CN103792315A - 一种人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法，包括：待测样品首先进入高效液相色谱仪对血清蛋白进行分离；³⁴S和⁵⁴Fe同位素稀释剂与高效液相色谱仪的洗脱液在线混合后进入电感耦合等离子体质谱仪检测，通过硫元素对人血清中转铁蛋白、白蛋白进行绝对定量，并对转铁蛋白进行硫、铁元素共同准确定量。本发明具有操作简便、液相分离效果好、定量结果准确可靠、重现性好等优点，弥补了目前蛋白质定量技术里蛋白标准物质匮乏、蛋白定量偏差大的不足，填补了目前国内无机质谱技术对基体样品中混合蛋白同时、多方式绝对定量方法的空白，为不同基体样品中含硫蛋白及金属蛋白的绝对定量提供了新的思路和手段。

Description

一种人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法

技术领域

本发明涉及蛋白质定量分析领域，更进一步说，涉及一种人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法。

背景技术

人血清中转铁蛋白及白蛋白的浓度水平与一些疾病息息相关，如血清转铁蛋白浓度在机体受到急性或慢性感染时降低，而在缺铁性贫血和妊娠末期，转铁蛋白含量增高。血清白蛋白的浓度可以反映肝脏是否受损及受损的严重程度，同时白蛋白浓度水平的改变还能引起一系列的病理性继发症。因此对人血清中转铁蛋白及白蛋白的定量分析研究是探索疾病发生发展状况的重要手段。

目前蛋白质定量技术中比较成熟的方法多是基于同位素标记的生物质谱（如电喷雾电离质谱、基质辅助激光解吸质谱）分析技术，但是生物质谱的信号响应与蛋白质含量关系复杂，需要已知丰度的纯蛋白进行归一化处理，才能对蛋白质定量。然而，由于蛋白质种类繁多，并不是所有蛋白都有商品化产品，必须花费很长时间纯化、制备各种纯蛋白。不同与生物质谱，电感耦合等离子质谱（ICP-MS）是一种“硬”电离模式，样品被等离子体的高温（6000～10000K）离子化成正离子并在真空系统中按照质荷比分离，信号响应与原子所处的分子环境无关，特别适合复杂体系中痕量或微量元素的定量。

利用ICP-MS联用技术对蛋白质中的元素定量，是近年来蛋白质定量技术研究的热点。其中高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）联用定量蛋白质的研究较多，而且为保证定量的准确性，需要使用与待测蛋白匹配的标准物质保障质控和量传，然而目前可获得的纯蛋白十分有限，常采用HPLC-ICP-MS结合同位素稀释法来解决这一难题。同位素稀释法（ID）主要分为特异性形态及非特异性形态。前者的稀释剂在前处理过程中加入到待测样品里，定量结果不受实验过程中样品损失、形态变化、仪器漂移等因素影响，但是必须制备出与待测样品匹配的特异性稀释剂，直到2005年才第一次应用到蛋白质的绝对定量。非特异性形态同位素稀释法（也称柱后同位素稀释法），稀释剂为某元素的浓缩同位素，基本都有商品化的产品，可实现不同基体蛋白质的定量分析。

大部分蛋白质中均含有甲硫氨酸、半胱氨酸等含硫氨基酸，因此硫（S）是最适合作为蛋白质定量分析的元素。ICP-MS测定出蛋白质中硫的含量，再根据蛋白质氨基酸序列确定的硫原子个数，就可以对蛋白质进行定量分析。但是，目前报道的ICP-MS测量硫最大的难题是¹⁶O₂ ⁺等对硫的谱线干扰，需要使用碰撞/反应池技术或高分辨质谱来解决，因此通过测定硫来定量的蛋白质主要是纯蛋白，涉及到基体蛋白质定量的还很少。而且高效液相色谱-柱后同位素稀释质谱法（HPLC-ID-ICP-MS）对基体蛋白质的定量分析大部分通过测定金属元素，如Fe、Cu、Zn、Sn等进行，还未见到硫、铁共同定量转铁蛋白的比较以及基体样品人血清里转铁蛋白、白蛋白通过硫元素的同时定量分析。

发明内容

为解决现有技术中出现的问题，本发明提供了一种人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法。通过强阴离子交换高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱同位素稀释法（HPLC-ID-ICP-MS）绝对定量人血清中混合蛋白的方法。本发明具有操作简便、液相分离效果好、定量结果准确可靠、重现性好等优点，弥补了目前蛋白质定量技术里蛋白标准物质匮乏的不足，适用于不同基体样品中含硫蛋白及金属蛋白的绝对定量。

本发明的目的是提供一种人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法。

包括：

待测样品首先进入高效液相色谱仪对血清蛋白进行分离；³⁴S和⁵⁴Fe同位素稀释剂与高效液相色谱仪的洗脱液在线混合后进入电感耦合等离子体质谱仪检测，通过硫元素对人血清中转铁蛋白、白蛋白进行绝对定量，并对转铁蛋白进行硫、铁元素共同准确定量。

具体步骤包括：

（1）待测样品的前处理过程：包括人血清标准物质的重构及血清样品的富集；

（2）样品检测：待测样品进样进入高效液相色谱仪进行测定，对血清蛋白进行分离；³⁴S和⁵⁴Fe同位素稀释剂通过泵加入，与高效液相色谱仪的洗脱液在线混合后进入电感耦合等离子体质谱仪检测；

（3）定量计算：将整个色谱分离过程中质谱得到的同位素比值谱图转化为质量流谱图，积分相应蛋白质的峰面积可得到元素的绝对含量，结合液相进样体积及蛋白质所含元素个数，计算出蛋白质的绝对浓度。

其中，

³⁴S和⁵⁴Fe同位素稀释剂流速在高效液相色谱仪洗脱待测样品的0～15min为0.01～0.05mL/min，在15～30min流速增加到0.08～0.30mL/min；³⁴S同位素稀释剂浓度为2～8μg/g，⁵⁴Fe同位素稀释剂浓度为0.1～0.6μg/g。

高效液相色谱条件：流动相A为20mmol/Kg Tris-HCl（pH8.6），B为A+500mmol/Kg甲酸铵溶液，使用前经过0.22μm有机相微孔滤膜过滤；流速0.6～1.0mL/min，时间程序为30min里B相由0%增加到100%；进样体积10μL，自动进样；紫外检测器检测波长为280nm；

电感耦合等离子体质谱仪条件：功率1200～1300W，样品气流速1.00～1.50L/min，辅助气流速0.80～1.20L/min，冷却气流速15～17L/min，分辨率m/Δm=4000，扫描次数700×1。

本发明具体可采用以下技术方案：

1）、HPLC-ID-ICP-MS联用系统：

液相色谱仪HPLC：日本Shimadzu公司液相色谱系统，含LC-30AD高压液相泵，SIL-30AC自动进样器，CTO-20A柱温箱，SPD-20A紫外检测器。采用Shodex QA-825IEC（8.0mm×75mm）强阴离子交换柱为色谱柱。

同位素稀释法ID：同位素稀释剂³⁴S、⁵⁴Fe混合溶液由液相泵LC-20AD加入，与液相色谱的洗脱液经过三通混合后在线进入ICP-MS检测。

电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS：美国Thermo Fisher Scientific公司Element2扇形磁场电感耦合等离子质谱仪，配置低（m/Δm=300）、中（m/Δm=4000）、高（m/Δm=10000）3种固定分辨率，配有进样系统，射频发生器，等离子体系统，离子透镜系统，真空系统，检测器，气路控制系统。

2）、配制所需试剂：

（1）、配置25mmol/Kg Tris-HAc缓冲液，500mmol/Kg Na₂CO₃溶液，10mmol/Kg FeCl₃溶液。

（2）、流动相：A相：20mmol/Kg Tris-HCl（pH8.6）；B相：A+500mmol/Kg甲酸铵溶液，使用前经过0.22μm有机相微孔滤膜过滤。所有的试剂均是优级纯，实验用水均为超纯水。

3）、人血清标准物质及样品的前处理过程：可采用本领域通常的前处理过程，本发明中，可优选按以下进行前处理：

（1）、人血清标准物质的重构：从冰箱中取出样品瓶，室温放置1h。在桌面上轻击样品瓶底部，确保所有样品均在样品瓶底部，移去螺栓帽。连同橡胶塞一同称重并清零，小心提升橡胶塞直到空气进入其中，通过橡胶塞的凹槽用移液枪小心加入1mL超纯水，将橡胶塞放回原位，称重m=1.0185g。室温下放置1h，接下来的1h中小心倒置至少5次（不能摇动），室温下过夜。使用当天，1h里至少倒置5次。

（2）、人血清标准物质及样品的富集处理：人血清蛋白标准物质、人血清样品按下面方法富集处理，即300μL25mmol/Kg Tris-HAc缓冲液中加入5μL500mmol/Kg Na₂CO₃，5μL 10mmol/Kg FeCl₃和100μL重构的血清标准品及血清样品，得到的样品溶液室温下孵育2h，备用。

4）、实验所用的仪器条件：

（1）、高效液相色谱条件：流动相A为20mmol/Kg Tris-HCl（pH8.6），B为A+500mmol/Kg甲酸铵溶液，使用前经过0.22μm有机相微孔滤膜过滤。流速0.7mL/min，时间程序为30min里B相由0%增加到100%；进样体积10μL，自动进样；紫外检测器检测波长为280nm。

（2）、柱后同位素稀释条件：³⁴S和⁵⁴Fe同位素稀释剂通过液相系统自带的LC-20AD泵加入，与液相色谱的洗脱液经过三通混合后在线进入ICP-MS检测。

（3）、电感耦合等离子体质谱仪条件：功率1200～1300W，样品气流速1.00～1.50L/min，辅助气流速0.80～1.20L/min，冷却气流速15～17L/min，分辨率m/Δm=4000，扫描次数700×1。

5）、样品检测与定量计算：

（1）、样品检测：开机待高效液相色谱仪、电感耦合等离子体质谱仪稳定后，先用1ng/g的Be、In、Bi调谐液对ICP-MS进行调谐，然后用Φ=0.13mm的PEEK管及三通连接液相色谱仪、稀释剂加入泵和电感耦合等离子体质谱仪。在上述HPLC-ID-ICP-MS仪器参数条件下采用自动进样器进样10μL进行测定，HPLC对血清蛋白进行分离，ICP-MS在线对混合溶液中³²S、³⁴S、⁵⁴Fe及⁵⁶Fe进行检测。

（2）、定量计算：将整个色谱分离过程中质谱得到的同位素比值谱图，根据下面的同位素稀释公式，转化为元素的质量流（Mass Flow）谱图。

${\mathrm{MF}}_s=c_{\mathrm{sp}}{d}_{\mathrm{sp}}{f}_{\mathrm{sp}}\frac{M_s}{M_{\mathrm{sp}}}\frac{A_{\mathrm{sp}}^b}{A_s^b}\frac{R_m-R_{\mathrm{sp}}}{R_s-R_m}$

公式中，c_sp、d_sp和f_sp分别代表同位素稀释剂的浓度(ng/g)、密度(g/mL)和流速(mL/min)；M_s和M_sp分别表示样品和稀释剂中元素的原子量；

和

分别表示样品和稀释剂中核素b的丰度；R_m、R_sp、R_s分别表示混合样品、稀释剂和样品中核素a与核素b的比值。

积分质量流谱图中的峰面积可得到相应蛋白质中该元素的绝对含量，依据液相进样体积及蛋白质所含元素个数，即可计算出蛋白质的绝对浓度。

现有技术中没有出现转铁蛋白、白蛋白同时定量的研究，但血清中转铁蛋白、白蛋白同时定量存在的技术困难是：血清中转铁蛋白、白蛋白的正常含量范围不同，转铁蛋白是2.35～3.00mg/mL，白蛋白是35～50mg/mL，这导致两种蛋白中硫含量差别很大，ICP-MS测得两种蛋白中硫的信号强度相差近20倍，直接进行定量会导致蛋白定量结果不准确，所以为了能同时准确定量这两种蛋白，本发明采用控制稀释剂浓度及流速来克服这一困难。

现有技术中³⁴S和⁵⁴Fe两种同位素稀释剂的同时使用分别定量转铁蛋白没有出现，但有文献曾用³⁴S及⁶⁵Cu混合来定量混合的标准蛋白，研究结果是不能通过金属蛋白中的金属元素来准确定量蛋白质，原因是金属元素在蛋白质中的存在形式是非共价键，金属元素与蛋白质的结合力比较弱，在液相色谱分离过程中流动相的pH值、离子强度、极性溶剂等因素都会导致金属元素的流失。但本发明中通过液相色谱条件（流动相等）的控制，克服了这一困难，成功用³⁴S和⁵⁴Fe两种同位素稀释剂对转铁蛋白进行了共同定量，而且两种定量结果基本吻合。

本发明与现有技术相比具有的有益效果是：

1、本发明建立了强阴离子交换高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用与同位素稀释法结合的方法体系（HPLC-ID-ICP-MS），对基体样品人血清中转铁蛋白、白蛋白进行同时定量分析。血清样品先由高效液相色谱仪，采用强阴离子交换色谱技术洗脱分离出其中的蛋白成分：免疫球蛋白、转铁蛋白、白蛋白，在紫外检测器波长280nm下得到血清样品的液相色谱图，根据与纯蛋白的谱图对比，确定免疫球蛋白、转铁蛋白、白蛋白的谱峰位置及保留时间分别为8.3、13.0、21.8min。然后用Φ=0.13mm的PEEK管及三通连接液相色谱仪、稀释剂加入泵和电感耦合等离子体质谱仪，再由电感耦合等离子体质谱作为检测器，在中分辨m/Δm=4000模式下消除¹⁶O₂ ⁺、⁴⁰Ar¹⁶O⁺等对³²S⁺、⁵⁶Fe⁺的谱学干扰。在线对混合溶液中³²S⁺、³⁴S⁺、⁵⁴Fe⁺及⁵⁶Fe⁺进行检测，得到整个过程中³²S⁺/³⁴S⁺、⁵⁶Fe⁺/⁵⁴Fe⁺的同位素比值谱图，根据同位素稀释法公式，转化为硫、铁元素的质量流谱图。积分质量流谱图中的峰面积可得到相应蛋白中该元素的绝对含量，依据液相进样体积及蛋白质所含元素个数，就可计算出蛋白质的绝对浓度。该方法体系设计合理、条件适宜。

2、本发明针对血清样品中转铁蛋白、白蛋白含量差异导致的同位素稀释剂浓度选择难题，为保证定量分析的准确性，采用在线改变同位素稀释剂流速的方法，保证了两种蛋白出峰时同位素比值R_m均合适，而且稀释剂信号能随着流速变化而迅速改变并达到稳定。本发明具有操作简便、液相分离效果好、定量结果准确可靠、重现性好等优点，弥补了目前蛋白质定量技术里蛋白标准物质匮乏的不足。

3、本发明填补了目前国内无机质谱联用技术对基体样品中混合蛋白同时、多种方式绝对定量方法的空白，可以准确科学地对不同基体样品中含硫蛋白及金属蛋白进行定量分析，同时对无机质谱联用技术在蛋白质定量领域的应用具有重要意义。

附图说明

图1为实施例1人血清标准物质ERM-DA470/IFCC的液相色谱图；

图2为实施例1人血清标准物质ERM-DA470/IFCC的硫元素分析质谱图；

图3为实施例1人血清标准物质ERM-DA470/IFCC的硫元素质量流谱图；

图4为实施例2基体样品正常人血清的液相色谱图；

图5为实施例2基体样品正常人血清的硫元素分析质谱图；

图6为实施例2基体样品正常人血清的硫元素质量谱图；

图7为本发明的方法采用的系统示意图

附图标记说明：

1为LC-30AD泵，2为自动进样器，3为柱温箱，4为色谱柱，5为紫外检测器，6为Element2质谱仪，7为LC-20AD泵，8为³⁴S、⁵⁴Fe同位素稀释剂，9为流动相A，10为流动相B

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明。

本发明的定量系统HPLC-ID-ICP-MS主要由高效液相色谱分离、稀释剂加入泵、电感耦合等离子体质谱检测和接口四部分构成。其中所述的高效液相色谱，采用强阴离子交换色谱柱对血清样品进行洗脱分离混合蛋白；采用LC-20AD泵引入并控制同位素稀释剂流速；采用高分辨质谱在分辨率为4000的条件下消除谱学干扰；色谱洗脱液、同位素稀释剂经由三通混合后进入质谱，其它接口均用Φ=0.13mm的PEEK管连接。

实施例1：

实施例样品为人血清标准物质ERM-DA470/IFCC，其中转铁蛋白、白蛋白含量的标准值分别为2.32±0.08、36.5±1.1mg/mL。

1、人血清标准物质ERM-DA470/IFCC的重构：按照说明书所述，从冰箱中取出样品瓶（#08360），室温放置1h。在桌面上轻击样品瓶底部，确保所有样品均在样品瓶底部，移去螺栓帽。连同橡胶塞一同称重并清零，小心提升橡胶塞直到空气进入其中，通过橡胶塞的凹槽用移液枪小心加入1mL超纯水，将橡胶塞放回原位，称重m=1.0185g。室温下放置1h，接下来的1h中小心倒置至少5次（不能摇动），室温下过夜。使用当天，1h里至少倒置5次。

2、样品的富集处理：人血清标准物质ERM-DA470/IFCC按文献所述方法富集处理，即300μL25mmol/Kg Tris-HAc缓冲液中加入5μL 500mmol/Kg Na₂CO₃，5μL 10mmol/Kg FeCl₃和100μL重构的血清标准品，得到的样品溶液室温下孵育2h，在4℃冰箱中保存备用。

3、样品的检测：人血清标准物质ERM-DA470/IFCC样品溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，按照HPLC-ID-ICP-MS操作参数（见表1）进样检测，样品重复进样三次，同位素稀释剂采用超纯水稀释处理³⁴S、⁵⁴Fe浓缩同位素到浓度分别为2.21μg/g、0.13μg/g。得到液相色谱分离谱图及以时间/min为横坐标，信号强度/cps为纵坐标的元素分析谱图。

表1HPLC-ID-ICP-MS操作参数

4、蛋白质的绝对定量：

（1）人血清标准物质的液相分离：样品的液相色谱分离谱图见图1，与纯蛋白的液相谱图对比，根据保留时间一致确定液相色谱图中免疫球蛋白、转铁蛋白、白蛋白的谱峰位置及保留时间分别为8.3、13.0、21.8min。

（2）转铁蛋白、白蛋白中硫含量测定：将整个色谱分离过程中以时间/min为横坐标，信号强度/cps为纵坐标的元素分析谱图见图2，经数据处理得到同位素比值谱图，再根据下面的同位素稀释公式，转化为硫元素的质量流（Mass Flow）谱图见图3。

${\mathrm{MF}}_s=c_{\mathrm{sp}}{d}_{\mathrm{sp}}{f}_{\mathrm{sp}}\frac{M_s}{M_{\mathrm{sp}}}\frac{A_{\mathrm{sp}}^b}{A_s^b}\frac{R_m-R_{\mathrm{sp}}}{R_s-R_m}$

公式中，c_sp、d_sp和f_sp分别代表同位素稀释剂的浓度(ng/g)、密度(g/mL)和流速(mL/min)；M_s和M_sp分别表示样品和稀释剂中硫元素的原子量；和

分别表示样品和稀释剂中核素b（³⁴S）的丰度；R_m、R_sp、R_s分别表示混合样品、稀释剂和样品中核素a与核素b的比值（³²S⁺/³⁴S⁺）。

对质量流谱图中的转铁蛋白、白蛋白进行峰面积积分，可得到相应蛋白中硫元素的绝对量，依据液相进样体积以及蛋白所含硫元素个数（转铁蛋白：分子量75.2KDa，每分子含47个硫原子；白蛋白：分子量66.4KDa，每分子含41个硫原子），就可计算出蛋白质的浓度。

（3）转铁蛋白中铁含量测定：数据处理过程与硫含量测定相同，得到转铁蛋白中铁元素的质量流谱图，峰面积积分得到的铁元素绝对量，同样根据液相进样体积和每个转铁蛋白分子含2个铁原子，最终计算出转铁蛋白的浓度。

5、定量结果分析：采用建立的HPLC-ID-ICP-MS方法体系绝对定量人血清标准物质ERM-DA470/IFCC中转铁蛋白、白蛋白浓度结果见表2。其中转铁蛋白、白蛋白均通过测定蛋白质中的硫元素实现定量，同时由于转铁蛋白为一种典型的含铁金属蛋白，且富集处理后铁与蛋白质的化学计量比已知，因此转铁蛋白还通过测定铁元素进行定量。蛋白浓度测定值与参考物质的标准值基本吻合，重复三次实验的相对标准偏差RSD均<10%，说明定量结果准确可靠，精确度和重复性良好。

表2HPLC-ID-ICP-MS绝对定量ERM-DA470/IFCC中蛋白质结果（n=3）

实施例2：

实施例样品为基体样品正常人血清。

1、样品的富集处理：正常人血清样品按以下方法富集处理：300μL25mmol/Kg Tris-HAc缓冲液中加入5μL 500mmol/Kg Na₂CO₃，5μL10mmol/KgFeCl₃和100μL正常人血清，得到的样品溶液室温下孵育2h，在4℃冰箱中保存备用。

2、样品的检测：取人血清样品溶液经0.22μm微孔滤膜过滤后，液相色谱进样量10μL，重复进样三次，同位素稀释剂采用超纯水稀释处理³⁴S、⁵⁴Fe浓缩同位素到浓度分别为7.95μg/g、0.57μg/g，流速条件：0～15min为0.014mL/min，15～30min流速增大到0.08mL/min，其他仪器条件按照上述HPLC-ID-ICP-MS操作参数（见表1）进行检测。得到液相色谱分离谱图及以时间/min为横坐标，信号强度/cps为纵坐标的元素分析谱图。

3、蛋白质的绝对定量：

（1）人血清样品的液相分离：样品的液相色谱分离谱图见图4，与纯蛋白的液相谱图对比，根据保留时间一致确定液相色谱图中免疫球蛋白、转铁蛋白、白蛋白的谱峰位置及保留时间分别为8.3、13.0、21.8min。

（2）转铁蛋白、白蛋白中硫含量测定：将整个色谱分离过程中以时间/min为横坐标，信号强度/cps为纵坐标的元素分析谱图见图5，经数学处理得到同位素比值谱图，再根据下面的同位素稀释公式，转化为硫元素的质量流（Mass Flow）谱图见图6。

${\mathrm{MF}}_s=c_{\mathrm{sp}}{d}_{\mathrm{sp}}{f}_{\mathrm{sp}}\frac{M_s}{M_{\mathrm{sp}}}\frac{A_{\mathrm{sp}}^b}{A_s^b}\frac{R_m-R_{\mathrm{sp}}}{R_s-R_m}$

公式中，c_sp、d_sp和f_sp分别代表同位素稀释剂的浓度(ng/g)、密度(g/mL)和流速(mL/min)；M_s和M_sp分别表示样品和稀释剂中硫元素的原子量；

和

分别表示样品和稀释剂中核素b（³⁴S）的丰度；R_m、R_sp、R_s分别表示混合样品、稀释剂和样品中核素a与核素b的比值（³²S⁺/³⁴S⁺）。

对质量流谱图中的转铁蛋白、白蛋白进行峰面积积分，可得到相应蛋白中硫元素的绝对量，依据液相进样体积以及蛋白所含硫元素个数（转铁蛋白：分子量75.2KDa，每分子含47个硫原子；白蛋白：分子量66.4KDa，每分子含41个硫原子），就可计算出蛋白质的浓度。

（3）转铁蛋白中铁含量测定：数据处理过程与硫含量测定相同，得到转铁蛋白中铁元素的质量流谱图，峰面积积分得到的铁元素绝对量，同样根据液相进样体积和每个转铁蛋白分子含2个铁原子，最终计算出转铁蛋白的浓度。

4、定量结果分析：采用建立的HPLC-ID-ICP-MS方法体系绝对定量基体样品正常人血清中转铁蛋白、白蛋白浓度结果见表3。其中转铁蛋白、白蛋白均通过测定蛋白质中的硫元素实现定量，同时由于转铁蛋白为一种典型的含铁金属蛋白，且富集处理后铁与蛋白质的化学计量比已知，因此转铁蛋白还通过测定铁元素进行定量。蛋白浓度测定值均在正常人血清蛋白水平范围内，重复三次实验的相对标准偏差RSD均<5%，说明定量结果准确可靠，精确度和重复性良好。

表3HPLC-ID-ICP-MS绝对定量正常人血清中蛋白质结果（n=3）

本发明通过直接测定蛋白质中的硫、铁元素，实现基体样品人血清中转铁蛋白、白蛋白的同时、多方式定量分析方法。该方法具有操作简便、液相分离效果好（30min内可将免疫球蛋白、转铁蛋白、白蛋白完全分离）、定量结果准确可靠、精确度和重复性好等优点，可以准确科学地对不同基体样品中含硫蛋白及金属蛋白进行定量分析，弥补了目前蛋白质定量技术里蛋白标准物质匮乏的不足，填补了目前国内无机质谱联用技术对基体样品中混合蛋白同时、多方式绝对定量方法的空白，同时对无机质谱技术在蛋白质定量技术领域的应用具有重要意义。

Claims (4)

1.一种人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法，其特征在于所述方法包括：

待测样品首先进入高效液相色谱仪对血清蛋白进行分离；³⁴S和⁵⁴Fe同位素稀释剂与高效液相色谱仪的洗脱液在线混合后进入电感耦合等离子体质谱仪检测，通过硫元素对人血清中转铁蛋白、白蛋白进行绝对定量，并对转铁蛋白进行硫、铁元素共同准确定量。

2.如权利要求1所述的人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法，其特征在于所述方法包括：

（1）待测样品的前处理过程：包括人血清标准物质的重构及血清样品的富集；

（2）样品检测：待测样品进样进入高效液相色谱仪进行测定，对血清蛋白进行分离；³⁴S和⁵⁴Fe同位素稀释剂通过泵加入，与高效液相色谱仪的洗脱液在线混合后进入电感耦合等离子体质谱仪检测；

（3）定量计算：将整个色谱分离过程中质谱得到的同位素比值谱图转化为质量流谱图，积分相应蛋白质的峰面积可得到元素的绝对含量，结合液相进样体积及蛋白质所含元素个数，计算出蛋白质的绝对浓度。

3.如权利要求2所述的人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法，其特征在于：

³⁴S和⁵⁴Fe同位素稀释剂流速在高效液相色谱仪洗脱待测样品的0～15min为0.01～0.05mL/min，在15～30min流速增加到0.08～0.30mL/min；

³⁴S同位素稀释剂浓度为2～8μg/g，⁵⁴Fe同位素稀释剂浓度为0.1～0.6μg/g。

4.如权利要求3所述的人血清蛋白无机质谱联用技术的定量方法，其特征在于：

高效液相色谱条件：流动相A为20mmol/Kg Tris-HCl（pH8.6），B为A+500mmol/Kg甲酸铵溶液，使用前经过0.22μm有机相微孔滤膜过滤；流速0.6～1.0mL/min，时间程序为30min里B相由0%增加到100%；进样体积10μL，自动进样；紫外检测器检测波长为280nm；

电感耦合等离子体质谱仪条件：功率1200～1300W，样品气流速1.00～1.50L/min，辅助气流速0.80～1.20L/min，冷却气流速15～17L/min，分辨率m/Δm=4000；扫描次数700×1。

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