CN117147868A - 金属蛋白及能够形成金属蛋白的蛋白的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种金属蛋白及能够形成金属蛋白的蛋白的检测方法。所述金属蛋白的检测方法包括：将经过标记的金属蛋白样品引入到体积排阻色谱(SEC)中进行分离，之后采用电感耦合等离子体质谱(ICP‑MS)的高基体系统(HMI)对分离后的金属蛋白进行在线稀释，再利用ICP‑MS对稀释后的样品进行分析检测。本发明的方法解决了目前SEC‑ICP‑MS分析金属蛋白时，生物体系中高浓度盐分导致ICP‑MS检测灵敏度降低的问题，并且在30min内实现高盐基质样品中不同分子量金属蛋白的分离与检测，对金属蛋白的检出限低至μg/mL级别。本发明方法还具有检测灵敏度高、耗时短、重现性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物化学检测分析技术领域，具体涉及一种金属蛋白及能够形成金属蛋白的蛋白的检测方法。
背景技术
蛋白质不仅是生物体的基本组成成分，也是生物体各种功能的执行者。研究发现，生物体内约三分之一至二分之一的蛋白与金属元素结合形成金属蛋白(包括金属酶)，比如：血红蛋白、转铁蛋白等。金属蛋白参与了生物体内多种生命过程，包括新陈代谢、电子传递、信号传导、DNA合成等。为了探明金属蛋白在生物体生命过程中的具体生物学功能，需要对金属蛋白进行分离检测，这是金属蛋白研究的前提条件，因此证实生物体系中存在金属蛋白并对不同种类的金属蛋白进行分离和检测具有十分重要的意义。
在目前关于金属蛋白分析方法的研究中，与ICP-MS联用的技术得到了广泛关注，例如，柱状凝胶电泳-电感耦合等离子体质谱(GE-ICP-MS)、毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱(CE-ICP-MS)和体积排阻色谱-电感耦合等离子体质谱(SEC-ICP-MS)等。但是GE-ICP-MS联用方法仍存在前期系统搭建繁琐、凝胶制备及测样耗时等弊端，无法完成金属蛋白快速简便的分离检测。CE-ICP-MS由于迁移时间的重复性差和灵敏度有限而限制了其的广泛应用。SEC由于具有简单易行的测试原理和实验设计，在操作过程中易于掌控，在保证样品中蛋白质完整性的同时，能完成金属蛋白的快速分离，因此SEC是目前为止分离金属蛋白比较有效的技术之一。分析过程中，为了维持金属蛋白的结构，SEC分离体系的流动相必须与含盐较高的生物体系相一致，这会导致分离系统中流动相及金属蛋白基质本身的高盐成分进入到ICP-MS中，对SEC-ICP-MS检测带来两个挑战：(1)生物体系中的高盐成分进入到ICP-MS中，会带来基体干扰，降低检测灵敏度；(2)进样系统积累大量盐分，导致进样系统污染。因此，目前的金属蛋白分析方法均存在或多或少的缺陷，仍缺乏一种快速、简便、高效分离高盐基质中金属蛋白的分析方法。
发明内容
有鉴于此，本发明针对目前SEC-ICP-MS技术分析金属蛋白时高浓度盐分会导致ICP-MS检测灵敏度降低的问题，提供一种金属蛋白的检测方法，以期至少部分地解决上述技术问题。
为了实现上述目的，作为本发明的第一个方面，提出了一种金属蛋白的检测方法，包括如下步骤：
将金属蛋白样品通过体积排阻色谱进行分离，之后利用ICP-MS的高基体模式通入分离相对所述金属蛋白样品中的高盐基质进行在线稀释，然后再通过ICP-MS系统进行检测。
作为本发明的第二个方面，还提出了一种能够生成金属蛋白的蛋白样品的检测方法，先将所述能够生成金属蛋白的蛋白样品与含金属元素的试剂反应，孵育成金属蛋白样品，再利用如上所述的金属蛋白的检测方法进行检测。
基于上述方案可知，本发明的方法相对于现有技术至少具备如下有益效果，包括但不限于：
本发明结合SEC-ICP-MS联用技术，以SEC分离不同分子量的金属蛋白，并用ICP-MS对金属进行监测和定性定量分析，利用ICP-MS高基体模式，对SEC流动相中高盐基质进行在线稀释，既可以保证检测灵敏度，又有效地降低了高盐基质对进样系统的影响，使得SEC-ICP-MS可以高效分离和检测高盐基质中的金属蛋白，本发明提出的方法具有快速、高灵敏度、重现性好等特点；
本发明的方法可以在30min内实现高盐基质样品中不同分子量金属蛋白的分离与检测，对金属蛋白的检出限可以低至μg/mL级别；
同时，针对有结合能力但未结合金属离子的蛋白质，可与金属溶液孵育反应后形成金属蛋白，通过SEC-ICP-MS进行蛋白质分析，为蛋白质分析提供了另一种思路。
附图说明
图1是本发明的快速分析高盐基质中金属蛋白的主要流程；
图2是采用本发明的SEC-ICP-MS方法分析高盐基质中不同分子量金属蛋白标准溶液的谱图：(a)BSA，(b)OVA，(c)CA，(d)RA，(e)BSA、OVA、CA和RA的混合溶液；
图3是四种不同分子量金属蛋白保留时间与分子量拟合关系谱图；
图4是来自铅暴露后小鼠中性粒细胞蛋白样品中铅结合蛋白的SEC-ICP-MS谱图；
图5是金属标准曲线在不同溶剂和不同检测模式下的检出限柱状图；
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
针对目前SEC-ICP-MS技术分析金属蛋白时高浓度盐分会导致ICP-MS检测灵敏度降低的问题，本发明提出了一种快速、灵敏的分析高盐基质中金属蛋白的方法。
现有技术中，SEC在分离金属蛋白时，具有快速、不影响金属蛋白完整性的优势，但SEC分离体系的流动相必须与含盐较高的生物体系相一致，这会导致分离系统中流动相及金属蛋白基质本身的高盐成分进入到ICP-MS中，带来基体干扰，降低检测灵敏度，并导致进样系统积累大量盐分而被污染；传统降低高盐基质浓度的方法是对样品进行液体稀释，而此操作会带来污染风险和稀释误差，对检测结果的准确性产生影响。ICP-MS是一种具有高灵敏度和高选择性以及大线性校准范围的检测器，其并不能直接分析检测金属蛋白，需要与柱状凝胶电泳(GE)、毛细管电泳(CE)或体积排阻色谱(SEC)等技术联用，但是GE-ICP-MS联用方法仍存在前期系统搭建繁琐、凝胶制备及测样耗时等弊端，无法完成金属蛋白快速简便的分离检测，而CE-ICP-MS由于迁移时间的重复性差和灵敏度有限而限制了其的广泛应用，SEC-ICP-MS则由于上述的高盐分污染而影响了检测精度。
ICP-MS的高基体系统(HMI系统)是一种针对进入ICP-MS检测器中的高盐基质提出的系统，其具有由计算机控制且可重现的特点，相较于人工进行的液体稀释等常规降低高盐基质浓度的方法，HMI系统节约了时间和试剂成本，降低了风险，减少了误差。在最近五到十年的跟踪文献研究中未发现其应用于金属蛋白的分析和检测的案例，猜测可能是因为金属蛋白显示为配位化合物的性质，金属离子离解度没有那么强，所属技术领域的普通技术人员在之前对金属蛋白的检测通常只用繁琐的前处理液体稀释方法来解决高盐基质的影响，并没有想到可以使用测量金属离子的高基体系统对金属蛋白进行稀释和检测。
本发明人经过大量试验研究进一步发现，SEC-ICP-MS的联用技术结合高基体系统(HMI系统)，可实现高盐基质中金属蛋白的快速分离和检测。区别于传统检测方式，HMI系统可以对进入ICP-MS的金属蛋白高盐基质进行在线稀释，可以调节不同的稀释强度，能够减少ICP-MS进样系统基体沉积而不影响金属蛋白的分离检测，使得SEC-ICP-MS系统也可以实现高盐基质中金属蛋白的快速分离和高灵敏检测。通过条件优化，本发明人经过研究总结发现，可以利用SEC对不同分子量金属蛋白进行分离，从而建立了SEC-ICP-MS联用技术结合HMI系统分析金属蛋白的新方法。
具体地，本发明公开了一种金属蛋白的检测方法，包括如下步骤：
将金属蛋白样品通过体积排阻色谱(SEC)进行分离，之后利用ICP-MS的高基体(HMI)模式通入分离相对所述金属蛋白样品进行在线稀释，然后再通过ICP-MS系统进行检测。
其中优选地，所述分离相为高纯氩气；通入分离相的位置例如为ICP-MS系统的高基体模式系统，更具体的例如为雾化器与矩管之间的连接管处。由此，金属蛋白样品在通过SEC分离之后、进入ICP-MS检测之前，利用高基体模式在雾化器与矩管之间的连接管处通入高纯氩气对样品中的高盐基质进行在线稀释，可以降低金属蛋白样品在进入等离子体之前的密度，同时减少了高盐基质对金属蛋白检测过程中灵敏度的影响。
其中优选地，所述将金属蛋白样品通过体积排阻色谱进行分离的步骤具体包括：
(a)配制一定浓度的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和硫酸钠混合溶液作为流动相，用稀硝酸与氢氧化钠调节流动相的pH，将经过pH调节后的流动相作为高盐基质，超声脱气待用；
(b)使用步骤(a)中制备的流动相，不改变流动相组分及流速的条件下将所述金属蛋白样品进样到体积排阻色谱中，并根据分子量的不同对蛋白进行在线分离，同时将保留时间和分子量进行拟合，根据保留时间与分子量的拟合关系，完成蛋白的定性分析。
其中优选地，在所述步骤(a)中，含盐流动相经过调节后pH应在6.5到7.5之间，优选pH为7.0；
在所述步骤(b)中，金属蛋白样品进样量与流速在不改变流动相组分及流速的条件下分别为20μL和0.5mL/min。
其中优选地，所述利用高基体模式通入分离相对所述金属蛋白样品进行在线稀释，然后再通过ICP-MS系统进行检测的步骤具体包括：
(c)将步骤(b)中分离得到的不同分子量蛋白引入ICP-MS，利用高基体模式在雾化室与矩管之间的连接管处通入高纯氩气对高基体溶液进行在线稀释，然后通过时间分辨模式(TRA)对金属蛋白的保留时间与信号值进行监测，得到金属蛋白保留时间与信号值谱图。将不同浓度蛋白与Mass Hunter数据处理软件得出的蛋白峰面积进行拟合，通过拟合关系实现蛋白的定量分析。
其中优选地，在所述步骤(c)中，所述高基体模式为高基体低稀释模式，高纯氩气流速为0.2-0.5L/min；
其中优选地，在所述步骤(c)中，选用高基体低稀释模式时ICP-MS使用的载气为氩气且所述载气流速为0.6-0.7L/min。
本发明还公开了一种能够生成金属蛋白的蛋白样品的检测方法，先将所述能够生成金属蛋白的蛋白样品与含金属元素的试剂反应，孵育成金属蛋白样品，再利用如上所述的金属蛋白的检测方法进行检测。如此，以前只能通过红外、质谱等方法测量的蛋白质分子也可以通过先形成金属蛋白样品，再利用检测金属成分的ICP-MS系统进行分析检测，结果更方便准确。
其中优选地，所述能够生成金属蛋白的蛋白样品经过如下方法与含金属元素的试剂反应，孵育成金属蛋白样品：
(1)用饱和金属溶液与浓度为1mg/mL的待测试蛋白样品溶液以设定比例混合，室温下孵育反应15min以得到金属标记的蛋白样品溶液，将经过标记的蛋白样品溶液与亚硫酸氢钠混合进行中和反应，将经过中和后的样品进行超滤后得到待分析的金属蛋白样品。
其中优选地，在步骤(1)中使用的饱和金属溶液为饱和碘化钾溶液；
其中优选地，在所述步骤(1)中蛋白质与碘化钾饱和溶液的体积比为9:1，使用的亚硫酸氢钠浓度为100mmol/L，经过标记的蛋白样品溶液与亚硫酸氢钠的混合体积比例为9:1。
其中优选地，在所述步骤(1)中的超滤是将经过中和之后的蛋白样品溶液在4℃、10000g、10min条件下超滤5次；然后用pH＝7.5的0.1MTris-HCl定容到1mg/mL，使用前稀释至0.1mg/mL作为待分析的金属蛋白样品。
在一个优选的具体实施方式中，如图1所示，本发明的能够形成金属蛋白的蛋白的检测方法，包括如下步骤：
由蛋白样品制备金属蛋白样品/配制高盐流动相；
将所述金属蛋白样品通过体积排阻色谱(SEC)进行分离；
利用ICP-MS的高基体(HMI)模式通入分离相对所述金属蛋白样品进行在线稀释，然后再通过ICP-MS系统进行检测。
其中，如图2、3所示，图2是采用本发明的SEC-ICP-MS方法分析高盐基质中不同分子量金属蛋白标准溶液的谱图，图中(a)BSA，(b)OVA，(c)CA，(d)RA，(e)BSA、OVA、CA和RA的混合溶液；图3是四种不同分子量金属蛋白保留时间与分子量拟合关系谱图。由图2、3可知，对于不同金属蛋白，本发明的方法测量速度很快，基本都在30min内出现响应峰；并且，测量精确度也很高，实验结果落在一定的方差范围之内(R2＝0.95)。
下面结合实施例对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的范围不限于此。显然，下文中描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部实施例；基于本发明的下述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
在本实施例中，以四种不同分子量标准碘代蛋白溶液为例，来验证本发明所述的快速分析高盐基质中金属蛋白方法的性能。
具体过程如下：
(1)测试样品的制备：将四种1mg/mL不同分子量标准蛋白溶液，包括：牛血清白蛋白(BSA，66kDa)，卵蛋白(OVA，44kDa)，碳酸酐酶(CA，29kDa)，核糖核酸酶(RA，13.7kDa)，分别与饱和碘化钾溶液以体积比9:1的比例在常温下孵育15min。然后将混合溶液与100mmol/L亚硫酸氢钠以体积比9:1的比例在常温下进行中和反应，然后在4℃、10000g、10min条件下超滤5次。最后用0.1M Tris-HCl(pH＝7.5)定容到1mg/mL，使用前稀释至0.1mg/mL以得到用于检测的试样溶液。
(2)含盐流动相配制：称取一定量4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)与硫酸钠粉末于蓝盖瓶中，加入适量超纯水，配制成10mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)与40mmol/L硫酸钠混合溶液，用稀硝酸与氢氧化钠调节混合溶液的pH至7.0，超声脱气待用。
(3)SEC分离：将标准碘代蛋白溶液进样20μL到HPLC高效液相色谱仪(HPLC 1200，安捷伦公司，德国)，通过色谱柱TosoHaas G3000SWXL size exclusion column(7.8mm×30cm dimension，5μmparticle size，poresize)在不改变流动相组分与流速的条件下将所述不同分子量碘代蛋白与碘离子分离。
(4)ICP-MS检测：将色谱柱分离得到的不同分子量碘代蛋白引入美国安捷伦8800型ICP-MS，利用高基体模式在雾化室和矩管之间的连接管处通入高纯氩气对高基体溶液进行在线稀释，然后通过TRA检测模式对碘代蛋白的保留时间与信号值进行监测，得到碘代蛋白保留时间与信号值谱图。将不同浓度碘代蛋白与Mass Hunter数据处理软件得出的碘代蛋白峰面积进行拟合，通过拟合关系实现碘代蛋白的定量分析。
定性和定量分析：
(1)定性分析
在采集得到的SEC-ICP-MS谱图上，通过高斯拟合，确定样品中检出蛋白质的分子量。
(2)定量分析
标准碘代蛋白溶液标准曲线的绘制：用0.1M Tris-HCl(pH＝7.5)溶液配制浓度分别为0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL的四种不同分子量标准碘代蛋白混合溶液，自动进样20μL，利用SEC-ICP-MS联用系统进行分析。将金属蛋白的峰面积与相应浓度绘制成标准曲线，得到拟合关系，利用拟合关系对样品峰的浓度进行定量。并将0.1mg/mL的标准蛋白混合物连续重复5次进样，计算峰面积、峰高和日内日间保留时间的相对标准偏差，结果见表1。
表1体积排阻色谱-电感耦合等离子体质谱联用方法的分析性能
利用本发明的方法能在30min内实现对四种不同分子量碘代蛋白的分离，检出限低至0.7μg/mL，将蛋白分子量与保留时间拟合得到R2为0.95，保留时间日间和日内相对标准偏差分别为0.2-0.9％和0.3-0.4％，说明了本发明具有快速、高灵敏度和良好重复性等优点。
实施例2
在本实施例中，以铅暴露后小鼠中性粒细胞蛋白为例，采用本发明提供的快速分析高盐基质中金属蛋白的方法，对其中铅结合蛋白进行了分离检测，具体过程如下：
(1)测试样品的制备：经腹腔注射暴露生理盐水、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg醋酸铅的C57BL小鼠，在暴露28天后，经颈椎脱臼处死，分别从其骨髓中提取中性粒细胞。各组提取的中性粒细胞，经裂解液处理，获得中性粒细胞蛋白样品。各组中性粒细胞蛋白样品经超滤管在4℃、15000g、60min条件下超滤5次得到待测定样品。
(2)流动相配制：称取一定量4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)与硫酸钠粉末于蓝盖瓶中，加入适量超纯水，配制成10mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)与40mmol/L硫酸钠混合溶液，用稀硝酸与氢氧化钠调节混合溶液的pH至7.0，超声脱气待用。
(3)SEC分离：将中性粒细胞蛋白溶液进样20μL到HPLC高效液相色谱仪(HPLC1200，安捷伦公司，德国)，通过色谱柱TosoHaas G3000SWXL size exclusion column(7.8mm×30cm dimension，5μmparticle size，poresize)在不改变流动相组分与流速的条件下将所述中性粒细胞蛋白与铅离子分离。
(4)ICP-MS检测：将色谱柱分离得到的中性粒细胞蛋白引入美国安捷伦8800型ICP-MS中，利用高基体模式在雾化室与矩管之间的连接管处通入高纯氩气对高基体溶液进行在线稀释，然后通过TRA检测模式对金属蛋白的保留时间与信号值进行监测，得到金属蛋白保留时间与信号值谱图(参见图4)。
对比例
用一系列金属离子标准曲线(0μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L和100μg/L)在不同溶剂中被ICP-MS常规模式和三种不同稀释程度的HMI模式(包括低稀释模式、中稀释模式和高稀释模式)检测，其中低稀释模式定义为载气流速0.62L/min，稀释气流速0.37L/min；中稀释模式定义为载气流速0.36L/min，稀释气流速0.63L/min；高稀释模式定义为载气流速0.19L/min，稀释气流速0.80L/min。比较ICP-MS不同检测模式下不同基质(超纯水和高盐基质)中的检出限(结果如图5所示)。结果表明，相比于超纯水，高盐基质会导致检出限增高，影响检测的精确度。在高盐基质中，与常规模式下的检出限相比，低稀释模式的检出限低了几倍，与超纯水在常规模式下的检出限处于相同数量级。说明低稀释条件下的HMI模式可以消除高盐基质对金属检测信号的抑制，提高检测灵敏度。
结论：从以上实施例可以看出，本发明的方法解决了目前SEC-ICP-MS分析金属蛋白时，生物体系中高浓度盐分导致ICP-MS检测灵敏度降低的问题，并且在30min内实现高盐基质样品中不同分子量金属蛋白的分离与检测，对金属蛋白的检出限低至μg/mL级别。本发明方法还具有检测灵敏度高、耗时短、重现性好等优点，可以快速、灵敏地检测出样品中的金属蛋白。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种金属蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将金属蛋白样品通过体积排阻色谱进行分离，之后利用ICP-MS的高基体模式通入分离相对所述金属蛋白样品中的高盐基质进行在线稀释，然后再通过ICP-MS系统进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离相为高纯氩气；
进行在线稀释的分离相的导入位置为ICP-MS系统雾化室与矩管之间的连接管处。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述将金属蛋白样品通过体积排阻色谱进行分离的步骤具体包括：
(a)配制一定浓度的4-羟乙基哌嗪乙磺酸和硫酸钠混合溶液作为流动相，用稀硝酸与氢氧化钠调节流动相的pH，将经过pH调节后的流动相作为高盐基质，超声脱气待用；
(b)使用步骤(a)中制备的流动相，不改变流动相组分及流速的条件下将所述金属蛋白样品进样到体积排阻色谱中，并根据分子量的不同对蛋白进行在线分离，同时将保留时间和分子量进行拟合，根据保留时间与分子量的拟合关系，完成蛋白的定性分析。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述步骤(a)中，含盐流动相经过调节后pH应在6.5到7.5之间，优选pH为7.0；
在所述步骤(b)中，金属蛋白样品进样量与流速在不改变流动相组分及流速的条件下分别为20μL和0.5mL/min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述利用高基体模式通入分离相对所述金属蛋白样品中的高盐基质进行在线稀释，然后再通过ICP-MS系统进行检测的步骤具体包括：
(c)将步骤(b)中分离得到的不同分子量蛋白引入ICP-MS，利用高基体模式在雾化室与矩管之间的连接管处通入高纯氩气对高基体溶液进行在线稀释，然后通过时间分辨模式(TRA)对金属蛋白的保留时间与信号值进行监测，得到金属蛋白保留时间与信号值谱图。将不同浓度蛋白与Mass Hunter数据处理软件得出的蛋白峰面积进行拟合，通过拟合关系实现蛋白的定量分析。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述步骤(c)中，所述高基体模式为高基体低稀释模式，高纯氩气流速为0.2-0.5L/min；
作为优选，在所述步骤(d)中，选用高基体低稀释模式时ICP-MS使用的载气为氩气且所述载气流速为0.6-0.7L/min。
7.一种能够生成金属蛋白的蛋白样品的检测方法，其特征在于，先将所述能够生成金属蛋白的蛋白样品与含金属元素的试剂反应，孵育成金属蛋白样品，再利用如权利要求1-6任一项所述的金属蛋白的检测方法进行检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述能够生成金属蛋白的蛋白样品经过如下方法与含金属元素的试剂反应，孵育成金属蛋白样品：
(1)用饱和金属溶液与浓度为1mg/mL的待测试蛋白样品溶液以设定比例混合，室温下孵育反应15min以得到金属标记的蛋白样品溶液，将经过标记的蛋白样品溶液与亚硫酸氢钠混合进行中和反应，将经过中和后的样品进行超滤后得到待分析的金属蛋白样品。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中使用的饱和金属溶液为饱和碘化钾溶液；
作为优选，在所述步骤(1)中蛋白质与碘化钾饱和溶液的体积比为9:1，使用的亚硫酸氢钠浓度为100mmol/L，经过标记的蛋白样品溶液与亚硫酸氢钠的混合体积比例为9:1。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，在所述步骤(1)中的超滤是将经过中和之后的蛋白样品溶液在4℃、10000g、10min条件下超滤5次；然后用pH＝7.5的0.1M Tris-HCl定容到1mg/mL，使用前稀释至0.1mg/mL作为待分析的金属蛋白样品。
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