CN117143259A - 一种红枣降解多糖、降解多糖组分及其制备方法和应用 - Google Patents

一种红枣降解多糖、降解多糖组分及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品深加工技术领域,具体涉及一种红枣降解多糖、降解多糖组分及其制备方法和应用。本发明提供了一种红枣降解多糖的制备方法,利用超声波辅助联合H2O2‑Vc的方法对红枣多糖进行降解,并利用DEAE‑Sepharose Fast Flow凝胶柱和Sephacryl S‑100层析柱对红枣降解多糖进行分离纯化。本发明所述红枣降解多糖和多糖组分,降解处理后多糖表面碎片化程度加深,降解未改变多糖基本结构,而表观形貌特征出现一定程度改变;降解处理能提高多糖抗氧化能力且与多糖分子量成反比。

Description

一种红枣降解多糖、降解多糖组分及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于食品深加工技术领域,具体涉及一种红枣降解多糖、降解多糖组分及其制备方法和应用。
背景技术
红枣(Ziziphus jujube Mill.)是鼠李科枣属植物的果实,广泛分布于亚热带和热带地区,在我国主要分布在黄河沿岸各省以及新疆阿克苏地区。我国是世界上最大的红枣生产国也是唯一的红枣出口国,占世界红枣总产量的90%以上;因此,我国对红枣的开发与深入研究具有独特优势。红枣中富含多种生物活性成分,如多酚、黄酮、维生素、多糖、环核苷酸等。研究表明多糖是红枣中具有功能活性的主要成分之一,具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、降糖、降血脂、调节肠道菌群等多种生物活性,这表明红枣多糖在功能食品领域有很高的应用价值。目前,关于红枣多糖的研究主要集中在结构表征和活性研究等方面,由于天然红枣多糖分子量大、黏度高、溶解性差等因素,其产品开发受到限制。因此,找到有效的方法降解红枣多糖,是研究降解红枣多糖结构和开发新产品的基础。
目前,多糖降解方法可分为物理降解法、化学降解法、生物降解法以及联合降解法。化学降解法操作简单,但可能存在环境污染等问题;物理降解法虽可减少环境污染,但存在降解不彻底、对设备要求高等问题;生物降解法反应条件温和,但生产成本高,且对酶和微生物筛选困难。
发明内容
本发明利用超声波辅助H2O2-Vc联合降解红枣多糖,以DPPH自由基清除率为指标采用响应面法对降解条件进行优化,以制备具有高抗氧化活性的多糖,以期为红枣多糖的开发利用奠定理论基础。
本发明采用超声波辅助H2O2-Vc联合法降解红枣多糖,优化降解条件,对降解产物采用DEAE Sepharose Fast Flow和Sephacryl S-100层析柱进行分离纯化,再对纯化多糖组分进行结构解析和体外抗氧化活性研究:
1.红枣多糖的降解条件的优化
采用传统的水提醇沉法从红枣中提取红枣多糖(ZMP),随后采用超声辅助H2O2-Vc联合法对红枣多糖进行降解。以DPPH自由基清除率为指标,根据单因素试验和响应面优化,得出最佳降解条件为:超声时间为65min、降解剂H2O2-Vc浓度为10mmol/L、降解温度51℃,降解多糖(DZMP)得率为72.16%,最佳条件下DZMP的DPPH自由基清除率为81.76%。降解后总糖含量增至81.78%,蛋白质含量略有减小。
2.红枣降解多糖的分离纯化及结构分析
采用DEAE Sepharose Fast Flow层析柱和Sephacryl S-100凝胶柱分离纯化DZMP,得到一个中性多糖组分(DPZMP1)和三个酸性多糖组分(DPZMP2、DPZMP3和DPZMP4),根据多糖组分纯度选取DPZMP3进行结构解析。单糖组成分析表明,DPZMP3主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸组成,其摩尔比为1:1.4875:1.6:7.675,且平均分子量为34.275kDa;结合甲基化和核磁分析表明,DPZMP3属于HG型果胶;红外光谱分析表明,DPZMP3具有糖类典型的特征吸收峰,且含有糖醛酸特征吸收峰,进一步证明了DPZMP3为酸性糖,840cm-1处的吸收峰对应α构型,与核磁结果一致;紫外光谱分析表明,DPZMP3组分中不含蛋白质和核酸,与化学检验结果相符;SEM结果表明,降解处理后多糖表面碎片化程度加深。多糖结构解析表明,降解未改变多糖基本结构,而表观形貌特征出现一定程度改变。
3.红枣降解多糖组分体外抗氧化活性研究
研究红枣多糖、红枣降解多糖及其纯化组分的体外抗氧化活性结果表明,ZMP、DZMP和DPZMP3的DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力、还原力以及总抗氧化能力呈剂量依赖性。经降解后红枣多糖的抗氧化能力显著提升,三者的抗氧化能力依次为ZMP<DZMP<DPZMP3。尤其是DPPH自由基清除活性,当浓度为2.0mg/mL时,IC50值从0.4432mg/mL降至0.2174mg/mL。因此,降解处理能提高多糖抗氧化能力且与多糖分子量成反比。
附图说明
图1为超声时间对DZMP清除DPPH自由基的影响;
图2为H2O2-Vc浓度对DZMP清除DPPH自由基的影响;
图3为降解温度对DZMP清除DPPH自由基的影响;
图4为交互作用的响应面和等高线图;
图5为红枣降解多糖洗脱曲线;
图6为Sephacryl S-100洗脱曲线;
图7为红枣降解多糖组分HPGPC检测色谱图;
图8为单糖混标和红枣降解多糖组分的离子色谱图,单糖混合物标准:岩藻糖(Fuc)、盐酸氨基半乳糖(GalN)、鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、盐酸氨基葡萄糖(GlcN)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰-D氨基葡萄糖(GlcNAc)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、果糖(Fru)、核糖(Rib)、半乳糖醛酸(GalA)、古罗糖醛酸(GulA)、葡萄糖醛酸(GlcA)、甘露糖醛酸(ManA);
图9为DPZMP3多糖组分NMR谱(A:1H-NMR谱,B:13C-NMR谱,C:HSQC谱);
图10为红枣降解多糖组分紫外吸收光谱;
图11为DPZMP3红外吸收光谱;
图12为DPZMP3扫描电镜测试图;
图13为ZMP、DZMP、DPZMP3的DPPH自由基清除活性;
图14为ZMP、DZMP、DPZMP3的羟自由基清除活性;
图15为ZMP、DZMP、DPZMP3的还原能力;
图16为ZMP、DZMP、DPZMP3的超氧阴离子自由基清除活性;
图17为ZMP、DZMP、DPZMP3的总抗氧化能力。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。本发明实施例中所用的试剂和材料如非特殊说明,均为本领域的常规市售商店中采购得来,为分析纯级别甚至光谱级别。且进行试验数据统计时,实验均重复三次,结果以平均值±标准差表示;采用Design Expert、SPSS软件进行方差分析和数据处理;使用Origin2018软件进行绘图。
实施例1
1.1红枣多糖的制备
新鲜红枣去除枣核后干燥,粉碎得到红枣粉末,加入数倍体积的乙醇回流脱脂,除去脂溶性物质,低温挥干多余乙醇得到脱脂枣粉。以1:20(m/V)加入去离子水,80℃提取1h,离心收集上清液,滤渣加水复提,合并浓缩提取液,加入4倍体积无水乙醇溶液4℃静置过夜,收集沉淀,加水复溶得到多糖溶液。再经脱色、除蛋白、浓缩、冷冻干燥得红枣多糖(ZMP)。
1.2单因素试验设计
以DPPH自由基清除率为指标,进行单因素试验。研究不同超声时间、H2O2-Vc(1:1)浓度、降解温度条件下得到的降解产物对DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除率的测定方法如下。取4mg/mL多糖溶液50mL在不同条件下降解,再经浓缩、透析、醇沉、冷冻干燥得不同条件的降解多糖。取1mg/mL不同条件的降解多糖溶液2mL与2mL DPPH-乙醇(0.1mmol/L)溶液充分混匀,37℃避光反应30min,在517nm波长下测定溶液吸光度,计算降解产物对DPPH自由基的清除率。DPPH自由基清除率按公式(1)计算:
式中:A1为样品组吸光度,A2为空白组吸光度(无水乙醇代替DPPH),A0为对照组吸光度(去离子水代替样品)。
超声时间的影响:取4mg/mL多糖溶液,在H2O2-Vc浓度15mmol/L、降解温度50℃条件下,考察不同超声时间(20、40、60、80和100min)对DPPH自由基清除率的影响。
H2O2-Vc浓度的影响:取4mg/mL多糖溶液,在超声时间60min、降解温度50℃条件下,考察不同H2O2-Vc浓度(5、10、15、20、25mmol/L)对DPPH自由基清除率的影响。
降解温度的影响:取4mg/mL多糖溶液,在H2O2-Vc浓度10mmol/L、超声时间60min条件下,考察不同降解温度(30、40、50、60、70℃)对DPPH自由基清除率的影响。
1.2.1超声时间对DZMP清除DPPH自由基的影响
如图1所示,随着超声降解时间的延长DZMP对DPPH自由基清除率呈现先增加后平缓的趋势。这可能是因为随着时间的延长红枣多糖分子量达到限定链长,导致DPPH自由基清除率趋于平缓;因此,选择降解时间为60min进行响应面优化试验。
1.2.2H2O2-Vc浓度对DZMP清除DPPH自由基的影响
如图2所示,当H2O2-Vc浓度在5~10mmol/L时,随H2O2-Vc浓度的增加,DPPH自由基清除率随之增加,这可能是随H2O2-Vc浓度增加多糖分子量减小,活性基团逐渐增多。当H2O2-Vc浓度超过10mmol/L时,DZMP对DPPH自由基清除率逐渐降低,可能是红枣多糖降解过度,导致多糖活性降低。因此,选择H2O2-Vc浓度为10mmol/L进行响应面优化试验。
1.2.3降解温度对DZMP清除DPPH自由基的影响
如图3所示,随降解温度的增加,DZMP对DPPH自由基清除率呈现先增加后降低的趋势。这是因为适当提高降解温度,加速分子运动,使红枣多糖降解速率增加;当温度过高时导致H2O2分解以及Vc活力下降,导致降解速率下降。因此,选择降解温度为50℃进行响应面试验。
1.3响应面实验设计
以单因素试验为基础,根据Box-Behnken实验设计原理,以超声时间(A)、H2O2-Vc浓度(B)、降解温度(C)为自变量,DPPH自由基清除率为响应值。设计响应面实验,优化红枣多糖降解工艺,因素与水平设计见表1。
表1响应面实验设计的因素与水平
1.3.1模型构建与方差分析
响应面实验设计结果如表2所示。利用Design Expert软件对表2进行拟合,得到回归方程为:
Y=82.06+1.17A+0.28B+0.57C-0.50AB-0.39AC-0.22BC-2.03A2-2.52B2-1.77C2
回归模型方差分析如表3所示。该回归模型的P值小于0.0001,说明该模型极显著,失拟项P>0.05不显著,决定系数为R2=0.9857,表明该模型拟合度好;校正后决定系数RAdj 2=0.9674,与R2接近,说明模型准确性高,可用于响应值的预测。根据F值可以看出超声时间对多糖降解影响最大,H2O2-Vc浓度影响最小。交互项AB和二次项A2、B2、C2对DZMP清除DPPH自由基影响极显著(P<0.01),交互项BC对DZMP清除DPPH自由基影响显著(P<0.05),其他因素影响均不显著。
表2响应面实验设计与结果
表3回归模型方差分析
注:*表示差异显著(P<0.05);**表示极显著(P<0.01)。
1.3.2交互作用
响应面和等高线图可以直观地反映各因素对降解多糖清除DPPH自由基的影响以及各因素间交互作用是否显著,当响应面越陡,等高线越偏离圆,说明交互作用越显著。由图4中A可以看出随着超声时间和H2O2-Vc浓度的变化,降解多糖对DPPH自由基清除率先升高后降低,当超声时间为65.48min,H2O2-Vc浓度达10.18mmol/L时,降解多糖DPPH自由基清除率达到最大。同时可以看出超声时间与H2O2-Vc浓度交互作用显著,与方差分析结果一致。由图4中B可以看出随着降解温度的增加,降解多糖对DPPH自由基清除率先增加后降低;同时,随着降解时间的增加,降解多糖DPPH自由基清除率先增加后缓慢降低,且交互作用不显著。由图4中C以看出随着降解温度和H2O2-Vc浓度的增加,降解多糖对DPPH自由基清除率先增加,在降解温度达到51℃,H2O2-Vc浓度达到10.18mmol/L时,降解多糖对DPPH自由基清除率达到峰值,两者交互作用显著。
1.4降解多糖制备
根据单因素和响应面法获得的最佳降解条件,在此条件下对红枣多糖进行降解,再经浓缩、透析、冷冻干燥等过程制备降解红枣多糖(DZMP)。
利用Design Expert软件进行分析得出红枣多糖最佳降解条件为:超声时间65.48min、H2O2-Vc浓度10.11mmol/L、降解温度51.31℃,理论上DPPH自由基清除率预测值为82.255%。考虑到实验的可行性,对上述条件进行修正,最终优化降解条件:超声时间为65min、H2O2-Vc浓度为10mmol/L、降解温度51℃,在此条件下DPPH自由基清除率为81.76%,结果与预测值误差为0.60%。表明该模型能很好的预测红枣多糖的降解情况,具有一定的可靠性。
1.5多糖理化性质
采用苯酚-硫酸法测定ZMP和DZMP总糖含量;采用考马斯亮蓝法测定ZMP和DZMP蛋白质含量。
如表4所示,降解后红枣多糖的总糖含量由75.47%增加到81.78%,蛋白质含量由2.35%降低到1.14%。结果表明降解对多糖和蛋白质含量影响较小。
表4降解产物主要成分
注:不同字母表示显著性差异(P<0.05)
本实施例以DPPH自由基清除率为指标,建立了以超声波辅助H2O2-Vc降解红枣多糖的方法。响应面优化超声波辅助H2O2-Vc降解红枣多糖的条件为:超声时间为65min、H2O2-Vc浓度为10mmol/L、降解温度51℃,在此最佳条件下DZMP的DPPH自由基清除率为81.76%,得率为72.16%。降解后总糖含量由75.47%增加到81.78%,蛋白质含量略有减小。
实施例2
2.1降解多糖的分离纯化
装柱与平衡:将柱材装入规格为100cm×Φ2.6cm的色谱柱中,用去离子水以1.5mL/min流速平衡色谱柱,洗脱3个柱体积。
DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析:称取300mg红枣降解多糖复溶于10mL去离子水,于8000r/min离心15min,取上清液,过0.45μm滤膜,上柱。洗脱液需过0.45μm滤膜,再超声5min,去除杂质和气泡。先用去离子水洗脱,再依次用0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L的NaCl溶液洗脱,采用苯酚-硫酸法每隔5管测定洗脱液在490nm处的吸光度值,并绘制洗脱曲线。合并相同组分减压浓缩,透析72h,每2h更换去离子水,最后合并各组分的透析液,减压浓缩,冷冻干燥得到红枣降解多糖的各级分离物,命名为DZMP1、DZMP2、DZMP3、DZMP4。
Sephacryl S-100凝胶柱层析:将50mg经过DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱纯化后的红枣降解多糖(DZMP1、DZMP2、DZMP3、DZMP4)复溶,于8000r/min离心15min,取上清液,过0.45μm滤膜,上柱。去离子水洗脱前需过0.45μm滤膜,再超声5min,去除杂质和气泡,洗脱流速为0.8mL/min,每管收集洗脱液10mL。采用苯酚-硫酸法每隔5管测定洗脱液在490nm处的吸光度值,并绘制洗脱曲线。合并相同组分减压浓缩,冷冻干燥得纯化组分,命名为DPZMP1、DPZMP2、DPZMP3、DPZMP4。
2.1.1红枣降解多糖的分离纯化
采用DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱分离红枣降解多糖,洗脱曲线如图5所示。分别以0、0.1、0.2、0.3mol/L NaCl溶液洗脱得到四个糖峰,富集、浓缩、透析、冻干,并将其命名为DZMP1、DZMP2、DZMP3、DZMP4。根据DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱洗脱规律,DZMP1是中性多糖,而其他三种红枣降解多糖组分DZMP2、DZMP3、DZMP4是酸性多糖,其中以DZMP1和DZMP4的得率最低。
采用Sephacryl S-100凝胶柱对其进行进一步纯化处理,洗脱曲线如图6所示。收集对应糖峰,富集、浓缩、冻干得纯化多糖,将其命名为DPZMP1、DPZMP2、DPZMP3、DPZMP4。
2.2纯化组分理化性质分析
总糖含量的测定:利用实施例1中的方法测定纯化多糖(DPZMP1、DPZMP2、DPZMP3、DPZMP4)的总糖含量。
蛋白质含量的测定:利用实施例1中的方法测定纯化多糖(DPZMP1、DPZMP2、DPZMP3、DPZMP4)的蛋白质含量。
总酚含量的测定:采用Folin-Ciocalteu比色法测定纯化多糖(DPZMP1、DPZMP2、DPZMP3、DPZMP4)总酚含量。
总糖含量和纯度越高的样品,其结构表征越容易,可信度越高。表5是四种纯化组分理化性质测定结果,其中酸性多糖组分DPZMP2、DPZMP3、DPZMP4总糖含量高达90%以上,尤其是DPZMP3组分总糖含量最高为95.81%,中性多糖组分DPZMP1总糖含量仅为89.41%,与DZMP相比,经过纯化后多糖含量显著增加,大多数杂质被去除,使多糖纯度更高。糖含量和纯度越高的降解多糖组分越容易对其结构进行表征。因此,选DPZMP3进行结构解析和活性研究。
红枣降解多糖组分中蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定,其中中性多糖组分DPZMP1蛋白质含量是1.05%,而酸性多糖组分DPZMP2、DPZMP3、DPZMP4中蛋白质含量均低于1.0%,且各组分多酚含量也较低,对多糖结构影响可忽略。因此,结合各组分糖含量及纯度选DPZMP3进行结构解析和活性研究。
表5红枣降解多糖组分基本理化性质
注:不同字母表示显著性差异(P<0.05)
2.3分子量的测定
红枣降解多糖组分(DPZMP3)采用高效液相凝胶色谱法(HPGPC)进行纯度分析和分子量的测定。其条件为:检测器:RI-10A示差检测器;色谱柱:BRT105-104-102串联凝胶柱(8×300mm);柱温:40℃;流动相:0.05mol/L NaCl溶液;流速:0.6mL/min进样量:20μL。
样品处理,样品配制成5mg/mL溶液,过0.22μm滤膜后,转移至进样瓶中进行上机测试。
标准曲线,以不同分子量的Dextranstandards 1152作为标准品进行检测,以标品的色谱峰保留时间与其分子量对数值绘制标准曲线,计算DPZMP3分子量。
利用HPGPC法对红枣降解多糖纯化组分DPZMP3分子量和纯度进行检测。根据不同分子量的葡聚糖标品,拟合得到的lgMw-RT校正曲线方程为:y=-0.1924x+12.2其相关系数R2为0.9943,具有良好的线性关系,可用于DPZMP3分子量及纯度的测定。如图7所示,红枣降解多糖纯化组分DPZMP3,除流动相的峰(46.6min)外,仅有一个对称色谱峰(39.839min),表明DPZMP3组分均一、纯度高,可用于结构表征,根据标准曲线计算得DPZMP3分子量:lgMw4.5,Mw/Da 34275。
2.4单糖组成分析
红枣降解多糖组分(DPZMP3)单糖组成采用离子色谱法进行测定。其条件为:检测器:电化学检测器;色谱柱:Dionex CarbopacTM PA20(3×150mm);柱温:30℃;流动相:A:H2O;B:15mmol/L NaOH,C:100mmol/L NaOAC;流速:0.3mL/min;进样量:5μL。
样品处理,称取5mg DPZMP3置于安瓿瓶中,加入2mL TFA(3mol/L)充分溶解,密封后,置于烘箱120℃水解3h。随后将水解溶液转移至管中,在氮气下吹干,并向残留物中加入甲醇,继续吹干,充分去除TFA,然后加入5mL去离子水涡旋混匀,吸取50μL混合液加入950μL去离子水,离心,过0.22μm滤膜后,转移至进样瓶中,进行离子色谱分析。
标准品的测定,称取16种单糖标准品配成混标液。采用与样品相同的处理方法进行离子色谱分析。
单糖组成分析是多糖结构表征的基础,将DPZMP3经水解后通过离子色谱分析糖链中重复的单元。图8中A为16种单糖标准品的离子色谱图,图8中B为DPZMP3多糖组分单糖组成离子色谱图,对比各单糖标准品的保留时间,可以看出红枣降解多糖组分DPZMP3主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸组成,其摩尔比为1:1.4875:1.6:7.675,说明降解不改变多糖基本结构。降解后,鼠李糖、阿拉伯糖和木糖含量降低,半乳糖和半乳糖醛酸增加,说明超声辅助H2O2-Vc优先作用于鼠李糖、阿拉伯糖和木糖附近的糖苷键,而在其他单糖附近的糖苷键较稳定。根据单糖组成及比例,可以判断DPZMP3组分为果胶多糖,且主链主要由半乳糖醛酸组成。
2.5甲基化分析
红枣降解多糖组分(DPZMP3)甲基化方法如下。称取DPZMP3样品2-3mg置于反应瓶中,加入1mL DMSO和甲基化试剂A液(无水碱溶液)充分溶解后,抽真空除湿、除氧,加入N2保护气后密封,避光,再加入甲基化试剂B液(碘甲烷溶液),30℃避光磁力搅拌水浴反应60min。最后加入2mL超纯水终止反应。将以上混合液在透析袋中透析2-3d,直至透析袋内容物澄清为止,冻干回收,并测定甲基化是否完全。
将冻干回收的甲基化多糖,加入1mL的2mol/L TFA密封水解90min,减压蒸干,随后加入去离子水,减压蒸干,重复4-5次去除TFA。
水解后的单糖进行衍生化处理,从而确定糖苷键的位置。水解物加入2mL双蒸水,60mg硼氢化钠室温下反应8h,而后滴加冰醋酸中和,以及少量多次加入的甲醇蒸干去除硼酸盐。然后加入1mL乙酸酐,100℃反应1h,进行乙酰化,冷却至室温后加入甲苯除去多余的醋酐。最后采用CH2Cl2萃取乙酰化产物,并收集有机层,然后过0.45μm滤膜,定容至10mL,转置于进样瓶中进行上机测试。
GC-MS色谱条件为:检测器:RXI-5SIL MS;色谱柱:30m×0.25mm×0.25μm;载气流速:氦气,流速为1mL/min;进样口温度:250℃;检测器温度:250℃/min;程序升温条件:起始温度120℃,以3℃/min升温至250℃/min;保持5min。
将纯化多糖组分DPZMP3进行甲基化、酸水解以及衍生化处理,并通过GC-MS确定糖苷键类型及连接位点。
通过傅里叶红外光谱检测DPZMP3组分是否完全甲基化,将完全甲基化的DPZMP3组分经过一系列的处理,通过GC-MS分析,得到DPZMP3组分甲基化分析的总离子流图。DPZMP3中主要含有6个色谱峰,将6个甲基化糖基峰对应的质谱图与标准谱库检索进行比对(标准谱库:https://www.ccrc.uga.edu/),确定部分甲基化糖基的类型。
如表6所示,DPZMP3组分主要含有6种甲基化糖残基,分别是以阿拉伯糖为主的非还原性末端残基T-Araf和1,5-Araf糖苷键;以鼠李糖为主的1,2,4-Rhap糖苷键;以半乳糖为主的1,2,4-Rhap、1,4,6-Galp、1,4-Galp糖苷键;以半乳糖醛酸为主的1,4-GalpA糖苷键。在甲基化分析中,鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和半乳糖醛酸的摩尔比与单糖组成基本接近,也间接证明了DPZMP3组分甲基化基本完全。结合单糖组成分析,可以推断出DPZMP3的主链为半乳糖醛酸通过1,4-GalpA连接的果胶型多糖,通过1,2,4-Rhap实现与其他中性糖的连接。
表6DPZMP3甲基化分析结果
2.6核磁共振分析
称取50mg红枣降解多糖纯化组分DPZMP3,多次溶于重水中然后冻干,最后将冻干样品溶于500μL重水中,超声下使其完全溶解并置于核磁管中。采用核磁共振仪在303K下扫描样品1H NMR谱、13C NMR谱、HSQC谱,并对核磁核磁图谱进行分析。
图9中(A)是DPZMP3多糖组分的1H-NMR谱,(B)是DPZMP3多糖组分的13C-NMR谱,通过一维图谱可推断出多糖基本信息,如糖苷键类型、连接方式等。研究表明,端基氢的化学位移大于5.0ppm为α构型,小于5.0ppm为β构型。根据1H-NMR谱图可以看出端基氢相关区域内有3个比较明显的氢信号峰,化学位移分别为5.16ppm、4.54ppm、4.54ppm,通过分析DPZMP3端基氢的化学位移,可以确定DPZMP3中糖残基A为α构型、B和C为β构型。HSQC谱是用于分析糖残基中氢核与碳核之间的相互作用,通过HSQC谱和13C-NMR谱的分析结果,可以确定糖残基端基氢和端基碳的化学位移,分别为5.16/99.13ppm、4.54/103.15ppm和4.54/103.15ppm。根据13C-NMR谱、HSQC谱可以确定糖残基A中C2-C6的化学位移分别为67.83ppm、175.53ppm、68.03ppm、77.88ppm和70.61ppm,以及与之对应氢信号的化学位移是3.70ppm、4.04ppm、4.34ppm和4.70ppm。结合甲基化结果以及相关文献的数据,可推测糖残基A为半乳糖醛酸,且归属为1,4-GalpA。此外,6号位碳在175.53ppm出现吸收峰,也说明半乳糖醛酸存在。通过结合甲基化分析结果以及相关文献的糖残基化学位移,可以确定糖残基B和C糖残基分别归属为1,4-Galp和1,4,6-Galp,说明降解处理不会破坏多糖的基本结构。
表7DPZMP3单糖残基C、H化学位移归属
2.7紫外光谱扫描
配置0.5mg/mL的DPZMP3溶液,以去离子水为空白对照,在200~400nm范围内进行紫外光谱扫描。
如图10所示,DPZMP3组分在280nm和260nm处未发现吸收峰,这说明DPZMP3组分中未发现蛋白质与核酸的存在,这与化学检验的结果相一致。
2.8红外光谱扫描
称取3mg充分干燥的DPZMP3和300mg溴化钾(105℃烘箱干燥4-6h)混合、研磨、压片,分辨率设置为0.4cm-1,在400~4000cm-1范围内进行红外光谱扫描。
红枣降解多糖组分DPZMP3红外光谱如图11所示,在3413cm-1处宽而强的吸收峰是羟基伸缩振动(O-H);在2933cm-1处的吸收峰为碳氢伸缩振动(C-H);在1612cm-1处的吸收峰为醛基伸缩振动(C=O),1419cm-1处为C-H的变角振动吸收峰,说明DPZMP3中含有糖醛酸是酸性多糖。在1200-1000cm-1左右的吸收峰为C-O-C和C-OH-伸缩振动,证明了吡喃糖环的存在。在894cm-1处有强吸收峰,说明DPZMP3为β型吡喃糖,说明降解后没有改变多糖的主要官能团结构。
2.9扫描电镜分析
采用SEM对多糖组分DPZMP3进行微观结构表征,用导电胶粘取适量干燥的样品,在真空环境下进行镀金。测试电压为3.0kV,使用扫描电子显微镜进行观察并拍摄。
DPZMP3多糖组分在不同倍数下的扫描电镜图像如图12所示。从图中可以观察到DPZMP3多糖组分由许多大小不一的不规则片状和块状组成。在10000倍下,多糖表面呈多孔蜂窝状,表面呈海绵状纹路。表明降解改变多糖空间结构,使多糖表明形貌特征发生变化。这可能是在降解过程中超声波产生的空化和剪切作用以及形成的羟基自由基破坏多糖之间的糖苷键,使分子聚集程度降低,分子分布散乱,导致多糖空间结构发生改变。
实施例3
3.1DPPH自由基清除率的测定
DPPH自由基清除率的测定参照实施例1的方法。
如图13所示,红枣多糖对DPPH自由基清除活性呈浓度依赖性。在2.0mg/mL浓度下ZMP、DZMP、DPZMP3、Vc的清除率分别达到81.55%、89.64%、92.89%、96.93%,清除能力依次为ZMP<DZMP<DPZMP3<Vc。经SPSS分析计算得,多糖的IC50值分别为0.4432mg/mL、0.3153mg/mL、0.2174mg/mL。结果显示,DZMP和DPZMP3对DPPH自由基清除活性显著强于ZMP,且与阳性对照Vc的DPPH自由基清除活性接近。说明降解处理能提高多糖的DPPH自由基清除能力,且经分离纯化的多糖组分纯度更高,具有更强的DPPH自由基清除能力。
3.2羟自由基清除能力的测定
取1mL一定浓度样品溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5和2.0mg/mL)中加入1mL6mmol/L FeSO4溶液、1mL 6mmol/L水杨酸-乙醇溶液和1mL 6mmol/L H2O2溶液,摇匀后37℃避光反应30min,在517nm波长下测定溶液吸光度,以相同浓度Vc做阳性对照。羟自由基清除率按公式(2)计算:
式中:A1为样品组吸光度,A2为空白组吸光度(去离子水代替H2O2溶液),A0为对照组吸光度(去离子水代替样品)。
如图14所示,在0.2-2.0mg/mL浓度下,所有样品均对羟自由基有一定程度的清除作用,且随样品浓度升高而提升。在2.0mg/mL浓度下ZMP、DZMP、DPZMP3和Vc对羟自由基的清除率分别为29.83%、33.46%、41.82%、92.65%,清除能力依次为ZMP<DZMP<DPZMP3<Vc。结果表明,ZMP、DZMP、DPZMP3均表现出一定的羟自由基清除活性,且弱于阳性对照。这可能是因为降解导致多糖糖苷键断裂,分子量降低,分子间作用力下降,暴露出更多基团,使小分子多糖更容易与羟自由基结合。
3.3还原力
在15mL离心管中加入2mL一定浓度样品溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5和2.0mg/mL)、2mL 1%[K3Fe(CN)6]溶液、2mL 0.2mmol/L PBS缓冲溶液(pH 6.6)充分混匀,50℃避光反应20min后,通过加入2mL 10% TCA终止反应,然后3000rpm离心10min。取2mL上清液、2mL去离子水、0.4mL 0.1%FeCl3混匀,室温下反应10min,在700nm波长下测定溶液吸光度,以相同浓度Vc做阳性对照。还原力按公式(3)计算:
还原力=A1-A0#(4-2),公式(3)
式中:A1为样品组吸光度,A0为对照组吸光度(去离子水代替样品)。
如图15所示,在0.2-2.0mg/mL浓度下,随着样品溶液浓度的增加,所有样品的还原力增加。样品浓度为2.0mg/mL时,ZMP、DZMP、DPZMP3的还原力分别为0.280、0.428、0.507,同浓度下经过降解处理的多糖还原力是未处理的1.8倍,且所有多糖样品的还原力均弱于Vc。结合本研究结果,降解导致多糖糖苷键断裂,降低多糖分子量,产生更多游离的供氢原子来发挥抗氧化作用。3.4超氧自由基清除能力的测定
在比色管中加入0.4mL一定浓度样品溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5和2.0mg/mL)、2mL 50mmol/l Tris-HCl溶液(pH 8.2)充分混匀,25℃水浴20min,加入2ml 7mmol/L邻苯三酚,充分混匀,25℃避光水浴反应5min,最后加入0.4ml HCl(10mmol/L)终止反应。在420nm波长下测溶液吸光度,以相同浓度Vc做阳性对照。还原力按公式(4)计算:
式中:A1为样品组吸光度,A2为空白组吸光度(去离子水代替邻苯三酚溶液),A0为对照组吸光度(去离子水代替样品)。
如图16所示,ZMP、DZMP、DPZMP3和Vc对超氧阴离子自由基的清除作用呈剂量依赖性。对超氧自由基清除能力依次为ZMP<DZMP<DPZMP3<Vc,ZMP、DZMP和DPZMP3的IC50值分别为6.35mg/mL、2.09mg/mL、1.34mg/mL。在2.0mg/mL浓度下ZMP、DZMP、DPZMP3对超氧阴离子自由基的清除率分别为38.48%、49.57%和55.96%,均低于阳性对照组Vc的清除率。此外,降解还有可能导致多糖中活性基团(如硫酸根基团)的暴露,使多糖抗氧化能力增强。
3.5总抗氧化能力测定
总抗氧化能力测定采用FRAP微板法,测定方法见表,反应液充分混匀,37℃避光反应30min,在593nm下测溶液吸光度,以相同浓度Vc做阳性对照,以Fe2+浓度表示总抗氧化能力。
表8总抗氧化能力测定方法
注:FRAP工作液为FRAP检测缓冲液、TPTZ溶液、FeCl3溶液以10:1:1的比例配制。
如图17所示,在0.2-2.0mg/mL浓度范围下,ZMP、DZMP、DPZMP3和Vc的总抗氧化能力呈剂量依赖性。当样品浓度为2.0mg/mL时,ZMP、DZMP、DPZMP3的总抗氧化能力分别相当于0.363mmol/L FeSO4、0.561mmol/L FeSO4、0.725mmol/L FeSO4,远低于阳性对照Vc的总抗氧化能力。结果表明,降解后的多糖DZMP以及纯化多糖DPZMP3具有更多的还原基团和比表面积,使得总抗氧化能力增强。
体外抗氧化实验表明,ZMP、DZMP、DPZMP3的DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力、超氧阴离子自由基清除能力、还原力以及总抗氧化能力呈剂量依赖性,经过降解后红枣多糖的抗氧化能力显著提高,三者的抗氧化能力依次为ZMP<DZMP<DPZMP3。当浓度为2.0mg/mL时,DZMP和DPZMP3对DPPH自由基清除率和Vc接近,其清除率的IC50值分别为0.3153mg/mL和0.2174mg/mL;羟自由基清除能力为33.46%、41.82%;超氧阴离子自由基清除能力为49.57%、55.96%;还原能力为0.428、0.507;总抗氧化能力相当于0.561mmol/L FeSO4、0.725mmol/L FeSO4;这表明降解处理能提高多糖体外抗氧化能力,这可能是由于降解导致多糖糖苷键断裂,分子间作用力下降,使得多糖降解为小分子片段,分子量降低,溶解性增强,粘度下降,暴露出更多的活性基团,使活性基团和自由基之间的接触更容易,从而提高多糖抗氧化能力。经分离纯化的多糖组分纯度更高,具有更强的体外抗氧化能力。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述,但它仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部实施例,人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例,这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种红枣降解多糖的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:对从红枣中提取得到的红枣多糖,利用超声波辅助联合H2O2-Vc的方法进行降解,得红枣降解多糖。
2.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于,所述红枣多糖的提取方法包括水提醇沉法。
3.根据权利要求1所述制备方法,其特征在于,所述超声波辅助联合H2O2-Vc的方法包括:超声时间为40~80min、降解剂H2O2-Vc浓度为5~20mmol/L、降解温度40~60℃。
4.利用权利要求1~3任一项所述制备方法制备得到的红枣降解多糖。
5.从权利要求4所述红枣降解多糖中分离纯化得到的多糖组分。
6.根据权利要求5所述多糖组分,其特征在于,采用DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶柱和Sephacryl S-100层析柱对红枣降解多糖进行分离纯化。
7.根据权利要求5或6所述多糖组分,其特征在于,包括一个中性多糖DZMP1和三个酸性多糖组分DZMP2、DZMP3、DZMP4。
8.酸性多糖组分DZMP3,其特征在于,所述酸性多糖组分DZMP3主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸组成。
9.根据权利要求8所述酸性多糖组分DZMP3,其特征在于,所述鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸的摩尔比为1:1.4875:1.6:7.675。
10.权利要求4所述红枣降解多糖、权利要求5~7任一项所述红糖组分或权利要求8或9所述酸性多糖组分DZMP3在制备高抗氧化活性的制剂中的应用。
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