CN117138028A - 一种含有表皮干细胞因子的组合物及其在糖尿病足修复中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有表皮干细胞因子的组合物及其在糖尿病足修复中的应用，具体涉及医药技术领域。一种含有表皮干细胞因子的组合物在制备糖尿病足修复产品中的应用。所述组合物包括表皮干细胞上清液提取物、细胞生长因子、卡波姆、透明质酸、烟酰胺、羟苯甲酯、维生素E、胶原蛋白、寡肽‑1和寡肽‑5。所述组合物具有能够促进糖尿病足破损组织再生、风险低、功能性高等优势。

Description

一种含有表皮干细胞因子的组合物及其在糖尿病足修复中的 应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种含有表皮干细胞因子的组合物及其在糖尿病足修复中的应用。
背景技术
糖尿病足是糖尿病患者血糖控制不佳时，因周围神经病变与外周血管疾病合并过高的机械压力，可引起足部软组织以及骨关节系统的破坏与畸形的形成，进而引发下肢远端神经异常和不同程度的周围血管病变相关的足部溃疡、感染和深层组织破坏，是我国临床常见的一种慢性病。
在现有各大医院，对糖尿病足的治疗手段主要分为三种，一是通过药液浸泡，对糖尿病足感染组织进行消炎杀毒；二是利用内服药液控制糖尿病足感染病变；三是手术治疗，例如溃疡清创、骨突切除、足与踝关节畸形矫正等。
但是针对糖尿病足的细胞修复技术仍处于探索和研究阶段，并没有得到广泛应用。
细胞修复技术作为一种新兴的治疗方法，在未来可能为治疗糖尿病足提供更好的选择。细胞修复技术主要利用干细胞、基因治疗和生物材料等手段，通过修复受损组织和促进新血管生长，从而达到修复和再生作用。
目前，一些研究表明，干细胞具有很大的潜力用于治疗糖尿病足。干细胞可以分化为多种不同类型的细胞，这些细胞可以促进组织修复和再生。
但是现有的干细胞治疗存在以下缺陷：
1.技术难度和成本：细胞治疗的技术难度较高，包括细胞培养、制备和植入等方面的问题。此外，细胞治疗还需要大量的资源和设备投入，导致治疗的成本较高，对患者来说可能难以承担。
2. 缺乏长期有效性的证据：尽管细胞因子在实验室和初步的临床研究中表现出一定的糖尿病足修复作用，但对于其长期有效性，尚缺乏足够的证据支持。目前还需要深入的长期随访研究来评估其治疗效果的持久性。
3. 细胞因子虽然能够促使糖尿病足的修复，但其疗效在不同个体之间可能存在差异。对于一些严重的糖尿病足，仅使用该技术可能无法完全恢复正常皮肤功能。
4.缺乏统一标准和规范：在细胞因子修复糖尿病足的使用中，缺乏统一的标准和规范，使得该技术的临床应用存在较大的差异性。这给临床医生和患者带来了一定的困扰。
发明内容
为此，本发明提供一种含有表皮干细胞因子的组合物及其在糖尿病足修复中的应用，以解决上述的技术缺陷。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
根据本发明第一方面提供的一种含有表皮干细胞因子的组合物在制备糖尿病足修复产品中的应用。
根据本发明第二方面提供的一种含有表皮干细胞因子的糖尿病足修复组合物，其特征在于，所述组合物包括表皮干细胞上清液提取物、细胞生长因子、卡波姆、透明质酸、烟酰胺、羟苯甲酯、维生素E、胶原蛋白、寡肽-1 和寡肽-5。
进一步的，所述组合物包括表皮干细胞上清液提取物10-100ml、成纤维干细胞生长因子2-10ng/ml、肝细胞生长因子5-15ng/ml、卡波姆0.3mg/ml-0.8g/ml、透明质酸0.1-0.3mg/ml、烟酰胺0.2-0.4mg/ml、羟苯甲酯 0.2-0.5mg/ml、维生素E 0.3-0.6mg/ml、胶原蛋白0.2-0.6mg/ml、寡肽-1 0.1-0.3mg/ml和寡肽-5 0.1-0.3mg/ml。
各组分的作用如下：
表皮干细胞上清液提取物：能刺激细胞外一些大分子（如透明质酸和糖蛋白等）的合成和分泌，滋润皮肤，因此它既可作为化妆品的添加剂及用于面部整形手术，促进人皮肤的新陈代谢、减少皮肤畸形；也可在医药上治疗皮肤外伤、术后创口、褥疮、口腔溃疡和坏疽、以及放射治疗引起的皮炎等。它可以加速伤口和溃疡面的愈合。
成纤维干细胞生长因子：能够促进新血管形成，修复损害的内皮细胞。
HGF(肝细胞生长因子)：HGF(肝细胞生长因子)在促进肝细胞再生的同时参与正常组织的损伤后修复，他具有促进表皮干细胞增生和新生血管形成的作用，一般认为在血管生成过程中，表皮干细胞需要表现出一系列特殊、复杂的行为，包括增殖、迁移、细胞间互相黏着、排成直线以及形成开放的腔样结构，HGF刺激新生血管生成，其作用因子活性较之前更为强大；可促进组织细胞的发生、生存和再生，抑制细胞凋亡。同时HGF能够抑制高糖环境下表皮干细胞的程序性死亡（凋亡），促进表皮干细胞再修复；并有效调节胶原纤维的合成和炎性反应，在促进创伤愈合与防止组织纤维化中起重要的作用。
卡波姆：有增稠、悬浮等重要用途，工艺简单，稳定性好，广泛应用于乳液、膏霜、凝胶中。
透明质酸：是肌肤中的一种重要成分，具有表皮组织修复的功能。
烟酰胺：可促进生物氧化过程和组织新陈代谢，对维持正常组织(特别是皮肤)的完整性。
羟苯甲酯：广谱抗菌活性，能抑制革兰氏阴性、阳性细菌，对酵母菌及霉菌有较强的抑制作用，与传统的防腐产品(例如：苯甲酸钠)相比，具有使用浓度低，广谱高效，并且安全经济，使用效期长。广泛用于化妆品、医药、食品及其它工业产品的防腐。
维生素E：维生素E的作用主要有保护皮肤的功能，能够修复受损细胞膜、恢复细胞正常功能，并促进血液循环，有助淡化瘀痕。
胶原蛋白：能维持皮肤和组织器官的形态和结构，也是修复各损伤组织的重要原料物质。
寡肽-1：能促进细胞生长和提高细胞活性，修复受损肌肤。修复胶原纤维和弹性纤维。
寡肽-3：可诱导干细胞分化，促进组织修复，修复基底层成纤维细胞。
寡肽-5：特异性刺激上皮细胞的新陈代谢，修复角质层，增加鱼质层厚度增强胶原蛋白和弹性蛋白的活力。
进一步的，所述表皮干细胞上清液提取物包括使用表皮干细胞加入含有诱导药物的诱导培养基中进行诱导定向培养，在进行中等程度损伤处理，最后收集营养所分泌的营养因子并进行纯化，得表皮干细胞上清液提取物。
进一步的，所述表皮干细胞诱导药物包括维生素E、寡肽-3、成纤维干细胞生长因子、海藻糖、半胱氨酸、雷帕霉素。
进一步的，所述表皮干细胞诱导药物包括维生素E 0.01μL/ml、寡肽-3 0.3μL/ml、成纤维干细胞生长因子0.2μL/ml、海藻糖0.2μL/ml、半胱氨酸0.1μL/ml、雷帕霉素0.5μL/ml。
各组分的作用如下：
维生素E：维生素E是一种重要的抗氧化剂，有助于保护细胞和组织不受氧化损伤。
寡肽-3：可诱导干细胞分化，促进组织修复，修复基底层成纤维细胞。
成纤维干细胞生长因子：能够促进新血管形成，修复损害的内皮细胞。
海藻糖：可用于细胞再生。
半胱氨酸：半胱氨酸能参与体内多种氧化还原反应，对细胞具有一定保护作用。
雷帕霉素：诱导细胞自噬，抗衰。
根据本发明第三方面提供的一种含有表皮干细胞因子的糖尿病足修复组合物的制备方法，所述方法包括：
步骤一，将卡波姆溶解在表皮干细胞上清液提取物中，得到卡波姆溶液；
步骤二，依次向卡波姆溶液加入成纤维干细胞生长因子、肝细胞生长因子、透明质酸、烟酰胺、羟苯甲酯、维生素、胶原蛋白、寡肽-1和寡肽-5，搅拌均匀，得到混合溶液；
步骤三，将混合溶液放到23-28℃下40-60min，得到凝胶溶液。
本发明利用表皮干细胞因子修复糖尿病足是一种治疗糖尿病足病变的新方法。糖尿病足是由于糖尿病引起的血液供应不足和神经功能障碍导致的足部溃疡和感染。表皮干细胞因子是由表皮干细胞分泌的生物活性物质，具有促进细胞增殖、抗炎和修复损伤等作用。本发明通过将含有表皮干细胞因子的组合物应用于糖尿病足患者的创面，可以促进创面上皮细胞的增殖，加速伤口愈合过程。此外，表皮干细胞因子还具有抗炎作用，可以减轻创面的炎症反应，并提高创面抗菌能力，降低感染风险。
本发明具有如下优点：
1. 促进糖尿病足破损组织再生：表皮干细胞因子能够激活体内存在的干细胞，并促使其分化为具有修复功能的细胞，从而促进受损组织的再生和修复。这种技术可以更有效地促进新组织的生长和伤口的愈合。
2. 低风险性：表皮干细胞因子修复糖尿病足技术是一种相对安全的治疗方法。
3. 多功能性：除了促进糖尿病足修复外，表皮干细胞因子还具有其他多功能性。它可以促进血管生成、抗炎作用和免疫调节等，对于细胞再生和组织修复过程中的其他问题也能有所帮助。
4.利用表皮干细胞分泌多种因子提取混合液对糖尿病足进行修复。如：HGF(肝细胞生长因子)、BFGF(神经营养因子)、VEGF（血管内皮生长因子）、EGF（表皮生长因子）、FGF（表皮生长因子）、KGF（成纤维细胞生长因子）。
5.使用的细胞代次高，一般第6-7代的细胞，每单位原代细胞可用的量更多，成本降低，因此能够更高效的用于糖尿病足修复的临床治疗研究。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例1提供的表皮干细胞诱导前后对比图；其中，A-诱导前；B-诱导后；
图2为本发明实施例1提供的CD31、角质19、胶原蛋白表达的Western blot检测图；
图3为本发明实施例1一种表皮干细胞多种因子诱导前后含量图；
图4为本发明实验例2提供的病例1糖尿病足修复图的志愿者使用组合物前后对比图；其中，A-使用前；B使用后；
图5为本发明实验例2提供的病例2糖尿病足修复图的志愿者使用组合物前后对比图；其中，A-使用前；B使用10天后；C-使用20天后。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供一种表皮干细胞上清液提取物：
使用第七代表皮干细胞，铺于六孔板上使用α-MEM培养基进行培养，生长密度达到80%，细胞生长状态良好，细胞活率>95%，形态符合表皮干细胞形态，细胞表面分子流式结果符合表皮干细胞相关分子指标：ci2B1、Q3B1、Q5B1、a6B4及ay35等，显微镜下观察细胞形态符合表皮干细胞形态。上清吸出，吸干净残液后用PBS缓冲液反复洗涤3次，洗好后将PBS缓冲液残余液吸干，吸干后贴着孔板壁缓慢加入诱导培养基2ml/孔（诱导药物：维生素E 0.01μL/ml，寡肽-3 0.3μL/ml，成纤维干细胞生长因子0.2μL/ml ，海藻糖0.2μL/ml ，半胱氨酸0.01μL/ml，雷帕霉素 0.5μL/ml），操作完成后将孔板放入培养箱（5% CO2、37℃），诱导表皮干细胞72小时进行定向分化，表皮干细胞诱导前后对比图如图1所示；然后对诱导定向分化后的细胞采用缺氧（8%氧气+95%空气、37℃）方法处理，造成细胞的中等程度损伤。收集损伤的营养所分泌的营养因子并进行纯化（表皮干细胞上清液提取物）。配合一下成分混合应用。
CD31、角质19、胶原蛋白表达的Western blot检测如图2所示。
收取表皮干细胞上清并进行细胞计数，后续进行HGF(肝细胞生长因子)、BFGF(神经营养因子)、 VEGF（血管内皮生长因子）、EGF（表皮生长因子）、 FGF（表皮生长因子）、 KGF（成纤维细胞生长因子） 等因子的Elisa检测，并对结果进行作图处理。表皮干细胞多种因子诱导前后含量图如图3所示。
实施例2
本实施例提供一种含有表皮干细胞因子的糖尿病足修复的组合物：
表皮干细胞上清液提取物10ml、成纤维干细胞生长因子2ng/ml、肝细胞生长因子5ng/ml、卡波姆0.3mg/ml、透明质酸0.1mg/ml、烟酰胺0.2mg/ml、羟苯甲酯0.2mg/ml、维生素E 0.3mg/ml、胶原蛋白0.2mg/ml、寡肽-1 0.1mg/ml和寡肽-5 0.1mg/ml。
实施例3
本实施例提供一种含有表皮干细胞因子的糖尿病足修复的组合物：
表皮干细胞上清液提取物50ml、成纤维干细胞生长因子5ng/ml、肝细胞生长因子10ng/ml、卡波姆0.1g/ml、透明质酸0.2mg/ml、烟酰胺0.3mg/ml、羟苯甲酯 0.3mg/ml、维生素E 0.4mg/ml、胶原蛋白0.4mg/ml、寡肽-1 0.2mg/ml和寡肽-5 0.2mg/ml。
实施例4
本实施例提供一种含有表皮干细胞因子的糖尿病足修复的组合物：
表皮干细胞上清液提取物100ml、成纤维干细胞生长因子10ng/ml、肝细胞生长因子15ng/ml、卡波姆0.8g/ml、透明质酸0.3mg/ml、烟酰胺0.4mg/ml、羟苯甲酯0.5mg/ml、维生素E 0.6mg/ml、胶原蛋白0.6mg/ml、寡肽-1 0.3mg/ml和寡肽-50.3mg/ml。
实施例5
本实施例提供一种实施例2-4含有表皮干细胞因子的组合物的制备方法：
1）将卡波姆溶解在表皮干细胞上清液提取物中，得到卡波姆溶液；
2）依次向卡波姆溶液加入成纤维干细胞生长因子、肝细胞生长因子、透明质酸、烟酰胺、羟苯甲酯、维生素E、胶原蛋白、寡肽-1和寡肽-5，搅拌均匀，得到混合溶液；
3）将混合溶液放到23-28℃下40-60min，得到凝胶溶液。
实验例1
（1）选取符合糖尿病足(DF)的临床病例。DF的诊断标准参照1999年上海科委鉴定筋疽的诊断标准。
采用Wagner分级的方法，0级：有发生足溃疡的危险因素，目前无溃疡；1级：表面溃疡，临床上无感染；2级：较深的溃疡，常合并软组织炎，无脓肿或骨的感染；3级：深度感染，伴有骨组织病变或脓肿；4级：局限性坏疽(趾、足跟或前足背)；5级：全足坏疽。
选取分级处于2～4级的患者18例，典型特征为：伤口坏死组织和分泌物较多，伴有恶臭，患肢肿胀，局部红肿，可有疼痛及皮温升高。其中，男性9例，女性9例；年龄45岁-60岁。合理清创后所有患者均采用口服降糖药或胰岛素降糖，或者胰岛素泵控制血糖在理想水平；取溃疡面分泌物做细菌培养及药敏试验，选用有效的抗生素控制感染；同时给予改善循环及扩张血管治疗，进行合理的足部护理，防止进一步外部的损伤。
在上述综合治疗的基础上，将患者随机分为两组，每组3人；
一组患者创面采用无菌纱布填充，凡士林纱布覆盖，加压弹力绷带包扎，作为对照组；另一组患者创面采用涂抹实施例3的组合物，一日2次；
观察比较对照组和试验组连续两周的治疗效果。
药物组合物的治疗结果：
a、两组患者溃疡面积的比较
分别在给药前、治疗一周后以及治疗两周后测定患者的溃疡面积。
根据假设检验法如表1：
表1-P值的统计意义表
结果表明，在治疗一周后，与治疗前相比对照组和试验组患者的溃疡面积均明显减少，具有统计学差异(P<0.05)；
在治疗两周后，与治疗前相比对照组和试验组患者的溃疡面积继续缩小(P<0.01)，且试验组治疗效果优于对照组(P<0.05)。结果见表2和图1。
其中，一周后的对照组与治疗前的对照组比较，统计学差异P<0.05；
一周后的试验组与治疗前的试验组比较，统计学差异P<0.05；
一周后的试验组与一周后的试验组比较，统计学差异P>0.05；
两周后的对照组与治疗前的对照组比较,统计学差异P<0.01；
两周后的试验组与治疗前的试验组比较,统计学差异P<0.01；
两周后的对照组与两周后的试验组比较，统计学差异P<0.05。
表2两组患者溃疡面积的比较（）
注：同一组与治疗前比较，#P<0.05，##P<0.01；同一时间与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
由此可见，试验组可以显著缩小糖尿病足患者的溃疡面积。
实验例2
案例1，李某某，3级，深度感染，伴有骨组织病变或脓肿，合理清创后所有患者均采用口服降糖药或胰岛素降糖，或者胰岛素泵控制血糖在理想水平；取溃疡面分泌物做细菌培养及药敏试验，选用有效的抗生素控制感染；同时给予改善循环及扩张血管治疗，进行合理的足部护理，防止进一步外部的损伤。使用实施例1的组合物，一日2次，使用10天后，坏疽有所改善，具体如图4所示；
案例2，张某某，4级，局限性趾坏疽，合理清创后所有患者均采用口服降糖药或胰岛素降糖，或者胰岛素泵控制血糖在理想水平；取溃疡面分泌物做细菌培养及药敏试验，选用有效的抗生素控制感染；同时给予改善循环及扩张血管治疗，进行合理的足部护理，防止进一步外部的损伤。使用实施例1的组合物，一日2次，使用10天后，坏疽有所改善，使用20天后，结痂，基本好全，详细见图5所示。
本发明能够促进糖尿病足的修复，且风险低。具有多功能性强，具有抗炎和免疫调节作用。可以利用多因子分泌提取混合液对糖尿病足进行修复。使用的细胞使用代次高，降低成本。可以为糖尿病足的修复事业研究提供了更好的帮助。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种含有表皮干细胞因子的组合物在制备糖尿病足修复产品中的应用。
2.一种含有表皮干细胞因子的糖尿病足修复组合物，其特征在于，所述组合物包括表皮干细胞上清液提取物、细胞生长因子、卡波姆、透明质酸、烟酰胺、羟苯甲酯、维生素E、胶原蛋白、寡肽-1 和寡肽-5。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括表皮干细胞上清液提取物10-100ml、成纤维干细胞生长因子2-10ng/ml、肝细胞生长因子5-15ng/ml、卡波姆0.3mg/ml-0.8g/ml、透明质酸0.1-0.3mg/ml、烟酰胺0.2-0.4mg/ml、羟苯甲酯 0.2-0.5mg/ml、维生素E 0.3-0.6mg/ml、胶原蛋白0.2-0.6mg/ml、寡肽-1 0.1-0.3mg/ml和寡肽-5 0.1-0.3mg/ml。
4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述表皮干细胞上清液提取物包括使用表皮干细胞加入含有诱导药物的诱导培养基中进行诱导定向培养，在进行中等程度损伤处理，最后收集营养所分泌的营养因子并进行纯化，得表皮干细胞上清液提取物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述表皮干细胞诱导药物包括维生素E、寡肽-3、成纤维干细胞生长因子、海藻糖、半胱氨酸、雷帕霉素。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述表皮干细胞诱导药物包括维生素E0.01μL/ml、寡肽-3 0.3μL/ml、成纤维干细胞生长因子0.2μL/ml、海藻糖0.2μL/ml、半胱氨酸0.1μL/ml、雷帕霉素0.5μL/ml。
7.一种含有表皮干细胞因子的糖尿病足修复组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤一，将卡波姆溶解在表皮干细胞上清液提取物中，得到卡波姆溶液；
步骤二，依次向卡波姆溶液加入成纤维干细胞生长因子、肝细胞生长因子、透明质酸、烟酰胺、羟苯甲酯、维生素、胶原蛋白、寡肽-1和寡肽-5，搅拌均匀，得到混合溶液；
步骤三，将混合溶液放到23-28℃下40-60min，得到凝胶溶液。
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