CN117126250A - 一种抗菌肽、含有其的卡波姆凝胶及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗菌肽、含有其的卡波姆凝胶及应用。所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

Description

一种抗菌肽、含有其的卡波姆凝胶及应用
技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别涉及一种抗菌肽，其可以用于治疗细菌性阴道病。
背景技术
女性阴道是开放性的腔道，分布着大量菌群，正常菌群对阴道有着占位性保护作用。如果女性阴道菌群平衡被打破，例如厌氧菌过度繁殖等就容易引发细菌性阴道病。细菌性阴道病是最为常见的一种阴道感染性疾病，占阴道感染近一半，患者可有阴道瘙痒、阴道分泌物异常等症状。细菌性阴道病患者需要及时接受治疗，否则会增加自然流产、产后子宫内膜炎等疾病的患病风险。现阶段，使用甲硝唑等抗菌药物是治疗细菌性阴道病的首选，但长时间使用容易形成耐药菌株。抗菌肽是一类广泛存在于动物、植物、昆虫及人体内，由基因编码并具有特定空间结构的小分子多肽，分子量在2000至7000Da左右，由20至60个氨基酸残基组成，具有良好的抗菌活性，是一类有望可以替代传统抗生素的生物大分子，其来源广泛，抗菌性能优异且不容易引起细菌耐药性，但天然抗菌肽具有一定的局限性，包括抗菌活性低、不稳定及溶血性较高等缺陷。
发明内容
本发明之一提供了一种抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明之二提供了一种含有本发明之一所述的抗菌肽的组合物。
在一个具体实施方式中，所述组合物还包括凝胶剂、保湿剂、pH调节剂和水。
在一个具体实施方式中，抗菌肽0.5至2.0质量份，凝胶剂1至2质量份，保湿剂10至20质量份，无菌水500至700质量份。
在一个具体实施方式中，所述凝胶剂选自卡波姆。
在一个具体实施方式中，所述凝胶剂选自卡波姆940、卡波姆934和卡波姆941中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述保湿剂选自甘油、丙二醇、乙醇、山梨醇和聚乙二醇中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述pH调节剂选自三乙醇胺和/或氢氧化钠。
在一个具体实施方式中，所述组合物的pH值为4.5至6.5。
在一个具体实施方式中，所述组合物中还包括防腐剂，所述防腐剂例如为羟苯甲酯。
在一个具体实施方式中，防腐剂的用量为1至2质量份。
本发明之三根据本发明之一所述的抗菌肽本发明之二中任意一项所述的组合物在用于制备抗葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、细球菌属、莫拉氏菌属、棒状杆菌属、克雷白氏菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、变形菌属、假单胞菌属、摩氏摩根菌、嗜血杆菌属、黄单细胞菌属、不动杆菌属和丙酸杆菌属中的至少一种的药物中的应用。
在一个具体实施方式中，所述应用为在用于制备抗金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌中的至少一种的药物中的应用。
在一个具体实施方式中，所述应用为在用于制备治细菌性阴道病中的至少一种的药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明制备出的抗菌肽卡波姆凝胶具有很好的抗菌活性，溶血率低，凝胶易涂展，舒适感好，不妨碍皮肤的正常生理作用，具有一定的保水作用，也能促进药物的透皮吸收，起到更好的给药效果，可以用于临床上细菌性阴道病的使用。
具体实施方式
以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。
如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。
本发明的抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，由吉尔化学合成，其所合成的抗菌肽的含量为97.7％。
普通营养琼脂培养基和营养肉汤培养基均购买于北京索莱宝科技有限公司。
PBS为pH7.2的磷酸盐缓冲液购买于北京索莱宝科技有限公司。
枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、大肠埃希氏菌CMCC(B)44102和铜绿假单胞菌CMCC(B)10104均购买于北京三药科技开发公司。
实施例1
抑菌活性检测
在96孔板的每个孔中加入100μL营养肉汤培养基，然后在第一列的第一行中加入浓度为2048μg/mL的抗菌肽水溶液(即仅为抗菌肽和水的混合溶液)100μL，将该孔中的营养肉汤培养基和抗菌肽水溶液混合均匀，从第一列第一行吸取100μL加入第一列第二行，混合均匀后，再第一列第二行取100μL加入下一行，以此重复，直至第一列第八行吸取100μL弃去；然后将金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003稀释至104至105CFU/mL，按每孔100μL菌液接种于96孔板，此时抗菌肽在第一列的第一行的终浓度为1024μg/mL，在第一列的第八行终浓度为4μg/mL。将第二列、第三列依照第一列的方式配制作为第一列的重复列，第四、五、六列使用纯化水依照第一列方式配制为阴性对照；第七、八、九列依照第一列配制成终浓度为1μg/ml的氨苄西林作为阳性对照。将96孔板置于37℃条件培养过夜，使用酶标仪测量OD620的值。以抗菌肽浓度为横坐标，以OD620值为纵坐标做曲线，曲线拐点右侧第一个测量数据的点所对应的浓度即为最小抑菌浓度(MIC)。
对于枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、大肠埃希氏菌CMCC(B)44102和铜绿假单胞菌CMCC(B)10104的最小抑菌浓度(MIC)测定同对金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003的活性测定。
抗菌肽对四种细菌的最小抑菌浓度(MIC)的结果见表1。
表1抗菌肽抑菌结果
细菌名称 最小抑菌浓度(μg/mL)
枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 5
金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 5
大肠埃希氏菌CMCC(B)44102 7
铜绿假单胞菌CMCC(B)10104 6
根据表1可知，抗菌肽在4μg/mL以上对于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有较好的抑菌作用。
实施例2
体外溶血率检测
抗菌肽对动物红细胞溶血率检测使用的血样为脱纤维绵羊血。
抗菌肽的溶血活率检测方法为：将红细胞用PBS缓冲液(pH7.2，购买于北京索莱宝科技有限公司)洗涤后离心(1500r、15min)弃去上清液，将体积比为92:8的0.9wt％的氯化钠水溶液和弃去上清后的红细胞液混合，配制成8％的红细胞悬液，取100μL的8％红细胞悬液于96孔板各个孔中，然后向第一至三列中加入抗菌肽水溶液(由抗菌肽和纯化水配制溶液)，从而使第一列1-8行检测孔中的抗菌肽的终浓度分别为：2048μg/mL；1024μg/mL；512μg/mL；256μg/mL；128μg/mL；64μg/mL；32μg/mL；16μg/mL，第二列，第三列为第一列的重复列；阴性对照用PBS缓冲液，阳性对照为0.1％(v/v)Triton X-100溶液。37℃下培养1h，1500rpm离心5分钟，将100μl上清液转移到新的96孔板中，使用酶标仪测量OD414值。根据OD414值计算出抗菌肽溶血率，结果见表2。
抗菌肽溶血率计算方法：(检测孔OD414－阴性对照孔OD414)/(阳性对照孔OD414－阴性对照孔OD414)×100％。
表2抗菌肽溶血活血检测结果
抗菌肽浓度μg/mL 抗菌肽溶血率(％)
16 0
32 0.6
64 1.7
128 4.2
256 6.8
512 7.9
1024 14.5
2048 17.4
抗菌肽的溶血率值越小，则代表抗菌肽的溶血毒性越小。从表2可以看出抗菌肽的溶血率很低，特别是在2048μg/mL以下未有大幅度的溶血现象发生。
实施例3
选择卡波姆、甘油、并用三乙醇胺调节pH，设计3个水平3个因素(见表3)的正交试验，得到样品1至样品9共计9个配方的抗菌肽卡波姆凝胶，具体见表4。
表3 3水平3因素正交设计表
表4通过正交试验得到的抗菌肽卡波姆凝胶
样品 卡波姆g 甘油g pH
1 1.0 10 4.5
2 1.5 15 4.5
3 2.0 20 4.5
4 2.0 10 5.5
5 1.5 15 5.5
6 1.0 20 5.5
7 1.0 10 6.5
8 1.5 15 6.5
9 2.0 20 6.5
抗菌肽卡波姆凝胶的制备步骤如下：
步骤一：根据表4分别称取卡波姆和甘油。
步骤二：取500g无菌水，在高速搅拌下将GE级卡波姆940粉末撒入，继续搅拌直至粉末完全分散到无菌水中，在低速搅拌下加入三乙醇胺调节其pH至表4中的数值，得到凝胶基质。
步骤三：取1.0g抗菌肽加入100g无菌水中，混合均匀，加入甘油，搅拌混合均匀后逐渐加入到凝胶基质中，制成抗菌肽卡波姆凝胶。
步骤四：将抗菌肽卡波姆凝胶以3ml/支的量进行灌装分装至阴道给药器中，包装即得。
对所制得的9种样品进行产品外观、可见异物、粘稠性、pH、抗菌活性检测的在25±2℃下进行性能测试，具体测试方法如下：
(1)外观：在光照度3000至5000lx下目视观察抗菌肽卡波姆凝胶外观是否为无色至浅黄色凝胶，色泽均匀，测试结果见表5。
(2)可见异物：依照《中国药典》2020版第四部0904页可见异物检查法：将分装于阴道给药器中中的抗菌肽卡波姆凝胶在光照度1000至1500lx下目视检测。结果判定：抗菌肽卡波姆凝胶中不得检出金属屑、玻璃屑、长度超过2mm的纤维、最大粒径超过2mm的块状物等明显可见异物，测试结果见表5。
(3)黏稠度：使用数显黏度计，按中国药典2020版规定方法测定黏度，同一样品取三次测量平均值，测试结果见表5。
(4)pH值：采用pH计直接测量法，同一样品取三次测量平均值，测试结果见表5。
(5)抑菌率检测：依据中华人民共和国卫生行业标准WS/T 650-2019抑菌率检测方法进行，具体如下：
将金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003接种于普通营养琼脂培养基，培养24小时候后用PBS缓冲液洗下，并用PBS缓冲液稀释至约5.0×105CFU/mL至4.5×106CFU/mL菌悬液，得到试验用菌悬液。取5.0ml抗菌肽卡波姆凝胶加入到无菌试管中，并置于20℃±1℃水浴中5min后，再加入0.1mL试验用菌悬液，迅速混匀，得到测试样品，立即计时。待测试样品中的金黄色葡萄球菌与抗菌肽溶液相互作用10min，分别吸取1.0mL测试样品接种于2个平皿中，在后续培养的菌落因过于密集而无法进行菌落计数时，则以PBS缓冲液做10倍系列稀释，然后选取适宜稀释度进行同样的操作，即分别吸取1.0mL接种2个平皿中；然后向加有测试样品的平皿中倾注普通营养琼脂培养基，并混合均匀，然后于36℃±1℃培养48h时进行菌落计数，根据菌落计数得出测试样品中的菌含量。试验重复3次。同时用PBS缓冲液代替抗菌肽卡波姆凝胶，进行平行试验，作为阳性对照。经菌落计数，计算出阳性对照中的菌含量在1.0×104CFU/mL至9.0×104CFU/mL之间。取同批次不加入试验用菌悬液的PBS缓冲液和液体普通营养培养基分别作阴性对照。计算抑菌率计算抑菌率的公式如下：
式中：
X—抑菌率，％；
A0—阳性对照的菌含量，单位为CFU/mL；
A1—测试样品的菌含量，单位为CFU/mL；
以上检测项目获得的结果见表5。
表5抗菌肽卡波姆凝胶试验结果
根据表5可知，样品1至9均能够满足需要。其中样品5为最优，即用三乙醇胺调节pH至5.5，15g甘油，1.5g卡波姆，产品性能最佳。
实施例4
抗菌肽卡波姆凝胶的稳定性考察
取实施例3中制备获得的抗菌肽卡波姆凝胶样品1至9，于温度25±2℃、相对湿度60±10％、光照强度：200±10LX的试验箱中，放置6个月，分别在第0、1、2、3、6个月的月末取样进行稳定性重点项目考察，其中，具体考察指标为外观、可见异物、粘稠度、pH和抗菌活性，考察办法同实施例3。
结果见表6。
表6抗菌肽卡波姆凝胶稳定性考察结果
由表6可知6个月的稳定性考察试验可知，外观、可见异物、粘稠度、pH、抗菌活性考察项目的指标无明显变化，显示抗菌肽卡波姆凝胶剂稳定性较好。
实施例5
卡波姆凝胶的阴道黏膜刺激试验
1、检测依据：《消毒技术规范》(2002年版)2.3.5阴道黏膜刺激试验
2、样品制备：采用实例3中的中制备的样品5的卡波姆凝胶
3、试验方法：
3.1、实验动物的准备：选用健康、初成年的雌性白色新西兰兔，同一品系，体重2.0kg至2.5kg。试验前仔细检查动物阴道口，无分泌物、充血、水肿和其它损伤情况。分为刺激组和对照组，每组3只。
3.2、刺激方法：将动物固定，暴露出会阴和阴道口，将充满3mL受试卡波姆凝胶的阴道给药器用受试液湿润后轻柔的插入4cm至5cm阴道处，缓慢注入受试卡波姆凝胶，抽出阴道给药器，完成刺激。对照组动物用生理盐水作同样处理。刺激后24h气栓法处死动物取出完整阴道，纵向切开观察、固定，选取阴道的两端和中央3个部位的组织制片，HE染色后，进行组织病理学检查，按照《消毒技术规范》(2002年版)中的相关规定进行评分和分级，然后计算阴道刺激指数。
其中，阴道刺激指数计算公式如下：
刺激指数＝刺激组平均积分－对照组平均积分
结果见表7。
表7新西兰兔阴道黏膜刺激试验病理检查记录表
根据表7可知，卡波姆凝胶对新西兰兔的阴道黏膜刺激评分为0.34，对新西兰兔阴道刺激试验的反应强度为无刺激性。
实施例6
抗菌肽卡波姆凝胶配方和制法与实施例3中样品5的不同之处在于将卡波姆940替换为卡波姆941。
稳定性考察同实施例3，结果见表8。
实施例7
抗菌肽卡波姆凝胶配方和制法与实施例3中样品5的不同之处在于将卡波姆940替换为卡波姆934。
稳定性考察同实施例3，结果见表8。
实施例8
抗菌肽卡波姆凝胶配方和制法与实施例3中样品5的不同之处在于将甘油替换为丙二醇。
稳定性考察同实施例3，结果见表8。
实施例9
抗菌肽卡波姆凝胶配方和制法与实施例3中样品5的不同之处在于将甘油替换为乙醇。
稳定性考察同实施例3，结果见表8。
实施例10
抗菌肽卡波姆凝胶配方和制法与实施例3中样品5的不同之处在于将甘油替换为山梨醇。
稳定性考察同实施例3，结果见表8。
实施例11
抗菌肽卡波姆凝胶配方和制法与实施例3中样品5的不同之处在于将甘油替换为聚乙二醇。
稳定性考察同实施例3，结果见表8。
表8
根据表8结果可知，实施例6至11的产品在6个月内的抑菌率均表现良好。
综合实施例3中样品1-9和实施例6至11的结果可知，凝胶剂为卡波姆940、卡波姆934、卡波姆941是合适的，其中以卡波姆940最佳。保湿剂为甘油、丙二醇、乙醇、山梨醇、聚乙二醇是合适的，其中以甘油为最佳。

Claims (10)

1.一种抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种含有权利要求1所述的抗菌肽的组合物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括凝胶剂、保湿剂、pH调节剂和水。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，抗菌肽0.5至2.0质量份，凝胶剂1至2质量份，保湿剂10至20质量份，无菌水500至700质量份。
5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述凝胶剂选自卡波姆。
6.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述凝胶剂选自卡波姆940、卡波姆934和卡波姆941中的至少一种。
7.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述保湿剂选自甘油、丙二醇、乙醇、山梨醇和聚乙二醇中的至少一种。
8.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述pH调节剂选自三乙醇胺和/或氢氧化钠。
9.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物的pH值为4.5至6.5。
10.根据权利要求1所述的抗菌肽或权利要求2至9中任意一项所述的组合物在用于制备抗葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌属、细球菌属、莫拉氏菌属、棒状杆菌属、克雷白氏菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、变形菌属、假单胞菌属、摩氏摩根菌、嗜血杆菌属、黄单细胞菌属、不动杆菌属和丙酸杆菌属中的至少一种的药物中的应用；
优选地，所述应用为在用于制备抗金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏菌和铜绿假单胞菌中的至少一种的药物中的应用；
优选地，所述应用为在用于制备治细菌性阴道病中的至少一种的药物中的应用。
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