CN117122738A - 一种具备生物粘附功能的类人皮肤材料及制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于新材料技术领域，涉及医用耗材，具体涉及一种具备生物粘附功能的类人皮肤材料及制备方法与应用。将明胶、透明质酸和弹性蛋白加入至水中混合均匀获得预混液，将单宁酸溶液滴加至预混液中混合均匀获得混合溶液，将混合溶液去除气泡后置于1～8℃的条件下进行降温成型获得初凝胶，将初凝胶置于含有EDC和NHS的溶液中进行交联反应，即得所述类人皮肤材料。本发明提供的类人皮肤材料移植时不需要通过手术植入，具有易于操作、方便快捷、对人体无害、与伤口匹配程度高及稳固的生物粘附等优点。
Description
技术领域
本发明属于新材料技术领域，涉及医用耗材，具体涉及一种具备生物粘附功能的类人皮肤材料及制备方法与应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
目前治疗皮肤缺损的常用方法是自体或异体皮肤移植，但是由于自体供源不足或免疫反应等限制，治疗效果欠佳。近年来，生物学和医学界研究开发了多种人工皮肤替代移植治疗，但其效果和功能仍不完善。
市面上大多数人工皮肤都需要使用手术缝合线植入，自身不具备粘附性能。但在临床实践中，使用手术缝合线存在一些局限如对伤口的二次损伤、线结易松动裂开等。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种具备生物粘附功能的类人皮肤材料及制备方法与应用，本发明提供的类人皮肤材料集生物粘附功能和基本保护功能于一体，使其在满足覆盖并保护伤口的前提下能够实现稳固的生物粘附，即移植时不需要通过手术植入，即可覆盖和保护创伤部位，具有易于操作、方便快捷、对人体无害、与伤口匹配程度高及稳固的生物粘附等优点。此外，本发明提供的类人皮肤材料还具备一定的抗菌、促血管化及促修复功能，可以在伤口部位为缺损皮肤提供良好愈合环境。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一方面，一种具备生物粘附功能的类人皮肤材料的制备方法，将明胶、透明质酸和弹性蛋白加入至水中混合均匀获得预混液，将单宁酸溶液滴加至预混液中混合均匀获得混合溶液，将混合溶液去除气泡后置于1～8℃的条件下进行降温成型获得初凝胶，将初凝胶置于含有EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的溶液中进行交联反应，即得所述类人皮肤材料；
其中，明胶、透明质酸、弹性蛋白和单宁酸的添加质量比为8～20:0.4～0.6:1～3:1～7。
本发明以明胶、透明质酸和弹性蛋白作为基体材料，使得类人皮肤材料具有促修复、促血管化、屏障等功能。
本发明中添加单宁酸，其中五个臂的酚羟基，不仅可以与明胶、透明质酸形成酯键，而且与基体材料复合交联后，能够赋予类人皮肤材料与目标组织稳固生物粘附的功能；同时，单宁酸与基体材料复合交联后，能够与细菌细胞膜进行相互作用，破坏细菌细胞膜结构，导致细菌死亡，从而使得类人皮肤材料具有抗菌功能。
由于皮肤创面还有可能位于关节(例如指关节、膝关节等)处，为避免关节活动影响皮肤创面的治疗效果，不仅需要保证其具有促修复、促血管化、屏障、抗菌、生物粘附的功能，还需要保证其具有较高的机械强度，防止关节活动过大导致类人皮肤材料破裂。
本发明将单宁酸滴加至混合均匀的明胶-弹性蛋白-透明质酸溶液中，具有一定的温敏特性，利用其温敏特性改变其溶液状态，初稿形成凝胶，有利于进一步交联提高其机械强度。
交联的方式一般采用具有多官能团的交联剂(一般为戊二醛等)进行，但是这些交联剂能够与羧基、氨基、羟基进行反应，大大减少了单宁酸羟基含量，影响其生物粘附功能。本发明采用EDC/NHS进行交联，其机理为：羧基与EDC先生成活性中间体-酰基脲，活性中间体再与氨基发生亲核反应，形成酰胺键，EDC活化的酰基脲容易水解破坏，采用NHS以稳定反应，即利用基体材料本身的羧基和氨基进行交联。该交联方式，不仅能够避免单宁酸羟基参与交联，防止影响生物粘附功能，而且交联时产生的酰胺键具有更高的稳定性；同时，避免交联剂进行交联时的空间占位，增加材料的密实性；从而提高类人皮肤的热稳定性及机械性能。
另一方面，一种具备生物粘附功能的类人皮肤材料，由上述制备方法获得。
第三方面，一种上述具备生物粘附功能的类人皮肤材料在制备治疗或修复皮肤创伤的材料中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明采用单宁酸作为粘附和抗菌单元，可以使类人皮肤材料在具备优异生物粘附性能的同时具备一定抗菌效果。本发明制备的类人皮肤材料可以有效贴合至组织表面，在关节弯曲的情况下不影响粘附效果。此外其还具备稳定的水下粘附性能，可有效匹配伤口渗液的情况。本发明制备的类人皮肤材料具备广谱的抗菌性能，可以抑制多种细菌生长和繁殖为稳定的创面修复提供保障。本发明获得的类人皮肤材料弹性模量为14.4～216KPa，抗拉强度为3.5～27KPa，对生物组织的界面粘附强度为0.1～0.4N/mm。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中具备生物粘附功能的类人皮肤材料制备流程。
图2为本发明实施例2制备的类人皮肤材料对生物组织的表观粘附测试示意图，A为食指伸直时的侧面，B为食指伸直时的上面，C为食指弯曲时的侧面，D为食指弯曲时的上面。
图3为本发明实施例2具备生物粘附功能的类人皮肤材料的抑菌效果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
鉴于目前皮肤创伤进行人工皮肤的植入时需要使用手术线缝合，会对受损组织造成二次伤害，本发明提出了一种具备生物粘附功能的类人皮肤材料及制备方法与应用。
本发明的一种典型实施方式，提供了一种具备生物粘附功能的类人皮肤材料的制备方法，将明胶、透明质酸和弹性蛋白加入至水中混合均匀获得预混液，将单宁酸溶液滴加至预混液中混合均匀获得混合溶液，将混合溶液去除气泡后置于1～8℃的条件下进行降温成型获得初凝胶，将初凝胶置于含有EDC和NHS的溶液中进行交联反应，即得所述类人皮肤材料；
其中，明胶、透明质酸、弹性蛋白和单宁酸的添加质量比为8～20:0.4～0.6:1～3:1～7。
在一些实施例中，获得预混液的混合温度为50～70℃。
在一些实施例中，预混液中明胶的浓度为8～20wt％。
在一些实施例中，单宁酸溶液中单宁酸的浓度为1～7wt％。
在一些实施例中，单宁酸溶液中的溶剂为Tris-Hcl缓冲液。
在一些实施例中，获得混合混液的混合温度为50～70℃。
在一些实施例中，降温成型在模具中进行。
在一些实施例中，交联的时间为40～80min。
在一些实施例中，含有EDC和NHS的溶液中的EDC的浓度为10～40mg/ml。
在一些实施例中，EDC和NHS的质量比为9～11:1。
本发明的另一种实施方式，提供了一种具备生物粘附功能的类人皮肤材料，由上述制备方法获得。
本发明的第三种实施方式，提供了一种上述具备生物粘附功能的类人皮肤材料在制备治疗或修复皮肤创伤的材料中的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
将RO水、明胶、透明质酸、弹性蛋白按计算好的比例混合，在60℃、1000rpm条件下搅拌30分钟，得到预混液(明胶、透明质酸、弹性蛋白的浓度分别为8wt％、0.5wt％、2wt％)。将单宁酸溶于Tris-Hcl缓冲液中，并在30℃、800rpm条件下搅拌20分钟，得到单宁酸溶液(浓度为1wt％)。将393μl单宁酸溶液滴加到19.6ml预混液中，并在60℃、1000rpm下混合30分钟。将混合均匀的溶液置于60℃水浴锅中去除气泡。将去除气泡后的混合溶液取出冷却至室温，而后将其浇铸到硅胶模具中，并将其转移至4℃环境。材料成形后将其从硅胶模具剥离。将剥离后的材料置于100ml EDC/NHS的70％酒精溶液(EDC、NHS的浓度分别为10mg/ml、1mg/ml)中交联1小时。最后使用PBS水洗交联后的凝胶即得类人皮肤材料，制备过程如图1所示。
实施例2
将RO水、明胶、透明质酸、弹性蛋白按计算好的比例混合，在60℃、1000rpm条件下搅拌30分钟，得到预混液(明胶、透明质酸、弹性蛋白的浓度分别为15wt％、0.5wt％、2wt％)。将单宁酸溶于Tris-Hcl缓冲液中，并在30℃、800rpm条件下搅拌20分钟，得到单宁酸溶液(浓度为3wt％)。将1.5ml单宁酸溶液滴加到18.5ml预混液中，并在60℃、1000rpm下混合30分钟。将混合均匀的溶液置于60℃水浴锅中去除气泡。将去除气泡后的混合溶液取出冷却至室温，而后将其浇铸到硅胶模具中，并将其转移至4℃环境。材料成形后将其从硅胶模具剥离。将剥离后的材料置于100ml EDC/NHS的70％酒精溶液(EDC、NHS的浓度分别为20mg/ml、2mg/ml)中交联1小时。最后使用PBS水洗交联后的凝胶即得类人皮肤材料，制备过程如图1所示。
实施例3
将RO水、明胶、透明质酸、弹性蛋白按计算好的比例混合，在60℃、1000rpm条件下搅拌30分钟，得到预混液(明胶、透明质酸、弹性蛋白的浓度分别为18wt％、0.5wt％、2wt％)。将单宁酸溶于Tris-Hcl缓冲液中，并在30℃、800rpm条件下搅拌20分钟，得到单宁酸溶液(浓度为5wt％)。将2.7ml单宁酸溶液滴加到17.3ml预混液中，并在60℃、1000rpm下混合30分钟。将混合均匀的溶液置于60℃水浴锅中去除气泡。将去除气泡后的混合溶液取出冷却至室温，而后将其浇铸到硅胶模具中，并将其转移至4℃环境。材料成形后将其从硅胶模具剥离。将剥离后的材料置于100ml EDC/NHS的70％酒精溶液(EDC、NHS的浓度分别为30mg/ml、3mg/ml)中交联1小时。最后使用PBS水洗交联后的凝胶即得类人皮肤材料，制备过程如图1所示。
实施例4
将RO水、明胶、透明质酸、弹性蛋白按计算好的比例混合，在60℃、1000rpm条件下搅拌30分钟，得到预混液(明胶、透明质酸、弹性蛋白的浓度分别为20wt％、0.5wt％、2wt％)。将单宁酸溶于Tris-Hcl缓冲液中，并在30℃、800rpm条件下搅拌20分钟，得到单宁酸溶液(浓度为7wt％)。将2ml单宁酸溶液滴加到18ml预混液中，并在60℃、1000rpm下混合30分钟。将混合均匀的溶液置于60℃水浴锅中去除气泡。将去除气泡后的混合溶液取出冷却至室温，而后将其浇铸到硅胶模具中，并将其转移至4℃环境。材料成形后将其从硅胶模具剥离。将剥离后的材料置于100ml EDC/NHS的70％酒精溶液(EDC、NHS的浓度分别为40mg/ml、4mg/ml)中交联1小时。最后使用PBS水洗交联后的凝胶即得类人皮肤材料，制备过程如图1所示。
实施例1～4的基体材料、单宁酸及EDC/NHS的浓度如表1所示。
表1实施例1～4的基体材料、单宁酸及EDC/NHS的浓度
对实施例1～4制备的类人皮肤材料进行性能测试，测试方法为：
弹性模量：参考GB/T 528-2009中的4型制备哑铃状试样，而后在力学试验机上进行拉伸试验，通过Origin软件计算线性弹性阶段的应力-应变曲线斜率即为材料弹性模量。
抗拉强度：抗拉强度则通过上述拉伸试验获取最大拉力。抗拉强度通过最大拉力除以哑铃试样的原始横截面积计算获得。
界面粘附强度：将材料制成150mm×25mm×3mm大小的样条，并在其背侧贴上合适的胶带并裁剪。参考GB/T 2792-2014中给出的方法对不同实施例的样品进行90度剥离测试。上夹具夹持至少25mm，机器运转后忽略第一个25mm的剥离力，以后续50mm上的剥离力取平均值计算界面粘附强度。
抑菌性能测试：将凝胶样品制备成合适大小的圆柱形状(直径3mm，高度3mm)。将原代大肠杆菌培养至第三代后，取部分第三代菌进行稀释平板计数，最后依据计数结果将大肠杆菌稀释至5×106CFU/ml。取100ul大肠杆菌悬液均匀涂布在LB琼脂培养平板上，最后将水凝胶圆柱样片贴放在涂满大肠杆菌的平板上，各样品与平板周缘相距15mm以上，置于37℃环境下静置共培养24h，并观察抑菌环大小。如下图3为实施例2的抑菌效果图示。使用Image J软件进行处理测量。
测试结果如表2所示。
表2实施例1～4制备的类人皮肤材料的性能
采用上述实施例对皮肤创伤的修复过程为：对伤口创面进行初步清创处理之后，保证组织表面无异物、无血块或血污，随后将类人皮肤材料直接贴合于创伤组织表面以提供稳固的生物粘附及良好的创面修复环境。
将实施例2制备的类人皮肤材料，裁剪后贴附于食指，如图2所示，当食指由伸直状态变为弯曲状态时，类人皮肤材料能够保证与食指良好贴附，且没有破裂；表明制备的类人皮肤材料可以有效贴合组织表面。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具备生物粘附功能的类人皮肤材料的制备方法，其特征是，将明胶、透明质酸和弹性蛋白加入至水中混合均匀获得预混液，将单宁酸溶液滴加至预混液中混合均匀获得混合溶液，将混合溶液去除气泡后置于1～8℃的条件下进行降温成型获得初凝胶，将初凝胶置于含有EDC和NHS的溶液中进行交联反应，即得所述类人皮肤材料；
其中，明胶、透明质酸、弹性蛋白和单宁酸的添加质量比为8～20:0.4～0.6:1～3:1～7。
2.如权利要求1所述的具备生物粘附功能的类人皮肤材料的制备方法，其特征是，获得预混液的混合温度为50～70℃。
3.如权利要求1所述的具备生物粘附功能的类人皮肤材料的制备方法，其特征是，预混液中明胶的浓度为8～20wt％。
4.如权利要求1所述的具备生物粘附功能的类人皮肤材料的制备方法，其特征是，单宁酸溶液中单宁酸的浓度为1～7wt％；
或，单宁酸溶液中的溶剂为Tris-Hcl缓冲液。
5.如权利要求1所述的具备生物粘附功能的类人皮肤材料的制备方法，其特征是，获得混合混液的混合温度为50～70℃。
6.如权利要求1所述的具备生物粘附功能的类人皮肤材料的制备方法，其特征是，降温成型在模具中进行。
7.如权利要求1所述的具备生物粘附功能的类人皮肤材料的制备方法，其特征是，交联的时间为40～80min。
8.如权利要求1所述的具备生物粘附功能的类人皮肤材料的制备方法，其特征是，含有EDC和NHS的溶液中的EDC的浓度为10～40mg/ml；
或，EDC和NHS的质量比为9～11:1。
9.一种具备生物粘附功能的类人皮肤材料，其特征是，由权利要求1～8任一所述的制备方法获得。
10.一种权利要求9所述的具备生物粘附功能的类人皮肤材料在制备治疗或修复皮肤创伤的材料中的应用。
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