CN117089599A - 一种长编码序列微珠及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种长编码序列微珠及其制备方法。本发明将微珠表面的羧基位点活化，暴露出表面的羧基，然后与带有barcode 1序列的寡核苷酸进行缩合反应；进一步通过T4连接酶催化寡核苷酸的5’‑P末端和3’‑OH末端之间形成磷酸二酯键，引入barcode 2序列；依次引入barcode 3序列和barcode 4序列，四轮反应后得到长序列编码的微珠。本发明制备的长序列编码的微珠种类丰富，在空间转录组测序中可定位更全面的组织，展现出组织内部不同区域间的转录组差异。

Description

一种长编码序列微珠及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种长编码序列微珠及其制备方法。

背景技术

高等生物的细胞、组织具有很高的空间异质性，细胞在组织样本中的相对位置，以及基因表达的空间信息对于研究疾病的病理学及生物发育都是非常重要的。单细胞测序技术分辨率和检测通量的大幅度提高，使得研究者能够在单细胞分辨率上得到细胞之间的异质性。相反，空间转录组，一种空间条形码RNA-Seq方法，为研究者提供了组织中细胞所处的空间信息，以及组织中不同区域的细胞构成和基因表达状态，但现有方法需要预先选择标记，且最新的空间转录组技术尚达不到单细胞的分辨率，因此目前比较常见的是将空间转录组联合单细胞测序技术联用。一般地，空间转录组测序的第一步，可以通过制备带有条形码标记，将标记定点固定在生物芯片上，或随机固定后进行标记解码等流程。

现有技术CN115786457A公开了一种长编码序列二氧化硅微珠的制备方法，得到携带1728(12×12×12)种甚至452984831(768×768×768)种不同序列的微珠，然而微珠的种类仍然不够丰富。

发明内容

为解决上述问题，特提出本发明。

首先，本发明提供了一种长编码序列微珠的制备方法，包括：

（1）分别设计引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6，所述引物为寡核苷酸单链，其中引物1和引物3，引物4和引物5之间能够退火；

其中，引物1的5′端有氨基修饰，包括通用引物序列、UMI序列和barcode 1序列；

引物2的5′端有磷酸基修饰，包括link1序列、barcode 2序列和link2序列；

引物3包括link1反向互补序列和长度为4-20nt的barcode1反向互补序列；

引物4的5′端有磷酸基修饰，即barcode 3序列；

引物6的5′端有磷酸基修饰，包括link 3序列、barcode 4序列和polyT序列；

引物5包括link3反向互补序列、barcode3的反向互补序列和link 2反向互补序列；

所述link1序列、link2序列和link3序列是长度为1-20nt的辅助连接序列；

将引物1和引物3经过退火反应制得barcode 1引物；将引物4和引物5经过退火反应制得barcode 3引物；

（2）微珠的活化：将羧基化的微珠置于EDC和NHS混合液中，进行活化；

（3）将活化后的微珠与barcode 1引物混合后进行缩合反应；

（4）将步骤（3）得到的微珠与引物2、连接酶混合后反应；

（5）将步骤（4）得到的微珠与barcode 3引物、连接酶混合后反应；

（6）将步骤（5）得到的微珠与引物6、连接酶混合后反应，制得所述长编码序列微珠。

通过上述制备方法，制备的长序列编码的微珠种类更丰富，比如使用12-768种barcode 1、barcode 2、barcode 3和barcode4，最终得到携带20736（12×12×12×12）种甚至约3479亿（768×768×768×768）种不同序列的微珠，在空间转录组测序中可定位更全面的组织，展现出组织内部不同区域间的转录组差异。而且，相比2段连接或者3段连接，相同的oligo数量下，4段连接得到的不同序列组合更多，可以获得更多种微珠。比如36种oligo，若是3段连接，每段12种，那么可以获得微珠种类数为1728（12×12×12）；若是4段连接，每段9种，那么可以获得微珠种类数为6561（9×9×9×9）。

其中，本发明发现采用上述互补引物提前退火以及设计辅助连接序列的方式，能够增强寡核苷酸序列间的连接效率，但是，随着微珠连接反应的次数增加，寡核苷酸序列间的连接效率会受到影响，当通过四轮连接反应制备长序列编码的微珠时，本发明发现通过控制引物3中barcode1反向互补序列在4-20nt时，能够使得连接效率较好。

本发明中，通用引物序列是与测序仪兼容的引物的结合区域；所述引物包括但不限于illumina、MGIseq、Life Ion、Pacbio或者Nanopore等测序平台的测序引物，如illumina Sequencing Reads1 primer序列ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT（SEQ IDNo.1）。

本发明中，所述link1序列、link2序列和link3序列是长度为1-20nt的辅助连接序列，用于不同寡核苷酸之间的高效连接。

本发明中，所述barcode 1序列、barcode 2序列、barcode 3序列和barcode 4序列为长度10-20nt的编码序列，整个寡核苷酸链包含一段或者多段位置barcode序列。

优选地，引物3中的barcode1反向互补序列的长度为8-20nt；更优选为12-20nt；更优选为16-20nt；最优选为15-17nt。

优选地，所述polyT序列的长度为10-35nt，结尾包含VN序列；其中V、N为简并碱基，V表示A、G或C，N表示A、T、G或C。

优选地，所述微珠为聚苯乙烯微珠（例如图1所示）、二氧化硅微珠（例如图2所示）、磁性复合材料微珠（例如图3所示）中的至少一种。

二氧化硅微珠是一种无毒、无污染、高强、高韧、稳定性好、表面积大的无机非金属纳米材料，因此可以在一定规模上制备出纳米级的单分散二氧化硅微珠，并且已在生物细胞分离和医学工程方面获得广泛的应用。单分散二氧化硅微珠由于形状均一性好、尺寸可控、分散性质好、组成单一和表面易功能化等特点，在合成长序列编码的二氧化硅微珠方面有巨大的应用价值。

在具体实施过程中，采用连接酶连接时配合使用连接buffer。

优选地，所述连接酶为T4连接酶。

在具体实施过程中，采用T4连接酶连接时配合使用T4连接buffer。

优选地，所述微珠的PDI不超过0.05；和/或，所述微珠的直径为0.05~20微米。更优选地，所述微珠的直径为0.1~1.0微米。

优选地，所述UMI序列是长度为8-16nt的随机引物。

优选地，所述引物3的长度为10-60nt；和/或，所述引物4的长度为10-20nt；和/或，所述引物5的长度为12-60nt。

优选地，所述制备方法还包括在每次反应之后清洗、重悬微珠。

进一步，本发明提供了上述任一实施方案制备的长编码序列微珠。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明制备的长序列编码的微珠种类丰富，在空间转录组测序中可定位更全面的组织，展现出组织内部不同区域间的转录组差异。相比2段连接或者3段连接，相同的oligo数量下，4段连接得到的不同序列组合更多，可以获得更多种微珠，而且4段连接方式比3段连接方式需要的引物数量更少，大大提高经济性。

此外，本发明的长序列编码微珠制备方法操作简单易行，与传统的微珠合成方法相比，减少了微珠的损失率、均一性高、连接效率较高，能够保证DNA序列的完整延伸，应用前景广阔。

附图说明

图1是聚苯乙烯微珠图。

图2是二氧化硅微珠电镜图。

图3是磁性复合材料微珠结构图。

图4是本发明长序列编码微珠制备方法的引物设计示意图。

图5是本发明长序列编码微珠制备方法的引物序列示意图。

图6是实施例1的长编码序列微珠的荧光效果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

本发明中的术语：

MES：2-吗啉乙磺酸；

EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；

NHS：N-羟基琥珀酰亚胺。

实施例1

本实施例提供了一种长编码序列微珠的制备方法，本实施例首先将二氧化硅微珠表面的羧基位点活化，暴露出表面的羧基，然后与带有barcode 1序列的寡核苷酸进行缩合反应；进一步通过T4连接酶催化寡核苷酸的5’-P末端和3’-OH末端之间形成磷酸二酯键，引入barcode 2序列；然后再次利用T4连接酶，引入barcode 3序列；最后利用T4连接酶，引入barcode 4序列。四轮反应后，同一微珠上的所有寡核苷酸具有相同的barcode、不同的UMI，而不同微珠上的寡核苷酸具有不同的barcode组合，最终得到长序列编码的二氧化硅微珠，具体步骤如下：

1.设计引物

如图4所示，设计6组引物，分别为引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6，引物均为寡核苷酸单链，其中引物1和引物3，引物4和引物5之间能够退火；

其中，引物1的5′端有氨基修饰，从5′-3′为Illumina测序平台的READ1序列、UMI序列（随机序列）、barcode 1序列；

引物2的5′端有磷酸基修饰，从5′-3′为link1序列、barcode 2序列、link2序列；

引物3从5′-3′为link1反向互补序列、barcode1反向互补序列；

引物4的5′端有磷酸基修饰，即barcode 3序列；

引物5从5′-3′为link3反向互补序列、barcode3的反向互补序列、link 2反向互补序列；

引物6的5′端有磷酸基修饰，从5′-3′为link 3序列、barcode 4序列和polyT序列；

引物序列如表1所示。

表1

2.羧基化二氧化硅微珠的活化

将二氧化硅微珠原液稀释200倍后，在显微镜下进行精确计数（约30万个/μL）；称取MES（100mg）、EDC（20mg）和NHS（15mg），将MES配制为0.5M，吸取16mL配制好的MES溶解EDC和NHS，然后用混合液重悬已计数好的微珠，分到10个1.5mL EP管中，每管400μL，室温下在金属振荡仪上（1000rpm）反应过夜进行活化。

3. barcode 1引物退火反应（100μL体系）

引物1和引物3按1:1摩尔比混合，再加入5×退火buffer进行退火反应；PCR程序设置为：95℃-15℃，每3min退火10℃，最终得到barcode 1引物（退火产物），引物浓度100µM。

其中5×退火buffer配方如表2所示。

表2

4. barcode 1缩合反应

将上述活化好的二氧化硅微珠均分到96孔板，每孔20μL，再向每个孔加入5 µL的barcode 1引物（退火产物，10µM），振荡混匀，将金属振荡仪的震速设置为1000 rpm，在室温下振荡反应过夜。反应结束后，将微珠收集到50mL离心管，用含0.01% v/v吐温-20的PBS洗一次，离心后小心去除上清，然后将微珠在TE Buffer中洗涤两次，用无酶水重悬微珠。

5. barcode 2连接反应

将步骤4得到的微珠均分到96孔板，再加入5 μL 5×T4连接buffer、500U/µL T4连接酶5μL、5μL 引物2（10µM），剩余补水，总体积为50μL。在金属浴振荡仪上16℃反应0.5h（震速1000rpm）。收集微珠到50mL离心管，用10 mM的Tris-HCl（pH8.0）洗三次，离心后小心去除上清，然后用无酶水重悬二氧化硅微珠。

6. barcode 3引物退火反应（100μL体系）

引物4和引物5按1:1摩尔比混合，再加入5×退火buffer（表2）进行退火反应；PCR程序设置为：95℃-15℃，每3min退火10℃，最终得到barcode 3引物（退火产物），引物浓度100µM。

7. barcode 3连接反应

将步骤5中重悬好的二氧化硅微珠均分到96孔板，再加入5 μL T4连接buffer、500U/μL T4连接酶5 μL、5 μL barcode 3退火产物（10µM），剩余补水，总体积为50μL。在金属浴振荡仪上16℃反应0.5 h（震速1000rpm）。反应结束后收集二氧化硅微珠到50mL离心管，用10 mM的Tris-HCl（pH8）洗1-3次，然后用无酶水重悬二氧化硅微珠。

8.barcode 4连接反应

将步骤7中重悬好的二氧化硅微珠均分到96孔板，再加入5 μL T4连接buffer、500U/μL T4连接酶5 μL 和5 μL引物6（10µM），剩余补水，总体积为50μL。在金属浴振荡仪上16℃反应0.5h（震速1000rpm）。反应结束后收集二氧化硅微珠到50mL离心管，用10mM的Tris-HCl（pH 8.0）洗一次；离心后加入2M的NaOH进行解链5次，目的是去掉引物6和残余引物，每次5min，最后一次完全弃净；再用无酶水洗3次，最后用10mL TE-TW（0.01% Tween-20）重悬微珠，分装到离心管里，4℃保存。

实施例2~5

本实施例提供了一种长编码序列微珠的制备方法，步骤仅与实施例1不同的是：

如图5所示，分别设计引物3中Bar1-RC（barcode1反向互补序列）长度分别取4、8、12和16nt（实施例1中为20nt）, link1反向互补序列不变，合成长编码序列微珠；即引物3序列分别为：

TACGATTCAG（SEQ ID No.8），

TACGATTCAGGATC（SEQ ID No.9），

TACGATTCAGGATCGTAC（SEQ ID No.10）,

TACGATTCAGGATCGTACTAGC（SEQ ID No.11）。

试验例

采用荧光杂交法评估上述合成的长编码序列微珠的效果，具体步骤为：配制DNA探针杂交液，杂交合成的微珠在50℃下孵育15min，杂交完成后用清洗缓冲液对微珠进行清洗，均匀铺在载玻片上，晾干后用扫描仪对微珠进行扫描，扫描完成后在相同参数下对图像进行分析处理，记录微珠的平均荧光强度，其中，质检探针序列为：5'-cy5-AAAAAAAAAAAAAAA-3'（SEQ ID No.12）。

将上述合成的长编码序列微珠分别采用荧光杂交法进行测试，每种微珠重复做三次，记录对应的平均荧光强度，结果见表3。

表3

实施例1的长编码序列微珠的荧光效果如图6所示。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种长编码序列微珠的制备方法，其特征在于，包括：

（1）分别设计引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6，所述引物为寡核苷酸单链，其中引物1和引物3，引物4和引物5之间能够退火；

其中，引物1的5′端有氨基修饰，包括通用引物序列、UMI序列和barcode 1序列；

引物2的5′端有磷酸基修饰，包括link1序列、barcode 2序列和link2序列；

引物3包括link1反向互补序列和长度为4-20nt的barcode1反向互补序列；

引物4的5′端有磷酸基修饰，即barcode 3序列；

引物6的5′端有磷酸基修饰，包括link 3序列、barcode 4序列和polyT序列；

引物5包括link3反向互补序列、barcode3的反向互补序列和link 2反向互补序列；

所述link1序列、link2序列和link3序列是长度为1-20nt的辅助连接序列；

将引物1和引物3经过退火反应制得barcode 1引物；将引物4和引物5经过退火反应制得barcode 3引物；

（2）微珠的活化：将羧基化的微珠置于EDC和NHS混合液中，进行活化；

（3）将活化后的微珠与barcode 1引物混合后进行缩合反应；

（4）将步骤（3）得到的微珠与引物2、连接酶混合后反应；

（5）将步骤（4）得到的微珠与barcode 3引物、连接酶混合后反应；

（6）将步骤（5）得到的微珠与引物6、连接酶混合后反应，制得所述长编码序列微珠。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，引物3中的barcode1反向互补序列的长度为8-20nt。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，引物3中的barcode1反向互补序列的长度为12-20nt。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，引物3中的barcode1反向互补序列的长度为16-20nt。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，引物3中的barcode1反向互补序列的长度为15-17nt。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述barcode 1序列、barcode 2序列、barcode 3序列和barcode 4序列为长度10-20nt的编码序列；

和/或，所述UMI序列是长度为8-16nt的随机引物；

和/或，所述polyT序列的长度为10-35nt，结尾包含VN序列；其中V、N为简并碱基，V表示A、G或C，N表示A、T、G或C。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述微珠为聚苯乙烯微珠、二氧化硅微珠、磁性复合材料微珠中的至少一种；

所述微珠的PDI不超过0.05；所述微珠的直径为0.05~20微米。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述引物3的长度为10-60nt；和/或，所述引物4的长度为10-20nt；和/或，所述引物5的长度为12-60nt。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括在每次反应之后清洗、重悬微珠。

10.一种长编码序列微珠，其特征在于，其由权利要求1~9中任一项所述的制备方法制得。