CN117098845A - 脂磷壁酸(lta)适配体及相关办法 - Google Patents

Abstract

描述了一些特异性结合脂磷壁酸(LTA)的适配体及相关方法。

Description

脂磷壁酸(LTA)适配体及相关办法

优先权要求

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2021年2月4日提交的美国临时专利申请No.63/145,632的权益，其公开以其整体通过引用并入本文。

技术领域

本申请总体上涉及生物化学，且特别涉及特异性结合脂磷壁酸(“LTA”)的适配体及相关方法。

背景技术

磷壁酸是磷酸甘油或磷酸核糖醇与碳水化合物通过磷酸二酯键连接的细菌共聚物。磷壁酸在多数革兰氏阳性细菌(包括葡萄球菌)的细胞壁中存在，而且似乎延伸到了肽聚糖层的表面。磷壁酸可与肽聚糖层的N-乙酰胞壁酸或位于N-乙酰胞壁酸单元之间的四肽交联中的末端D-丙氨酸共价连接，或者可通过脂质锚固着在细胞质膜上。固着在脂膜上的磷壁酸被称为“脂磷壁酸”(或LTAs)。

在Tadler等人的“Sandwich immunoassay for the detection of lipoteichoicacid”Journal of Clinical Laboratory Analysis.3(1)：21–25(1989)中介绍了一种用于检测脂磷壁酸的夹心免疫测定法。从变异链球菌(Streptococcus mutans)(BHT菌株)中制备单克隆抗体以纯化LTA，而且还确定了其与革兰氏阳性和阴性细菌的交叉反应以及与取代和未取代的LTA的反应。鉴定出8种只与革兰氏阳性菌反应的单克隆抗体。选择能够捕获H-LTA的抗体以展开夹心免疫测定法，根据描述，该方法的灵敏度在PBS中为0.2ng LTA/mL，在全血中的为0.5ng/mL，在处理过的全血中为2.0ng/mL。展开这种检测方法的目的是快速检测体液中的LTA。

适配体(aptamer)是形成三维结构的寡核苷酸的短链，能够以高亲和力和特异性结合靶物质。例如，适配体可用作生物传感器的元件，类似于抗体，其可在检测和分析系统中识别分子。

相较于基于蛋白质的抗体，基于寡核苷酸的适配体具有几个优点。第一，适配体可以在体外合成，第二，包括毒素在内的多种有机和无机物质可用作适配体的靶，以及第三，相较于蛋白质抗原，适配体在各种温度下更稳定。

一旦适配体被鉴别且获得，就可通过自动寡聚物合成，以相对低的成本和高的批次一致性复制它们。此外，适配体可相对简单地被修饰以引入有用的功能基团，例如荧光分子或光反应性基团。

2012年6月21日公布的PCT国际申请PCT/KR2011/009631(对应于WO 2012081908)，其内容以其整体通过引用并入本文，其中描述了一种针对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中“teiocoic”酸的RNA适配体，更具体地说，描述了一种能特异性结合金黄色葡萄球菌中“teiocoic”酸的RNA适配体，该适配体可用于检测金黄色葡萄球菌中的该酸，金黄色葡萄球菌为例如食物中毒的原因之一。

与其DNA对应物相比，RNA适配体的稳定性稍差。此外，RNA适配体对溶液化学成分(pH值，盐分等)变化的耐受性也低于DNA适配体，而且由于RNA适配体的三级结构会受到这些变化的影响，因此更容易失去结合亲和力。

发明内容

本文描述的是针对LTA的DNA适配体。

在某些实施方案中，这种适配体具有环(loop)结构。在某些实施方案中，这种适配体具有双链茎(stem)结构。在某些实施方案中，这种适配体还包含至少一种标记物质，例如光学标记，电化学标记，放射性同位素，或其组合。

具体描述的是SEQ ID NO：1-11的示例性DNA适配体。

(5’->3’)(SEQ ID NO：1)：CGA GGC TCT CGG GAC GAC CTG TCG TCA GGAAAA ACGAAAACC CTA AGG GTC GTC CCG CCT TTAGGA TTT ACA G；

(5’->3’)(SEQ ID NO：2)：CGA GGC TCT CGG GAC GAC CAG TCG GCC CGA AAA CAATAT AAA TCC GAG GTC GTC CCG CCT TTAGGA TTT ACAG；

(5’->3’)(SEQ ID NO：3)：CGA GGC TCT CGG GAC GAC GTA GTC GTC ACA CAA GCTGGT TAT CCAAAAGTC GTC CCG CCT TTAGGATTT ACA G；

(5’->3’)(SEQ ID NO：4)：CGA GGC TCT CGG GAC GAC GAA GTC GCC ACG TAA ACCGAC GAC CGT CAG GTC GTC CCG CCT TTAGGATTT ACAG；

(5’->3’)(SEQ ID NO：5)：CGA GGC TCT CGG GAC GAC GTG GCG GCC CGA AAA CAGATAAAT CAT AAAGTC GTC CCG CCT TTA GGA TTT ACA G；

(5’->3’)(SEQ ID NO：6)：CGA GGC TCT CGG GAC GAC AAA GGA GTC ACG AAA ACAATA AAG ACT AAA GTC GTC CCG CCT TTA GGA TTT ACA G；

(5’->3’)(SEQ ID NO：7)：CGA GGC TCT CGG GAC GAC GTC GTC GAC CCA AGA ACAATA AAG CTT AAA GTC GTC CCG CCT TTA GGA TTT ACA G；

(5’->3’)(SEQ ID NO：8)：CGA GGC TCT CGG GAC GAC GAG ACA CGC TAG TAT CGAAGC GGC CCA AAA GTC GTC CCG CCT TTA GGA TTT ACA G；

(5’->3’)(SEQ ID NO：9)：CGA GGC TCT CGG GAC GAC TTG TCG GAC CGA CTG GTGATA AAC CCT ATG GTC GTC CCG CCT TTA GGA TTT ACA G；以及

(5’->3’)(SEQ ID NO：10：CGA GGC TCT CGG GAC GAC AAT ACC CGA AGG GCA TTGCCG CCT CCA AAA GTC GTC CCG CCT TTA GGA TTT ACA G。

可以看出，这些适配体的“核心序列”分别为SEQ ID NO：11-20：

(SEQ ID NO：11)：CTG TCG TCA GGA AAA ACG AAA ACC CTA AGG；

(SEQ ID NO：12)：CAG TCG GCC CGA AAA CAA TAT AAA TCC GAG；

(SEQ ID NO：13)：GTA GTC GTC ACA CAA GCT GGT TAT CCA AAA；

(SEQ ID NO：14)：GAA GTC GCC ACG TAA ACC GAC GAC CGT CAG；

(SEQ ID NO：15)：GTG GCG GCC CGA AAA CAG ATA AAT CAT AAA；

(SEQ ID NO：16)：AAA GGA GTC ACG AAA ACA ATA AAG ACT AAA；

(SEQ ID NO：17)：GTC GTC GAC CCA AGA ACA ATA AAG CTT AAA；

(SEQ ID NO：18)：GAG ACA CGC TAG TAT CGA AGC GGC CCA AAA；

(SEQ ID NO：19)：TTG TCG GAC CGA CTG GTG ATAAAC CCT ATG；以及

(SEQ ID NO：20)：AAT ACC CGA AGG GCA TTG CCG CCT CCA AAA。

在某些实施方案中，DNA适配体的核心序列是(SEQ ID NO:21)：

RWV GBV GHC MSR ARA MMR ATA AAK MHT AAA–

其中A、C、G和T具有它们的通常的含义，其中R是A或G；其中W是A或T；其中V是A、C、或G；其中B是C、G、或T；其中H是A、C、或T；其中M是A或C；其中S是C或G；其中K是G或T。

SEQ ID NO：1-10的适配体也包括PCR引物退火区(或“引物序列”)(5’-CGA GGCTCT CGG GAC GAC(SEQ ID NO：22)-[核心序列]-GTC GTC CCG CCT TTA GGA TTT ACA G-3’(SEQ ID NO：23)，不过只要不干扰适配体与LTA的结合，可使用其他PCR引物退火区。

因此，所描述的DNA适配体包含下述(a)到(c)中任一项的多核苷酸，并且能够结合脂磷壁酸(“LTA”)：(a)包含SEQ ID NO：11-21中任一项所述核心序列的多核苷酸，(b)包含基于SEQ ID NO：11-21中任一项所述核心序列进行缺失、取代、插入和/或增加一至两个碱基的核心序列的多核苷酸，以及(c)包含与SEQ ID NO：11-21中任一项所述核心序列具有80％或以上的序列相同性的核心序列的多核苷酸。

在某些实施方案中，提供了用于检测LTA的方法，包括将本文所述的适配体与LTA结合以检测所述LTA。

因此，本文进一步描述了DNA适配体及其用于检测LTA的用途。

附图简述

图1显示了SEQ ID NO：1-5的DNA适配体的预测的二级结构(分别从左到右)。

图2显示了SEQ ID NO：6-10的DNA适配体的预测的二级结构(分别从左到右)。

本发明的实施方式

本文使用的术语“碱基配对”指的是一对互补合成碱基形成的碱基配对，例如腺嘌呤和胸腺嘧啶或鸟嘌呤和胞嘧啶。

本文使用的术语“DNA适配体”指的是由DNA分子组成的适配体序列。DNA适配体是配体分子，其通过基于单链核酸分子的二级和三级结构形成的构象结构，通过氢键结合或其他相互作用，与靶分子牢固且特异性地结合。

本文使用的术语“靶分子”指的是DNA适配体可以结合的物质。例如，靶分子是LTA。

在一方面，描述了一种用于检测LTA的制剂(agent)，该制剂包含本文所述的DNA适配体。在某些实施方案中，用于检测LTA的制剂利用所述DNA适配体与LTA的结合能力，在体外检测LTA的制剂。例如，DNA适配体预先用荧光试剂标记，并且将标记的DNA适配体与样品混合。

在一方面，描述了一种用于检测LTA的组合物，该组合物包含本文所述的DNA适配体。

原则上，该组合物可依照本领域已知的方法制备。例如，参见雷明顿制药科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)所述的方法(默克出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州(Merck Publishing Co.,Easton,Pa))。

例如，制备物可以通过本领域通常使用的方法制备，包含溶解本文至少一种DNA适配体于例如药学上可接受的溶剂中，并且如果需要，向其中加入例如药学上可接受的载体。

“药学上可接受的溶剂”的实例包括水、乙醇、丙二醇、乙氧基化异硬脂醇、聚氧化异硬脂醇、和聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。

在一方面，本公开涉及一种用于检测样品中的LTA或用于更通常地检测样品中的革兰氏阳性细菌的试剂盒，该试剂盒包含本文所述的DNA适配体。除本文所述的DNA适配体之外，本文所述的试剂盒可包含，例如缓冲液、标记试剂、和/或说明书。

在某些实施方案中，适配体用标记物质标记，并且LTA的检测可通过检测标记物质进行。标记物质的实例包括染料、荧光染料、放射性同位素、抗体、抗原、和酶。荧光染料的实例包括FITC。这些标记可附着于适配体的特定碱基或特定结构，例如适配体的发夹环结构的特定位点或适配体的3’或5’末端。

光学标记可以举例为荧光材料。例如，荧光材料可选自荧光素，6-FAM，罗丹明，德克萨斯红，四甲基罗丹明，羧基罗丹明，羧基罗丹明6G，羧基对甲氨基酚，羧基罗丹明110，Cascade Blue，Cascade Yellow，香豆素，Cy2(花菁2)，Cy3，Cy3.5，Cy5，Cy5.5，Cy-铬，藻红素，PerCP(多甲藻黄素叶绿素—蛋白质)，PerCP-Cy5.5，JOE(6-羧基-4’，5’-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素)，NED，ROX(5-(和-6)-羧基-X-罗丹明)，HEX，荧光黄，滨海蓝(Marina Blue)，俄勒冈绿488，俄勒冈绿500，俄勒冈绿514，Alexa Fluor，7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸，BODIPY FL，BODIPY FL-Br 2，BODIPY 530/550，其缀合物，以及其组合。

光学标记可以是适合用于酶联免疫吸附测定(“ELISA”)的酶。用于ELISA的酶可包括碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，荧光素酶，或葡糖氧化酶。当酶用作光学标记时，可以使用化学发光材料来诱导化学发光反应，化学发光材料可选自鲁米诺，异鲁米诺，萤光素，光泽精，3-(2’-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酸氧基)苯基-1，2-二氧杂环丁烷-e(AMPPD)，和二钠3-(4-甲氧基螺{1，2-二氧杂环丁烷-3,2’-(5’-氯)三环[3.3.1.13,7]葵烷}-4-基)苯基膦酸盐(CSPD)。除此之外，本领域技术人员适当选择的任何材料都是有用的。

光学标记可以是荧光共振能量转移(“FRET”)对，其包括供体荧光团和受体荧光团，相互之间有适当的间距，并且其中供体的荧光发射被受体抑制或猝灭。供体荧光团包括FAM，TAMRA，VIC，JOE，Cy3，Cy5和德克萨斯红。受体荧光团可被选择以便其激发光谱与供体的发射光谱重叠。受体可为用于猝灭多种供体的非荧光受体。

本文还描述了适配体固定载体，其中用于检测LTA的适配体(或其多结构适配体)固定在固相载体表面。作为固相载体，可以使用各种形状的载体，例如片状、板状、圆柱形的、和球状载体。作为载体的材料，可以使用塑料、金属、玻璃或类似材料。通常，任何材料可以使用，只要它是能够固定适配体的材料，例如用于在侧向流动测定装置中使用。(参见，例如Jiang等的美国专利申请20200249228A1(2020年8月6日)“腹膜透析患者腹膜炎的快速诊断”，其内容并入本文作为参考。)。例如，适配体固定载体可为载体，其中载体是固定在片状固相载体的表面。

借助以下示例性实施例进一步描述本发明。

实施例

实施例1

在针对靶脂磷壁酸质(LTA)相对于反-靶(counter-target)例如脂多糖(LPS)、肽聚糖的特异性筛选核酸文库数代之后，处理富集的文库以鉴定适配体候选物。通过初始筛选产生的文库进行测序用于示差分析，并且依据结合性能鉴定最有希望的适配体序列。在表征最佳候选物之前，在1X SELEX缓冲液中对这些候选物对LTA的反应进行定性评估。

正如本领域技术人员将理解的，SELEX始于极大的寡核苷酸文库的合成，该文库由随机生成的固定长度的序列组成，侧翼是作为引物的恒定的5’和3’端。对于长度为n的随机生成的区域，文库中可能的序列数量为4n(n个位置，在各位置有四种可能(A、T、C或G))。文库中的序列暴露于靶配体，该靶配体可为蛋白质或小的有机化合物，并且没有与靶配体结合的那些序列会被移除，通常是通过亲和层析或在顺磁颗粒上捕获靶。结合的序列被洗脱并且通过PCR扩增，以便为随后的筛选轮次做准备，在随后的筛选轮次中，洗脱条件的严格性可以增加以确定结合最紧密的序列。

测序：对初始文库进行九轮溶解(Melting-Off)筛选，然后进行平行评估。SELEX过程通过多轮筛选富集与LTA结合的序列，且移除对1X SELEX缓冲液或LPS有反应的序列。结果，待测序群体中应包含潜在适配体候选物的多个拷贝。

在平行筛选后，使用Illumina(SanDiego，CA，US)MiniSeqTM系统使用单端读取技术对适配体文库测序。深度测序和后续数据分析简化了进行大量筛选轮次的传统方式(Schütze et al.，2011)。从平行暴露的最终文库中分析巨量序列。从这些数据集中，以90％的同源性构建文库序列家族(考虑突变、缺失和插入的序列相似性)。

生物信息学和适配体候选物的选择：在阳性靶群体中单个序列的频率是考虑因素，但是相似序列之间的变异程度也重要，90％的同源性是最低要求(整个序列100％匹配对以加入一个家族不是必要的；最多可以有两个碱基错配、插入或删除)。

一个因素是在非阳性靶暴露群体中的序列的存在。收集四个文库用于测序：从在1X SELEX缓冲液中与阳性靶孵育中回收的平行评估后的文库；从在1X SELEX缓冲液中与LPS孵育中回收的平行评估后的文库；从仅在1X SELEX缓冲液中孵育中回收的平行评估后的文库；和从在1X SELEX缓冲液中与LTA孵育中回收的平行评估的文库。将阳性群体与反群体进行比较，以鉴定在反选择步骤中没有移除的序列，但是其仍然具有对LTA和LPS两者的亲和力。候选物的富集率也被考虑(参见，例如Wang et al.，2014)。选择了200个候选物用于微阵列合成和高通量评估。

在这200个适配体候选物中，SEQ ID NO：1-5被特别鉴定为选择过程中的实例(图1)。群体中最普遍的家族在反群体中也高度存在。然而，该序列(以及相似序列)在阳性群体中以足够高的频率出现，仍然值得在高通量分析中研究。SEQ ID NO:1-5是基于阳性群体比反群体和/或阴性群体的存在比例更高选择的。

最终，所有候选序列表现了基于mfold二级结构预测的足够的稳定性，以此认定为候选物(图1)。

微阵列合成和半定量评估

微阵列方法：合成与文库恒定区互补的Cy5标记的报告寡核苷酸(5’-GTC GTC CCGAGA GCC TCG/3Cy5Sp/-3’(SEQ ID NO：24))。SEQ ID NO：24将在靶结合过程中被置换。寡核苷酸经过脱盐纯化。

数据分析如下进行。从添加样品之前以及添加样品后每个候选物的平均荧光值中减去平均背景荧光值。

微阵列结果：

首先针对100ng/mL的靶LTA样品对候选物进行测试。用报告寡核苷酸对候选物进行阻断的结果进行成像。根据图像，大多数候选物都与报告分子相互作用良好。读取结果后，在23℃下将候选物与靶样品培养过夜。然后将蠕动泵入口处的溶液替换成1X SELEX缓冲液，以置换微阵列中的靶样品。

用同样的过程分析对1μg/mL反靶LPS样品反应的候选物，提供第二次运行的数据。

候选物对靶样品和反靶样品的反应百分比按18个重复位置的平均值计算。比较反应百分比本身以确定对靶做出特定反应的候选物。根据靶条件下的信号损失与反靶条件下的信号损失的比例对候选者进行排序。比例分值越高，相对于对反条件的反应的对靶条件的反应越多。然后合成比例分值前五名的候选适配体(SEQ ID NO：6-10)进行定性评估。

单克隆合成与定性验证：

评估方法：合成SEQ ID NO：6-10，并通过脱盐纯化。评估与前述的SELEX所用的方法类似。

评估结果：通过SEQ ID NO：6-10在1X SELEX缓冲液中仅针对靶LTA进行初步评估以确定哪些候选物表现出明显的反应。

候选物电泳泳道中存在物质的强度差异代表了与靶LTA培养和结合后从磁珠中释放的候选物量的不同。根据这些结果，选择了SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8候选物，以对反靶LPS进行进一步评估。

在患者样品存在的情况下，针对靶和反靶对所选候选者进行了重新评估。候选SEQID NO；6以与已知具有高浓度糖的其他样品类似的模式运行。SEQ ID NO：9对靶的反应强于对反靶的反应。

实施例2

适配体包含选自由SEQ ID No：11-21组成的组的核心序列，其适当地标记了猝灭标签，并且用于取自患者的医疗样品(例如腹膜透析液)中检测LTA的测定。因此，该检测方法用于检测医疗样本中革兰氏阳性细菌的存在，以便诊断对象的感染，以使用适当的抗生素进行治疗。

参考文献

(各文献内容以其整体通过引用并入本文)：

Ellington and Szostak“In vitro selection of RNA molecules that bindspecific ligands.”Nature 1990,346,818.

Gold et al.“Aptamers and the RNA world,past and present.”Cold SpringHarb.Perspect.Biol.2012,4,a003582.

Schütze et al.“Probing the SELEX Process with Next-GenerationSequencing.”PLoS ONE 6(12):e29604(2011).DOI:10.1371/journal.pone.0029604.

Tuerk et al.“Systematic evolution of ligands by exponentialenrichment:RNA ligands to bacteriophage t4 DNA polymerase.”Science 1990,249,505–510.

Wang et al.“Particle Display:A Quantitative Screening Method forGenerating High-Affinity Aptamers.”Angewandte Communications InternationalEdition 53:4796-4801(2014).DOI:10.1002/anie.201309334.

Zhuo et al.“Recent Advances in SELEX Technology and AptamerApplications in Biomedicine.”Int.J.Mol.Sci.2017,18,2142；doi:10.3390/ijms18102142.

M.Zuker“Mfold web server for nucleic acid folding and hybridizationprediction.”Nucleic Acids Res.31(13):3406-3415(2003).http://mfold.rna.albany.edu/？q＝DINAMelt/Quickfold.

US Patent Application Publication 20200249228A1 to Jiang et al.(Aug.6,2020)for“Rapid Diagnosis of Peritonitis in Peritoneal DialysisPatients.”

Claims (20)

1.包含下列(a)至(c)中任一的多核苷酸并能结合脂磷壁酸(“LTA”)的DNA适配体，

(a)包含SEQ ID NO：11-21中任一项所示的核心序列的多核苷酸，

(b)包含核心序列的多核苷酸，所述核心序列在SEQ ID NO：11-21中任一项所示的核心序列中具有一至两个碱基的缺失、取代、插入和/或添加，以及

(c)包含核心序列的多核苷酸，所述核心序列与SEQ ID NO：11-21中任一项所示的核心序列具有80％或更高的序列相同性，其结合LTA。

2.根据权利要求1所述的DNA适配体，所述适配体具有环结构。

3.根据权利要求1所述的DNA适配体，所述适配体具有双链茎结构。

4.根据权利要求1所述的DNA适配体，其还包含至少一种标记物质。

5.根据权利要求4所述的DNA适配体，所述标记物质是光学标记、电化学标记、放射性同位素，或其组合。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的DNA适配体，所述DNA适配体具有SEQ ID NO：11的核心序列。

7.根据权利要求1-5中任一项所述的DNA适配体，所述DNA适配体具有SEQ ID NO：12的核心序列。

8.根据权利要求1-5中任一项所述的DNA适配体，所述DNA适配体具有SEQ ID NO：13的核心序列。

9.根据权利要求1-5中任一项所述的DNA适配体，所述DNA适配体具有SEQ ID NO：14的核心序列。

10.根据权利要求1-5中任一项所述的DNA适配体，所述DNA适配体具有SEQ ID NO：15的核心序列。

11.根据权利要求1-5中任一项所述的DNA适配体，所述DNA适配体具有SEQ ID NO：16的核心序列。

12.根据权利要求1-5中任一项所述的DNA适配体，所述DNA适配体具有SEQ ID NO：17的核心序列。

13.根据权利要求1-5中任一项所述的DNA适配体，所述DNA适配体具有SEQ ID NO：18的核心序列。

14.根据权利要求1-5中任一项所述的DNA适配体，所述DNA适配体具有SEQ ID NO：19的核心序列。

15.根据权利要求1-5中任一项所述的DNA适配体，所述DNA适配体具有SEQ ID NO：20的核心序列。

16.根据权利要求1-5中任一项所述的DNA适配体，所述DNA适配体具有SEQ ID NO：21的核心序列。

17.根据前述权利要求中任一项所述的DNA适配体，还包含：SEQ ID NO：22和/或SEQ IDNO：23。

18.一种用于检测葡萄球菌(Staphylococcus)的生物传感器，所述生物传感器包含：

前述权利要求中任一项所述的DNA适配体，以及

固定所述DNA适配体的底材。

19.根据权利要求18所述的生物传感器，还包含：

所述底材与所述DNA适配体之间的接头。

20.一种检测样品中脂磷壁酸(“LTA”)的方法，所述方法包含

利用权利要求1-17中任一项所述的DNA适配体和/或权利要求18或19中所述的生物传感器来检测样品中的LTA。