CN110376293A - 生物样品中的金属蛋白的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种能够将LC‑ICPMS的条件连续保持为一定从而进行数据可靠性高的金属蛋白的测定的、生物样品中的金属蛋白的分析方法,该金属蛋白是生物分子与金属元素结合而成的复合物,所述生物样品中的金属蛋白的分析方法包括以下步骤:利用液相色谱法对经过了前处理的生物样品进行处理,以分离出所述金属蛋白;以及利用电感耦合等离子体质谱法对分离出的金属蛋白进行分析,其中,使用乙酸铵溶液作为流动相。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物样品中的金属蛋白的分析方法,尤其涉及使用液相色谱-电感耦合等离子体质谱法(LC-ICPMS)分析生物样品中的金属蛋白的分析方法。
背景技术
微量元素在植物和动物体内的生物系统中发挥重要作用,近年来的研究显示,活体内的金属含量与某些病理因素存在一定关联。作为从样品中检测金属元素并推定其含量的方法,ICPMS是较为高效、便利的一种。
在生物体中,一些生物分子如酶、卟啉等会与金属元素结合,形成被称为金属蛋白的复合物,针对这样的复合物,已知有将液相色谱法(LC)和电感耦合等离子体质谱法(ICPMS)相结合对人血清中的血浆铜蓝蛋白进行测定的方法(参考非专利文献1)。另外,在环境研究中,也对砷、锡和汞的有机金属化合物进行了分析。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:
Determination of Ceruloplasmin in Human Serum by ImmunoaffinityChromatography and Size Exclusion Chromatography-ICP-MS,Viorica Lopez-Avila等,《Springer》,2004:245-468
发明内容
要解决的技术问题
在非专利文献1的方法中,作为LC的流动相,采用的是浓度为50mM、流速为0.6mL/min的Tris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷-盐酸混合液),该缓冲液广泛用于ICPMS测定。
但是,非专利文献1中使用的Tris-HCl缓冲液是一种非挥发性溶液,在进行LC-ICPMS分析时,该缓冲液中的溶质会在高温的离子源中作为非挥发性的固体而析出。经过多次分析后,由于上述固体的累积,恐怕会堵塞下一级的锥孔体,造成进样的中断。因此,在现有技术中,为防止锥孔体被堵塞,在分析过程中需要频繁地中断分析以进行装置维护,从而及时清除析出的成分。
在组学分析中,样本数目极多,需要能够长时间连续稳定地进行测定的装置和方法。而在上述方案中,由于上述的频繁中断与维护,无法在进行一连贯的多样本分析的期间将装置的条件保持为一定,从而存在生物样品中的金属蛋白的测定的数据可靠性不高的这样的问题。
用于解决技术问题的技术方法
本发明是为了解决上述技术问题而做出的,提供一种生物样品中的金属蛋白的分析方法,所述金属蛋白是生物分子与金属元素结合而成的复合物,所述生物样品中的金属蛋白的分析方法的特征在于,包括以下步骤:利用液相色谱法对经过了前处理的生物样品进行处理,以分离出所述金属蛋白;以及利用电感耦合等离子体质谱法对分离出的金属蛋白进行分析,其中,使用乙酸铵溶液作为流动相。
在上述生物样品中的金属蛋白的分析方法中,优选的是,所述液相色谱法为尺寸排阻色谱法。
在上述生物样品中的金属蛋白的分析方法中,优选的是,在利用电感耦合等离子体质谱法对所述分离出的金属蛋白进行分析之前,使用紫外线检测器对所述分离出的金属蛋白进行检测。
在上述生物样品中的金属蛋白的分析方法中,优选的是,所述乙酸铵溶液的浓度为25-100mM。
在上述生物样品中的金属蛋白的分析方法中,优选的是,所述乙酸铵溶液的pH值为6-7。
在上述生物样品中的金属蛋白的分析方法中,优选的是,在所述前处理中采用了免疫亲和层析法。
在上述生物样品中的金属蛋白的分析方法中,优选的是,所述金属元素为钾、磷、钠、钙、镁、铝、砷、汞、铅、镉、钛、银、钡、锌、铬、锰、铜、铷、铁、锗、硒、锶、钴、镍、钼、锡、锑、铂、铯、铀、镧、铈、镨、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥、钇、锂或硼。
在上述生物样品中的金属蛋白的分析方法中,优选的是,在利用电感耦合等离子体质谱法对所述分离出的金属蛋白进行分析时,还利用电喷雾电离质谱法对所述分离出的金属蛋白进行分析。
发明效果
根据本发明的生物样品中的金属蛋白的分析方法,能够连续进行分析而无需中断,从而将LC-ICPMS的条件连续保持为一定,进行数据可靠性高的金属蛋白的测定。
附图说明
图1的(a)~(d)是实施例1中针对Fe和Co两种元素进行测定而得的谱图。
图2~图48分别是实施例2中针对指定的47种元素进行测定而得的谱图。
图49的(a)~(l)是实施例3中在改变流动相的浓度的情况下针对Fe和Co两种元素进行测定而得的谱图。
图50的(a)和(b)是示出实施例4中LC-ICPMS的连续运行结果的分析图。
图51的(a)~(n)示出了实施例4中标准样品的LC-UV-ICPMS谱图及其校准曲线。
具体实施方式
本实施方式的生物样品中的金属蛋白的分析方法与现有技术一样,利用LC-ICPMS进行分析。其中,为避免析出的固体残留下来堵塞锥孔体,使用挥发性的乙酸铵溶液作为流动相,由此,本发明不需要频繁的装置维护就能连续进行生物样品的分析,从而保持分析条件一定,保证了数据的可靠性。
具体来说,根据本实施方式的分析方法,首先,对生物样品进行前处理。作为一种较佳的方式,在前处理中可以采用免疫亲和层析法,去除其中含量较丰富的几种蛋白质,例如白蛋白、IgG、转铁蛋白、IgA、触珠蛋白、抗胰蛋白酶等。这些大分子蛋白质往往难以通过后述的SEC(尺寸排阻色谱法)与金属蛋白区分开来,而通过采用免疫亲和层析法,能够排除这些蛋白质的干扰。
之后,利用液相色谱法对经过了前处理的生物样品进行处理,以分离出金属蛋白。作为液相色谱法的一种较佳的方式,可以采用SEC,将金属蛋白与游离的金属元素分离开来。
接着,针对分离出的金属蛋白,利用ICPMS进行分析,确定其种类以及含量。在本实施方式中,优选在执行ICPMS的分析之前,还使用紫外线检测器对来自LC的金属蛋白进行检测。这样做的好处是,当ICPMS的检测信号异常衰减时,通过比较紫外线检测器的检测信号与ICPMS的检测信号,能够判断是LC进样故障还是ICPMS本身的故障、例如锥孔体堵塞。例如在紫外线检测器的检测结果正常,而ICPMS的检测结果明显衰减时,可判断是ICPMS本身的进样故障;而在紫外线检测器和ICPMS的检测结果均异常衰减或没有信号时,可判断是LC进样故障。
另外,在利用ICPMS对分离出的金属蛋白进行分析时,还可以同时利用电喷雾电离质谱法(ESIMS)对该分离出的金属蛋白进行分析。经过ICPMS的分析可知该金属蛋白中含有何种金属元素,而ESIMS则可以测出该金属蛋白的分子量,二者结合,就能够容易地判断出该金属蛋白具体是哪种金属蛋白。
另外,通过在温和条件(接近生物体环境)下执行SEC,不仅能够保持蛋白质的天然状态,而且还能提供近似的分子大小信息。因此在LC中,乙酸铵溶液的pH值优选为6-7。
以下列举出4个实施例,说明在使用了LC-ICPMS的金属蛋白的分析方法中采用乙酸铵溶液作为流动相的可行性以及数据的可靠性。
[实施例1]
在本实施例中,针对Fe和Co两种元素进行测定,流动相浓度为100mM。
作为生物样品,分别采用市售的样品A——SIGMA Human Serum H4522(含Fe元素)、和样品B——Wako氰钴胺素,C63H88CoN14O14P,MW 1355.38(维他命B12,VB12)(含Co元素)与SIGMA肌红蛋白(来自马心脏),MW 17kDa(含Fe元素)的混合液。其中,与溶液接触的部件均使用无金属材料制备。
本实施例的LC-ICPMS分析条件如下表1-1和1-2所示。
表1-1使用设备
表1-2 LC-ICPMS分析条件
分析结果示于图1。其中,图1的(a)表示在280nm的光照下用紫外线检测器检测到的、样品A经LC后的金属蛋白的信号;(b)表示ICPMS检测到的、样品A经LC后的金属蛋白的信号;(c)表示在280nm的光照下用紫外线检测器检测到的、样品B经LC后的金属蛋白的信号;(d)表示ICPMS检测到的、样品B经LC后的金属蛋白的信号。
其中,(b)中的两个波峰代表两种含铁蛋白,未检测出含钴的蛋白,(c)中的两个波峰代表样品B中的两种成分,(d)中的两个波峰分别代表两种金属元素Fe和Co。
[实施例2]
使用乙酸铵溶液作为流动相的LC-ICPMS可对已知的所有种类的金属蛋白进行分析,在本实施例中,例举其中的47种金属元素进行分析测定,但其可测定范围不限于此。作为生物样品,采用样品A,流动相浓度为100mM。
本实施例的使用设备与实施例1相同,其LC-ICPMS分析条件如下表2所示。
表2
将该47种元素的ICPMS分析结果示于图2~图48。
[实施例3]
在本实施例中,针对Fe和Co两种元素进行测定。作为生物样品,分别采用样品A和样品B,流动相浓度分别设为100mM、50mM、25mM。
本实施例的使用设备与实施例1相同,其LC-ICPMS分析条件如下表3所示。
表3
分析结果示于图49。其中,(a)~(c)表示在280nm的光照下用紫外线检测器检测到的、样品A经LC后的金属蛋白的信号,(a)~(c)的流动相浓度分别为100mM、50mM、25mM;(d)~(f)表示ICPMS检测到的、样品A经LC后的金属蛋白的信号,(d)~(f)的流动相浓度分别为100mM、50mM、25mM;(g)~(i)表示在280nm的光照下用紫外线检测器检测到的、样品B经LC后的金属蛋白的信号,(g)~(i)的流动相浓度分别为100mM、50mM、25mM;(j)~(l)表示ICPMS检测到的、样品B经LC后的金属蛋白的信号,(j)~(l)的流动相浓度分别为100mM、50mM、25mM。
[实施例4]
本实施例的使用设备与实施例1相同。如前所述,采用乙酸铵溶液作为流动相可以实现多样本的连续分析而无需为维护而中断。本实施例为确认乙酸铵溶液作为流动相时的ICPMS的数据精度,在流动注射的条件下对ICPMS标准样品进行300次以上的连续测定,测定结果示于图50。图50的测定的LC-ICPMS分析条件如下表4所示。
表4
图50的(a)表示300次以上的分析中每次样品注入分析所得到的ICPMS的谱图的波峰面积,横轴为注入次数,纵轴为波峰面积;(b)表示在该300次以上的分析中,所连接的紫外线检测器的检测结果(波峰的高度和波峰的面积)。由图50可知,利用乙酸铵溶液作为流动相进行不间断的连续测定,数据的再现性良好,因而可靠性高。
另一方面,在表5所示的分析条件下对样品B进行测定,获取不同的注入量下的谱图的波峰面积和波峰高度,示于图51。图51的(a)和(b)分别是紫外线检测器和ICPMS的检测结果,(c)~(n)分别为该标准样品的校准曲线。
根据图51可知,紫外线210nm、280nm、ICPMS各自检测到的谱图的波峰高度和波峰面积均呈现良好的线性特征(相关系数R2>0.996)。因此,通过LC-ICPMS的谱图的波峰面积和波峰高度对元素量进行评价是可行的。
表5
Claims (8)
1.一种生物样品中的金属蛋白的分析方法,所述金属蛋白是生物分子与金属元素结合而成的复合物,所述生物样品中的金属蛋白的分析方法的特征在于,包括以下步骤:
利用液相色谱法对经过了前处理的生物样品进行处理,以分离出所述金属蛋白;以及
利用电感耦合等离子体质谱法对分离出的金属蛋白进行分析,
其中,使用乙酸铵溶液作为流动相。
2.根据权利要求1所述的生物样品中的金属蛋白的分析方法,其特征在于,
所述液相色谱法为尺寸排阻色谱法。
3.根据权利要求1所述的生物样品中的金属蛋白的分析方法,其特征在于,
在利用电感耦合等离子体质谱法对所述分离出的金属蛋白进行分析之前,使用紫外线检测器对所述分离出的金属蛋白进行检测。
4.根据权利要求1所述的生物样品中的金属蛋白的分析方法,其特征在于,
所述乙酸铵溶液的浓度为25-100mM。
5.根据权利要求2所述的生物样品中的金属蛋白的分析方法,其特征在于,
所述乙酸铵溶液的pH值为6-7。
6.根据权利要求1所述的生物样品中的金属蛋白的分析方法,其特征在于,
在所述前处理中采用了免疫亲和层析法。
7.根据权利要求1所述的生物样品中的金属蛋白的分析方法,其特征在于,
所述金属元素为钾、磷、钠、钙、镁、铝、砷、汞、铅、镉、钛、银、钡、锌、铬、锰、铜、铷、铁、锗、硒、锶、钴、镍、钼、锡、锑、铂、铯、铀、镧、铈、镨、钕、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥、钇、锂或硼。
8.根据权利要求1~7中的任一项所述的生物样品中的金属蛋白的分析方法,其特征在于,
在利用电感耦合等离子体质谱法对所述分离出的金属蛋白进行分析时,还利用电喷雾电离质谱法对所述分离出的金属蛋白进行分析。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20191025 |