包含异二聚化结构域，用于使CAR的关键信号传导和抗原识别模块分开。
本发明的CAR，即包含nfP2X7 E200结合结构域的CAR，可以被设计为以任何顺序和/或组合包含本文所述的上述结构域的任何部分或一部分，从而产生功能性CAR。
可以分离和/或纯化本文公开的CAR或由其衍生的一个或多个多肽、编码所述CAR的一个或多个核酸分子或重组表达载体细胞、或表达所述CAR的细胞群。术语“分离的”是指从自然状态改变或去除。例如，分离的细胞群意味着此类细胞的富集以及与通常以其天然存在状态与所述分离的细胞缔合的其他细胞的分离。分离的细胞群是指基本上纯化的细胞群，其是比自然界中发现的更为同质的细胞群。优选地，富集的细胞群包含至少约90％的所选细胞类型。在特定方面，细胞群包含至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的所选细胞类型。
靶抗原表位
本发明提供了包含靶抗原的表位或由靶抗原的表位组成的分子(例如肽或多肽)的用途。靶细胞抗原被细胞免疫治疗剂识别，因此分子或多肽与癌细胞上的靶抗原竞争结合细胞免疫治疗剂。
如本文所用，术语肽和多肽可以互换使用，特别是当分子的总长度小于50个氨基酸时。
通常，分子(例如肽或多肽)中包含的表位将包含与细胞免疫治疗剂意图结合的靶细胞上的表位相同或基本上相同的氨基酸序列。例如，当分子中包含的表位的氨基酸序列与靶细胞上的抗原中包含的氨基酸序列不同时，氨基酸序列的差异将不会显著影响分子与细胞免疫治疗剂结合的能力(或将仍与靶细胞上的靶抗原竞争结合细胞免疫治疗剂)。分子中包含的表位的氨基酸序列可以是与细胞上的靶抗原上的表位的氨基酸序列至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在某些实施方案中，靶抗原上的表位的氨基酸序列与用于抑制细胞免疫治疗剂活性的分子上包含的表位的序列相同。
在某些实例中，细胞免疫治疗剂用于结合靶细胞上的CD19的胞外结构域。应当理解，在此类实例中，根据本发明的第一或第二方面使用的分子将包含与细胞免疫治疗剂结合的CD19的ECD相同的表位。用于靶向CD19的细胞免疫治疗剂是本领域技术人员已知的，此类免疫治疗剂结合的表位也是已知的。例如，为了抑制包含具有由抗CD19 scFv FMC683组成的抗原识别结构域的CAR的CAR-T细胞的活性，技术人员将理解，根据本发明的第一或第二方面使用的分子应包含由scFv FMC683结合的表位。类似地，为了抑制包含具有由抗CD19scFv A3B1组成的抗原识别结构域的CAR的CAR-T细胞的活性，技术人员将理解，根据本发明的第一或第二方面使用的分子应包含由scFv A3B1结合的表位。用于各种抗CD19细胞免疫治疗剂的由抗CD19抗体FMC683、3B10和4G7-2E3结合的表位描述于Klesmith et al.,(2019)Biochemistry,58:489-4881，其通过引用并入本文。
在类似的实例中，细胞免疫治疗剂用于结合靶细胞上的CD20。应当理解，在此类实例中，根据本发明的第一或第二方面使用的分子将包含与细胞免疫治疗剂结合的CD20相同的表位。
在其他实例中，细胞免疫治疗剂用于结合间皮素，因此分子或多肽包含间皮素的表位。
在其他实例中，细胞免疫治疗剂用于结合EGFR，因此分子或多肽包含EGFR的表位。
在其他实例中，细胞免疫治疗剂用于结合GPC3，因此分子或多肽包含GPC3的表位。
在其他实例中，细胞免疫治疗剂用于结合MUC1，因此分子或多肽包含MUC1的表位。
在其他实例中，细胞免疫治疗剂用于结合HER2，因此分子或多肽包含HER2的表位。
在其他实例中，细胞免疫治疗剂用于结合GD2，因此分子或多肽包含GD2的表位。
在其他实例中，细胞免疫治疗剂用于结合CEA，因此分子或多肽包含CEA的表位。
在其他实例中，细胞免疫治疗剂用于结合EpCAM，因此分子或多肽包含EpCAM的表位。
在其他实例中，细胞免疫治疗剂用于结合LeY，因此分子或多肽包含LeY的表位。
在其他实例中，细胞免疫治疗剂用于结合PSCA，因此分子或多肽包含PSCA的表位。
在其他实例中，细胞免疫治疗剂用于结合CD276，因此分子或多肽包含CD276的表位。
在其他实例中，细胞免疫治疗剂用于结合功能障碍的P2X7受体，因此分子或多肽包含功能障碍的P2X7受体的表位。
通常，功能障碍的P2X7受体的表位包含功能障碍的P2X7受体的肽片段，其中该片段包含在功能性P2X7受体上未发现的表位。
因此，功能障碍的P2X7受体表位可以功能障碍的P2X7受体片段的形式提供，其具有在不能结合ATP的相邻正确包装的单体之间的界面处形成的三个ATP结合位点中的至少一个。此类受体无法将非选择性钙通道的开放延伸至凋亡孔。
功能障碍的P2X7受体的一系列肽片段是已知的并且讨论于PCT/AU2002/000061(以及相应的出版物WO 2002/057306和US 7,326,415、US 7,888,473、US 7,531,171、US 8,080,635、US 8,399,617、US 8,709,425、US 9,663,584或US10,450,380)、PCT/AU2008/001364(以及相应的出版物WO 2009/033233和US 8,440,186、US 9,181,320、US 9,944,701或US10,597,45)和PCT/AU2009/000869(以及相应的出版物WO 2010/000041和US 8,597,643、US 9,328,155或US10,238,716)，其全部内容整体并入。下文描述了这些说明书中的示例性肽，其包括预期用于本发明的表位。
PCT公布肽序列
WO 2002/057306 GHNYTTRNILPGLNITC(SEQ ID NO:2)(本文也称为“E200”表位)
WO 2009/033233 KYYKENNVEKRTLIKVF(SEQ ID NO:3)(本文也称为“E300”表位)
WO 2010/000041 GHNYTTRNILPGAGAKYYKENNVEK(SEQ ID NO:4)(本文也称为“E200/E300”或“复合”表位)。
E200、E300和复合表位的其他实例在本文表1中描述。如本文其他位置所讨论的，包含E200、E300或复合表位的肽或多肽可以含有额外的氨基酸。在某些实例中，额外的氨基酸可以直接衍生自nfP2X7受体序列内存在的相邻序列。替代性地，额外的氨基酸序列可以衍生自一种或多种接头序列，如富含甘氨酸/丝氨酸的接头序列，和/或衍生自免疫球蛋白的铰链区。技术人员将理解，可以对E200、E300或复合表位进行此类修饰，以增加肽或多肽的稳定性或溶解度，或调节与CAR的结合程度。
在第一或第二方面的任何实施方案中，多肽降低细胞免疫治疗剂与细胞(优选癌细胞)上功能障碍的P2X7受体结合的能力。优选地，多肽阻断或破坏细胞免疫治疗剂与癌细胞上存在的功能障碍的P2X7受体的相互作用。
在第一或第二方面的任何实施方案中，多肽上的表位包含与细胞免疫治疗剂结合的功能障碍的P2X7受体上的表位基本上相同或同源的氨基酸序列。换言之，尽管两个表位的氨基酸序列可能不同，但细胞免疫治疗剂具有足够的同源性以结合该多肽和细胞上的功能障碍的P2X7受体两者。在任何实施方案中，多肽上的表位包含或组成为细胞免疫治疗剂所结合的功能障碍的P2X7受体上的表位的氨基酸序列。
根据本发明使用的分子
应当理解，本发明的分子的结构将取决于是否根据本发明的第一方面或第二方面使用该分子。
在特定实施方案中，分子可以是多肽的形式。此类多肽可以是融合蛋白或嵌合蛋白的形式。
更具体地，该分子优选地是多肽的形式，该多肽包含有助于对细胞免疫治疗剂产生暂时且可逆的作用的序列和结构。
以结合靶抗原的CAR-T细胞为例，多肽可以包含用于结合CAR的抗原识别结构域的表位，并且可以包含或可以不包含用于促进多肽的溶解度和稳定性增加的额外序列。
在抗nfP2X7受体CAR T细胞的特定实例中，用于本发明方法的分子将优选为肽或多肽的形式，其包含E200、E300或复合表位的氨基酸序列，如本文所定义。在特别优选的实施方案中，该分子是包含E200表位的氨基酸序列的多肽或肽，优选至少包含如SEQ ID NO:3、4、5或6中任一项所示的序列的多肽或肽。另外，肽或多肽可以包含衍生自nfP2X7受体序列且邻近天然受体序列内的E200表位出现的额外氨基酸残基。此外，多肽可以包含额外的氨基酸残基以改善多肽的溶解度和/或稳定性，如添加衍生自富含甘氨酸/丝氨酸的接头区和/或IgG铰链区的氨基酸残基。本文在表1中提供了对“最小”E200表位序列的此种添加的若干实例，尽管技术人员将理解可以使用任何数量的替代修饰。
确认给定分子被相关CAR结合的能力也完全在本领域技术人员的能力范围内。例如，在结合nfP2X7受体的CAR的背景下，技术人员将能够使用常规技术来确认CAR对多肽(或一系列多肽)的结合，从而确定多肽用于本发明的方法中的适用性。
在除了设计用于结合nfP2X7受体或E200表位的CAR之外的更广泛的CAR背景中，技术人员将类似地能够确定设计的分子或多肽是否能够被CAR结合。例如，在确定了待抑制的免疫治疗剂后，技术人员可以容易地确定免疫治疗剂被设计结合的抗原。在最简单的实例中，这可以通过参考与免疫治疗剂相关的产品信息和靶抗原的知识来完成。然后技术人员可以配制用于破坏细胞免疫治疗剂和靶抗原的相互作用的分子(优选肽或多肽)的氨基酸序列。在最简单的实例中，技术人员可以设计包含与细胞免疫治疗剂的靶抗原相同的氨基酸序列的肽或多肽。
最后，技术人员在鉴定了用于破坏细胞免疫治疗剂和本发明的靶抗原的相互作用的分子的适当氨基酸内容后，可以使用常规技术容易地确定该分子是否：a)被CAR T细胞结合和b)能够成功抑制CAR T细胞的细胞杀伤。确定与靶抗原的结合和细胞毒性的方法是本领域众所周知的。用于确定与CAR T细胞的结合和细胞杀伤减少的非限制性方法和各种实验方案在本文的实施例中详细描述。
用于促进多肽溶解度和稳定性增加的序列的进一步实例可以包括血清白蛋白(优选HSA)、转铁蛋白、抗体Fc区的序列或绒毛膜促性腺激素(CG)β链的羧基端肽的序列。其他序列可以包括非结构化多肽序列以增加整个多肽的总体尺寸和流体动力学半径。此类方法先前被称为“XTENylation”(非精确重复肽序列)、“PASylation”(由脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物组成的多肽序列融合，即PAS)、“ELPylation”(与弹性蛋白样肽(ELP)重复序列的融合)、“HAPylation”(例如，包含甘氨酸残基的均聚物)或GLK(明胶样蛋白)融合物。
应当理解，可以采用多种其他结构，例如，包含表位的多肽可以缀合或融合至任何合适的载体部分。在某些实施方案中，载体部分可以选自：碳水化合物、脂质、脂质体、肽和适体。
在一些实施方案中，多肽可以在包含PEG偶联表面上的多肽的脂质体(例如，聚乙二醇化脂质体)的背景下提供。这提供了包被有被细胞免疫治疗剂识别和结合的表位的脂质体。
在多肽包含抗体Fc区序列的情况下，并且根据本发明的第一方面，Fc区优选不包含当被多肽结合时否则会靶向细胞免疫治疗剂进行细胞杀伤的序列。相反，根据本发明第二方面使用的多肽将优选包含确实包含此序列的抗体的Fc区。
本文中的术语“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C端区域。换言之，Fc区含有两个重链片段，其包含抗体的CH2和CH3结构域。在本发明的上下文中，Fc区包含两个重链片段，优选所述重链的CH2和CH3结构域。两个重链片段通过两个或更多个二硫键和通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
根据本发明的第一方面，Fc融合蛋白优选不表现出任何效应功能或任何可检测的效应功能。“效应功能”或“效应活性”是指归因于抗体Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型而变化。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；和B细胞激活。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的减少/耗竭。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结于Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的464页的表3。
评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如,Hellstrom,I.et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))以及Hellstrom,I et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可以采用非放射性测定方法(参见例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA；和CytoTox非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,WI)。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代性地或额外地，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在如公开于Clynes et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95:652-656(1998)中的动物模型中。还可以进行C1q结合测定，以确认抗体无法结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.et al.,Blood 101:1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.and M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。FcRn结合和体内清除/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法进行(参见例如，Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO 2013/120929Al)。
效应功能降低的抗体Fc区包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些(美国专利号6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处具有取代的Fc突变体，包括将残基265和297取代为丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。例如，抗体变体可以包含具有一个或多个减少FcγR结合的氨基酸取代的Fc区，例如在Fc区的位置234和235处的取代(残基的EU编号)。例如，取代是L234A和L235A(LALA)(参见例如WO 2012/130831)。此外，可以在Fc区中进行改变，导致C1q结合改变(即减少)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie et al.J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
根据本发明第一方面使用的其他Fc修饰包括减少或消除与FcγR和/或补体蛋白结合的变体，从而减少或消除Fc介导的效应功能如ADCC、ADCP和CDC。此类变体在本文中也称为“敲除变体”或“KO变体”。减少与FcγR和补体结合的变体可用于减少Fc区介导的不需要的相互作用以及用于调节融合蛋白的选择性。优选的敲除变体描述于2008年10月2日公开的US2008-0242845A1中，题为“Fc Variants with Optimized Properties”，其通过引用明确并入本文。优选的修饰包括但不限于位置234、235、236、237、267、269、325和328处的取代、插入和缺失，其中编号根据EU索引。优选的取代包括但不限于234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L和328R，其中编号根据EU索引。优选的变体包括236R/328R。变体可以在任何IgG同种型或IgG同种型Fc区的背景下使用，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4。用于减少FcγR和补体结合以及减少Fc介导的效应功能的优选IgG Fc区是IgG2和IgG4 Fc区。杂合同种型也可以是有用的，例如美国系列号11/256,060中所述的杂合IgG1/IgG2同种型。用于减少FcγR和补体相互作用的其他修饰包括但不限于取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P和234V以及通过突变或酶促手段或通过在不糖基化蛋白质的生物体(如细菌)中产生来去除位置297处的糖基化。这些和其他修饰综述于Strohl,2009,Current Opinion in Biotechnology 20:685-691中，其通过引用整体并入。
根据本发明的第二方面，可以使用改善与FcγR和/或补体结合的Fc修饰。此类Fc变体可以增强Fc介导的效应功能，如ADCC、ADCP和/或CDC。用于改善FcγR和补体结合的优选修饰描述于2006年2月2日公开的US 2006-0024298A1和2006年10月19日公开的US2006-0235208 A1，其通过引用明确并入本文。优选的修饰包括在选自236、239、268、324和332的位置处的取代，其中编号根据EU索引。优选的取代包括但不限于236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D和332E。优选的变体包括但不限于239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T和267E/268F/324T。增强FcγR和补体相互作用的其他修饰包括但不限于取代298A、333A、334A、326A、2471、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、305I和396L。这些和其他修饰综述于同前所述的Strohl,2009中。
在一个实施方案中，本文公开的融合物可以掺入增强对抑制性受体FcγRIIb的亲和力的Fc变体。此类变体可以为本文的融合物提供与FcγRIIb+细胞(包括例如B细胞和单核细胞)相关的免疫调节活性。在一个实施方案中，相对于一种或多种激活受体，Fc变体选择性地提供对FcγRIIb的增强的亲和力。用于改变与FcγRIIb结合的修饰描述于2008年5月30日提交的美国系列号12/156,183，题为“Methods and Compositions for InhibitingCD32bExpressing Cells”，其通过引用明确并入本文。特别地，改善与FcγRIIb结合的Fc变体可以包括在选自234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328和332的位置处(根据EU索引)的一个或多个修饰。用于增强FcγRIIb亲和力的优选取代包括但不限于234D、234E、234W、235D、235F、235R、235Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y和332E。更优选地，取代包括但不限于235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W和328Y。用于增强与FcγRIIb结合的优选Fc变体包括但不限于235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E和267E/328F。
本文所述的融合蛋白可以在任何IgG同种型或IgG同种型Fc区的背景下掺入Fc修饰，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4。可选择IgG同种型以例如改变一种或多种FcγR和/或补体介导的效应功能。杂合IgG同种型也可以有用。例如，美国系列号US11/256,060描述了可用于特定发明的许多杂合IgG1/IgG2恒定区。在本发明的一些实施方案中，融合蛋白可以包含用于同种型修饰，即将亲本IgG修饰为替代IgG中的氨基酸类型的方式。例如，IgG1/IgG3杂合变体可以通过取代方式构建，用于在两种同种型不同的位置处用来自IgG3的氨基酸取代IgG1的CH2和/或CH3区中的位置。因此，可以构建包含一种或多种取代方式的杂合变体IgG抗体，取代方法例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435R和436F。在本发明的其他实施方案中，可以通过在两种同种型不同的位置处用来自IgG1的氨基酸取代IgG2的CH2和/或CH3区中的位置的取代方式来构建IgG1/IgG2杂合变体。因此，可以构建包含一种或多种取代方式的杂合变体IgG抗体，取代方式例如以下氨基酸取代中的一种或多种：233E、234L、235L、-236G(指在位置236处插入甘氨酸)和327A。
在本发明第二方面的实施方案中，本文公开的融合蛋白可掺入改善FcRn结合的Fc变体。此类变体可以增强融合蛋白的体内药代动力学特性。增加与FcRn的结合和/或改善药代动力学性质的优选变体包括但不限于位置259、308、428和434处的取代，包括但不限于例如259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y和434M(提交于2008年12月22日的美国系列号12/341,769，题为“Fc Variants with Altered Binding to FcRn”，其通过引用完全并入)。增加Fc与FcRn结合的其他变体包括但不限于：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton et al.,2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216,Hinton et al.2006Journal ofImmunology 176:346-356)、256A、272A、286A、305A、307A、307Q、311A、312A、376A、378Q、380A、382A、434A(Shields et al,Journal of Biological Chemistry,2001,276(9):6591-6604,其通过引用完全并入)、252F、252T、252Y、252W、254T、256S、256R、256Q、256E、256D、256T、309P、311S、433R、433S、433I、433P、433Q、434H、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H、308T/309P/311S(dall Acqua et al.Journal of Immunology,2002,169:5171-5180,Dall'Acqua et al.,2006,Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524,其通过引用完全并入)。用于调节FcRn结合的其他修饰描述于Yeung et al.,2010,J Immunol,182:7663-7671。
多肽可以是融合蛋白的形式，使得包含表位和任何其他序列的区域由单个核酸构建体编码，即“遗传融合”)。替代性地，多肽可以包含功能障碍的P2X7受体表位和经由化学缀合或经由肽非共价附接而连接的任何其他序列。
本文所述的融合蛋白可以包含用于连接包含功能障碍的P2X7受体表位的序列和本文所述的任何其他序列(例如，抗体的Fc区、HSA序列等)的接头区。
术语“接头”用于表示包含通过肽键连接的两个或更多个氨基酸残基的多肽，并且用于连接一个或多个抗原结合部分。此类接头多肽是本领域众所周知的(参见例如，Holliger,P.,et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448；Poljak,R.J.,et al.(1994)Structure 2:1121-1123)。多种接头可用于本文所述的一些实施方案以共价连接两个不同的多肽或肽序列。
本文中的“接头”也称为“接头序列”、“间隔区”、“系链序列”或其语法等同物。同源或异源双功能接头是众所周知的(参见1994Pierce Chemical Company目录，关于交联接头的技术部分，第155-200页，通过引用整体并入)。可以使用多种策略将分子共价连接在一起。这些包括但不限于蛋白质或蛋白质结构域的N末端和C末端之间的多肽连接、经由二硫键的连接以及经由化学交联试剂的连接。在该实施方案的一方面，接头是通过重组技术或肽合成生成的肽键。接头肽可以主要包含以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。接头肽的长度应足以连接两个分子，使它们相对于彼此呈现正确的构象，从而它们保留期望的活性。在一个实施方案中，接头的长度为约1至50个氨基酸，优选地长度为约1至30个氨基酸。在一个实施方案中，可以使用长度为1至20个氨基酸的接头。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头。替代性地，多种非蛋白质聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物，可能发现用作接头，即可用作接头。本发明的融合蛋白可以包含位于功能障碍的P2X7受体表位和本文所述的任何其他序列之间的接头区域(或间隔区)。
接头通常是长度最多为20个氨基酸的肽。术语“连接至”或“融合至”是指在两个部分之间形成的共价键，例如肽键。因此，在本发明的上下文中，接头的长度可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸。
在一些方面，本发明的融合蛋白包括肽接头。技术人员将熟悉适合用作根据本发明的接头的由各种氨基酸组成且具有各种长度的各种肽接头的设计和使用。接头可以包含重复氨基酸序列的各种组合。
接头可以是柔性接头(如包含甘氨酸和丝氨酸残基重复的那些)、刚性接头(如包含谷氨酸和赖氨酸残基、侧翼丙氨酸重复的那些)和/或可切割接头(例如易受蛋白酶切割影响的序列)。此类接头的实例是本领域技术人员已知的并且例如描述于Chen et al.,(2013)Advanced Drug Delivery Reviews,65:1357-1369中。
在一些方面，肽接头可以包括各种长度和组合的氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在一些方面，肽接头可以包括序列Gly-Gly-Ser(GGS)、Gly-Gly-Gly-Ser(GGGS)或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)及其变体或重复序列。在一些方面，肽接头可以包括氨基酸序列GGGGS(长度为6个氨基酸的接头)或甚至更长。接头可以是一系列不同长度的重复甘氨酸和丝氨酸残基(GS)，即(GS)n，其中n是1至15或更大的任何数字。例如，接头可以是(GS)3(即，GSGSGS)或更长的(GS)11或更长。应当理解，n可以是任何数字，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或更大。具有此种长度的接头的融合蛋白包括在本发明的范围内。类似地，接头可以是一系列由丝氨酸残基分隔的重复甘氨酸残基。例如，(GGGGS)3(即接头可包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(G4S)3)及其变体。
肽接头可以由Thr-Pro(TP)的一系列重复组成，其在重复序列的N端和C端包含一个或多个附加氨基酸。例如，接头可以包含序列GTPTPTPTPTGEF(也称为TP5接头)或由序列GTPTPTPTPTGEF组成。在另外的方面，接头可以是短的和/或α-螺旋刚性接头(例如A(EAAAK)3A、PAPAP或二肽如LE)。
在某些方面，接头可以是柔性的且可切割的。此类接头优选包含一个或多个蛋白酶识别位点以实现切割。
本发明优选的接头包含来自抗体铰链区的序列。可以使用来自任何抗体同种型的铰链区序列，包括例如来自IgG1、IgG2、IgG3和/或IgG4的铰链序列。接头序列还可以包括任何长度的CL/CH1结构域的任何序列，但不是CL/CH1结构域的所有残基；例如CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基。接头可以衍生自任何同种型的免疫球蛋白重链，包括例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ。接头可以衍生自免疫球蛋白轻链，例如Cκ或Cλ。接头序列还可以衍生自其他蛋白质，如Ig样蛋白质(例如TCR、FcR、KIR)、铰链区衍生序列和来自其他蛋白质的其他天然序列。
在本发明第二方面的替代实施方案中，分子可以是蛋白质缀合物的形式，其包含靶抗原表位形式(即，用于竞争结合细胞免疫治疗剂)的第一部分和毒素形式的第二部分。优选地，当此类分子与细胞免疫治疗剂结合时，细胞免疫治疗剂经历由毒素介导的细胞死亡。应当理解，可以利用任何合适的毒素(例如，通常与抗体缀合以引发细胞死亡的那些毒素)。
在本发明第二方面的某些实施方案中，分子可以是用于结合细胞免疫治疗剂的抗独特型抗体的形式，并且其缀合至细胞毒素或化疗剂用于触发细胞免疫治疗剂的细胞死亡。
技术人员将能够很好地鉴定根据本发明的此类实施方案使用的合适的抗独特型抗体。此外，技术人员将熟悉用于与抗独特型抗体缀合的合适的细胞毒性剂以用于本发明的该方面。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、1131、1125、Y90、Rel86、Rel88、Sml53、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂(例如，美登木素生物碱、奥瑞他汀、度洛西汀、卡奇霉素或其衍生物、紫杉烷类、甲氨蝶呤、亚德里亚霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷)、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其他嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，如核酸分解酶；抗生素；毒素，如小分子毒素或酶活性毒素。在一些实施方案中，抗体缀合至一种或多种细胞毒性剂，如化疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的蛋白质毒素、酶活性毒素,或其片段)、或放射性同位素。抗独特型抗体免疫缀合物还包括其中抗体与酶活性毒素或其片段缀合的那些，酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆蛋白A链、蒴莲素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白(Aleurites fordii protein)、石竹素蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆素、皂角抑制剂、白树素、丝裂霉素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。
抗独特型抗体和细胞毒性剂的缀合物可以使用多种已知蛋白质偶联剂中的任一种来制备，例如接头(参见Vitetta et al.,Science 238:1098(1987))、W094/11026。接头可以是促进细胞毒性药物在细胞中释放的“可切割接头”，如酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头和含二硫键接头(Chari et al.,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
核酸
本发明还提供了编码本文所述的用于抑制细胞免疫治疗剂的活性多肽的核酸分子。
使用体外方法，核酸可用于生成旨在根据本发明施用的多肽。替代性地，核酸可以促进多肽的体内表达，从而将核酸施用于需要治疗的受试者。在此类实施方案中，核酸可以包含编码多肽的核酸序列和用于诱导其表达的可控启动子。或者，启动子可以提供多肽的组成型表达。此外，应当理解，根据上下文，核酸可以用于编码多肽的核酸序列的瞬时表达。
核酸分子可以包含任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的或修饰的RNA或DNA。例如，核酸分子可以包括单链和/或双链DNA、单链和双链区域混合的DNA、单链和双链RNA、以及单链和双链区域混合的RNA。包含DNA和RNA的杂合分子可以是单链或更典型地是双链的或单链和双链区域的混合。另外，核酸分子可以包含含有RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。核酸分子还可以包含为了稳定性或其他原因而修饰的一种或多种修饰碱基或DNA或RNA骨架。DNA和RNA可以进行多种修饰；因此，术语“核酸分子”包括化学、酶促或代谢修饰的形式。
在本发明第二方面的一些实施方案中，核酸分子包含编码SEQ ID NO:2、3和4中任一项的氨基酸序列的核酸序列。
此外，本发明提供了包含编码本发明的多肽或其部分的核酸分子的核酸构建体。核酸构建体还可以包含以下一项或多项：一个或多个宿主的复制起点；在一个或多个宿主中有活性的选择标记基因；和/或一个或多个转录控制序列。
如本文所用，术语“选择性标记基因”包括赋予表达其的细胞以表型的任何基因，以促进用构建体转染或转化的细胞的鉴定和/或选择。
“选择性标记基因”包括任何核苷酸序列，当其由用构建体转化的细胞表达时，赋予细胞以促进这些转化细胞的鉴定和/或选择的表型。编码合适的选择标记的一系列核苷酸序列是本领域已知的(例如Mortesen,RM.and Kingston RE.Curr Protoc Mol Biol,2009；Unit 9.5)。编码选择性标记的示例性核苷酸序列包括：腺苷脱氨酶(ADA)基因；胞嘧啶脱氨酶(CDA)基因；二氢叶酸还原酶(DHFR)基因；组氨醇脱氢酶(hisD)基因；嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶(PAC)基因；胸苷激酶(TK)基因；黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)基因或抗生素抗性基因，如氨苄青霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因；荧光报告基因，如绿色、红色、黄色或蓝色荧光蛋白编码基因；以及基于发光的报告基因，如萤光素酶基因，以及其他允许使用注入荧光激活细胞分选(FACS)等技术对细胞进行光学选择的基因。
此外，应当注意，选择性标记基因可以是构建体中的不同开放阅读框，或者可以表达为与另一种多肽(例如CAR)的融合蛋白。
如上所述，核酸构建体还可以包含一种或多种转录控制序列。术语“转录控制序列”应当理解为包括影响可操作地连接的核酸的转录的任何核酸序列。转录控制序列可以包括例如前导序列、聚腺苷酸化序列、启动子、增强子或上游激活序列、以及转录终止子。通常，转录控制序列至少包括启动子。如本文所用，术语“启动子”描述赋予、激活或增强细胞中核酸表达的任何核酸。
在一些实施方案中，至少一种转录控制序列可操作地连接至本发明第二方面的核酸分子。出于本说明书的目的，当转录控制序列能够促进、抑制或以其他方式调节核酸分子的转录时，转录控制序列被视为与给定核酸分子“可操作地连接”。因此，在一些实施方案中，核酸分子处于转录控制序列如组成型启动子或诱导型启动子的控制之下。
“核酸构建体”可以是任何合适的形式，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、载体等的形式，其在与适当的控制元件缔合时能够复制并且可以在细胞之间转移构建体中含有的基因序列。因此，该术语包括克隆和表达媒介物以及病毒载体。在一些实施方案中，核酸构建体是载体。在一些实施方案中，载体是病毒载体。
启动子可以相对于表达发生的细胞、组织或器官组成型或差异性地调节可操作连接的核酸分子的表达。因此，启动子可以包括例如组成型启动子或诱导型启动子。“组成型启动子”是在大多数环境和生理条件下有活性的启动子。“诱导型启动子”是在特定环境或生理条件下有活性的启动子。本发明考虑使用在感兴趣的细胞中有活性的任何启动子。因此，本领域普通技术人员可以容易地确定多种启动子。
哺乳动物组成型启动子可以包括但不限于猿猴病毒40(SV40)、巨细胞病毒(CMV)、P-肌动蛋白、泛素C(UBC)、延伸因子-1α(EF1A)、磷酸甘油酸激酶(PGK)和CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAGG)。
诱导型启动子可以包括但不限于化学诱导型启动子和物理诱导型启动子。化学诱导型启动子包括具有受化学化合物如醇、抗生素、类固醇、金属离子或其他化合物调节的活性的启动子。化学诱导型启动子的实例包括：四环素调节的启动子(例如参见美国专利5,851,796和美国专利5,464,758)；类固醇响应性启动子，如糖皮质激素受体启动子(例如参见美国专利5,512,483)、蜕皮激素受体启动子(例如参见美国专利6,379,945)等；以及金属响应性启动子如金属硫蛋白启动子(例如参见美国专利4,940,661、美国专利4,579,821和美国专利4,601,978)等。
如上所述，控制序列还可以包括终止子。术语“终止子”是指位于转录单元末端的、发出转录终止信号的DNA序列。终止子是通常含有聚腺苷酸化信号的3'-非翻译DNA序列，有助于将聚腺苷酸序列添加到初级转录物的3'-末端。与启动子序列一样，终止子可以是在其预期使用的细胞、组织或器官中可操作的任何终止子序列。合适的终止子是本领域技术人员已知的。
如将理解的，本发明的核酸构建体还可以包括额外的序列，例如允许增强的表达、细胞质或膜运输和定位信号的序列。具体的非限制性实例包括内部核糖体进入位点(IRES)或切割位点(例如P2A、T2A)。
本发明延伸至基本上如本文所述的所有遗传构建体。这些构建体还可以包括旨在用于在真核生物中维持和/或复制遗传构建体和/或将遗传构建体或其部分整合到真核细胞基因组中的核苷酸序列。
用于将外源遗传物质例如本发明第三方面的核酸构建体有意引入(转染/转导)至真核细胞中的方法是本领域已知的。应当理解，最适合将核酸构建体引入期望宿主细胞的方法取决于许多因素，例如核酸构建体的大小、宿主细胞的类型、期望的转染/转导效率和转染/转导细胞的最终期望或所需的活力。此类方法的非限制性实例包括：化学转染，使用化合物如阳离子聚合物、磷酸钙或结构如脂质体和树枝状聚合物进行；非化学方法，如电穿孔、声穿孔、热休克或光转染；基于粒子的方法，如“基因枪”递送、磁转染、穿刺或病毒转导。
将根据期望的转染/转导方法来选择核酸构建体。在本发明第三方面的一些实施方案中，核酸构建体是病毒载体，并且用于将核酸构建体引入宿主细胞的方法是病毒转导。利用病毒转导来引发PBMC中CAR表达的方法是本领域已知的(Parker,LL.et al.Hum GeneTher.2000；11:2377-87)，并且更通常地利用逆转录病毒系统来转导哺乳动物细胞(Cepko,C.和Pear,W.Curr Protoc Mol Biol.2001,unit 9.9)。在其他实施方案中，核酸构建体是质粒、粘粒、人工染色体等，并且可以通过本领域已知的任何合适的方法转染至细胞中。
治疗和施用方法
如本文中进一步讨论的，本发明可用于多种病况的治疗，但优选用于癌症的治疗。
更具体地，本发明特别适用于微调或关闭靶向功能障碍的P2X7受体的各种细胞免疫疗法。此类应用可用于治疗、最小化或降低由此类细胞免疫疗法导致的异常免疫反应的风险。
免疫系统的不适当或不受控制的激活可能导致潜在致命的免疫反应，该免疫反应由细胞因子和白细胞之间的正反馈环组成，同时多种细胞因子的水平高度升高。此种不受控制的免疫激活，通常称为细胞因子级联、细胞因子相关毒性、细胞因子释放综合征，能够由多种身体状况或医学治疗引起，最显著的是专门利用受体的免疫系统来对抗疾病的免疫疗法。
尽管可以使用不同的术语来描述细胞因子风暴、细胞因子级联或细胞因子释放综合征，但所有这些状况的共同点是免疫系统不受控制的激活，这能够导致潜在的致命后果。
如本文所用，细胞因子相关毒性是指响应于异常免疫系统激活的潜在危及生命的异常细胞因子，例如异常免疫系统激活由疾病但也包括免疫调节疗法引起。
本领域中还使用术语细胞因子释放综合征(CRS)来描述细胞因子相关的毒性。当足够严重时，这种综合征可称为高细胞因子血症或“细胞因子风暴”。如本文所用，CRS定义了患者的全身炎症反应，其特征尤其是低血压、发热和/或寒战，并且可能导致死亡。CRS据信是由细胞因子和免疫细胞之间不受控制的正反馈环引起的，导致多种细胞因子水平高度升高。CRS还涉及免疫系统介质的全身表达，包括促炎细胞因子和抗炎细胞因子水平升高。
技术人员将熟悉细胞因子相关毒性或高细胞因子血症的临床表现，因此也将熟悉用于鉴定需要治疗细胞因子相关毒性(包括高细胞因子血症)的个体的各种方法。
下表列出了细胞因子相关毒性的一些公认的临床体征和症状：
表2：细胞因子相关毒性的临床体征
/>
此外，美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准(CTCAE v 4.0)包含针对与抗体治疗相关的细胞因子反应综合征而设计的分级系统，如下所示：
·1级-轻度反应；未指示输注中断；未指示干预
·2级-指示治疗或输注中断，但对症治疗(例如抗组胺药、
NSAIDS、麻醉药、静脉输液)有迅速反应；指示预防性药物持续<24小时
·3级-延长(例如，对对症药物没有快速反应和/或短暂中断输注)；
初步改善后症状复发；指示因临床后遗症(例如肾功能损害、肺部浸润)而需要住院治疗
·4级-危及生命的后果；指示加压或通气支持
本文所用的高细胞因子血症是由细胞因子和免疫细胞之间不适当的正信号传导以及最终细胞因子释放引起的潜在致命的免疫反应。对于患者来说，这会导致高烧、肿胀和发红、极度疲劳、恶心，在某些情况下甚至是致命的。虽然超过150种已知的炎症介质被认为在细胞因子风暴期间被释放，但通常在本发明的方法中，技术人员可以通过测量一种或多种合适的细胞因子的血清水平来确定细胞因子相关毒性的水平，例如可以测量1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种细胞因子，如独立地选自IL-1β、TNFα、IL-6、IL-8(CXCL8)、IL-2、IL-10、IFNγ、IL-12p70和GM-CSF(例如IL-6、TNFα、IFNγ、IL-2和IL-8)的细胞因子。
用于测量指示细胞因子相关毒性的细胞因子的血清水平的基于实验室的方法对于技术人员来说是已知的。这些方法将可用于本发明的方法中，例如，用于确定个体是否患有细胞因子相关毒性以及确定根据本发明的治疗是否已经成功。
用于测定生物样品(包括血清和血浆样品)中细胞因子水平的多种方法是技术人员已知的。简而言之，可以根据制造商的方案，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒通过ELISA测定生物样品中炎症细胞因子的水平。
或者，可以根据制造商的说明使用多重微珠阵列试剂盒(例如，Bio-Plex HumanCytokine Assay)测定血清细胞因子的水平。
技术人员还应当理解，由于某些个体的潜在疾病(对其他们正在接受免疫治疗)，基线炎性细胞因子水平可能非常高。因此，技术人员还应当理解，确定细胞因子水平的倍数增加、净增加或变化率增加而不是绝对水平可以提供个体中细胞因子相关毒性的可能性的更好指征。
确定细胞因子相关毒性可能性的其他方法包括监测指示细胞因子水平升高的蛋白质。例如，C反应蛋白(CRP)是由肝脏产生的急性期蛋白，通常可作为IL-6生物活性的可靠替代物。因此，技术人员还将理解测量CRP水平作为鉴定需要治疗细胞因子相关毒性的个体的手段的实用性。
本发明的方法还可用于在怀疑或存在肿瘤溶解综合征风险的情况下抑制细胞免疫治疗剂的活性或永久关闭细胞免疫治疗剂的活性。
因此，本发明提供了用于最小化或降低受试者中肿瘤溶解综合征风险的方法，所述受试者已经接受或正在接受用于结合细胞上的靶抗原(例如但不限于功能障碍的P2X7受体)的细胞免疫治疗剂的治疗，该方法包括：
-提供已经接受或正在接受使用结合细胞上的靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者；
-向受试者施用分子，任选地用于结合细胞免疫治疗剂的多肽或编码所述多肽的核酸，所述分子或多肽包含靶抗原的表位或由靶抗原的表位组成；
其中分子或多肽上的表位与靶抗原上的表位竞争结合细胞免疫治疗剂，并且分子或多肽由此破坏细胞免疫治疗剂和细胞上的靶抗原之间的相互作用；
从而最小化或降低受试者中肿瘤溶解综合征的风险。优选地，该方法不降低细胞免疫治疗剂的细胞的生存力。
在进一步的实施方案中，本发明提供了治疗受试者中的肿瘤溶解综合征的方法，所述受试者已经接受或正在接受用于结合靶抗原(例如但不限于功能障碍的P2X7受体)的细胞免疫治疗剂的治疗，该方法包括：
-提供已经接受或正在接受结合细胞上的靶抗原的细胞免疫治疗剂地治疗的受试者；
-向受试者施用分子，任选地以用于结合细胞免疫治疗剂的多肽或编码所述多肽的核酸的形式，所述分子或多肽包含靶抗原的表位或由靶抗原的表位组成；
其中分子多肽上的表位与靶抗原上的表位竞争结合细胞免疫治疗剂，并且分子或多肽由此破坏细胞免疫治疗剂和细胞上的靶抗原之间的相互作用；
从而治疗受试者的肿瘤溶解综合征。优选地，该方法不降低细胞免疫治疗剂的细胞的生存力。
在另外的实施方案中，本发明提供了用于最小化或降低已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中肿瘤溶解综合征的风险的方法，该方法包括：
-提供已经接受或正在接受结合细胞上的靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者；
-向受试者施用用于结合细胞免疫治疗剂的多肽或编码所述多肽的核酸；其中所述多肽包含：
i)竞争结合细胞免疫治疗剂的靶抗原的表位，并且该多肽从而破坏细胞免疫治疗剂和细胞上的靶抗原之间的相互作用；
ii)用于触发细胞介导的杀伤的氨基酸序列，
其中，在多肽与细胞治疗剂结合后，细胞免疫治疗剂被靶向进行细胞介导的杀伤；
从而最小化或降低受试者中肿瘤溶解综合征的风险。
在另外的实施方案中，本发明提供了用于治疗已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中肿瘤溶解综合征的方法，该方法包括：
-提供已经接受或正在接受结合细胞上的靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者；
-向受试者施用用于结合细胞免疫治疗剂的多肽或编码所述多肽的核酸；其中所述多肽包含：
i)竞争结合细胞免疫治疗剂的靶抗原的表位，并且该多肽从而破坏细胞免疫治疗剂和细胞上的靶抗原之间的相互作用；
ii)用于触发细胞介导的杀伤的氨基酸序列，
其中，在多肽与细胞治疗剂结合后，细胞免疫治疗剂被靶向进行细胞介导的杀伤；
从而治疗受试者的肿瘤溶解综合征。
如本文所用，肿瘤溶解综合征是指在癌症治疗期间可能作为并发症发生的一组代谢异常，其中大量肿瘤细胞通过治疗被同时溶解，将其内容物释放到血流中。这种情况最常发生在淋巴瘤和白血病治疗后。在肿瘤学和血液学中，这是一种潜在的致命并发症，对于TLS风险增加的患者，应在化疗之前、期间和之后进行密切监测。
肿瘤溶解综合征的特点是高血钾(高钾血症)、高血磷(高磷血症)、低血钙(低钙血症)、高血尿酸(高尿酸血症)以及高于正常水平的血尿素氮(BUN)和其他含氮化合物(氮血症)。血液电解质和代谢物的这些变化是由于细胞分解而将垂死细胞的细胞内容物释放到血流中的结果。在这方面，TLS类似于横纹肌溶解症，具有相似的机制和血液化学效应，但具有不同的原因。在TLS中，细胞毒性治疗后或细胞更新率和肿瘤增殖率较高的癌症中会发生分解。肿瘤溶解综合征中的代谢异常最终能够导致恶心和呕吐，但更严重的是急性尿酸性肾病、急性肾衰竭、癫痫发作、心律失常和死亡。
应当理解，本发明的方法在施用本文所述的细胞免疫治疗剂和分子的时间安排方面提供了灵活性。在本发明第一方面的某些实施方案中，包含靶抗原表位的分子(例如，多肽)的施用时机可以使得仅在需要减少细胞免疫治疗剂活性的第一个迹象或指示时(例如，循环细胞因子存在增加的证据，这可能预示着即将发生的细胞因子风暴)施用该分子。
替代性地，根据本发明的第一方面，可以在细胞免疫治疗剂已经成功地减少了显著比例的肿瘤负荷，但期望给予细胞免疫治疗剂重新增殖/恢复效力的机会的时间之后施用分子。通过这种方式，施用分子的时机使临床医生能够暂时关闭细胞免疫疗法以防止细胞耗竭。此外，确定施用的分子的适当剂量以使得细胞活性能够轻度、中度或显著降低将在本领域技术人员的能力范围内。此外，可以根据剂量梯度施用多肽，以能够逐渐抑制细胞的活性。
CAR T细胞的强直激活可能导致过度激活和激活诱导的细胞死亡。在效应细胞存活的情况下，经由CAR受体对CAR T细胞进行强效激活，导致成熟为Teff细胞并高表达标志物PD-1、TIGIT、TIM-3和其他被定义为激活标志物的标志物，并导致免疫细胞耗竭。耗竭的细胞无法进行克隆扩增，并且它们失去效应功能。T细胞的慢性激活会导致其功能障碍，CART细胞也是如此。募集T细胞的癌症免疫治疗中的一个主要障碍是慢性激活，这能够导致：急性过度激活和激活诱导的细胞死亡；导致T细胞和CAR T细胞的功能障碍的慢性强直激活(没有任何恢复期)。为细胞提供休息或恢复期能够恢复T细胞和CAR T细胞长期效应功能所需的T细胞功能或CAR T细胞功能水平。
与所谓的“液体癌”相比，CAR T细胞清除实体癌肿瘤细胞需要更长的时间间隔。在Kymriah(抗CD19 CAR T细胞疗法)治疗的B细胞前体ALL等B谱系恶性肿瘤中，大多数患者在2周后发现肿瘤清除，并且最晚在4周后发现完全响应(完全MRD响应)。这意味着所有肿瘤细胞都被消除，从而使CART细胞有机会恢复其功能。在淋巴瘤中，肿瘤清除变得更加困难，因为完全响应的时间可能需要几个月，而且T细胞已经显示出功能障碍的迹象。激活时间是非生理性延长的。在实体癌中，肿瘤清除可能需要甚至更长的时间(超过6个月)，并且与肿瘤微环境相结合，CAR T细胞表现出部分由于慢性强直激活驱动的功能障碍。为细胞提供周期性激活阶段(CAR的功能阶段)和恢复阶段(CAR在此期间不识别癌细胞)有助于其持久存在。
因此，本发明第一方面的方法可以包括在施用用于抑制细胞活性的分子之前用细胞免疫治疗剂(例如，CAR T细胞)治疗的几周的周期。该周期可以是在施用促进活性可逆关闭或减弱的分子之前约2周、约3周、约4周、约5周或约6周的激活期。活性被抑制或关闭的时间段可以是约1周的时间段、约2周的时间段或更长的时间段。在某些实施方案中，根据本发明的第一方面，CAR T活性的时期是约2周，随后是CAR T活性被可逆抑制的约2周。
根据本发明的第二方面，在某些情况下可能需要快速清除并永久关闭细胞免疫治疗剂的活性。同样，施用分子的时机将很容易由临床医生确定，并且可能是在免疫治疗剂触发的潜在有害免疫反应的迹象出现时，使得细胞免疫治疗剂的活性需要永久关闭以利于接受治疗的受试者。
实施例
实施例1：阻断抗nfP2X7CART细胞杀伤
T细胞用编码抗nfP2X7 CAR的慢病毒载体转导。所使用的CAR包含用于结合受体的E200表位的抗原结合结构域(如本文别处所述)。
CAR T细胞产品显示41％的CAR表达。效应物与靶标的比率为5:1(T细胞与MOLM-13)，对应于2:1的ET比率(nfP2X7-CAR T与MOLM-13)。
将来自组成型表达萤火虫萤光素酶和eGFP报告基因的MOLM-13细胞系(MOLM-13_LUC_eGFP)的细胞按每孔25,000个细胞进行接种，并以指定的ET接种CAR T细胞。
使用四种不同的肽变体来减少nfP2X7 CAR T细胞对MOLM-13癌细胞的杀伤(图1A)。所有4种肽均包含nfP2X7的E200表位序列，这也是本研究中使用的nfP2X7 CAR结合的表位。这些肽在N端和C端区域包含不同的接头区域。表1中提供了肽的序列。
如图1A所示，所有4种肽都能够减少直接抗原结合CAR T细胞参与减少24小时后仍存活的MOLM-13细胞百分比所指示的癌细胞数量的情况。这表明使用包含由CAR抗原结合结构域识别的表位序列的肽可显著阻断直接CAR功能。
使用“间接”CAR T系统进行了类似的实验。简而言之，将MOLM-13细胞与抗nfP2X7CAR T细胞以及包含a)由CAR T细胞结合的表位和b)用于结合CD33的抗原结合结构域的多肽一起共培养。通过这种方式，该多肽能够使抗nfP2X7 CAR T细胞经由不同的抗原(为CD33)与MOLM-13细胞结合。与不添加肽时相比，第一个实验中使用的肽变体的进一步添加也显著减少了对MOLM-13细胞的杀伤(图1B)。
图2示出了nfP2X7 CAR T细胞杀伤MOLM-13癌细胞的减少的动力学。24小时后，这些肽继续阻断CAR T细胞杀伤细胞，而在没有这些肽的情况下，CART细胞继续降低MOLM-13细胞的生存力。
实施例2：抗nfP2X7CART细胞杀伤的阻断是由于肽与nfP2X7CAR的相互作用
图3显示T细胞杀伤细胞的减少具体是由于肽与nfP2X7 CAR的相互作用。更具体地说，将T细胞(未修饰的或表达nfP2X7 CAR的)与JeKo-1细胞以5比1的ET比率进行培养。使用5μg/mL的肽变体2进行阻断。
在共培养的第5天，测量细胞计数并评估JeKo-1细胞总数。实验中第1天和第3天添加的JeKo-1细胞总数为20,000个(因此每个条件添加的细胞总数为40,000个JeKo-1)。在实验的第一组中，即使用不表达nfP2X7 CAR的T细胞，共培养5天后，JeKo-1细胞总共增殖至60,000个细胞。该结果并未因添加阻断肽而改变。
相反，在实验的第二组中(即使用表达nfP2X7 CAR的T细胞)，当不添加阻断肽时，在共培养的第5天没有观察到JeKo-1细胞。添加5μg/mL的阻断肽变体2逆转了这一情况，5天后，培养物中存在40,000个JeKo-1细胞。这些结果表明，通过使用包含被T细胞表达的CAR识别的表位的肽，可以减少(即抑制)CAR T细胞对癌细胞的杀伤。
图4还显示，肽对CAR T功能的阻断可以通过减少肽的用量来控制，使用更大量的肽可以更大程度地阻断细胞杀伤。换言之，效果是剂量依赖性的。
应当理解，本说明书中公开和定义的本发明延伸至从文本或附图中提及或显而易见的两个或更多个单独特征的所有替代组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各个替代方面。
序列表
<110> 生物权威（澳大利亚）有限责任公司
<120> 控制免疫细胞活性的方法
<130> 53166790AZD
<150> 2021901030
<151> 2021-04-08
<160> 70
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 595
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Pro Ala Cys Cys Ser Cys Ser Asp Val Phe Gln Tyr Glu Thr Asn
1 5 10 15
Lys Val Thr Arg Ile Gln Ser Met Asn Tyr Gly Thr Ile Lys Trp Phe
20 25 30
Phe His Val Ile Ile Phe Ser Tyr Val Cys Phe Ala Leu Val Ser Asp
35 40 45
Lys Leu Tyr Gln Arg Lys Glu Pro Val Ile Ser Ser Val His Thr Lys
50 55 60
Val Lys Gly Ile Ala Glu Val Lys Glu Glu Ile Val Glu Asn Gly Val
65 70 75 80
Lys Lys Leu Val His Ser Val Phe Asp Thr Ala Asp Tyr Thr Phe Pro
85 90 95
Leu Gln Gly Asn Ser Phe Phe Val Met Thr Asn Phe Leu Lys Thr Glu
100 105 110
Gly Gln Glu Gln Arg Leu Cys Pro Glu Tyr Pro Thr Arg Arg Thr Leu
115 120 125
Cys Ser Ser Asp Arg Gly Cys Lys Lys Gly Trp Met Asp Pro Gln Ser
130 135 140
Lys Gly Ile Gln Thr Gly Arg Cys Val Val Tyr Glu Gly Asn Gln Lys
145 150 155 160
Thr Cys Glu Val Ser Ala Trp Cys Pro Ile Glu Ala Val Glu Glu Ala
165 170 175
Pro Arg Pro Ala Leu Leu Asn Ser Ala Glu Asn Phe Thr Val Leu Ile
180 185 190
Lys Asn Asn Ile Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile
195 200 205
Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr Cys Thr Phe His Lys Thr Gln Asn Pro
210 215 220
Gln Cys Pro Ile Phe Arg Leu Gly Asp Ile Phe Arg Glu Thr Gly Asp
225 230 235 240
Asn Phe Ser Asp Val Ala Ile Gln Gly Gly Ile Met Gly Ile Glu Ile
245 250 255
Tyr Trp Asp Cys Asn Leu Asp Arg Trp Phe His His Cys Arg Pro Lys
260 265 270
Tyr Ser Phe Arg Arg Leu Asp Asp Lys Thr Thr Asn Val Ser Leu Tyr
275 280 285
Pro Gly Tyr Asn Phe Arg Tyr Ala Lys Tyr Tyr Lys Glu Asn Asn Val
290 295 300
Glu Lys Arg Thr Leu Ile Lys Val Phe Gly Ile Arg Phe Asp Ile Leu
305 310 315 320
Val Phe Gly Thr Gly Gly Lys Phe Asp Ile Ile Gln Leu Val Val Tyr
325 330 335
Ile Gly Ser Thr Leu Ser Tyr Phe Gly Leu Ala Ala Val Phe Ile Asp
340 345 350
Phe Leu Ile Asp Thr Tyr Ser Ser Asn Cys Cys Arg Ser His Ile Tyr
355 360 365
Pro Trp Cys Lys Cys Cys Gln Pro Cys Val Val Asn Glu Tyr Tyr Tyr
370 375 380
Arg Lys Lys Cys Glu Ser Ile Val Glu Pro Lys Pro Thr Leu Lys Tyr
385 390 395 400
Val Ser Phe Val Asp Glu Ser His Ile Arg Met Val Asn Gln Gln Leu
405 410 415
Leu Gly Arg Ser Leu Gln Asp Val Lys Gly Gln Glu Val Pro Arg Pro
420 425 430
Ala Met Asp Phe Thr Asp Leu Ser Arg Leu Pro Leu Ala Leu His Asp
435 440 445
Thr Pro Pro Ile Pro Gly Gln Pro Glu Glu Ile Gln Leu Leu Arg Lys
450 455 460
Glu Ala Thr Pro Arg Ser Arg Asp Ser Pro Val Trp Cys Gln Cys Gly
465 470 475 480
Ser Cys Leu Pro Ser Gln Leu Pro Glu Ser His Arg Cys Leu Glu Glu
485 490 495
Leu Cys Cys Arg Lys Lys Pro Gly Ala Cys Ile Thr Thr Ser Glu Leu
500 505 510
Phe Arg Lys Leu Val Leu Ser Arg His Val Leu Gln Phe Leu Leu Leu
515 520 525
Tyr Gln Glu Pro Leu Leu Ala Leu Asp Val Asp Ser Thr Asn Ser Arg
530 535 540
Leu Arg His Cys Ala Tyr Arg Cys Tyr Ala Thr Trp Arg Phe Gly Ser
545 550 555 560
Gln Asp Met Ala Asp Phe Ala Ile Leu Pro Ser Cys Cys Arg Trp Arg
565 570 575
Ile Arg Lys Glu Phe Pro Lys Ser Glu Gly Gln Tyr Ser Gly Phe Lys
580 585 590
Ser Pro Tyr
595
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性E200表位
<400> 2
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Cys
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体E200表位肽
(E200')
<400> 3
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200表位Cys至Ser修饰
<400> 4
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 延伸的E200 Cys至Ser修饰
<400> 5
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys
20
<210> 6
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 延伸的E200' Cys至Ser修饰 (22 aa)
<400> 6
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys Thr
20
<210> 7
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 延伸的E200'' Cys至Ser修饰
<400> 7
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys Thr Cys
20
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pep16
<400> 8
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Cys
1 5 10 15
<210> 9
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pep17
<400> 9
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys Thr Ser
20
<210> 10
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 延伸的Pep17 (27 aa)
<400> 10
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys
20 25
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 最小序列E200肽 (靶表位)
<400> 11
Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性E300表位
<400> 12
Lys Tyr Tyr Lys Glu Asn Asn Val Glu Lys Arg Thr Leu Ile Lys
1 5 10 15
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 变体E300表位肽(E30')
<400> 13
Lys Tyr Tyr Lys Glu Asn Asn Val Glu Lys Arg Thr Leu Ile Lys Val
1 5 10 15
Phe
<210> 14
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性E200/E300或复合表位
<400> 14
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Ala Gly Ala Lys
1 5 10 15
Tyr Tyr Lys Glu Asn Asn Val Glu Lys
20 25
<210> 15
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200 + G4S接头
<400> 15
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 16
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200 + 2xG4S接头
<400> 16
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 17
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200+3xG4S接头
<400> 17
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 18
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200_延伸的肽17v3 (24 aa)
<400> 18
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys Thr Gly Ser
20
<210> 19
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200_延伸的肽17v4 (22 aa)
<400> 19
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Gly Ser
20
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200_延伸的肽17v5 (19 aa)
<400> 20
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Gly Ser
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200_延伸的肽17v6 (22 aa)
(E200表位延伸至N端区域)
<400> 21
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Gly Ser
20
<210> 22
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200_延伸的肽17v7 (25 aa) +接头
<400> 22
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 23
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200_延伸的肽17v8 (30 aa) +接头
<400> 23
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 24
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200_延伸的肽17v9 (35 aa) +接头
<400> 24
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200_延伸的肽17v10 (30 aa)
<400> 25
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys
20 25 30
<210> 26
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200_延伸的肽17v11 (32 aa) +接头
<400> 26
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Gly Ser
20 25 30
<210> 27
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200_延伸的肽17v12 (35 aa) +接头
"天然肽 2"
<400> 27
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 28
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200_延伸的肽17v13 (25 aa) +接头
<400> 28
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Thr Phe His Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 29
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200_延伸的肽17v14 (22 aa) +接头
<400> 29
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 30
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200_延伸的肽17v15 (30 aa) +接头
<400> 30
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Thr Phe His Lys Thr Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 31
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200_延伸的肽17v16 (27 aa) +
<400> 31
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys Thr Gly Gly Gly Gly Ser
20 25
<210> 32
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200+IgG铰链
<400> 32
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
20 25
<210> 33
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200+GS接头_IgG铰链
<400> 33
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
20 25
<210> 34
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200+G4S接头+IgG铰链
<400> 34
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
20 25 30
<210> 35
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 延伸的E200+ _IgG铰链
<400> 35
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Glu Pro Lys Ser Ser
20 25 30
Asp Lys Thr His Thr
35
<210> 36
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 延伸的E200+ GS接头+_IgG铰链
<400> 36
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Gly Ser Glu Pro Lys
20 25 30
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
35
<210> 37
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 延伸的E200+ G4S接头+IgG铰链
<400> 37
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
35 40
<210> 38
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200+IgG铰链+GS接头
<400> 38
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Ser
20 25
<210> 39
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200+GS接头+IgG铰链+GS接头
<400> 39
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Ser
20 25 30
<210> 40
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200+G4S接头+IgG铰链+GS接头
<400> 40
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
20 25 30
Gly Ser
<210> 41
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 延伸的E200+_IgG铰链+GS接头
<400> 41
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Glu Pro Lys Ser Ser
20 25 30
Asp Lys Thr His Thr Gly Ser
35
<210> 42
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 延伸的E200+GS接头+_IgG铰链+GS接头
<400> 42
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Gly Ser Glu Pro Lys
20 25 30
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Ser
35 40
<210> 43
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 延伸的E200+G4S接头+_IgG铰链+GS接头
<400> 43
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Ser
35 40
<210> 44
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200+IgG铰链+G4S接头
<400> 44
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 45
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200+GS接头+IgG铰链+G4S接头
<400> 45
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser
<210> 46
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E200+G4S接头+IgG铰链+G4S接头
<400> 46
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser
35
<210> 47
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 延伸的E200+IgG铰链+G4S接头
<400> 47
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Glu Pro Lys Ser Ser
20 25 30
Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 48
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 延伸的E200+GS接头+IgG铰链+G4S接头
<400> 48
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Gly Ser Glu Pro Lys
20 25 30
Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 49
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 延伸的E200+G4S接头+IgG铰链+G4S接头
<400> 49
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
<210> 50
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-端延伸的E200 +IgG铰链
<400> 50
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
20 25 30
<210> 51
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-端延伸的E200 +GS接头+IgG铰链
<400> 51
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
20 25 30
<210> 52
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-端延伸的E200 +G4S接头+IgG铰链
<400> 52
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys
20 25 30
Thr His Thr
35
<210> 53
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N和C端延伸的E200+IgG铰链
<400> 53
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Glu Pro
20 25 30
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
35 40
<210> 54
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N和C端延伸的E200+GS接头+IgG铰链
<400> 54
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Gly Ser
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
35 40
<210> 55
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N和C端延伸的E200+ G4S接头+ IgG铰链
<400> 55
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
35 40 45
<210> 56
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-端延伸的E200+IgG铰链 +GS接头
<400> 56
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Ser
20 25 30
<210> 57
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-端延伸的E200+GS接头+IgG铰链 +GS接头
<400> 57
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
20 25 30
Gly Ser
<210> 58
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-端延伸的E200+G4S接头+IgG铰链 +GS接头
<400> 58
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys
20 25 30
Thr His Thr Gly Ser
35
<210> 59
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-端和C端延伸的E200 + IgG铰链+GS接头
<400> 59
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Glu Pro
20 25 30
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Ser
35 40
<210> 60
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-端和C端延伸的E200 +GS接头+ IgG铰链+GS接头
<400> 60
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Gly Ser
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Ser
35 40
<210> 61
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-端和C端延伸的E200 + G4S接头+IgG铰链+GS接头
<400> 61
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Ser
35 40 45
<210> 62
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-端延伸的E200+IgG铰链 +G4S接头
<400> 62
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser
35
<210> 63
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-端延伸的E200+GS接头+IgG铰链 +G4S接头
<400> 63
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Ser
35
<210> 64
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-端延伸的E200+G4S接头+IgG铰链 +G4S接头
<400> 64
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys
20 25 30
Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 65
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-端和C端延伸的E200 + IgG铰链+G4S接头
<400> 65
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Glu Pro
20 25 30
Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
<210> 66
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-端和C端延伸的E200 +GS接头+ IgG铰链+G4S接头
<400> 66
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Gly Ser
20 25 30
Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
<210> 67
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-端和C端延伸的E200 + G4S接头+IgG铰链+G4S接头
<400> 67
Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu
1 5 10 15
Asn Ile Thr Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Gly Gly Gly
35 40 45
Gly Ser
50
<210> 68
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "天然肽1"
<400> 68
Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr
1 5 10 15
Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
<210> 69
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "天然肽3"
<400> 69
Gly Gly Gly Gly Ser Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn Ile Leu Pro
1 5 10 15
Gly Leu Asn Ile Thr Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly Ser Gly Lys
20 25 30
<210> 70
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> "天然肽4"
<400> 70
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Phe Pro Gly His Asn Tyr Thr Thr Arg Asn
1 5 10 15
Ile Leu Pro Gly Leu Asn Ile Thr Ser Thr Phe His Lys Thr Ser Gly
20 25 30
Ser Gly Lys
35

Claims (42)

1.用于抑制已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的细胞免疫治疗剂的活性的方法，所述方法包括
提供已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者；
向所述受试者施用用于结合所述细胞免疫治疗剂的分子，所述分子包含所述靶抗原的表位或由所述靶抗原的表位组成；
其中所述分子上的表位与所述靶抗原上的表位竞争结合所述细胞免疫治疗剂，并且所述分子由此破坏所述细胞免疫治疗剂和所述靶抗原之间的相互作用；
从而抑制所述受试者中所述细胞免疫治疗剂的活性。
2.权利要求1的方法，其中所述抑制是可逆的，使得一旦所述分子已从所述受试者的循环中清除，所述细胞免疫治疗剂的活性就恢复。
3.权利要求2的方法，其中所述方法不降低所述细胞免疫治疗剂的细胞的生存力。
4.用于最小化或降低已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中异常炎症反应的风险的方法，所述方法包括：
提供已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者；
向所述受试者施用用于结合所述细胞免疫治疗剂的分子，所述分子包含所述靶抗原的表位或由所述靶抗原的表位组成；
其中所述分子上的表位与所述靶抗原上的表位竞争结合所述细胞免疫治疗剂，并且所述分子由此破坏所述细胞免疫治疗剂和所述靶抗原之间的相互作用；
从而抑制所述受试者中所述细胞免疫治疗剂的活性。
5.用于治疗已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中异常炎症反应的方法，所述方法包括：
提供已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者；
向所述受试者施用用于结合所述细胞免疫治疗剂的分子，所述分子包含所述靶抗原的表位或由所述靶抗原的表位组成；
其中所述分子上的表位与所述靶抗原上的表位竞争结合所述细胞免疫治疗剂，并且所述分子由此破坏所述细胞免疫治疗剂和所述靶抗原之间的相互作用；
从而抑制所述受试者中所述细胞免疫治疗剂的活性。
6.权利要求4或5的方法，其中所述异常炎症反应包括细胞因子相关的毒性。
7.权利要求6的方法，其中所述异常炎症反应包括“细胞因子释放综合征”(CRS)或高细胞因子血症。
8.用于增加受试者中的细胞免疫治疗剂的持久性的方法，其中所述细胞免疫治疗剂用于结合靶抗原，所述方法包括：
提供已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者；
向所述受试者施用用于结合所述细胞免疫治疗剂的分子，所述分子包含所述靶抗原的表位或由所述靶抗原的表位组成；
其中所述分子上的表位与所述靶抗原上的表位竞争结合所述细胞免疫治疗剂，并且所述分子由此破坏所述细胞免疫治疗剂和所述靶抗原之间的相互作用；
9.包含靶抗原的表位或由靶抗原的表位组成的分子在制备用于以下的药物中的用途：
a)抑制已经接受或正在接受用于结合所述靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的细胞免疫治疗剂的活性；
b)最小化或降低已经接受或正在接受用于结合所述靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中异常炎症反应的风险；
c)治疗已经接受或正在接受用于结合所述靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的异常炎症反应；
d)最小化或降低已经接受或正在接受用于结合所述靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中肿瘤溶解综合征的风险；
e)治疗已经接受或正在接受用于结合所述靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的肿瘤溶解综合征；或
f)增加受试者中的细胞免疫治疗剂的持久性，其中所述细胞免疫治疗剂用于结合所述靶抗原；
其中所述分子与所述靶抗原竞争结合所述细胞免疫治疗剂，并且所述分子由此破坏所述细胞免疫治疗剂和所述靶抗原之间的相互作用；
其中优选地，所述分子不降低所述细胞免疫治疗剂的细胞的生存力或不靶向所述细胞以进行细胞杀伤。
10.权利要求1至9中任一项的方法或用途，其中所述靶抗原在癌细胞的表面上表达或存在于癌细胞的表面上。
11.权利要求1至10中任一项的方法或用途，其中所述分子包含融合蛋白，所述融合蛋白包含所述表位和用于促进多肽的溶解度和稳定性改善的另外的序列。
12.权利要求11的方法或用途，其中所述另外的序列包含抗体的Fc区，其中所述抗体的Fc区不会触发ADCC或CDC。
13.权利要求11的方法或用途，其中所述另外的序列包含血清白蛋白。
14.用于抑制已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的细胞免疫治疗剂的活性的方法，所述方法包括：
-提供已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者；
-向所述受试者施用用于结合所述细胞免疫治疗剂的分子；其中所述分子包含：
i)竞争结合所述细胞免疫治疗剂的所述靶抗原的表位，并且所述分子由此破坏所述细胞免疫治疗剂和所述靶抗原之间的相互作用；
ii)用于触发细胞死亡的化合物，
其中，在所述分子与所述细胞治疗剂结合后，所述细胞免疫治疗剂经历细胞死亡或被靶向进行细胞介导的杀伤；
从而抑制所述受试者中所述细胞免疫治疗剂的活性。
15.用于最小化或降低已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中异常炎症反应的风险的方法，所述方法包括：
-提供已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者；
-向所述受试者施用用于结合所述细胞免疫治疗剂的分子；其中所述分子包含：
i)竞争结合所述细胞免疫治疗剂的所述靶抗原的表位，并且所述分子由此破坏所述细胞免疫治疗剂和所述靶抗原之间的相互作用；
ii)用于触发细胞死亡的化合物，
其中，在所述分子与所述细胞治疗剂结合后，所述细胞免疫治疗剂经历细胞死亡或被靶向进行细胞介导的杀伤；
从而抑制所述受试者中所述细胞免疫治疗剂的活性。
16.用于治疗已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中异常炎症反应的方法，所述方法包括：
-提供已经接受或正在接受用于结合靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者；
-向所述受试者施用用于结合所述细胞免疫治疗剂的分子；其中所述分子包含：
i)竞争结合所述细胞免疫治疗剂的所述靶抗原的表位，并且所述分子由此破坏所述细胞免疫治疗剂和所述靶抗原之间的相互作用；
ii)用于触发细胞死亡的化合物，
其中，在所述分子与所述细胞治疗剂结合后，所述细胞免疫治疗剂经历细胞死亡或被靶向进行细胞介导的杀伤；
从而抑制所述受试者中所述细胞免疫治疗剂的活性。
17.权利要求14或16中任一项的方法，其中所述分子降低所述细胞免疫治疗剂的细胞的生存力，优选靶向所述细胞进行降解/杀伤。
18.权利要求15至17中任一项的方法，其中所述异常炎症反应包括细胞因子相关的毒性。
19.权利要求18的方法，其中所述异常炎症反应包括“细胞因子释放综合征”(CRS)或高细胞因子血症。
20.包含靶抗原的表位的分子在制备用于以下的药物中的用途：
a)抑制已经接受或正在接受用于结合所述靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的细胞免疫治疗剂的活性；
b)最小化或降低已经接受或正在接受用于结合所述靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中异常炎症反应的风险；
c)治疗已经接受或正在接受用于结合所述靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的异常炎症反应；
d)最小化或降低已经接受或正在接受用于结合所述靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中肿瘤溶解综合征的风险；或
e)治疗已经接受或正在接受用于结合所述靶抗原的细胞免疫治疗剂的治疗的受试者中的肿瘤溶解综合征；
其中所述多肽包含：
i)与所述靶抗原竞争结合所述细胞免疫治疗剂的所述靶抗原的表位，并且所述分子由此破坏所述细胞免疫治疗剂和所述靶抗原之间的相互作用；
ii)用于触发细胞死亡的化合物，
其中，在所述分子与所述细胞治疗剂结合后，所述细胞免疫治疗剂经历细胞死亡或被靶向进行细胞介导的杀伤。
21.权利要求14至20中任一项所述的方法或用途，其中所述分子是融合蛋白的形式，所述融合蛋白包含所述表位和另外的序列，当所述细胞免疫治疗剂与所述多肽结合时，所述另外的序列用于促进靶向所述细胞免疫治疗剂进行细胞毒性T淋巴细胞(例如NK细胞)的细胞介导的杀伤。
22.权利要求21的方法或用途，其中所述另外的序列包含抗体的Fc区。
23.权利要求22的方法或用途，其中所述Fc区表现出效应功能并结合触发ADCC或CDC的Fcγ受体(FCγR)。
24.权利要求1至23中任一项的方法或用途，其中所述细胞免疫治疗剂包含免疫细胞或其祖细胞，其中所述免疫细胞表达包含抗原识别结构域和信号传导结构域的受体。
25.权利要求24的方法或用途，其中所述抗原识别结构域结合细胞表面上表达的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。
26.权利要求24的方法或用途，其中所述抗原识别结构域结合配体，所述配体促进所述细胞免疫治疗剂与癌细胞的结合。
27.权利要求25的方法或用途，其中所述抗原识别结构域结合选自下组的肿瘤相关抗原：CD33(Siglec-3)、CD123(IL3RA)、CD135(FLT-3)、CD44(HCAM)、CD44V6、CD47、CD184(CXCR4)、CLEC12A(CLL1)、FRp、MICA/B、CD305(LAIR-1)、CD366(TIM-3)、CD96(TACTILE)、CD133、CD56、CD29(ITGB1)、CD44(HCAM)、CD47(IAP)、CD66(CEA)、CD112(Nectin2)、CD117(c-Kit)、CD133、CD146(MCAM)、CD155(PVR)、CD171(LI CAM)、CD221(IGF1)、CD227(MUC1)、CD243(MRD1)、CD246(ALK)、CD271(LNGFR)、CD19、CD20、GD2，尤其是EGFR、间皮素、GPC3、MUC1、HER2、GD2、CEA、EpCAM、LeY、PCSA CD276和功能障碍的(nf)P2X7受体。
28.权利要求27的方法或用途，其中所述细胞免疫治疗剂的抗原识别结构域结合功能障碍的P2X7受体。
29.权利要求28的方法或用途，其中所述抗原识别结构域结合与所述功能障碍的P2X7受体的三磷酸腺苷(ATP)结合位点相关的表位。
30.权利要求29的方法或用途，其中所述抗原识别结构域结合包含所述功能障碍的P2X7受体的氨基酸位置210处的脯氨酸的表位。
31.权利要求28至30中任一项的方法或用途，其中所述受体的抗原识别结构域包含与结合所述功能障碍的P2X7受体的抗体或其片段的氨基酸序列同源的氨基酸序列。
32.权利要求31的方法或用途，其中所述抗原识别结构域包含与结合功能障碍的P2X7受体的抗体的片段-抗原结合(Fab)部分的氨基酸序列同源的氨基酸序列。
33.权利要求32的方法或用途，其中所述抗原识别结构域包含与结合功能障碍的P2X7受体的单链可变片段(scFv)或多价scFv的氨基酸序列或结合功能障碍的P2X7受体的单抗体结构域(sdAb)的氨基酸序列同源的氨基酸序列。
34.权利要求28至33中任一项的方法或用途，其中所述抗原识别结构域识别或结合E200、E300或E200-E300复合表位。
35.权利要求34的方法或用途，其中所述分子是包含E200、E300或E200-E300复合表位的氨基酸序列的肽或多肽，任选地其中所述分子包含如SEQ ID NO:2至70中任一个所示的氨基酸序列。
36.权利要求24至35中任一项的方法或用途，其中所述信号传导结构域包括衍生自激活受体的部分。
37.权利要求36的方法或用途，其中所述激活受体是CD3共受体复合物的成员或者是Fc受体。
38.权利要求3937的方法或用途，其中所述衍生自所述CD3共受体复合物的部分是CD3-ζ，且所述衍生自所述Fc受体的部分是FcεRI或FcγRI。
39.权利要求36至38中任一项的方法或用途，其中所述信号传导结构域包括衍生自共刺激受体的部分，任选地，其中所述信号传导结构域包括衍生自激活受体的部分和衍生自共刺激受体的部分。
40.权利要求39的方法或用途，其中所述共刺激受体选自由CD27、CD28、CD30、CD40、DAP10、OX40、4-1BB(CD137)和ICOS组成的组。
41.权利要求24至40中任一项的方法或用途，其中所述免疫细胞表达的受体是与细胞表面上表达的肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原结合的嵌合抗原受体(CAR)。
42.权利要求24至41中任一项的方法或用途，其中表达所述抗原受体的所述免疫细胞是本文所述的任何免疫细胞，或能够分化成免疫细胞的细胞(例如，免疫细胞的祖细胞)。
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