CN117143938A - 可溶性酵母葡聚糖及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种可溶性酵母葡聚糖及其制备方法，该制备方法包括：将含有细胞壁物料的第一溶液进行均质处理和加热处理，将加热处理反应液进行酶解处理，制备酶解物；其中，所述细胞壁物料由酵母酶解获得；对酶解物进行分离处理，制备葡聚糖样品A；对含有所述葡聚糖样品A的第二溶液进行碱处理，制备葡聚糖样品B；对葡聚糖样品B进行脱脂处理，制备葡聚糖样品C；对所述葡聚糖样品C进行羧甲基化处理，制备所述可溶性酵母葡聚糖。该制备方法中，最终通过羧甲基化处理制备得到高品质和高纯度的可溶性酵母葡聚糖，扩展了应用领域。
Description
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，特别是涉及一种可溶性酵母葡聚糖及其制备方法。
背景技术
采用自溶方式生产酵母抽提物，是目前酵母衍生品行业常用的制备技术，生产酵母抽提物会同时产生一定比例的细胞壁。由于细胞壁不溶于水，且其中还含有一定量的葡聚糖和甘露聚糖，目前细胞壁主要应用在饲料配料中，作为提升动物的免疫力原料使用，由于饲料的附加值不高，细胞壁的效益较低，因此提升细胞壁的效益日益重要。
细胞壁中较为关键的组分为葡聚糖和甘露聚糖，提升葡聚糖和甘露聚糖的纯度，能够提升细胞壁的使用价值。但由于酵母葡聚糖不溶于水，限制了葡聚糖的应用范围，因此，亟需提供一种改善葡聚糖溶解度的方法。
发明内容
基于此，有必要提供一种可溶性酵母葡聚糖及其制备方法，以改善葡聚糖的溶解度。
本发明的第一方面提供了一种可溶性酵母葡聚糖的制备方法，包括如下步骤：
将含有细胞壁物料的第一溶液进行均质处理和加热处理，将加热处理反应液进行酶解处理，制备酶解物；其中，所述细胞壁物料包括由酵母酶解获得的物料；
对所述酶解物进行固液分离处理，制备葡聚糖样品A；
对含有所述葡聚糖样品A的第二溶液进行碱处理，制备葡聚糖样品B；
对所述葡聚糖样品B进行脱脂处理，制备葡聚糖样品C；
对所述葡聚糖样品C进行羧甲基化处理，制备所述可溶性酵母葡聚糖。
在一些实施例中，采用均质机对含有细胞壁物料的第一溶液进行均质处理；
可选地，所述细胞壁物料在所述第一溶液中的质量百分比浓度为11％-15％；
可选地，所述均质处理的压力为60MPa-80MPa，所述均质处理的次数为2-4次。
在一些实施例中，所述酶解处理包括下述条件中的至少一项：
(1)所述酶解处理的温度为55℃-65℃；
(2)所述酶解处理的时间为12h-16h；
(3)所述酶解处理的pH值为5-7；
(4)采用酸性蛋白酶和甘露聚糖酶对所述加热处理反应液进行酶解处理；
可选地，所述酸性蛋白酶的质量占所述细胞壁物料的质量的2‰-4‰；
可选地，所述甘露聚糖酶的质量占所述细胞壁物料的质量的2‰-4‰。
在一些实施例中，所述碱处理包括下述条件中的至少一项：
(1)所述碱处理采用的碱包括氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或多种；
(2)所述碱的质量占所述第二溶液的质量的百分比为2％-4％；
(3)所述葡聚糖样品A在所述第二溶液中的质量百分比浓度为4％-8％；
(4)所述碱处理的温度为80℃-95℃；
(5)所述碱处理的时间为3h-6h。
在一些实施例中，采用体积百分比浓度为75％-100％的乙醇溶液对所述葡聚糖样品B进行脱脂处理。
在一些实施例中，所述将所述酶解物进行固液分离处理的步骤包括：
将所述酶解物分离为上清液和沉淀物，对所述上清液进行蒸发和喷雾干燥制得甘露聚糖，对所述沉淀物进行喷雾干燥制得所述葡聚糖样品A。
在一些实施例中，所述将所述葡聚糖样品C进行羧甲基化处理的步骤包括：
将所述葡聚糖样品C与体积百分比浓度为75％-95％的乙醇溶液以及碱液混合，于25℃-30℃下保温1h-5h，制备混合液；
将混合液与氯乙酸溶液混合，进行醚化处理。
在一些实施例中，所述羧甲基化处理包括下述条件中的至少一项：
(1)所述葡聚糖样品C和所述体积百分比浓度为75％-95％的乙醇溶液的质量体积比为1g:(5-10)mL；
(2)所述葡聚糖样品C和所述碱液的质量体积比为1g:(1-2)mL；
(3)所述碱液为质量百分比浓度为30％-40％的氢氧化钠溶液；
(4)所述醚化处理的温度为70℃-90℃；
(5)所述醚化处理的时间为2h-5h；
(6)所述混合液与所述氯乙酸溶液的体积比为1:(1.5-3)；
(7)所述氯乙酸溶液为氯乙酸的乙醇溶液，所述氯乙酸溶液中氯乙酸的摩尔浓度为3M-4M。
在一些实施方式中，所述加热处理包括：
进行所述均质处理后，于80℃-95℃保温处理2h。
在一些实施方式中，所述对碱处理反应液进行pH调节的步骤包括：
采用硫酸调节所述碱处理反应液的pH值至6.0-7.0。
本发明的第二方面提供了一种可溶性酵母葡聚糖，其采用本发明第一方面的方法制备得到。
上述的可溶性酵母葡聚糖及其制备方法，制备可溶性酵母葡聚糖时，通过对酵母酶解获得的细胞壁物料进行均质处理、酶解处理和分离处理，先制备得到较低纯度的葡聚糖样品A，通过上述处理可降低后续处理过程中酸碱的使用量；再通过对葡聚糖样品A进行碱处理和脱脂处理制备得到较高纯度的葡聚糖样品C，最终通过羧甲基化处理制备得到高品质和高纯度的可溶性酵母葡聚糖，扩展了应用领域。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关实施例对本发明进行更全面的描述。下述给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本文仅具体地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任意上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，每个单独公开的点或单个数值自身可以作为下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
在发明的描述中，“多种”的含义是至少两种，例如两种，三种等，除非另有明确具体的限定。
如果没有特别的说明，本发明的所有实施方式以及可选实施方式可以相互组合形成新的技术方案。如果没有特别的说明，本发明的所有技术特征以及可选技术特征可以相互组合形成新的技术方案。
如果没有特别的说明，本发明的所有步骤可以顺序进行，也可以随机进行，优选是顺序进行的。
酵母葡聚糖不溶于水，限制了葡聚糖的应用范围，因此改善葡聚糖的溶解度具有非常大的经济效益。
相关技术中，一般是通过碱法处理细胞壁来制备高纯度的葡聚糖，然后进一步羧甲基化处理，得到可溶性的羧甲基葡聚糖钠。采用碱法处理细胞壁最大的问题是能耗高，产品收率低，废水量较大，产品的纯度不高。经过测算一般生产1t葡聚糖水耗约为700t，葡聚糖相当于细胞壁的收率约为15％，最终产品的纯度约为85％，因此提升产品的利用率，降低能耗非常关键。
基于上述问题，本发明制备可溶性酵母葡聚糖时，首先对细胞壁物料进行均质处理、酶解处理和分离处理，以去除了甘露聚糖和蛋白质等杂质，得到较低纯度的葡聚糖样品A，可降低后续处理过程中的酸碱用量，减少废水数量。然后对较低纯度的葡聚糖样品A进行后续的碱处理和脱脂处理过程，可提高葡聚糖的纯度，得到较高纯度的葡聚糖样品C，最终通过羧甲基化处理改善了葡聚糖的溶解性。
本发明的第一方面提供了一种可溶性酵母葡聚糖的制备方法，包括如下步骤：
将含有细胞壁物料的第一溶液进行均质处理和加热处理，将加热处理反应液进行酶解处理，制备酶解物；其中，细胞壁物料包括由酵母酶解获得的物料；
对酶解物进行固液分离处理，制备葡聚糖样品A；
对含有葡聚糖样品A的第二溶液进行碱处理，制备葡聚糖样品B；
对葡聚糖样品B进行脱脂处理，制备葡聚糖样品C；
对葡聚糖样品C进行羧甲基化处理，制备可溶性酵母葡聚糖。
需要说明的是，上述提及的“第一溶液”、“第二溶液”中的“第一”、“第二”仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。
最后制备得到的可溶性酵母葡聚糖为水溶性羧甲基葡聚糖钠。
可理解地，制备可溶性酵母葡聚糖时，通过对酵母酶解获得的细胞壁物料进行均质处理、酶解处理和分离处理，先制备得到较低纯度的葡聚糖样品A，通过上述处理可降低后续处理过程中酸碱的使用量；再通过对葡聚糖样品A进行碱处理和脱脂处理制备得到较高纯度的葡聚糖样品C，最终通过羧甲基化处理制备得到高品质和高纯度的可溶性酵母葡聚糖，扩展了产品的应用领域。
本发明制备可溶性葡聚糖时，利用均质处理，辅助定向酶解技术等工艺，最终能够同时制备甘露聚糖和葡聚糖两种产品，其中，甘露聚糖的纯度超过了40％，进一步提升了酵母细胞壁的使用价值。
通过酶解处理和分离处理，能够除去甘露聚糖和蛋白质等杂质，使得后续最终产品提纯需要的碱液数量减少，对应的，后续调节pH所用的酸液数量也减少，大大减少了废水的数量，根据收率情况，预计可以减少正常废水的1/3。
通过酶解处理、碱处理和乙醇脱脂处理，得到的葡聚糖样品的纯度可高达95％。
制备可溶性酵母葡聚糖时，一般采用酵母，通过发酵扩培高蛋白酵母乳，使用高密度发酵技术，经过自溶酶解，制备得到细胞壁物料。
在一些实施方式中，所述酵母菌株选自酿酒酵母。在一些实施方式中，酵母菌株选自(Saccharomyces cerevisiae)ZB421，其已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61681，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2021年5月26日。
更进一步地，细胞壁物料的制备方法包括：
将冷冻保藏的酵母菌株，经过活化后，进行摇瓶扩培，培养成种子后，再采取流加补料商品发酵：采用15L发酵罐，商品发酵罐使用物料包括如下物料：糖蜜、氨水、磷酸二氢铵、pH调节剂和消泡油，pH调节剂包括硫酸和碳酸钠，消泡油包括PPE；首先发酵罐配置底水，加入1‰的硫酸镁，0.4‰的硫酸锌，2‰的酵母膏，调节底水pH值为4.5，然后按照酵母接种量为5％接入摇瓶种子，再加入糖蜜，氨水，磷酸二氢铵，硫酸，碳酸钠配成溶液，溶液浓度为10～30％；其中上述各物料都采取匀速流加补料方式添加，根据发酵时间和发酵的湿重，调节风量和流加原料量，控制发酵温度为30℃，pH值4.2-6.0，通气量按照6～30L/min通气，发酵时间按照14-16h进行。
发酵结束后，使用冰水对酵母乳进行分离洗涤操作，分离一次，洗涤二次，得到需要的酵母乳，酵母乳浓度为16-20％，测定指标，得到酵母乳物料，添加2％的乙酸、10％的乙酸乙酯，调节酵母浓度为13％左右，升温至47.5℃，热击上罐，处理5h，升温至51.5℃，保温3h，最后升温至58℃，然后添加酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味酶，酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味酶的质量分别占酵母乳物料中干物质总量的1‰，保温8h，控制PH在5.8-6.0之间；然后升温至68℃，加入酵母乳物料中干物质总量5wt‰的核酸酶，处理20h，降温到50℃，控制pH值为5.5，加入酵母乳物料中干物质总量3wt‰的脱氨酶，处理12h，结束酶解过程；酶解结束后，对酵母水解物进行分离，分离采用一分两洗，分离得到上清液和细胞壁物料。
需要说明的是，上述提及的“一分两洗”是指，对酵母水解物进行分离为重相和轻相，对于重相加水清洗一次，一次清洗后再次分离为重相和轻相，然后继续对重相加水，二次清洗后再次分离为重相和轻相。其中，重相为细胞壁物料，轻相为抽提物。
获得细胞壁物料后，将其配制成第一溶液，然后进行均质处理。在一些实施方式中，采用均质机对含有细胞壁物料的第一溶液进行均质处理。通过对细胞壁物料进行均质处理，能够促进细胞壁物料的破碎，方便后续的酶解除杂。
在一些可选的实施方式中，细胞壁物料在第一溶液中的质量百分比浓度为11％-15％；例如，可以为但不限定于11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％或者上述任意两个数值之间的范围。第一溶液中细胞壁物料的浓度低于上述范围时，后续处理水分含量高，处理成本高；第一溶液中细胞壁物料的浓度高于上述范围时，粘度增加，酶解效果降低。
在一些可选的实施方式中，均质处理为采用高压均质机进行高压均质处理，均质处理的压力为60MPa-80MPa；例如，可以为但不限定于60MPa、61MPa、62MPa、63MPa、64MPa、65MPa、66MPa、67MPa、68MPa、69MPa、70MPa、71MPa、72MPa、73MPa、74MPa、75MPa、76MPa、77MPa、78MPa、79MPa、80MPa或者上述任意两个数值之间的范围。均质处理的压力低于上述范围时，破碎效果差，后续酶解效果不佳；均质处理的压力高于上述范围时，细胞壁裂解严重，溶液粘度增加。
在一些可选的实施方式中，均质处理的次数为2-4次。可选地，均质处理的次数为3次。
均质处理后，对均质处理后的物料进行加热处理。在一些实施方式中，加热处理包括：进行均质处理后，于80℃-95℃保温处理2h；通过该加热处理，可易于提取细胞壁内容物。
即加热处理的温度为80℃-95℃；例如可以为但不限定于80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃或者上述任意两个数值之间的范围。
加热处理后，制得加热处理反应液，将加热处理反应液降温并调节其pH值后进行酶解处理。在一些实施方式中，酶解处理的温度为55℃-65℃；例如可以为但不限定于55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃或者上述任意两个数值之间的范围。
作为一种可选的实施方式，酶解处理的时间为12h-16h；例如可以为但不限定于12h、12.5h、13h、13.5h、14h、14.5h、15h、15.5h、16h或者上述任意两个数值之间的范围。酶解处理的时间控制在上述范围内时，能够充分发挥酶制剂的效果；酶解处理的时间高于上述范围，酶已失效，降低经济效益；酶解处理的时间低于上述范围，酶解效果较差。
在一些实施例中，进行酶解处理时，酶解处理的pH值为5-7；例如可以为但不限定于5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7或者上述任意两个数值之间的范围。进行酶解处理时，酶解处理的pH值控制在上述范围内时，酶解效果更佳。
在一些实施方式中，采用酸性蛋白酶和甘露聚糖酶对加热处理反应液进行酶解处理。
在一些可选的实施方式中，酸性蛋白酶的质量占所述细胞壁物料的质量的2‰-4‰；例如可以为但不限定于2‰、2.1‰、2.2‰、2.3‰、2.4‰、2.5‰、2.6‰、2.7‰、2.8‰、2.9‰、3‰、3.1‰、3.2‰、3.3‰、3.4‰、3.5‰、3.6‰、3.7‰、3.8‰、3.9‰、4‰或者上述任意两个数值之间的范围。酸性蛋白酶的用量低于上述范围时，酶解效果不佳；酸性蛋白酶的用量高于上述范围时，酶解效果并不能进一步提升，反而会提高成本。
在一些可选的实施方式中，甘露聚糖酶的质量占所述细胞壁物料的质量的2‰-4‰；例如可以为但不限定于2‰、2.1‰、2.2‰、2.3‰、2.4‰、2.5‰、2.6‰、2.7‰、2.8‰、2.9‰、3‰、3.1‰、3.2‰、3.3‰、3.4‰、3.5‰、3.6‰、3.7‰、3.8‰、3.9‰、4‰或者上述任意两个数值之间的范围。甘露聚糖酶的用量低于上述范围时，酶解效果不佳；甘露聚糖酶的用量高于上述范围时，酶解效果并不能进一步提升，反而会提高成本。
酶解处理后，于85℃对酶解物进行灭酶30min；灭酶后对酶解物进行分离处理。在一些实施方式中，将酶解物进行固液分离处理的步骤包括：将酶解物分离为上清液和沉淀物，对上清液进行蒸发和喷雾干燥制得甘露聚糖，对沉淀物进行喷雾干燥制得葡聚糖样品A。
需要说明的是，对酶解物进行固液分离时采用一分两洗的方式，分离得到上清液和沉淀物，上清液为甘露聚糖和蛋白质类物质，沉淀物大部分为细胞壁组分；通过对上清液进行蒸发和喷雾干燥处理可得到甘露聚糖，通过对沉淀物进行喷雾干燥处理可制得葡聚糖样品A，葡聚糖样品A中葡聚糖的纯度较低。通过对酶解物进行固液分离处理，可将甘露聚糖和葡聚糖分离，并收集得到纯度较高的甘露聚糖。
获得葡聚糖样品A后，对包含葡聚糖样品A的第二溶液进行碱处理。在一些实施方式中，碱处理采用的碱包括氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或多种。
在一些实施方式中，碱的质量占第二溶液的质量的百分比为2％-4％；例如可以为但不限定于2％、2.2％、2.5％、2.7％、3％、3.3％、3.5％、3.8％、4％或者上述任意两个数值之间的范围。碱的用量在上述范围内时，葡聚糖的纯度效果最好；碱的用量高于上述范围时，葡聚糖的纯度并不能进一步提升；碱的用量低于上述范围时，葡聚糖的纯度不佳。
在一些实施方式中，葡聚糖样品A在第二溶液中的质量百分比浓度为4％-8％；例如可以为但不限定于4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％或者上述任意两个数值之间的范围。
在一些实施例中，碱处理的温度为80℃-95℃；例如可以为但不限定于80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃或者上述任意两个数值之间的范围。碱处理的温度在上述范围时，能够促进杂质的去除且节约投入。
作为一种可选的实施方式，碱处理的时间为3h-6h；例如可以为但不限定于3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h或者上述任意两个数值之间的范围。
碱处理完成后，将碱处理反应液降温至60℃-70℃，分离清洗，得沉淀物，然后向沉淀物中加入硫酸，调节上清液pH值至6.0-7.0；接着分离洗涤，进行干燥处理，制得葡聚糖样品B。
将葡聚糖样品B进行脱脂处理。在一些实施方式中，采用体积百分比浓度为75％-100％的乙醇溶液对葡聚糖样品B进行脱脂处理；制得葡聚糖样品C，葡聚糖样品C中葡聚糖的纯度可达95％。
需要说明的是，上述提及的乙醇溶液为乙醇的水溶液。
在一些可选的实施方式中，采用索式抽提装置对葡聚糖样品B进行脱脂处理。
对脱脂处理后得到的葡聚糖样品C进行羧甲基化处理。在一些实施方式中，将所述葡聚糖样品C进行羧甲基化处理的步骤包括：将葡聚糖样品C与体积百分比浓度为75％-95％的乙醇溶液以及碱液混合，于25℃-30℃下保温1h-5h，制备混合液；将混合液与氯乙酸溶液混合，进行醚化处理。
需要说明的是，上述提及的乙醇溶液为乙醇的水溶液。乙醇溶液的体积百分比浓度可以为但不限定于75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％或者上述任意两个数值之间的范围。
在一些可选的实施方式中，葡聚糖样品C和体积百分比浓度为75％-95％的乙醇溶液的质量体积比为1g:(5-10)mL；例如可以为但不限定于1g:5mL、1g:5.5mL、1g:6mL、1g:6.5mL、1g:7mL、1g:7.5mL、1g:8mL、1g:8.5mL、1g:8mL、1g:8.5mL、1g:10mL或者上述任意两个比例之间的范围。
在一些可选的实施方式中，葡聚糖样品C和碱液的质量体积比为1g:(1-2)mL；例如可以为但不限定于1g:1.1mL、1g:1.2mL、1g:1.3mL、1g:1.4mL、1g:1.5mL、1g:1.6mL、1g:1.7mL、1g:1.8mL、1g:1.9mL、1g:mL或者上述任意两个比例之间的范围。
作为一种可能的实施方式，碱液为质量百分比浓度为30％-40％的氢氧化钠溶液。
在一些可能的实施方式中，醚化处理的温度为70℃-90℃；例如可以为但不限定于70℃、72℃、75℃、78℃、80℃、83℃、85℃、88℃、90℃或者上述任意两个数值之间的范围。
在一些可选的实施方式中，醚化处理的时间为2h-5h；例如，可以为但不限定于2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h或者上述任意两个数值之间的范围。
作为一种可能的实施方式，混合液与氯乙酸溶液的体积比为1:(1.5-3)；例如，可以为但不限定于1:1.5、1:1.7、1:2、1:2.3、1:2.5、1:2.8、1:3或者上述任意两个比例之间的范围。
作为一种可能的实施方式，氯乙酸溶液为氯乙酸的乙醇溶液，氯乙酸溶液中氯乙酸的摩尔浓度为3M-4M。
醚化处理后，向醚化反应液中加入盐酸调节pH值至6-7，然后加入体积百分比浓度为70-95％的乙醇溶液洗涤3-5遍以上至颜色变白，真空干燥，制得可溶性酵母葡聚糖，即水溶性羧甲基葡聚糖钠。
需要说明的是，上述提及的乙醇溶液为乙醇的水溶液。
本发明的第二方面提供了一种可溶性酵母葡聚糖，其采用第一方面的方法制备得到。
下述结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1.葡聚糖样品A的制备
对加热处理反应液进行酶解处理时的pH值、酶加入量和酶解时间进行优化筛选。
将含有细胞壁物料的第一溶液的溶度调节为13％，然后使用均质机对第一溶液进行破碎处理，均质压力为80Mpa，均质三次；然后升温至90℃，热击上罐，处理2h，制得加热处理反应液；将加热处理反应液降温至60℃，并调节其pH值至5-7；然后添加细胞壁物料的2‰-4‰的酸性蛋白酶和细胞壁物料的3‰的甘露聚糖酶，保温12-16h，制得酶解物，将酶解物于85℃灭酶30nmin。
采用一分两洗的方式对酶解物进行分离处理，分离得到上清液和沉淀物，上清液为甘露聚糖和蛋白类物质，测定上清液的收率，对上清液进行蒸发，喷雾干燥。沉淀物大部分为细胞壁组分，沉淀使用喷雾干燥得到纯度较低的葡聚糖样品A，测定上清液中甘露聚糖的含量和重相葡聚糖的含量。
(1)实施例1.1-实施例1.3的区别主要在于：进行酶解处理时的pH值不同。酶解处理的过程具体为：
将含有细胞壁物料的第一溶液的溶度调节为13％，然后使用均质机对第一溶液进行破碎处理，均质压力为80Mpa，均质三次；然后升温至90℃，热击上罐，处理2h，制得加热处理反应液；将加热处理反应液降温至60℃，并调节其pH值至5-7；然后添加细胞壁物料的3‰的酸性蛋白酶和细胞壁物料的3‰的甘露聚糖酶，保温16h，制得酶解物，将酶解物于85℃灭酶30nmin。
实施例1.1-实施例1.3中酶解pH值、上清液收率、上清液中甘露聚糖含量、重相葡聚糖含量分别如表1所示。
表1
其中，重相葡聚糖是指沉淀物中含有的葡聚糖。
由表1中结果可知，当酶解处理的pH值为5-7时，酶解效果均较佳。尤其当酶解处理的pH值为6.0时，酶解效果最佳，上清液的收率，以及上清液中甘露聚糖和重相葡聚糖的含量均比较高。技术人员分析其原因可能是由于，酶解处理的pH值影响酶的活性，在较为合适的pH值条件下，酶活性较高，酶解效果也较好。
(2)实施例1.4-实施例1.6的区别主要在于：进行酶解处理时的酸性蛋白酶的添加量不同。酶解处理的过程具体为：
将含有细胞壁物料的第一溶液的溶度调节为13％，然后使用均质机对第一溶液进行破碎处理，均质压力为80Mpa，均质三次；然后升温至90℃，热击上罐，处理2h，制得加热处理反应液；将加热处理反应液降温至60℃，并调节其pH值至6；然后添加细胞壁物料的2-4‰的酸性蛋白酶和细胞壁物料的3‰的甘露聚糖酶，保温16h，制得酶解物，将酶解物于85℃灭酶30nmin。
实施例1.4-实施例1.6中酶解pH值、上清液收率、上清液中甘露聚糖含量、重相葡聚糖含量分别如表2所示。
表2
由表2中结果可知，当酸性蛋白酶添加量为2‰-4‰时，酶解效果均较佳。尤其当酸性蛋白酶添加量为3‰时，酶解效果最佳，上清液的收率，以及上清液中甘露聚糖和重相葡聚糖的含量均比较高。技术人员分析其原因可能是由于，随着酸性蛋白酶添加量的增加，酶解效果变好，但是底物的数量没有变化，当酸性蛋白酶数量持续增加时，并不会增加最终的收率，且由于酸性蛋白酶的增加，可能导致最终成本的增加，因此酸性蛋白酶的最佳添加量为3‰。
(3)实施例1.7-实施例1.9的区别主要在于：进行酶解处理时的酶解时间不同。酶解处理的过程具体为：
将含有细胞壁物料的第一溶液的溶度调节为13％，然后使用均质机对第一溶液进行破碎处理，均质压力为80Mpa，均质三次；然后升温至90℃，热击上罐，处理2h，制得加热处理反应液；将加热处理反应液降温至60℃，并调节其pH值至6；然后添加细胞壁物料的3‰的酸性蛋白酶和细胞壁物料的3‰的甘露聚糖酶，保温12-16h，制得酶解物，将酶解物于85℃灭酶30min。
实施例1.7-实施例1.9中酶解pH值、上清液收率、上清液中甘露聚糖含量、重相葡聚糖含量分别如表3所示。
表3
由表3中结果可知，当酶解时间为12h-16h时，酶解效果均较佳。尤其当酶解时间为14h时，酶解效果最佳，上清液的收率，以及上清液中甘露聚糖和重相葡聚糖的含量均比较高。
由上述数据可知，经过酶解条件优化后，细胞壁的葡聚糖从22.7％能够提升到43.9％，几乎提升一倍，同时细胞壁物料的收率为63.5％，相当于后续加工的酸碱物料数量减少约1/3，因此通过酶法处理，能够减少后续加工物料的数量，从而能够节约后续产品处理的试剂和环保费用。
实施例2.葡聚糖样品C的制备
将葡聚糖样品A制备成浓度为6％的第二溶液，充分混匀，然后加入占第二溶液质量的4％的氢氧化钠，充分搅拌溶解后，升温至95℃，保温3h，并不停搅拌，保温完成后，降温至65℃，分离清洗，然后加入硫酸，调节pH值至6.0，然后分离洗涤，进行干燥处理，制得葡聚糖样品B。测定葡聚糖样品B的水分含量、蛋白质含量、葡聚糖含量、酯类含量和灰分含量，结果如表4所示。
采用体积百分比浓度为95％的乙醇水溶液对葡聚糖样品B进行脱脂处理(使用索式抽提装置)，得到葡聚糖样品C。测定葡聚糖样品C的水分含量、蛋白质含量、葡聚糖含量、酯类含量和灰分含量，结果如表4所示。
表4
由上述结果可知，细胞壁物料经过酶解处理后，残渣的葡聚糖含量提升到43.9％，纯度得到了一定的提高；通过使用碱法来进一步提取，除掉蛋白质和甘露聚糖以及碱溶性葡聚糖等杂质，得到的产品经过洗涤后产品的葡聚糖含量可以达到87.72％。
但是，这样制备的产品放置一段时间后，产品会出现明显的苦味和哈喇味，经过分析，发现主要是产品存在的一定量的脂类物质被氧化而导致的，因此可以通过有机溶剂脱脂得到纯度更好，口感风味更佳的葡聚糖产品，脱脂后，产品的葡聚糖含量提升到95％以上，比相关技术中产品品质和纯度要更好一些。
实施例3.可溶性酵母葡聚糖(羧甲基葡聚糖钠)的制备
向葡聚糖样品C中加入10倍体积的体积百分比浓度为95％的乙醇水溶液(相对于葡聚糖的质量体积比)和2倍质量的质量百分比浓度为40％的氢氧化钠溶液(相对于葡聚糖的质量比)，不停搅拌，25℃下，处理1h，然后升温到70℃，加入1.5倍体积的氯乙酸的乙醇溶液(氯乙酸的摩尔浓度为4M)，保温控制醚化2h，结束醚化后加入盐酸调节pH值至7.0，然后加入体积百分比浓度为95％的乙醇水溶液洗涤5遍，至颜色变白，真空干燥，得到可溶性酵母葡聚糖。
实施例4.可溶性酵母葡聚糖(羧甲基葡聚糖钠)的制备
向葡聚糖样品C中加入5倍体积的体积百分比浓度为75％的乙醇水溶液(相对于葡聚糖的质量体积比)和1倍质量的质量百分比浓度为30％的氢氧化钠溶液(相对于葡聚糖的质量比)，不停搅拌，25℃条件下，处理5h，然后升温到90℃，加入3倍体积的氯乙酸的乙醇溶液(氯乙酸的摩尔浓度为3M)，保温控制醚化5h，结束醚化后加入盐酸调节pH值至7.0，然后加入体积百分比浓度为95％的乙醇水溶液洗涤5遍，至颜色变白，真空干燥，得到可溶性酵母葡聚糖。
实施例5.可溶性酵母葡聚糖(羧甲基葡聚糖钠)的制备
向葡聚糖样品C中加入7倍体积的体积百分比浓度为80％的乙醇水溶液(相对于葡聚糖的质量体积比)和1.5倍质量的质量百分比浓度为35％的氢氧化钠溶液(相对于葡聚糖的质量比)，不停搅拌，25℃条件下，处理3h，然后升温到80℃，加入2倍体积的氯乙酸的乙醇溶液(氯乙酸的摩尔浓度为3.5M)，保温控制醚化3.5h，结束醚化后加入盐酸调节pH值至7.0，然后加入体积百分比浓度为95％的乙醇水溶液洗涤5遍，至颜色变白，真空干燥，得到可溶性酵母葡聚糖。
对比例1
对比例1中可溶性葡聚糖的制备方法和实施例3中可溶性葡聚糖的制备方法的区别主要在于：未对细胞壁物料进行均质处理和酶解处理，直接进行碱处理、脱脂处理和羧甲基化处理。具体过程如下：
将含有细胞壁物料的第一溶液的浓度调节为13％，充分混匀，然后升温至90℃，热击上罐，处理2h，然后加入占第一溶液质量的4％的氢氧化钠，充分搅拌溶解后，升温至95℃，保温3h，并不停搅拌，保温完成后，降温至65℃，分离清洗，然后加入硫酸，调节pH值至6.0，然后分离洗涤，进行干燥处理，制得葡聚糖样品B。
采用体积百分比浓度为95％的乙醇水溶液对葡聚糖样品B进行脱脂处理(使用索式抽提装置)，得到葡聚糖样品C。
向葡聚糖样品C中加入10倍体积的体积百分比浓度为95％的乙醇水溶液(相对于葡聚糖的质量体积比)和2倍质量的质量百分比浓度为40％的氢氧化钠溶液(相对于葡聚糖的质量比)，不停搅拌，25℃下，处理1h，然后升温到70℃，加入1.5倍体积的氯乙酸的乙醇溶液(氯乙酸的摩尔浓度为4M)，保温控制醚化2h，结束醚化后加入盐酸调节pH值至7.0，然后加入体积百分比浓度为95％的乙醇水溶液洗涤5遍，至颜色变白，真空干燥，得到可溶性酵母葡聚糖。
对比例2
对比例2中可溶性葡聚糖的制备方法和实施例3中可溶性葡聚糖的制备方法的区别主要在于：未对细胞壁物料进行均质处理，直接进行酶解处理和后续的碱处理、脱脂处理和羧甲基化处理。具体过程如下：
将含有细胞壁物料的第一溶液的溶度调节为13％，然后升温至90℃，热击上罐，处理2h，制得加热处理反应液；将加热处理反应液降温至60℃，并调节其pH值至5-7；然后添加细胞壁物料的2‰-4‰的酸性蛋白酶和细胞壁物料的3‰的甘露聚糖酶，保温12-16h，制得酶解物，将酶解物于85℃灭酶30nmin。
采用一分两洗的方式对酶解物进行分离处理，分离得到上清液和沉淀物，上清液为甘露聚糖和蛋白类物质，测定上清液的收率，对上清液进行蒸发，喷雾干燥。沉淀物大部分为细胞壁组分，沉淀使用喷雾干燥得到纯度较低的葡聚糖样品A。
将葡聚糖样品A制备成浓度为6％的第二溶液，充分混匀，然后加入占第二溶液质量的4％的氢氧化钠，充分搅拌溶解后，升温至95℃，保温3h，并不停搅拌，保温完成后，降温至65℃，分离清洗，然后加入硫酸，调节pH值至6.0，然后分离洗涤，进行干燥处理，制得葡聚糖样品B。
采用体积百分比浓度为95％的乙醇水溶液对葡聚糖样品B进行脱脂处理(使用索式抽提装置)，得到葡聚糖样品C。
向葡聚糖样品C中加入10倍体积的体积百分比浓度为95％的乙醇水溶液(相对于葡聚糖的质量体积比)和2倍质量的质量百分比浓度为40％的氢氧化钠溶液(相对于葡聚糖的质量比)，不停搅拌，25℃下，处理1h，然后升温到70℃，加入1.5倍体积的氯乙酸的乙醇溶液(氯乙酸的摩尔浓度为4M)，保温控制醚化2h，结束醚化后加入盐酸调节pH值至7.0，然后加入体积百分比浓度为95％的乙醇水溶液洗涤5遍，至颜色变白，真空干燥，得到可溶性酵母葡聚糖。
对比例3
对比例3中可溶性葡聚糖的制备方法和实施例3中可溶性葡聚糖的制备方法的区别主要在于：未对细胞壁物料进行酶解处理，进行均质处理后直接进行后续的碱处理、脱脂处理和羧甲基化处理。具体过程如下：
将含有细胞壁物料的第一溶液的溶度调节为13％，然后使用均质机对第一溶液进行破碎处理，均质压力为80Mpa，均质三次；然后升温至90℃，热击上罐，处理2h，制得加热处理反应液；
将热反应液稀释成浓度为6％的第二溶液，充分混匀，然后加入占第二溶液质量的4％的氢氧化钠，充分搅拌溶解后，升温至95℃，保温3h，并不停搅拌，保温完成后，降温至65℃，分离清洗，然后加入硫酸，调节pH值至6.0，然后分离洗涤，进行干燥处理，制得葡聚糖样品B。
采用体积百分比浓度为95％的乙醇水溶液对葡聚糖样品B进行脱脂处理(使用索式抽提装置)，得到葡聚糖样品C。
向葡聚糖样品C中加入10倍体积的体积百分比浓度为95％的乙醇水溶液(相对于葡聚糖的质量体积比)和2倍质量的质量百分比浓度为40％的氢氧化钠溶液(相对于葡聚糖的质量比)，不停搅拌，25℃下，处理1h，然后升温到70℃，加入1.5倍体积的氯乙酸的乙醇溶液(氯乙酸的摩尔浓度为4M)，保温控制醚化2h，结束醚化后加入盐酸调节pH值至7.0，然后加入体积百分比浓度为95％的乙醇水溶液洗涤5遍，至颜色变白，真空干燥，得到可溶性酵母葡聚糖。
对实施例3-5和对比例1-3中制备得到的可溶性酵母葡聚糖进行固形物含量、取代度、蛋白质含量、氯化物含量、羧甲基葡聚糖钠含量等检测，结果如表5所示。
表5
由实施例3-5和对比例1-3的结果比对可知，高纯度的葡聚糖样品C仍然为不溶性的葡聚糖，由于溶解性较差，严重限制了葡聚糖的应用领域。由实施例3-5的结果可知，利用衍生化加工技术，通过对高纯度的葡聚糖样品C进行羧甲基化处理，最终得到可溶性的羧甲基化酵母葡聚糖，产品的溶解度发生改变，能够扩展后续产品的应用领域；例如能够应用到化妆品，保健品等领域，提升产品的价值。
由实施例3和对比例1-3的结果比对可知，制备可溶性酵母葡聚糖时，通过预先对细胞壁物料进行均质处理和酶解处理，然后再进行后续处理，可明显提高最终制得的产物中羧甲基葡聚糖钠的含量；且对细胞壁物料进行均质处理和酶解处理可起到协同增效的作用。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种可溶性酵母葡聚糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将含有细胞壁物料的第一溶液进行均质处理和加热处理，将加热处理反应液进行酶解处理，制备酶解物；其中，所述细胞壁物料包括由酵母酶解获得的物料；
对所述酶解物进行固液分离处理，制备葡聚糖样品A；
对含有所述葡聚糖样品A的第二溶液进行碱处理，制备葡聚糖样品B；
对所述葡聚糖样品B进行脱脂处理，制备葡聚糖样品C；
对所述葡聚糖样品C进行羧甲基化处理，制备所述可溶性酵母葡聚糖。
2.如权利要求1所述的可溶性酵母葡聚糖的制备方法，其特征在于，采用均质机对含有细胞壁物料的第一溶液进行均质处理；
可选地，所述细胞壁物料在所述第一溶液中的质量百分比浓度为11％-15％；
可选地，所述均质处理的压力为60MPa-80MPa，所述均质处理的次数为2-4次。
3.如权利要求1所述的可溶性酵母葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述酶解处理包括下述条件中的至少一项：
(1)所述酶解处理的温度为55℃-65℃；
(2)所述酶解处理的时间为12h-16h；
(3)所述酶解处理的pH值为5-7；
(4)采用酸性蛋白酶和甘露聚糖酶对所述加热处理反应液进行酶解处理；
可选地，所述酸性蛋白酶的质量占所述细胞壁物料的质量的2‰-4‰；
可选地，所述甘露聚糖酶的质量占所述细胞壁物料的质量的2‰-4‰。
4.如权利要求1所述的可溶性酵母葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述碱处理包括下述条件中的至少一项：
(1)所述碱处理采用的碱包括氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或多种；
(2)所述碱的质量占所述第二溶液的质量的百分比为2％-4％；
(3)所述葡聚糖样品A在所述第二溶液中的质量百分比浓度为4％-8％；
(4)所述碱处理的温度为80℃-95℃；
(5)所述碱处理的时间为3h-6h。
5.如权利要求1所述的可溶性酵母葡聚糖的制备方法，其特征在于，采用体积百分比浓度为75％-100％的乙醇溶液对所述葡聚糖样品B进行脱脂处理。
6.如权利要求1所述的可溶性酵母葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述将所述酶解物进行固液分离处理的步骤包括：
将所述酶解物分离为上清液和沉淀物，对所述上清液进行蒸发和喷雾干燥制得甘露聚糖，对所述沉淀物进行喷雾干燥制得所述葡聚糖样品A。
7.如权利要求1所述的可溶性酵母葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述将所述葡聚糖样品C进行羧甲基化处理的步骤包括：
将所述葡聚糖样品C与体积百分比浓度为75％-95％的乙醇溶液以及碱液混合，于25℃-30℃下保温1h-5h，制备混合液；
将所述混合液与氯乙酸溶液混合，进行醚化处理。
8.如权利要求7所述的可溶性酵母葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述羧甲基化处理包括下述条件中的至少一项：
(1)所述葡聚糖样品C和所述体积百分比浓度为75％-95％的乙醇溶液的质量体积比为1g:(5-10)mL；
(2)所述葡聚糖样品C和所述碱液的质量体积比为1g:(1-2)mL；
(3)所述碱液为质量百分比浓度为30％-40％的氢氧化钠溶液；
(4)所述醚化处理的温度为70℃-90℃；
(5)所述醚化处理的时间为2h-5h；
(6)所述混合液与所述氯乙酸溶液的体积比为1:(1.5-3)；
(7)所述氯乙酸溶液为氯乙酸的乙醇溶液，所述氯乙酸溶液中氯乙酸的摩尔浓度为3M-4M。
9.如权利要求1至8任一项所述的可溶性酵母葡聚糖的制备方法，其特征在于，所述加热处理包括：
进行所述均质处理后，于80℃-95℃保温处理2h。
10.一种可溶性酵母葡聚糖，其特征在于，采用如权利要求1至9任一项所述的方法制备得到。
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